COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE PRODUÇÃO DA COMPOSIÇÃO E USO DA COMPOSIÇÃO DE NANOFIBRAS QUE COMPREENDE PVA, QUITOSANA, ANTIBIÓTICO E PEPTÍDEO DE DEFESA DO HOSPEDEIRO

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se à composição de nanofibras compreendendo um antibiótico e um peptídeo antimicrobiano para a aplicação em terapia de endodontia regenerativa. A presente invenção se situa nas áreas de Odontologia, Biotecnologia, Engenharia de tecidos, Nanotecnologia, Farmácia e Medicina.

Antecedentes da Invenção

[0002] O desenho de arcabouços multifuncionais para endodontia regenerativa são ferramentas nanobiotecnológicas necessárias para aprimorar o tratamento de casos de rizogênese incompleta de dentes permanentes imaturos, para a formação de um novo tecido pulpar.

[0003] A polpa dentária se caracteriza como um tecido conjuntivo frouxo, abundante em circulação sanguínea e terminações nervosas (DA ROSA; PIVA; DA SILVA, 2018). Tal tecido se situa na porção interna do órgão dentário, câmara pulpar e canais radiculares, e é circundado por estruturas rígidas, como a dentina (JONTELL et al., 1998). A polpa desempenha funções que incluem: atividades sensoriais, resposta imunológica, aporte nutritivo, além de formação, remodelagem, e regeneração tecidual (RODD; BOISSONADE, 2003). Essas funções são desempenhadas pela diversidade celular presente na polpa, representada por odontoblastos, fibroblastos, células vasculares, células- tronco, células do sistema imune, neurônios sensoriais e simpáticos, além de outras células que estão envolvidas com a manutenção e desenvolvimento radicular (MITSIADIS; WOLOSZYK, 2015; DA ROSA; PIVA; DA SILVA, 2018).

[0004] Assim como a raiz, o esmalte e a dentina, a polpa dentária origina-se a partir do ectomesênquima (YUAN; CHAI, 2019). Durante a primeira fase do desenvolvimento dentário, a campânula, o epitélio interno se conecta com o epitélio externo para a formação radicular. As células-tronco, então, conduzem o estabelecimento do arcabouço pulpar. Neste processo, a bainha epitelial de Hertwing (BEH) (que circunda a raiz) pode ser rompida ou perfurada, o que induz a formação de uma estrutura em malha, permitindo a entrada de células foliculares, que podem se diferenciar em uma matriz de cemento (HOVORAKOVA et al., 2018; (WINNING, TOWNSEND, 2000; HOVORAKOVA et al., 2018; PELED et al., 2016).

[0005] O trauma dentário pode ser denominado como injúrias causadas por forças externas que geram um rompimento das estruturas dentárias e vizinhas na cavidade oral (PATNANA et al., 2020). Tais lesões se enquadram como um problema de saúde pública de alta frequência, podendo ocasionar diversos impactos socioeconômicos e de qualidade de vida (BLOKLAND et al., 2016). As lesões traumáticas acometem com maior prevalência dentes anteriores de crianças em idade escolar (PETTI; GLENDOR; ANDERSSON, 2018). Nessa faixa etária, cerca de 20% das crianças já sofreram traumas dentários (BLOKLAND et al., 2016).

[0006] Como consequência dessas injúrias, o tecido pulpar pode ser acometido, tendo seu feixe vásculo-nervoso rompido (KRASTL; FILIPPI; WEIGER, 2020). Esses impactos no desenvolvimento dentário e radicular são um dos principais agentes etiológicos relacionados à necrose pulpar em dentes permanentes imaturos (DPIs) (HECOVA et al., 2010). Ademais, os danos que envolvem o tecido pulpar podem causar uma inflamação local, e mais gravemente desencadear uma necrose asséptica. Quando as repercussões traumáticas afetam a BEH, ou causam uma necrose pulpar, o desenvolvimento da raiz pode ser estagnado, aumentando o risco de fraturas (BORGES et al., 2017).

[0007] O rompimento das estruturas dentárias pode favorecer a entrada de microrganismos no ambiente pulpar (FOUAD, 2019). O microrganismo Staphylococcus aureus foi encontrado em 28% das lesões de cárie em crianças de 4 a 12 anos (KOUIDHI et al., 2014). Já a Enterococcus faecalis está presente tanto nas infecções pulpares iniciais quanto nas infecções endodônticas persistentes (ROCAS; SIQUEIRA JR.; SANTOS, 2004). Essa bactéria está envolvida com inúmeros casos de insucesso na terapia endodôntica (MURAD et al., 2014).

[0008] Os microrganismos envolvidos com a necrose pulpar também podem se organizar em biofilme (FOUAD, 2019). Essa estratégia de interação entre microrganismos de espécies homogêneas ou heterogêneas acontece por meio da produção e secreção de uma rede de matrizes extracelulares (KINANE; STATHOPOULOU; PAPAPANOU, 2017). Tais ramificações estabelecem uma barreira protetora contra diversos agentes químicos e físicos (WAN et al., 2021 ). Ainda, a presença do remanescente antigênico no sistema de canais radiculares (SCR) é responsável pela indução da resposta imunológica pró- inflamatória no tecido pulpar (TIAN et al., 2020). Inicialmente, os padrões moleculares associados aos patógenos podem ser reconhecidos por receptores do tipo tool (TLRs), presentes principalmente em odontoblastos, células dendríticas e macrófagos residentes (WAN et al., 2021 ). O reconhecimento desses epítopos acontece especialmente por TLR-2 e TLR-4, aos quais culminam em produção de citocinas, quimiocinas e mediadores envolvidos com a quimiotaxia, apoptose, hiperemia, e hipertermia pulpar. Dentre as citocinas envolvidas com a necrose pulpar, se destacam a IL-113, IL- 6, TNF-a, CCL2, CCL5 e IL-12. Além disso, diversas metaloproteinases e espécies reativas de oxigênio (ROS) contribuem para a degradação e rompimento das estruturas pulpares (KHORASANI et al., 2020).

[0009] Uma vez que as injúrias oriundas de lesões traumáticas ou cariosas podem desencadear a necrose pulpar, o tratamento endodôntico se torna necessário. Entretanto, devido a suas particularidades anatômicas, a conduta clínica convencional se torna inviável nesses elementos dentários (KIM et al., 2018). Desta forma, a principal terapia endodôntica utilizada para o tratamento de dentes imaturos com necrose pulpar é a revascularização pulpar (SHETTY et al., 2020).

[0010] Assim, o processo de indução de revascularização pulpar pode ser caracterizado como uma reentrância do tecido oriundo da região apical, após o estímulo do sangramento, que permite a formação de um tecido conjuntivo fibroso no SCR. A terapia para a indução de revascularização pulpar mais difundida foi sugerida por Diógenes (2014).

Terapia de revascularização pulpar

[0011] A primeira etapa da terapia de revascularização pulpar consiste no acesso do SCR e irrigação com hipoclorito de sódio e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Após o SCR ser seco, uma medicação intracanal é aplicada. Esta medicação será responsável por eliminar o maior percentual de microrganismos que possam desencorajar a formação do novo tecido. A medicação intracanal mais utilizada é conhecida como pasta tripla antibiótica (TAP).

[0012] A TAP consiste na associação em proporções similares de ciprofloxacino, metronidazol e minociclina (ARRUDA et al., 2018). Hoshino e colaboradores (1996) foram os primeiros a sugerir a utilização da TAP, contendo 25 pg.rnL’ ¹ de ciprofloxacino, metronidazol e minociclina. Sugere-se o uso de propilenoglicol como veículo para a formação de uma pasta antimicrobiana para a revascularização pulpar. No entanto, apesar do seu potencial antimicrobiano consolidado, uma das grandes críticas direcionadas à TAP tem sido associada ao manchamento dentário, associado à presença da minociclina (PORTER et al., 2016). Diante disso, muitos pesquisadores têm sugerido a utilização da associação de apenas dois antibióticos da pasta dupla antibiótica (DAP), contendo metronidazol e ciprofloxacino, ou a incorporação de outros antibióticos como ampicilina para uma nova formulação da TAP (ARSLAN et al., 2015).

[0013] Outras medicações como o Ca(OH)2 e clorexidina também são relatadas como medicações antimicrobianas para os processos de revascularização pulpar (NAGATA et al., 2014). Contudo, a clorexidina pode ser citotóxica para as células pulpares (RING et al., 2008), enquanto o Ca(OH)2 apresenta características antimicrobianas inferiores às pastas antimicrobianas TAP e DAP.

[0014] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0015] A dissertação de mestrado de SOUSA, Maurício Gonçalves da Costa intitulado como “Avaliação de peptídeos antimicrobianos e imunomoduladores: novas estratégias biotecnológicas para o preparo do dente para a revascularização pulpar” (2017) 195 f. Curso de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasília, revela a ação sinérgica da associação de ciprofloxacino (CIP) com o peptídeo IDR-1002, com a atividade antimicrobiana contra as bactérias S. aureus e E. faecalis na terapia de revascularização pulpar. O trabalho envolveu as moléculas livres, em concentrações de 0,0015 pg.mL’ ¹ de ciprofloxacino + 32 pg.mL’ ¹ de IDR-1002. A presente invenção utiliza diferentes concentrações dos componentes que compõem a composição e a dissertação não revela a produção de nanofibras, nem os possíveis métodos empregados.

[0016] O artigo JALVANDI, Javid; WHITE, Max; GAO, Yuan; TRUONG, Yen Bach; PADHYE, Rajiv; KYRATZIS, llias Louis. “Polyvinyl alcohol composite nanofibres containing conjugated levofloxacin chitosan for controlled drug release” Materials Science and Engineering: C, [S.L.], v. 73, p. 440446, abr. 2017. Elsevier BV. (http://dx.doi.Org/10.1016/j.msec.2016.12.112) revela uma formulação contendo nanofibras de PVA e quitosana, conjugadas com levofloxacino. Estas nanofibras foram produzidas pela técnica de eletrospinning, em que a solução final de levofloxacino-PVA-quitosana foi colocada em uma seringa de 5 mL, a voltagem aplicada foi de 12 kV e o fluxo da solução foi de 0,6 mL/h, posteriormente o material foi recolhido em um coletor localizado a 15 cm do bocal do sistema. A composição das nanofibras revelada pelo artigo diferem da formulação da presente invenção. Adicionalmente, os parâmetros utilizados para a produção das nanofibras por eletrospinning neste documento diferem daqueles aplicados na presente invenção. É importante considerar que alterações na voltagem utilizada, taxa do fluxo e concentração dos polímeros afetam as atividades biológicas das nanofibras.

[0017] O artigo SHANKHWAR, Nisha; KUMAR, Mani Shekhar; MANDAL, Biman B.; ROBI, P. S.; SRINIVASAN, A. intitulado “Electrospun polyvinyl alcohol polyvinyl pyrrolidone nanofibrous membranes for interactive wound dressing application” Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, [S.L.], v. 27, n. 3, p. 247 262, 23 dez. 2015. Informa UK Limited. (http://dx.doi.org/10.1080/09205063.2015.1120474) revela uma composição de nanofibras de PVA (8%)/PVP (20%), produzidas a partir da técnica de eletrospinning, em que a solução foi colocada em uma seringa de plástico de 20 mL acoplada a agulha de aço inoxidável. O fluxo da solução era de 2 mL/h, enquanto foi aplicada uma voltagem de 12 kV. As nanofibras foram recolhidas por um coletor a cerca de 15 cm de distância do bocal do sistema. A estas nanofibras foram incorporadas moléculas de ciprofloxacino. A composição das nanofibras reveladas nesse artigo difere da composição da presente invenção. Ademais, os parâmetros da técnica de eletrospinning revelados no artigo diferem daqueles aplicados na presente invenção. Por fim, ressalta-se que o artigo não revela a possibilidade de aplicar a formulação desenvolvida em terapia endodôntica.

[0018] O artigo KOOSHA, Mojtaba; MIRZADEH, Hamid, intitulado “Electrospinning, mechanical properties, and cell behavior study of chitosan/PVA nanofibers” Journal of Biomedical Materials Research Part A, [S.L.], v. 103, n. 9, p. 3081 - 3093, 24 mar. 2015. Wiley. (http://dx.doi.Org/10.1002/jbm.a.35443) revela uma formulação contendo nanofibras de quitosana (70%)/PVA (30%). Estas nanofibras foram produzidas a partir da técnica de eletrospinning, em que 5 mL da solução final de quitosana-PVA foi colocada em uma seringa, o fluxo da solução foi de 0,5 mL/h, enquanto uma voltagem de 20 kV foi aplicada ao sistema. A composição, tanto polimérica quanto de fármacos das nanofibras revelada pelo artigo diferem daquela revelada pela presente invenção. Além disso, os parâmetros aplicados para a técnica eletrospinning são diferentes entre o artigo e a presente invenção.

[0019] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0020] Sendo assim a busca por uma medicação intracanal para a revascularização pulpar com alto potencial antimicrobiano e menor incidência de efeitos adversos ainda é um desafio presente. A redução da carga microbiana no SCR não é simples de alcançar, uma vez que centenas de espécies de microrganismos podem estar relacionados a infecções pulpares (SAMPAIO-MAIA et al., 2016). Algumas bactérias podem continuar presentes no ambiente pulpar, mesmo após a utilização de TAP e de uma associação de Ca(OH)2 e clorexidina 2% (NAGATA et al., 2014). Assim, o uso de uma medicação intracanal eficiente é crucial para reduzir a maior quantidade de microrganismos no SCR possível.

Sumário da Invenção

[0021] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas constantes do estado da técnica a partir de uma composição antimicrobiana, antibiofilme e nanofibrosa que compreende PVA, quitosana, peptídeo de defesa do hospedeiro e antibiótico, sendo que essa composição foi produzida pela técnica de eletrospinning.

[0022] Assim, em um primeiro objeto, a composição é nanofibrosa e compreende:

• 60% a 69,5% PVA; • 29,5% a 39% de quitosana;

• 1% a 0,5%, em peso de antibiótico; e

• 1 % a 0,5% peptídeo de defesa do hospedeiro; em que a composição de nanofibra compreende PVA e a quitosana; e em que as porcentagens são em peso seco em relação à composição de nanofibra controle.

[0023] Em um segundo objeto, o processo de produção da composição compreende as etapas de: a) Misturar as soluções poliméricas sob aquecimento; b) Resfriar a solução polimérica obtida em a); c) Adicionar à composição polimérica o antibiótico e o peptídeo de defesa; d) Aplicar a técnica de formação das nanofibras.

[0024] Um terceiro objeto, o uso da composição é na preparação de um medicamento para tratamento endodôntico.

[0025] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0026] Figura 1 : Representação da degradação (A e B) e intumescimento (C e D) das nanofibras controle, incorporadas com ciprofloxacino, IDR-1002 ou associação de ambos. O peso médio das triplicates das fibras intumescidas em mg (A e C) e de seu grau de intumescimento e peso remanescente em percentual (B e D) foram avaliados até 21 dias. * representa diferenças estatísticas (p < 0,0001 ) após teste two-way Anova com correções de Bonferroni.

[0027] Figura 2: Caracterização da presença das moléculas de ciprofloxacino, IDR-1002 nas nanofibras de PVA e quitosana usando espectroscopia FTIR. Espectros conforme indicado, demonstram as de quitosana-álcool polivinílico (A), nanofibras contendo 1002 (B), nanofibras contendo ciprofloxacina (C) e nanofibras fibras contendo ciproflxacino e IDR-1002 (D). Picos vermelhos marcados por setas indicam os espectros característicos distintos do adlayer montado.

[0028] Figura 3A e 3B: Atividade antibiofilme das nanofibras de PVA e quitosana incorporadas com ciprofloxacino, IDR-1002 ou a combinação de ambos. Os experimentos de difusão radial (A e D) foram realizados previamente ao experimento de atividade antibiofilme. B e E representam a atividade antibiofilme das moléculas livres e C e F a atividade antibiofilme das moléculas nanoestruturadas contra as bactérias Staphylococcus aureus (3A) e Enterococcus faecalis (3B). Em A e D as barras representam as médias da difusão antimicrobiana em mm no programa Image J. Já em B, C, E e F, as barras representam as médias de absorbância em 500 nm da coloração de TCC. As diferenças estatísticas foram representadas por * p<0,05, ** p<0,01 , *** p<0,001 e **** p<0,0001 , após o teste one way Anova com correções de Bonferroni.

[0029] Figura 4: Atividade antibiofilme oral das nanofibras de PVA e quitosana incorporadas com ciprofloxacino, IDR-1002 ou a combinação de ambos. De A - F as imagens representam a coloração de SYNT9 (verde) e iodeto de propídeo (vermelha) dos discos de hidroxiapatita tratados com as moléculas livres (A-D) ou nanoestruturadas (E-H). De G-N são representadas as construções 3D dos biofilmes tratados, utilizando o programa Imaris 7.2. As barras em O e P representam os percentuais de células vivas das moléculas livres (O) ou nanoestruturadas (P). As diferenças estatísticas são representadas por # p<0,0001 quando comparados ao grupo controle e * p<0,0001 quando comparados ao grupo contendo nanofibras incorporadas com ciprofloxacino e IDR-1002 após teste oneway Anova com correções de Bonferroni.

[0030] Figura 5: Cromatogramas representativos do perfil de liberação do eluente das nanofibras incorporadas incubadas em água depois de 24h. Os cromatogramas são representados de acordo com o tempo de retenção (min) e a unidade de absorbância (AU) em 216 nm de ciprofloxacino (A) e do IDR-1002 (B). A cromatografia foi realizada com uma coluna shimadzu C18 (velocidade de injeção de 0,6 mL.min’ ¹ ) em método isocrático e concentração de 20% de acetonitrila. Espectros de massa avaliados no MALDI-ToF das frações oriundas do tempo de retenção de CIP (8,2 min) (A) e IDR-1002 (14,2 min) (B) representam as massas encontradas de 332,2 Da para CIP (A) e de 1652, Da após a ionização utilizando como base uma matriz de ácido a-ciano-4- hidroxicinâmico (10 mg.mL’ ¹ ).

[0031] Figura 6: MEV de nanofibras (a), nanofibras contendo ciprofloxacino (b), IDR-1002 (c) ou ambos (d) mostrando morfologia de nanofibras incorporadas ou controle e estrutura porosa. Tamanho do diâmetro da nanofibra e o a distribuição do tamanho dos poros das nanofibras, tanto incorporadas quanto controle foram calculados usando o software Image J 3.0. Barra de escala 20k. [0032] Figura 7: Biocompatibilidade das nanofibras incorporadas ou controle (não incorporadas) desenvolvidas em diferentes células humanas presentes no tecido periapical. Em A o teste de viabilidade foi realizado contra fibroblastos humanos por MTT, em B o teste de capacidade hemolítica e em C a citotoxicidade por LDH sobre PBMCS. Em A as barras representam as médias das absorbâncias a 570 nm. Em B as barras representam o percentual hemolítico das amostras testadas comparadas ao triton 2% (controle positivo) e PBS (controle negativo). Em C, as barras representam o percentual de produção de LDH na presença dos tratamentos utilizados, além dos grupos estimulados com o LPS e LTA comparadas ao triton 2% (controle positivo) e PBS (controle negativo).

Descrição Detalhada da Invenção

[0033] Diante da baixa efetividade dos medicamentos atualmente utilizados no tratamento de canal para a regeneração pulpar, a presente invenção descreve uma composição e o desenvolvimento de uma formulação nanofibrosa de PVA/quitosana, na proporção de 60% a 69,5% e 29,5% a 39% (em peso seco) respectivamente, incorporada com ciprofloxacino e o peptídeo IDR-1002, nas concentrações de 0,5% a 1% em relação à composição de nanofibra que pode ser utilizada para preparar um medicamento aplicado no tratamento da rizogênese incompleta de dentes permanentes imaturos. Esta composição auxilia na regeneração do tecido pulpar e permite maior assepsia do local a ser tratado, uma vez que tanto o antibiótico ciprofloxacino quanto o peptídeo IDR- 1002 atuam contra as principais bactérias responsáveis por infecções e inflamações da região pulpar em dentes permanentes imaturos.

[0034] A degradação, por intumescimento completo das nanofibras, ocorre em 21 dias, ideal para o tratamento de revascularização pulpar. Durante o processo de revascularização pulpar esse tempo de degradação é positivo, já que proporciona o controle do risco de sangramento e cria um microambiente apropriado para absorver células e fatores de crescimento. Entretanto, se esse processo for muito prolongado pode ocorrer um aumento da pressão contra a parede da dentina, causando danos a esse tecido.

[0035] A composição nanofibrosa PVA/Quitosana incorporada, descrita na presente invenção pode ser utilizada para preparar um medicamento aplicado no tratamento da rizogênese incompleta de dentes permanentes imaturos, já que possibilita auxiliar a regeneração do tecido pulpar, e atua contra a eliminação de microrganismos responsáveis pela pulpite de dentes permanentes imaturos, uma vez que tanto o antibiótico ciprofloxacino quanto o peptídeo IDR-1002, atuam de forma sinérgica como antibióticos e antibiofilme contra as bactérias Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus.

[0036] A associação destes dois compostos pode resultar em um melhor perfil terapêutico, já que possibilita aumentar a ação farmacológica contra os microrganismos e reduzir os efeitos adversos associados às terapias convencionais. Destaca-se que a formulação nanofibrosa não interfere na viabilidade celular de fibroblastos humanos e não possui atividade citotóxica ou atividade hemolítica.

[0037] Assim, a formulação desenvolvida torna possível associar de forma sinérgica dois agentes com ação contra infecções odontológicas com um material nanobiotecnológico que pode contribuir para a engenharia de tecidos na odontologia, auxiliando terapias endodônticas regenerativas. Esta composição permite a liberação prolongada do fármaco, o que auxilia na redução da dose necessária para obter o efeito terapêutico e consequentemente a diminuição dos efeitos adversos, melhorando o perfil do tratamento.

[0038] Um primeiro objeto, a composição está na forma de nanofibra e compreende:

• 60% a 69,5% de PVA;

• 29,5% a 39% de quitosana;

• 1 % a 0,5% antibiótico; e

• 1% a 0,5% de peptídeo de defesa do hospedeiro; em que a nanofibra é composta por PVA e a quitosana; e em que as porcentagens são em peso seco em relação à composição de nanofibra controle.

[0039] Por incorporados, entende-se na presente invenção que estes agentes antimicrobianos estão ligados (distribuídos/presentes) tanto na superfície das estruturas das nanofibras quanto na sua estrutura interna. No presente caso as soluções são misturadas e levadas para o processo de electrospinning, que permite desenvolver nanofibras com moléculas de ambos (Ciprofloxacino e IDR-1002) distribuídas tanto na superfície, quanto no interior das fibras, podendo ser liberados de forma controlada no local de ação.

[0040] Por “nanofibra controle” entende-se, nesta invenção, a nanofibra não incorporada com ciprofloxacino ou IDR-1002, compreendendo apenas PVA e quitosana.

[0041] Em uma concretização, a composição nanofibrosa compreende os polímeros PVA e quitosana, em concentrações de 69,5% e 29,5% (em peso seco), respectivamente.

[0042] Em uma realização, na composição nanofibrosa, o antibiótico e o peptídeo estão presentes, em sinergismo, na concentração de 1 % a 0,5%, em peso total de nanofibra controle. [0043] Em uma concretização, a composição nanofibrosa compreende um antibiótico da classe das quinolona.

[0044] Em uma realização a composição nanofibrosa compreende um antibiótico preferencialmente da classe das fluorquinolonas.

[0045] Em uma concretização a composição nanofibrosa compreende o antibiótico, que é preferencialmente o ciprofloxacino.

[0046] Em uma realização, a composição nanofibrosa compreende um peptídeo de defesa do hospedeiro IDR-1002, conforme a SEQ ID NO: 1. As moléculas de ciprofloxacino e IDR-1002 foram incorporadas as nanofibras.

[0047] Um segundo objeto, processo de produção da composição, compreende as etapas: a) Misturar as soluções poliméricas; b) Resfriar a solução polimérica obtida em a); c) Adicionar à composição polimérica o antibiótico e o peptídeo de defesa; d) Aplicar a técnica de formação de nanofibras.

[0048] Em uma concretização, os parâmetros do processo de produção da composição compreendem a) Misturar a solução de quitosana com solução de PVA, durante 5h a 50 SC; b) Resfriar a solução polimérica de quitosana com PVA; c) Adicionar à composição polimérica a solução de ciprofloxacino e a solução de IDR-1002, conforme a SEQ ID NO: 1 ; d) Aplicar a técnica de eletrospinning.

[0049] Em uma concretização, o processo de eletrospinning compreende as etapas de: e) Adicionar 20 ml_ da solução formada ao final da etapa c) a uma seringa plástica acoplada com uma agulha de aço inox; f) Aplicação de uma voltagem de 16 kV, em um fluxo de 0,5 mL.lr ¹ ; g) Recolhimento do material produzido na etapa f) em um coletor localizado a 12 cm do bocal do sistema. [0050] Um terceiro objeto, o uso da composição é para ser na preparação de um medicamento para tratamento endodôntico.

[0051] Em uma realização, o uso da composição nanofibrosa de PVA/quitosana compreendendo ciprofloxacino e IDR-1002, conforme SEQ ID NO: 1 é para preparar um medicamento para o tratamento de rizogênese incompleta de dentes permanentes imaturos.

[0052] Em uma concretização, o uso da composição nanofibrosa de PVA/quitosana compreendendo ciprofloxacino e IDR-1002 conforme SEQ ID NO: 1 na preparação de um medicamento contra as bactérias Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus.

Ciprofloxacino

[0053] O ciprofloxacino demonstra ser o antimicrobiano mais eficiente contra microrganismos endodônticos (ALSAEED et al., 2018). O ciprofloxacino apresenta características hidrofóbicas e pertence a classe das quinolonas de segunda geração, especificamente uma fluorquinolona (CHEN et al., 2021 ). Este antibiótico é capaz de inibir três enzimas situadas no citoplasma bacteriano: as topoisomerases do tipo HA e IV e a DNA-girase (OPPEGARD et al., 2016). Tais enzimas podem ser essenciais para a replicação, transcrição e tradução do DNA bacteriano (BAX et al., 2010).

[0054] Inicialmente, o fármaco desempenha funções bacteriostáticas, todavia o desfecho do tratamento à base de fluoroquinolonas se torna a morte bacteriana (SILVA; SILVA, 2019). Diante de sua eficiente ação antimicrobiana, o ciprofloxacino tem sido usado nas terapias endodônticas com resultados melhores em relação ao metronidazol e à minociclina (LATHAM et al., 2016).

Peptídeos de defesa do hospedeiro

[0055] Os peptídeos de defesa do hospedeiro (PDHs) são moléculas com ação antimicrobianas produzidas por animais, protozoários, fungos e bactéria contra antígenos (MORAVEJ et al., 2018). Os PDHs podem atuar como ferramentas dos mecanismos de defesa do hospedeiro, principalmente na imunidade inata, e ainda nos processos regenerativos (MORAVEJ et al., 2018). Os PDHs podem atuar na membrana por meio de interações eletrostáticas, ou hidrofóbicas, desestabilizando a membrana em forma de barril, detergente, poro toroidal, carpete ou afinamento da membrana (SCHÃFER; WENZEL, 2020).

[0056] Alterações e interações entre ácidos nucleicos, ribossomos e proteínas fosforiladas também podem acontecer devido ao seu perfil predominantemente catiônico (TAJBAKHSH et al., 2017). Alguns estudos consideram ainda a ação de PDHs em enzimas, transcrição de genes e síntese de DNA (JEZOWSKABOJCZUK; S TO KOWA- SOLTYS, 2018). Já em relação ao papel destas biomoléculas no sistema imune, podem atuar interagindo com receptores do tipo tool (TLRs), em receptores do tipo formil (FPRs) ou mesmo desencadeando vias de sinalização específicas de células do sistema imune adaptativo ou inato, ou até mesmo ativando as cascatas do sistema complemento (KATZENBACK, 2015; SKOVBAKKE et al., 2018). Sendo assim, um ponto importante a ser discutido neste contexto pode ser a baixa citotoxicidade de PDHs, mesmo em concentrações consideradas com ação antimicrobianas (RONCEVIÓ; PUIZINA; TOSSI, 2019).

[0057] Estudos demonstram o potencial de PDHs contra patógenos causadores da pulpite, como: E. faecalis, F. nucleatum e T. forsytia (LEE; BAEK, 2012; LEE et al., 2013; LI et al., 2020b). A capacidade antimicrobiana da catelicidina LL-37 também foi relatada contra 25 microrganismos prevalentes na pulpite como T. denticola, E. faecalis, P. gingivalis, T. forsythia e E. corrodens (THENNARASU et al., 2010; ROSEN; SELA; BACHRACH, 2012).

Peptídeo regulador da imunidade inata 1002

[0058] Peptídeos sintéticos que mimetizam a bacteriocina de neutrófilos bovinos (bac2), conhecidos como peptídeos reguladores da imunidade inata (IDRS) apresentam aplicação na endodontia, uma vez que possuem atividades antimicrobianas, antibiofilme e imunomoduladoras (NIJNIK et al., 2010; PENA et al., 2013).

[0059] O peptídeo IDR-1002, descrito por SEQ ID NO: 1 , apresenta tanto ação antimicrobiana, quanto imunomoduladora (NIJNIK et al., 2010). No que concerne à atividade antimicrobiana, esta biomolécula pode agir contra S. aureus e P. aeruginosa (RIVAS-SANTIAGO et al., 2013). Entretanto, a ação do IDR-1002 se destaca pela sua modulação do sistema imune inato e adaptativo diante processos infecciosos, ou de doenças crônicas inflamatórias (GARLAPATI et al., 2011 ; PRYSLIAK et al., 2017; PIYADASA et al., 2018). Em relação a atividade imunomoduladora sobre células do sistema imune inato, o IDR-1002 foi relacionado ao recrutamento de neutrófilos e o aumento de sua degranulação na presença de LPS, assim como na liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), TNF-a e IL-10 (NIYONSABA et al., 2013). Para mais, este peptídeo pode estar relacionado com a quimiotaxia de monócitos, uma vez que aumenta a quimioatração celular diante das citocinas CCL3 e CCL5 (MADERA; HANCOCK, 2015). Já macrófagos que foram estimulados com LPS e IDR-1002 apresentaram uma expressiva redução de TNF-a e COX- 2. A atividade imunomoduladora desta biomolécula nestas células foi associada com a inibição da translocação nuclear de NF-KB através de um mecanismo que bloqueia a fosforilação da IKBO.

[0060] Nesse sentido, esta biomolécula também foi capaz de reduzir a inflamação e a infiltração de macrófagos no pulmão de camundongos infectados com Pseudomonas aeruginosa, além de diminuir significativamente a carga bacteriana alveolar (WUERTH; FALSAFI; HANCOCK, 2017; WUERTH et al., 2018).

Nanofibras

[0061] Nanofibras apresentam diâmetro entre 0,01 e 1 pm e podem ser produzidas por polímeros naturais ou sintéticos. Compostos nanofibrosos e/ou composições nanofibrosas compreendem nanofibras. Estes compostos podem ser utilizados em diversos sistemas de liberação de fármacos, como antibióticos, anti-inflamatórios, antineoplásicos, além de peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos e moléculas de reparo (AAVANI; KHORSHIDI; KARKHANEH, 2019). Ainda, nanofibras podem ser utilizadas como estruturas muco adesivas, o que contribui para seu uso na mucosa oral e facilita a inserção dos fármacos na corrente sanguínea de forma controlada (STIE et al., 2020).

[0062] As nanofibras podem ser produzidas por técnicas de eletrospinning, laserspinning, melt-spinning ou self-assembly (SOUSA et al., 2020b). Um dos métodos mais populares para a produção de nanofibras consiste no electrospinning, uma técnica simples e de baixo custo. Nesta técnica, as soluções poliméricas são inseridas em uma seringa com uma agulha de metal ao qual é conectada à uma fonte de alimentação de alta tensão. Em seguida, a solução de polímero é ejetada da agulha pela alta força do campo elétrico. Inicialmente, uma gota de líquido é formada na extremidade da agulha e cargas induzidas cobrem a superfície. O jato começa a ter instabilidade após viajar pelo ar por uma curta distância e começa a chicotear, aumentando a distância da ponta da agulha até o coletor. Este processo auxilia no afinamento da fibra e evaporação de solvente (FRENOT; CHRONAKIS, 2003). Diante dos diversos benefícios das nanofibras para o potencial nas terapias endodônticas regenerativas, esses arcabouços atuam como sistema de liberação de fármacos comumente usados na revascularização pulpar. Nanofibras incorporadas com moléculas antimicrobianas podem contribuir para a liberação destas moléculas no SCR e servir como um arcabouço para a neoformação pulpar.

Polímeros

Quitosana (Cs) e poli (álcool vinílico) (PVA)

[0063] A quitosana (CS) é um polissacarídeo linear composto por glicosamina e N-acetilglicosamina proveniente da quitina, presente na estrutura esquelética de crustáceos e insetos, além das paredes celulares de bactérias e fungos (SATITSRI; MUANPRASAT, 2020). O acesso a esse polímero é fácil e de baixo custo (CAVALLARO et al., 2021 ). Além disso, esse polímero pode apresentar propriedades antimicrobianas, imunomoduladoras, pode ser biocompatível e biodegradável, além de funcionar como um sistema de liberação de fármacos (VASCONCELOS et al„ 2013; MILLER et al„ 2018).

[0064] As características versáteis da CS a torna um interessante polímero para o desenvolvimento de biomateriais para a endodontia (ZHANG et al., 2020a). Além de servirem como sistemas de liberação de moléculas antimicrobianas, a CS também pode ser utilizada para a produção de nanopartículas antimicrobianas e imunomoduladoras para a endodontia. Uma vertente na utilização da CS para a endodontia pode ser a engenharia de tecidos (ZHANG et al., 2020a).

[0065] O PVA é um polímero sintético de baixo custo e que apresenta características biocompatíveis. Existem muitas aplicações importantes deste polímero como no sistema de liberação de fármacos, na preparação de membranas, reciclagem de polímeros e embalagens de alimentos (LIU et al., 2020). Nesse sentido, a associação de PVA e CS tem apresentado diversas vantagens, como a melhora das propriedades bioquímicas das moléculas, da degradação das biomoléculas, e redução dos custos para a produção de novos arcabouços para a engenharia de tecidos (JALVANDI et al., 2017). Assim, a associação de ambos os polímeros é vantajosa para a criação de novos arcabouços biocompatíveis e biodegradáveis com liberação controlada de fármacos e peptídeos de defesa do hospedeiro no contexto da endodontia, especialmente na terapia de revascularização pulpar.

EXEMPLOS

[0066] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Exemplo 1 Produção das nanofibras

[0067] Durante a produção de nanofibras foram testadas concentrações distintas de PVA e quitosana (CS) (baixo peso molecular, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) ou a combinação dos dois polímeros. Soluções de PVA (10%, 12,5% e 20% p/v) em água ultrapura, CS (10%p/v) em uma solução 3:1 de ácido acético e água, ou ambos os polímeros (PVA 5% e CS 5% ou PVA 7% e CS 3% p/v) foram preparados. As nanofibras foram produzidas por eletrospinning. O processo de eletrospinning foi instalado em uma configuração horizontal. Resumidamente, uma seringa de plástico (20 mL) acoplada a uma agulha de aço inoxidável foi carregada com a solução, e as nanofibras foram produzidas usando uma voltagem de 16 kV e um fluxo de 0,5 mL.lr ¹ (NE- 2000, New Era, Pump Systems Inc.). A distância de trabalho entre a ponta da agulha e o coletor foi de 12 cm e as fibras produzidas foram coletadas em folha de alumínio.

Teste de degradação

[0068] As nanofibras (1 mg) produzidas na etapa anterior foram cortadas (6 mm de diâmetro) e imersas em 1 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Life Technologies, Carlsbad, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, EUA), 5% de L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, EUA), 5% de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e 5% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, EUA). A taxa de degradação foi determinada descontando-se o peso inicial do aparato, até sua completa dissolução no meio. A partir desses dados, foi possível determinar a composição para experimentos subsequentes, com base no tempo relacionado à regeneração do tecido pulpar. Assim, nanofibras de PVA (7% p/v) e CS (3% p/v), que se degradaram em 21 dias foram escolhidas para incorporar o ciprofloxacino e o peptídeo imunomodulador IDR- 1002 (Figura 1 ). Incorporação de ciprofloxacino e I DR- 1002 às nanofibras

[0069] A combinação polimérica de PVA 7% p/v e CS 3% p/v foi escolhida para os ensaios envolvendo a incorporação de ciprofloxacino e peptídeo IDR-1002. Assim, diferentes concentrações (0,25%, 0,5% e 1% em peso) de ciprofloxacino e IDR-1002 foram testadas. A solução polimérica de quitosana (diluída em água e solução de ácido acético na proporção de 1 :3) foi associada à solução polimérica de PVA (diluída em água) e homogeneizada por 5 h a 50 °C em um agitador magnético. Após a solubilização completa, ciprofloxacino, IDR-1002 ou ambos foram adicionados à solução final de PVA / CS. O método usado para produzir nanofibras incorporadas foi o eletrospinning. O processo de eletrospinning foi estabelecido em uma configuração horizontal: uma seringa de plástico de 20 ml_ acoplada a uma agulha de aço inoxidável (BD, calibre 12) foi carregada com a solução e as nanofibras incorporadas foram produzidas usando uma tensão de 16 kV e um fluxo de 0,5 mL.lr ¹ (NE-2000, New Era, Pump Systems Inc.). A distância de trabalho entre a ponta da agulha e o coletor foi de 12 cm, e o material produzido foi coletado em folha de alumínio (Figura 2).

Atividade microbiana das nanofibras incorporadas

[0070] Os ensaios de atividade antimicrobiana foram realizados contra E. faecalis (ATCC 19433) e S. aureus (ATCC 25923). Os experimentos foram realizados de acordo com a fase logarítmica das curvas de crescimento pré- determinadas. Ambas as bactérias foram pré-inoculadas de uma colônia em 5 ml_ de meio Luria Bertani (LB, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) e incubadas até atingirem absorbância de 0,50-0,65 a 595 nm. Nesta absorbância, 1x10 ¹² CFU.mL’ ¹ foi considerado para E. faecalis e 2,9 x 10 ⁸ CFU.mL ¹ para S. aureus. Assim, os bioensaios antibacterianos foram realizados em meio LB, com 5x10 ⁴ UFC por poço. As nanofibras incorporadas foram cortadas em forma circular (aproximadamente 6 mm de diâmetro e 1 mg) e esterilizadas durante a noite em luz ultravioleta. Nove grupos experimentais foram testados: ciprofloxacino (1%, 0,5% e 0,25% em peso), IDR-1002 (1%, 0,5% e 0,25% em peso) e ciprofloxacino juntamente com IDR-1002 (1% em peso, 0,5% em peso, e 0,25% em peso de cada). Este experimento foi realizado em placas de cultura de 96 poços (Kasvi, São José dos Pinhais, Brasil) que foram incubadas a 37 °C por 24 h, 48 h, 72 h e 7 dias. Após cada tempo, 1 pL de cada grupo foi coletado e inoculado em placas de Petri com meio de ágar LB e incubado novamente a 37 °C. Após 24 h, o número de UFCs foi contado e comparado aos grupos de controle.

[0071] Observou-se que nanofibras contendo ciprofloxacino 1%, em peso, e 0,5%, em peso, apresentaram atividade bactericida contra S. aureus e E. faecalis (Tabela 1 ). No entanto, a menor concentração testada de ciprofloxacino (0,25% em peso) não afetou o crescimento de S. aureus e teve apenas um efeito bacteriostático contra E. faecalis (Tabela 1 ). Em contraste, as nanofibras contendo IDR-1002 não afetaram o crescimento de S. aureus ou E. faecalis após 24 h de incubação (Tabela 1 ). A associação de ciprofloxacino (0,5% em peso) com IDR-1002 (0,5% em peso) incorporados em nanofibras de PVA / CS não afetou seu perfil, como foi observado com as nanofibras de ciprofloxacino (Tabela 1 ). Assim, a presença de IDR-1002 não alterou a atividade bactericida da ciprofloxacino em nanofibras com 0,5% de cada molécula.

Tabela 1 - Atividade antimicrobiana de nanofibras de PVA / CS incorporadas com diferentes concentrações de ciprofloxacino, IDR-1002 ou ambos contra S. aureus (ATCCC 25923) e E. faecalis (ATCC 19433).

Atividade antibiofilme

[0072] Em relação ao ensaio anti-biofilme, as bactérias foram pré-inoculadas de uma colônia em 5 ml_ de meio Brain Heart Infusion BHI (para E. faecalis) e caldo tríptico de soja TSB suplementado com glicose a 1% (para S. aureus). 24h mais tarde, as bactérias (1 ml_, 0,1 OD) foram semeadas nos discos de hidroxiapatita em uma placa de 24 poços. As placas foram então incubadas em condições anaeróbias a 37 °C, por 7 dias (E. faecalis) e em condições aeróbias por 2 dias (S. aureus). Após o crescimento do biofilme nos discos de hidroxiapatita, nanofibras (6 mm de diâmetro e 1 mg) incorporadas com ciprofloxacino, IDR-1002 ou ambos foram suavemente colocados sobre os biofilmes. Todos os grupos foram tratados com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC, Sigma Aldrich, Vancouver, Canadá) (0,05% por poço) para determinar a viabilidade celular dos biofilmes tratados. Após 24 h, as nanofibras foram cuidadosamente removidas e os discos irrigados com PBS, sendo então transferidos para outra placa, onde foram tratados com metanol (100%) para remoção do TTC por 30 min (com agitação a 100 rpm). O sobrenadante celular foi então transferido para uma placa de 96 poços. O metabolismo celular com base no TTC foi determinado usando uma leitura de 500 nm.

[0073] Discos de hidroxiapatita foram usados para simular as paredes de dentina, que são o principal alvo da formação de biofilme no sistema de canais radiculares. Assim, observou-se que após 24 h de incubação, nanofibras de ciprofloxacino-IDR1002 (redução de 48%) (p <0,01) foram capazes de erradicar biofilme de S. aureus significativamente. Em relação a E. faecalis, apenas nanofibras contendo ciprofloxacino e IDR-1002 foram capazes de erradicar o biofilme desse microrganismo (80% de redução) (p <0,05, p <0,01 ). Embora o IDR-1002 seja minimamente liberado de nanofibras de PVA / CS incorporadas, ele apresentou atividade antimicrobiana e antibiofilme por contato direto. [0074] O papel das nanofibras incorporadas no biofilme oral humano multiespécies também foi avaliado. O biofilme oral humano é composto por centenas de espécies microbianas, que envolvem bactérias e fungos Gram- positivos, Gram-negativos. Para simular essa situação in vitro, este experimento foi realizado em condições anaeróbias e em discos de hidroxiapatita, o que aproxima o modelo experimental do que ocorre clinicamente no sistema de canais radiculares. Os resultados por microscopia confocal também permitiram uma melhor avaliação das estruturas do biofilme formadas e erradicadas. Assim, as nanofibras de controle (não incorporadas) apresentaram atividade antibiofilme leve (redução de 18%) (p <0,01 ). Nanofibras contendo ciprofloxacino e IDR-1002 erradicaram 78% (p <0,001 ) do biofilme oral (Figuras 3 e 4).

Perfil de liberação de ciprofloxacino e I DP- 1002

[0075] O perfil de liberação in vitro do ciprofloxacino e IDR-1002 foi avaliado pelo método de eluição. Nanofibras incorporadas de 6 mm (1 mg) foram cortadas e colocadas em tubos Eppendorf de 2 ml_ com 400 pL de água ou solução de PBS. Os tubos foram incubados a 37 °C por 24, 48, 72 h, 7 dias, 14 dias e 21 dias. Em seguida, foi coletado o eluente de cada tempo experimental. As concentrações de ciprofloxacino e IDR-1002 foram determinadas com base em uma curva padrão (10-500 pg) em cromatografia líquida de alto desempenho (coluna C18 Shimadzu, taxa de injeção de 0,6 mL.min’ ¹ e método isocrático com 20% de acetonitrila).

[0076] Em relação às nanofibras incorporadas com ciprofloxacino-IDR1002, ambas as moléculas foram liberadas (79,5% da ciprofloxacino e 40,2% da IDR- 1002) em água e PBS. No PBS, 83,7% da ciprofloxacino foi liberado dessas estruturas em até 2 dias, enquanto o IDR-1002 permaneceu associado às estruturas de nanofibras, mesmo após 21 dias (0,8% de liberação). Esses resultados confirmam que a atividade antimicrobiana contra células planctônicas foi associada à ciprofloxacino, pois embora o peptídeo esteja presente em superfícies de nanofibras incorporadas, ele não é liberado para interagir com bactérias em meio aquoso. A grande quantidade de ciprofloxacino liberada rapidamente pode estar relacionada a mudanças no caráter da ligação de hidrogênio e na microestrutura dentro do arcabouço. Além disso, a quitosana permite a liberação lenta e linear de AMPs, o que pode explicar as baixas taxas de IDR-1002 liberadas das nanofibras de PVA / CS (Figura 5).

Caracterização das nanofibras

[0077] As características morfológicas e o diâmetro das nanofibras incorporadas ou de controle (não incorporada) foram avaliados por microscopia eletrônica de varredura (Fesem, ULTRA 55, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). As nanofibras incorporadas ou não foram fixadas com fita condutora de carbono de dupla face e revestidas com uma fina camada de ouro (20 nm) usando Sputter Coat Emitech K550. As imagens geradas foram capturadas e o diâmetro da nanofibra e a área dos poros foram determinados usando a Image J Tool for Windows, versão 3.0.

[0078] O seu tamanho, formato e área de poro das nanofibras de PVA/CS incorporadas ou de controle foram determinados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). O tamanho do diâmetro das nanofibras e a área dos poros são parâmetros importantes que podem influenciar suas atividades biológicas. Observou-se que a maioria das nanofibras controle possuía diâmetro entre 250 e 450 nm e áreas de poro entre 5 e 25 pm ² . Observou-se também que as nanofibras contendo ciprofloxacino e IDR-1002 apresentam diâmetros menores (a maioria entre 100 e 250 nm) e área de poros semelhante (entre 5 e 50 pm ² ) (Figura 6).

Biocompatibilidade das nanofibras

[0079] O contato direto das nanofibras, incorporadas ou controle (não incorporadas), com as diferentes células presentes no ambiente de revascularização pulpar foi realizado por meio da fixação das nanofibras incorporadas ou controle, em placas de poços com gelatina suína (1 ,5%) (Sigma Aldrich). O teste de biocompatibilidade foi realizado contra diferentes células humanas, como fibroblastos humanos (Hfib), células da papila dentária humana, células mononucleares do sangue periférico humano (CMSPHs) e eritrócitos humanos. Hifb e da papila apical humana foram incubadas com meio DMEM suplementado e CMSPHs foram incubadas com meio RPMI do Roswell Park Memorial Institute suplementado. De acordo com os parâmetros da ISO 10933-5, foram utilizadas 1x10 ⁴ células (para Hfib e células da papila apical) e 1x10 ⁵ células por poço. O ensaio de MTT foi usado para avaliar a viabilidade celular de Hfib e células da papila apical. Um total de 1x10 ⁵ CMSPHs foram usadas para testar a citotoxicidade das nanofibras incorporadas ou controle. Um ensaio de citotoxicidade em células CMSPHs foi realizado medindo a liberação da enzima lactato desidrogenase, LDH, após 24h de incubação. O ensaio hemolítico foi realizado em eritrócitos humanos. Observou-se que nenhum dos grupos experimentais reduziu significativamente a viabilidade celular após 24 horas de incubação. Para determinar a citotoxicidade das nanofibras em células mononucleares do sangue periférico mediu-se a produção de LDH. Os resultados revelaram que, novamente, nenhum dos grupos de nanofibras era tóxico. Além disso, as nanofibras tanto incorporadas quanto controle, não apresentaram potencial hemolítico para eritrócitos humanos (Figura 7).

Atividade imunomoduladora das nanofibras

[0080] O remanescente antigênico de microrganismos que persiste no sistema de canais radiculares mesmo após o uso de substâncias antimicrobianas pode estimular a produção de citocinas e mediadores que regulam o papel de diferenciação das células-tronco em tecidos especializados. As citocinas pró- inflamatórias tendem a desencorajar a formação de um tecido semelhante a polpa. Portanto, mimetizou-se um sistema de infecção in vitro, relacionando contato direto com células imunes humanas (CMSPHs), LPS (representando bactérias Gram-negativas) e LTA (mimetizando bactérias Gram-positivas).

[0081] As nanofibras incorporadas foram fixadas no fundo das placas de 96 poços com gelatina suína, para garantir seu contato direto com as CMSPHs. Após 24 h de incubação, o sobrenadante das culturas estimuladas foi coletado e armazenado a -80 e -70 °C até o dia do experimento. Como os processos de infecção endodôntica são polimicrobianos, CMSPHs foram estimulados com LPS (Pseudomonas aeruginosa, Sigma Aldrich) e LTA (S. aureus, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA), mimetizando uma infecção in vitro. As citocinas envolvidas com a atividade pró-inflamatória (IL-113, IL-6 e TNF-a) ou atividade anti-inflamatória e reparo tecidual (IL-10 e TGF-[3) foram medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA, eBiosciences e Invitrogen, Vancouver, Canadá).

[0082] Observou-se que apenas nanofibras ciprofloxacino-IDR-1002 isoladas não estimularam citocinas pró-inflamatórias (IL-113, IL-6 e TNF-a) na ausência de estímulos LPS e LTA (p <0,05, p <0,01 ). Além disso, as nanofibras ciprofloxacino-IDR-1002 regularam negativamente as citocinas pró- inflamatórias (IL-1 [3, IL-6 e TNF-a) na presença de LPS e LTA (p <0,05, p <0,01 ). Curiosamente, nanofibras de IDR-1002 ou nanofibras de ciprofloxacino- IDR 1002 regularam positivamente a citocina anti-inflamatória IL-10 apenas na presença de LPS e LTA (p <0,01 ). Isso sugere que as nanofibras ciprofloxacino-IDR1002 estão envolvidas com uma atividade imunomoduladora que poderia favorecer a formação de tecidos, especialmente a regulação negativa de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 [3, IL-6 e TNF-a) e a regulação positiva de citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-[3) na presença de LPS e LTA. A quitosana pode modular o sistema imunológico, explicando o perfil diferente das moléculas livres (não incorporadas em nanofibras) de ciprofloxacino e IDR-1002 em comparação com as nanoestruturadas.

Nanofibras interagem fisicamente com SC A Ps in vitro e estimulam a formação de tecido conjuntivo frouxo in vivo

[0083] Os fragmentos unirradiculares de dentes examinados foram desinfetados com hipoclorito de sódio 6% e mantidos em hipoclorito de sódio 1 ,5% até o uso. Os fragmentos dentais foram cortados e padronizados em 5 mm longitudinalmente. Um forame de 1 ,5 mm foi construído com uma broca diamantada 1014. Uma parte da nanofibra incorporadas ou de controle (não incorporadas) foi lacrada com MTA (Dentsply, Tulsa, EUA) e a outra parte foi deixada aberta. Os fragmentos dentais foram tratados com EDTA 17% (Dentsply, Tulsa. USA) antes do uso e preenchidos com nanofibras incorporadas ou de controle pré-fabricadas. As nanofibras incorporadas ou de controle foram cortadas (3 mm de largura x 5 mm de altura), modeladas manualmente em uma estrutura 3D e inseridas nos fragmentos dentais.

[0084] Os fragmentos dentais foram fixados nas placas de 24 poços com 1 ,5 ml_ de gelatina suína e bovina a 20% (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA). As células-tronco RP89 da papila apical (SCAP) foram cultivadas em meio a-MEM (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, EUA), contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco) 100 lU.mL’ ¹ de penicilina (Invitrogen) 100 pg.mL’ ¹ de estreptomicina (Invitrogen) e 2 mmol.L’ ¹ de L-glutamina (Invitrogen). As células foram ressuspensas em meio gelatinoso (1 ,5% de gelatina suína) para construir um ambiente 3D envolvendo nanofibras. 10 ⁵ células foram usadas dentro de cada sistema de canal radicular artificial. Essas células foram cultivadas no modelo 3D in vitro com as nanofibras incorporadas ou de controle por 3 dias e levadas para o teste in vivo. Para avaliar a interação entre nanofibras incorporadas ou de controle e SCAPs, fragmentos contendo nanofibras de controle e nanofibras com ciprofloxacino e IDR-1002 foram escolhidos para microscopia. Os fragmentos foram fixados com glutaraldeído 2,5% e desidratados com álcool (de 15 a 100%). Os fragmentos foram analisados por microscopia eletrônica de varredura (Fesem, Ultra 55, Zeiss). As nanofibras incorporadas ou de controle foram modeladas para se adaptarem aos canais radiculares e cultivadas in vitro com células-tronco da papila apical e gelatina (representando a formação de fibrina durante a coagulação do sangue). Foi observado que os SCAPs podem aderir às superfícies das nanofibras em nanofibras controle e nanofibras ciprofloxacino-IDR 1002. Também foi possível observar que as extensões celulares envolveram as nanofibras incorporadas ou de controle, criando um complexo favorável para a formação de novo tecido pulpar. Um teste in vivo foi realizado após 3 meses:

[0085] Fragmentos vazios e fragmentos contendo apenas células foram usados como controles. Notou-se que a presença de um arcabouço era crítica para a formação do tecido. Culturas contendo apenas SCAPs não formaram tecido conjuntivo dentro dos fragmentos de raiz. Em contraste, todos os grupos contendo nanofibras controle (não incorporadas), nanofibras ciprofloxacino, nanofibras IDR-1002 e nanofibras ciprofloxacino-IDR-1002 formaram um tecido conjuntivo dentro dos fragmentos. As nanofibras de controle estimularam o tecido fibroso organizado e o tecido conjuntivo frouxo. Em relação às nanofibras IDR-1002 e nanofibras ciprofloxacino-IDR-1002, ambas estimularam o tecido conjuntivo frouxo. Esses arcabouços foram capazes de estimular a formação de tecidos ricos em vasos sanguíneos. Além disso, não houve infiltração inflamatória no tecido pulpar formado pelas nanofibras de ciprofloxacino-IDR-1002.

[0086] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes e alternativas, abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.