Composition pour application phvtopharmaceutique pour stimuler les défenses naturelles des plantes

La présente invention a pour objet des compositions pour application phytopharmaceutique destinées à stimuler les défenses naturelles des plantes, notamment de la Vigne. En particulier, l'invention a pour objet des compositions contenant des oligosaccharides sécrétés par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.

Tout au long de leur développement, les plantes sont soumises à des agressions continuelles de la part de leur environnement. Cependant, elles se montrent souvent capables de résister naturellement à ces agressions extérieures grâce à la présence ou à l'activation de mécanismes de défense (Hammond- Kosack et Jones, 1996). Ainsi, bien que certains de ces mécanismes soient constitutifs et fournissent une barrière physique et chimique à une agression, d'autres ne sont induits qu'après une attaque par un nuisible.

Dès qu'une plante détecte un pathogène, elle met en place un des systèmes de défense naturelle les plus efficaces : la réponse d'hypersensibilité. Au niveau du site de pénétration du pathogène, cette réaction, rapide et violente, se traduit par la mort des premières cellules infectées et l'apparition d'une petite zone nécrotique, isolant ainsi les cellules attaquées du reste de la plante (Dangl et al., 1996 ; Lamb et Dixon, 1997). Le déclenchement de cette réponse dépend d'une reconnaissance spécifique de l'agent pathogène par la plante hôte. En effet, la plante attaquée reconnaît par l'intermédiaire d'une protéine (récepteur) des molécules produites par le pathogène, nommées éliciteurs. Chez la plante, les gènes codant pour les protéines réceptrices sont appelés gènes de résistance (gènes R), et pour le pathogène, les gènes codant pour les molécules élicitrices sont nommés gènes d'avirulence (gène Avr) : on parle alors ici d'une relation gène pour gène ou relation R-Avr (Hammond-Kosack, 1996). D'autres molécules,

qualifiées d'éliciteurs généraux, sont également capables d'initier (de façon moins spécifique que les éliciteurs cités précédemment) une réaction de défense de la plante hôte. Celles-ci sont le plus souvent des oligosaccharides libérés par le pathogène (éliciteurs exogènes) ou la cellule végétale (éliciteurs endogènes) (Scheel et Parker, 1996).

Ces oligosaccharides se décomposent en 4 classes : oligoglucanes, oligochitine et oligochitosane d'origine fongique ; et oligogalacturonides d'origine végétale. Les oligoglucanes sont composés de résidus β-glucose liés en 3-, 6- et 3,6-. La chitine est un polymère linéaire de résidus N-acétyl- β - glucosamine liés en 4-, qui représente le constituant majeur de la paroi du mycélium des champignons ; le chitosane est formé des mêmes résidus désacétylés. Les oligogalacturonides sont libérés par la dégradation des composés pectiques de la paroi des cellules végétales (homogalacturonanes) suite à l'attaque du pathogène ; ils sont composés de résidus d'acide α-galacturonique liés en 4-. Les oligosaccharides doivent le plus souvent être composés d'un nombre de résidus compris entre 4 et 15, pour avoir une action élicitrice (Côté et al., 1994).

Cette réaction de défense intense est ensuite suivie par la mise en place de mécanismes de défense dans les cellules voisines de la zone infectée, impliquant la diffusion d'un signal, c'est la réaction locale. Enfin, il y a émission de divers signaux d'alerte vers tous les autres organes de la plante, ce qui permet à la plante de réagir plus rapidement et plus efficacement lors d'une nouvelle agression, on parle alors de réaction systémique.

Lors de ces réactions, trois catégories de systèmes de défense peuvent être activés : - la formation d'un épiderme de cicatrisation et le renforcement des parois

(lignification...) (Dai et al, 1995) ;

- la synthèse de protéines de défense ou «Pathogenesis Related» (PR) protéines découvertes en 1970 chez le Tabac. Parmi ces protéines PR on trouve, par exemple, des inhibiteurs de protéase (Ryan, 1992), des enzymes hydrolytiques, comme les chitinases ou les β-1,3 glucanases (Derckel et al., 1996 ;

Robinson et al., 1997, Kraeva et al, 1998 ; Salzman et al, 1998 ; Renault et al, 2000) ;

- et la synthèse de métabolites secondaires de type phytoalexines. Parmi les métabolites secondaires, plus de 300 phytoalexines ont déjà été caractérisées. Elles appartiennent à un large spectre de classes chimiques différentes parmi lesquelles on pourra citer les coumarines, les benzofuranes, les terpènes, les alcaloïdes, et certains polyphénols (Smith, 1996).

La mise en place des réactions de défense des plantes implique toute une panoplie de signaux de transduction conduisant à l'induction rapide de l'expression de gènes de défense. Ainsi, la reconnaissance du pathogène par la plante hôte va activer toute une cascade de signaux dans les cellules attaquées tels que la phosphorylation de protéines par des protéines kinases, les flux d'espèces ioniques (Ca ⁺ ), la formation d'espèces oxygénées réactives (Coté et Hahn, 1994 ; Shibuya et al, 1996 ; Benhamou, 1996). De plus, les cellules attaquées sont capables de produire des signaux d'alarme transmis aux cellules voisines (réaction locale) ainsi qu'à toute la plante engendrant ainsi, comme énoncé dans le paragraphe précédent, le phénomène de réaction systémique.

Le mécanisme de résistance systémique le plus étudié est le phénomène de SAR ou «systemic acquired résistance». Le terme de SAR a été défini par Ross en 1961. Il décrit l'apparition de résistance d'une plante consécutive à une attaque par un pathogène, aussi bien dans les parties infectées que dans les parties saines de la plante. Elle se développe, en général, après l'apparition de lésions nécrotiques autour du site d'inoculation. Cette réponse d'hypersensibilité localisée restreint le pathogène dans, et autour du site d'infection, et semble rendre la plante plus résistante aux agressions par divers organismes (Ryals et al., 1996). C'est en 1966 que Ross a développé l'idée de l'existence de molécules signal qui, à de faibles concentrations, seraient capables d'activer des mécanismes de défense dans les tissus distants de la zone infectée.

Trois types de molécules peuvent intervenir chez les plantes comme signal d'alarme aux niveaux intra et intercellulaire, à courte ou longue distance : l'acide salicylique, l'éthylène et les jasmonates.

Chez la Vigne, les mécanismes de signalisation impliqués dans l'expression des réactions de défense ne sont pas encore bien connus. Cependant, on retrouve la synthèse des trois types de molécules de défense (lignine, protéines de défense et phytoalexines). En particulier, le rôle de phytoalexines est notamment tenu par une famille de composés originaux : les polyphénols (Deloire et al, 2000).

Présents en plus ou moins grandes quantités dans tous les organes de la plante, les phytoalexines sont inductibles au niveau des feuilles et des baies. Ce type d'induction est désigné sous le terme d'élicitation.

Les facteurs d'élicitation (ou éliciteurs) peuvent avoir des origines différentes. Il peut s'agir :

- d'élicitation biotique, par exemple lors d'une agression par un pathogène comme Botrytis cinerea, agent de la Pourriture grise (Jeandet et al, 1995 ;

Bavaresco et al., 1997), Plasmopara viticola, agent du Mildiou (Dercks et Creasy, 1989) ou Phomopsis viticola, responsable de l'Excoriose (Hoos et Blaich, 1990).

- d'élicitation abiotique par les facteurs environnementaux tels que U.V., température, lumière, asphyxie (Jeandet et al, 1997 ; Langcake et Pryce, 1977b ; Douillet-Breuil et al, 1999), le chlorure d'aluminium (Adrian et al., 1996) ou l'ozone (Sarig et al, 1996).

Lors d'une élicitation, des polyphénols et notamment des stilbènes comme le trαns-resvératrol, le tr ans -picéide, l'ε-viniférine, la δ-viniferine et le ptérostilbène, peuvent être induits au niveau des feuilles et des baies (Soleas et al, 1997 ; Jeandet et al, 2004). Cette propriété de biosynthèse de novo de stilbènes en réponse à un stress, et en particulier après attaque par un pathogène, suggère que ces molécules pourraient jouer le rôle de moyen de défense naturelle des plantes.

Ce rôle de molécules de défense est corroboré par certaines études qui semblent indiquer une corrélation étroite entre le niveau de résistance naturelle de la plante et son aptitude à synthétiser ces molécules. Par exemple, Langcake et

Mc Carthy (1979) ont mis en évidence une relation entre la résistance de certaines espèces du genre Vitis à Botrytis cinerea ou Plasmopara viticola et leur capacité de biosynthèse de stilbènes (resvératrol et viniférines). De plus, Dercks et Creasy (1989) ont montré que les espèces résistantes à Plasmopara viticola produisent cinq fois plus de phytoalexines que les espèces sensibles. De même, à l'intérieur de l'espèce vinifera, on trouve des cépages plus ou moins tolérants à l'attaque par des champignons selon leur capacité de production de phytoalexines.

Il est également intéressant de noter chez d'autres plantes, l'acquisition de résistance à certaines maladies fongiques rendue possible après introduction du gène codant pour la stilbène synthase. Ainsi, des plants de Luzerne (Medicago sativa L.) transformés avec le gène de la stilbène synthase d'Arachide (Arachis hypogae) présentent une résistance à l'infection par Phoma medicaginis qui est corrélée à l'apparition de picéides au niveau des feuilles (Hipskind et Palva, 2000). De même, des plants de Tabac, de Tomate ou de Riz transgéniques ayant incorporé un gène codant pour la stilbène synthase de Vigne sont moins sensibles à l'infection par Botrytis cinerea, Phytophtora infestans et Pyricularia oryza, respectivement (Thomzick et al., 1997; Stark-Lorenzen et al., 1997; Hain et al., 1993 ).

Plus récemment, Coutos-Thévenot et al. (2002) ont obtenu des plants de Vigne transformés par le gène de la stilbène synthase (Vstl) placé sous l'influence d'un promoteur inductible. Dans ces plantes, l'accumulation de trans-rQsvératrol est très nettement augmentée (d'un facteur 200) et ces Vignes transgéniques présentent une très grande résistance à Botrytis cinerea.

On connaît par le document FR 2836011 un procédé pour la stimulation des défenses naturelles des plantes qui comprend l'application auxdites plantes d'un agent éliciteur ou sensibilisateur qui est capable au contact des plantes de provoquer préventivement dans celles-ci l'activation des gènes de défense sur le site d'application du produit. Ce procédé utilise une quantité efficace d'un oligo β 1-3 glucane, préparée à partir de bactéries, d'algues ou de céréales. Cependant ces oligosaccharides possèdent 20 à 33 unités osidiques, ce qui limite leur pénétration au niveau des feuilles. D'autre part, ils sont extraits à partir

d'algues marines, ce qui est une source épuisable, et pouvant contenir des résidus de pollution marine. De plus, ils sont modifiés chimiquement par sulfatation.

Les inventeurs ont développé une technologie innovante et maîtrisée, garantissant la qualité et l'authenticité des produits. Il s'agit de la mise en culture de champignons en grands volumes, répondant aux besoins de l'industrie, notamment :

L'absence de solvant et de résidus, - L'homogénéité des substrats, La production continue, - L'absence totale de polluants,

La production standardisée et reproductible quant à la qualité et la concentration des métabolites.

De manière tout à fait surprenante, les inventeurs de la présente demande ont découvert que l'on pouvait directement incorporer le filtrat de culture, après autoclavage, dans une composition phytopharmaceutique. Ce procédé présente notamment l'avantage d'apporter une alternative utile et innovante aux extractions conventionnelles par solvants et d'éviter ainsi de produire des effets toxiques sur la plante. Dans le cas d'une extraction à l'éthanol, comme présenté à l'exemple 1, les inconvénients sont minimes car il s'agit d'un solvant naturel, produit classiquement par des levures à partir du glucose et que l'on retrouve dans le vin ou la bière. Le but de la présente invention est de proposer un procédé alternatif à l'emploi de produits chimiques et respectant ainsi l'environnement et le consommateur. De plus, l'élicitation des défenses naturelles des plantes permet de limiter la dose et le nombre de traitements Un autre aspect de l'invention se situe au niveau du mode d'action qui est préventif. En effet, cette nouvelle classe d'éliciteurs permet de simuler une attaque de pathogènes au niveau des cellules de la plante. Ces dernières vont enclencher un mécanisme naturel de défense qui va provoquer une réaction d'hypersensibilité mais aussi une résistance systémique acquise, et ce au moins une fois, ce qui permettra de prévenir encore plus efficacement l'attaque ultérieure. De très faibles quantités d'éliciteurs suffisent pour sensibiliser la

membrane cytoplasmique. Ainsi, le seuil de détection des éliciteurs par les plantes peut atteindre une valeur de 10 ^~9 Molaire ou même inférieure.

Un premier aspect de la présente invention concerne une composition pour application phytopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un oligosaccharide sécrété par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.

Par composition phytopharmaceutique on entend désigner selon la présente invention toute composition qui a trait à la protection des plantes ou des produits récoltés. Par oligosaccharides on entend désigner selon la présente invention des substances formées de plusieurs molécules d'osés (majoritairement de 4 à 15) liées par des liaisons osidiques.

Par champignon, on entend désigner selon la présente invention toutes les espèces de champignons connues. De manière préférée, le champignon est choisi parmi Botrytis cinerea, Phomopsis viticola et Eutypa lata et leurs mélanges

Bien entendu les principes actifs utilisables dans la composition selon l'invention peuvent provenir de mélanges de cultures de champignons obtenus à partir de genres différents.

Selon la présente invention, le principe actif peut être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par récupération du milieu de culture et du mycélium, sans séparation. Toute la culture, c'est-à-dire le milieu de culture et le mycélium, est alors utilisé pour obtenir le principe actif.

En outre, le principe actif selon l'invention peut également être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par séparation du milieu de culture d'avec le mycélium.

Le principe actif est alors obtenu soit à partir du milieu de culture, soit à partir du mycélium.

Dans le premier cas, le plus simple pour une exploitation industrielle, le principe actif est constitué d'une fraction acellulaire du milieu de culture. Par fraction acellulaire, on entend désigner une fraction sans cellules entières, mais

pouvant contenir des fragments de cellules ainsi que des molécules initialement présentes dans le corps cellulaire.

Ce milieu de culture peut être éventuellement purifié, la purification étant effectuée par précipitation d'un filtrat aqueux du milieu de culture par un solvant, de préférence de l'alcool.

Dans le deuxième cas, le principe actif est obtenu par extraction et lyse des cellules du mycélium.

Ainsi, par exemple, un procédé d'obtention d'un extrait de champignon caractérisé en ce que l'extrait de champignon est un filtrat de culture et/ou une préparation de mycélium comprend les étapes suivantes : a) mise en culture du champignon en milieu liquide pendant 3 à 28 jours b) séparation du filtrat de culture et du mycélium c) récupération du filtrat de culture obtenu à l'étape b) et, optionnellement, autoclavage de ce filtrat de culture et/ou d) récupération du mycélium obtenu à l'étape b) et élaboration d'une préparation de mycélium.

Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du milieu de culture, le procédé ne comprend pas l'étape d) mais peut comprendre de manière optionnelle les étapes suivantes :

• après l'étape c), une étape e) d'isolement d'une fraction polysaccharidique à partir du filtrat de culture obtenu à l'étape c). Cette étape e) peut se faire par précipitation à l'éthanol.

• une étape f) de lyophilisation de la fraction polysaccharidique isolée à l'étape e).

• la fraction polysaccharidique qui est obtenue à l'étape e), et éventuellement lyophilisée à l'étape f), est redissoute dans de l'eau puis optionnellement autoclavée afin d'obtenir une solution comprenant des fragments oligosaccharidiques.

Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du mycélium, le procédé ne comprend pas l'étape c) et l'élaboration de la préparation de mycélium à l'étape d) consiste en une extraction aqueuse, une hydrolyse acide, une hydrolyse enzymatique et/ou un autoclavage à partir du mycélium récupéré à l'étape d).

Dans le cas où le principe actif est obtenu à partir du mycélium et du milieu de culture, le procédé comprend les étapes c) et d) ainsi qu'éventuellement les étapes optionnelles mentionnées.

Les cultures de champignons in vitro utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode connue de l'art antérieur. Notamment les cultures de champignons peuvent être réalisées dans un milieu de culture liquide, dans des fioles Erlenmeyer ou en bioréacteurs, en particulier en fermenteurs.

Par milieu de culture on entend désigner selon la présente invention tout milieu de culture généralement connu de l'homme du métier. De tels milieux peuvent être solides, liquides ou semi-solides. De manière préférée, le milieu de culture est un milieu liquide.

On peut citer comme milieu de culture solide le Malt-Agar à 2% et le milieu Potato Dextrose Agar, et comme milieu de culture liquide le milieu Czapek-Dox

De plus, la composition selon la présente invention peut être autoclavée. De manière préférée, le principe actif de la composition selon la présente invention est sous forme liquide.

Selon la présente invention, la composition se présente sous la forme d'une solution, d'un concentré, ou d'une poudre lyophilisée.

Selon la présente invention, la composition est utilisée à titre préventif ou curatif.

Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la composition selon la présente invention pour stimuler les réactions de défense naturelle des plantes vis-à-vis d'une agression présente ou à venir.

Selon la présente invention, l'agression est une attaque par un pathogène, de préférence un champignon. De manière préférée, le champignon est Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa lata, Erisyphe necator (anciennement

dénommée Uncinula necator), Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora sp. ou en particulier Phyhophtora infestans ou Phytophtora parasitica .

Selon la présente invention, les réactions de défense naturelle des plantes sont la production par les feuilles et/ou les fruits de molécules de défense telles que les phytoalexines, comme par exemple les polyphénols de la Vigne, particulièrement les stilbènes, plus particulièrement les trans- et czs-picéides, leurs aglycones (les trans- et czs-resvératrol), le ptérostilbène ou les oligomères comme les ε- et δ- viniférines. De plus, l'expression de certains gènes est nettement augmentée, comme ceux codant la stilbène synthase, des glucanases et chitinases.

Selon la présente invention, les plantes sont choisies parmi la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, le tabac et les plantes ornementales. De manière préférée la plante choisie est la Vigne, la tomate ou la pomme de terre.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes pour la stimulation des défenses naturelles aux agents pathogènes des plantes, caractérisé en ce que l'on applique notamment aux feuilles ou aux fruits ou aux semences ou aux graines, de préférence les feuilles, une quantité efficace d'une composition selon la présente invention.

Dans le procédé selon la présente invention, les plantes suivantes sont traitées: la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales, les oléagineux, les protéagineux, le tabac, les plantes ornementales, de préférence la Vigne, la tomate ou la pomme de terre. Dans le procédé selon la présente invention, on traite des plantes pour lutter contre des pathogènes, de préférence des champignons, de préférence encore Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora infestans ou Phytophtora parasitica . De préférence on traite des plantes pour lutter contre les mildious et les oïdiums.

De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention permet de traiter la Vigne contre Uncinula necator (responsable de l'oïdium) et Plasmopara viticola (responsable du mildiou), et de traiter la tomate et la pomme de terre contre Phytophtora sp. (responsable du mildiou). Le procédé selon la présente invention permet de prévenir ou traiter des maladies de plantes telles que la pourriture grise, les oïdiums, les mildious, l'excoriose, Black-rot, l'Eutypiose, les tavelures des arbres fruitiers, la cloque du pêcher, les septorioses, les rouilles, les charbons, les caries, l'anthracnose, la pourriture du collet ou l'Esca. De manière préférée ces maladies sont la pourriture grise, les oïdiums, les mildious. De manière encore plus préférée ces maladies sont le mildiou et l'oïdium de la Vigne ou le mildiou de la tomate et de la pomme de terre.

La liste ci-dessous reprend les principales maladies (numérotées de 1 à 11), ainsi que les champignons responsables (en italique) et les plantes touchées (entre parenthèses), pour lesquelles le procédé selon la présente invention permettrait un traitement ou une prévention :

1 - Oïdiums

Erysiphe necator = Uncinula necator (Vigne) Erysiphe graminis (céréales) Podosphera leucotricha (arboriculture, fruitiers) Sphaerotheca pannosa (Rosiers)

2 - Mildious

Plasmopara viticola (Vigne) Plasmopara helianthi (Tournesol)

Phytophthora infestans (Pomme de terre) Phytophthora parasitica (Tomate)

3- Tavelures des arbres fruitiers Venturia inaequalis (pommier) Venturia pirina (poirier)

4- Cloque du pêcher

Taphrina deformans

5- Septorioses

Septoria nodorum et Septoria tritici (Céréales) Septoria sp. (colza)

6- Rouilles Puccinia graminis , Puccinia recondita et Puccinia striiformis (Céréales)

7- Charbons

Ustaligo tritici (Blé) Ustaligo maydis (Maïs) Ustaligo hordei (Orge)

8- Caries

Tilletia tritici, Tilletia caries et Tilletia foetida (Céréales)

9- Pourriture du collet

Phoma lingam (Crucifères, Colza) Rhizoetonia solani (Pomme de terre) Sclerotinia sclerotiorum (tomate)

10- Anthracnose

Colletotrichum gloeosporioides (Pois) Colletotrichum lindemuthianum (haricot)

11- Pourriture grise Botrytis cinerea (Vigne)

Dans la pratique, on traite les plantes dont il s'agit de stimuler les défenses naturelles soit lors d'une attaque par un agent pathogène soit en vue d'une attaque future, à l'aide d'une composition, notamment d'une solution aqueuse qui doit être appliquée sur les feuilles, les fruits ou sur les semences et qui comprend, outre les véhicules et constituants classiques de ce genre de composition, un ou plusieurs oligosaccharides de parois de champignons tels que définis plus haut, présents à des concentrations qui dépendent du résultat recherché, c'est-à-dire une stimulation immédiate ou une potentialisation des défenses. Le traitement est généralement réalisé à partir des premiers stades végétatifs de la plante éventuellement en plusieurs applications successives avantageusement par pulvérisation.

Le moment précis de la ou des applications sera choisi notamment en fonction de la plante traitée. Le véhicule vecteur est généralement l'eau. Il est toutefois possible d'avoir recours, en lieu et place de l'eau, à un vecteur choisi dans le groupe comprenant les huiles végétales, les agents tensio-actifs, les solvants, des agents dispersants et/ou des charges solides.

La présente invention sera maintenant décrite plus en détail à l'aide des exemples et compositions suivants, qui illustrent l'invention sans en limiter aucunement le cadre.

Légende des figures

Figure 1 : Teneur en stilbènes dans les feuilles de plantes (Vigne) traitées par l'éliciteur F241.

Figure 2 : Efficacité sur le Mildiou de la Vigne du produit F241 testé à deux doses. Contamination 2 jours après le traitement et observation sur les feuilles traitées.

Figure 3 : Accumulation des ARNm des gènes codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse des stilbènes (A) et des PR-protéines (B et C) dans les feuilles des plantes (Vitis vinifera) traitées par l'éliciteur F241.

Figure 4 : Efficacité sur le Mildiou de la Tomate et de la Pomme de Terre du produit F241 à la dose 25%. Contamination 2 jours après le traitement et observation de l'infestation sur les feuilles traitées 7 jours après la contamination.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé de production de nouveaux éliciteurs.

Etape 1 : Préparation des cultures de champignons La première étape pour le développement de cultures de champignons in vitro consiste à sélectionner l'espèce produisant les substances recherchées. On admet aujourd'hui qu'au sein d'une même espèce, il existe une variabilité des capacités de production d'un métabolite donné, en partie d'origine génétique. Lorsque cela est possible, il faudra donc exploiter cette variabilité en sélectionnant le meilleur génotype, c'est-à-dire le plus productif pour le métabolite recherché.

La souche de champignon sélectionnée (Botrytis cinerea par exemple) est cultivée sur milieu solide (Malt-agar à 2%) pendant 10 jours à 23 ± 2°C avec une photopériode (16h jour/8h d'obscurité) jusqu'à l'obtention de conidies. Les conidies sont ensuite mises en suspension dans de l'eau à 0,05% de tween 20. Des aliquots de cette suspension conidienne sont ajoutés au milieu de culture Czapek- Dox modifié (3 g/L NaNO ₃ , 3 g/L KH ₂ PO ₄ , 0,5 g/L KCl, 0,5 g/L MgSO ₄ , 0,01 g/L FeSO ₄ , 5 g/L d'acide tartrique, 20 à 50 g/L de D-glucose ou de saccharose, pH ajusté à 3,2 par KOH) préalablement stérilisé par autoclavage, à la concentration finale de 2, 5.10 ⁴ conidies/ml de milieu. Les cultures sont alors placées dans un bioréacteur de 5 à 20 litres, à 23 ± 2°C avec une vitesse de rotation au maximum de l'agitateur de 300 tr/min. et un débit d'air au maximum de 5 wm, pendant une durée au maximum de 35 jours.

Etape 2 : Préparation des oligosaccharides

Après séparation du mycélium et du milieu de culture par fïltration sur toile à blutter (50μm) ou centrifugation, le filtrat est récupéré et soumis à un autoclavage à 115-120 ⁰ C d'une durée de 40 à 60 minutes en fonction du volume traité. Après ce traitement, le filtrat, appelé F241, peut être utilisé sous cette forme pour traiter les plantes ou peut être lyophilisé puis remis en solution juste avant utilisation.

Etape 3 : Séchage ou atomisation ou lyophilisation des extraits Cette étape est avantageusement opérée à une température inférieure à 60° C, par exemple entre -60° C et 50 ⁰ C, à l'aide d'un lyophilisateur. Dans ce dernier cas, on obtient après lyophilisation environ 1 à 5 grammes de poudre sèche par litre de culture. La poudre obtenue est ensuite broyée à l'aide d'un broyeur, préférentiellement à l'aide d'un broyeur de type Mortier, à bille ou à couteaux.

Etape 4 : mélange et / ou incorporation à un ou des excipients et/ ou à d'autres principes actifs pour la préparation de la composition à usage phvtopharmaceutique

Les oligosaccharides isolés sont dosés par colorimétrie grâce à la réaction phénol-acide sulfurique (Dubois et al, 1956), puis sont dilués dans de l'eau distillée ou des adjuvants.

Exemple 2 : Stimulation des défenses naturelles de plants de Vigne traités par un éliciteur provenant du filtrat de culture (F241).

Les essais ont été réalisés sur de jeunes plants de Vigne du cépage Cabernet

Sauvignon (CS) et produits en serre à partir de boutures à un œil. Des lots de 6 plantes ont été constitués pour l'étude de chaque modalité d'un essai. Les niveaux foliaires ont été identifiés au moment des traitements et contaminations à l'aide d'un repère de couleur placé sous la troisième feuille étalée. On a tout d'abord traité des plantes entières des variétés CS par des compositions aqueuses

contenant 0,1% de Triton, et comportant l'éliciteur F241 à la concentration de 20% (v/v) qui est la dose optimale pour l'activité élicitrice.

Un mode d'apport classique par pulvérisation au moyen d'un banc de pulvérisation à jets projetés et à pression constante est utilisé. L'application est réalisée sur l'ensemble du végétal. La pression à laquelle la pulvérisation est pratiquée est fonction du volume à apporter. Un chariot de pulvérisation, équipé de 5 buses (1 supérieure centrale, 2 latérales droites, 2 latérales gauches) se déplace sur un rail de guidage à une vitesse constante. Les plantes d'un même lot sont traitées simultanément et de façon parfaitement contrôlée. Le volume d'application de l'éliciteur retenu est de 600 1/ha.

48 heures après traitement des plants, un lot est sélectionné et les feuilles sont récoltées. Elles sont ensuite séchées à l'aide d'un lyophilisateur (Virtis Uni- Trap 10-100). La poudre obtenue après broyage à l'aide d'un broyeur type Mortier, est extraite par du méthanol, à raison de 10 ml pour 200 mg de matière sèche à 4°C. Après centrifugation (10 min., 3500 rpm), 8 ml d'extrait méthanolique de feuilles sont évaporés au Speed Vac. L'échantillon est repris dans 1 ml de MeOHZH ₂ O (30/70 , v/v) puis chromatographié sur mini-colonne de silice greffée Cl 8 (SPE). Le conditionnement des cartouches est réalisé par lavages successifs au MeOH (2 ml), au MeOH 50% (2 ml), et à l'eau distillée (6 ml). Après dépôt de l'échantillon, les stilbènes sont élues avec 5 ml de MeOH/H ₂ 0 (80/20, v/v). L'éluat obtenu est directement injecté en HPLC sur colonne de silice en phase inverse (C 18). Les stilbènes sont détectés par fluorescence, à une longueur d'onde d'excitation de 300 nm et une longueur d'onde d'émission de 390 nm, qui correspondent aux longueurs d'onde optimales pour les stilbènes. Les teneurs en stilbènes des feuilles sont calculées par rapport à des courbes d'étalonnage réalisées avec des composés purs. Les résultats obtenus sont réunis sur la figure 1.

Exemple 3 : Etude de la résistance de plants de Vigne traités par l'éliciteur F241 à une infection par Plasmopara viticola.

Un lot de plantes traitées par l'éliciteur sont séchées à température ambiante puis remises en serre jusqu'au moment de leur contamination 48 heures plus tard.

Le matériel fongique est constitué d'un ensemble de sporocystes de bonne viabilité issu d'une souche de mildiou ou d'oïdium de référence, sensibles aux principales familles fongicides utilisées à l'heure actuelle.

La suspension de sporocystes est préparée dans une eau permutée maintenue à basse température afin de bloquer la libération des zoospores jusqu'au moment de l'inoculation. Par un lavage des feuilles infectées, les sporulations du champignon sont récupérées et mises en suspension dans de l'eau permutée. Une titration de la concentration de l'inoculum est opérée à l'aide d'une cellule de Malassez. La concentration optimale recherchée est de 50 000 sp/ml.

Pour une plante, environ 10 ml de suspension de sporocystes sont pulvérisés. La préparation de l'inoculum se déroule juste avant la contamination. Chaque plante est manipulée isolément et contaminée sur tous les niveaux de feuilles. Les plantes d'une même condition sont alors placées en incubation dans des enceintes d'isolement. Une brumisation d'eau à l'intérieur de ces enceintes individuelles permettra une saturation en humidité permanente très favorable au développement de la maladie. Toutes les plantes sont mises en incubation après leur contamination dans une salle climatisée à 21±2°C et éclairée 14 heures par jour. Les plantes restent dans ces conditions pendant 8 jours. Au terme de cette période, une notation des dégâts du champignon est réalisée sur chaque plante et pour chaque étage foliaire.

La notation est basée sur une observation visuelle de l'intensité des dégâts du champignon décomposée en deux éléments : la surface colonisée par le champignon et l'intensité de la sporulation. Nous utilisons une échelle allant de 0 à 100% (par pas de 5%).

Chaque feuille est observée de façon individuelle. Les étages foliaires notés dans le cas de plantes sont ceux correspondant au quatrième niveau de feuille au moment du traitement et des suivants (F4 ; F3 ; F2 ; Fl, Nl, N2, N3...). Un lien de couleur disposé sous la troisième feuille étalée au moment du traitement nous

permet de repérer aisément les différents niveaux de feuille sans aucune équivoque.

La moyenne des dégâts notés sur les 6 plantes d'un même lot est dans un premier temps calculée. La plante dont les dégâts sont les plus éloignés de cette moyenne (forte ou faible attaque) est écartée. La moyenne des 5 plantes les plus homogènes sera alors calculée et donnera le taux de dégâts pour chaque condition de l'essai. L'efficacité (E) de chaque modalité de l'essai est ensuite être calculée en référence au lot de plantes non traitées de l'essai selon la formule :

E = {[(T-D)/T]*100} où, T est la note moyenne d'attaque sur les plantes non traitées, et D celle observée sur les plantes traitées à la dose d.

Une analyse de variance permet la comparaison des résultats et de donner, le cas échéant, les différences entre les conditions étudiées.

Les résultats sont présentés sur la figure 2. La figure 2 présente les intensités d'attaque ainsi que les efficacités notées sur les différents lots de plantes (Vigne) traitées ou non par l'éliciteur F241.

Près de 43% de surface végétale est attaquée par le mildiou après traitement avec l'éliciteur à la dose 2%. Par contre, les dégâts sont très faibles sur les plantes traitées avec ce même produit à la dose 20% (moins de 1% de dégâts). Parallèlement, le taux d'expression des ARNm de différents gènes codant pour des enzymes impliquée dans les réactions de défense des plantes a été mesuré par le PCR quantitative en temps réel, grâce à l'utilisation d'amorces spécifiques.

Les résultats présentés sur la Figure 3 montrent que l'éliciteur F241 induit dans les feuilles de plantes {Vitis vinifera), dès les premières heures suivant le traitement, une nette augmentation du taux d'expression des gènes codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse des stilbènes, telles que la phénylalanine amonia-lyase (PAL) et la stilbène synthase (STS) d'un facteur 300 à 600, de même que ceux codant pour des protéines PR (Pathogenesis-Related) telles que les chitinases (CHIT), la protéine inhibitrice de polygalacturonases (PGIP) et l'inhibiteur de la serine protéinase (PIN) d'un facteur 5 à 60.

Exemple 4 : Etude de la résistance de plants de Tomate et de Pomme de Terre traités par l'éliciteur F241 à une infection par Phytophtora sp.

Les résultats présentés sur la figure 4 montrent que les taux d'infestation sont très faibles sur les plantes traitées avec l'éliciteur F241 (intensité d'infestation inférieure à 3% pour les deux plantes), avec une fréquence d'attaque de seulement 29% pour la Tomate.