발명의 명칭 :와이셀라헬레니카 WIKIM0103를포함하는비만 또는지방간질환의 예방，개선또는치료용조성물 기술분야

[1] 본출원은 2019년 2월 28일에출원된한국출원제 10-2019-0024255호에기초한 우선권을주장하며,해당출원의명세서및도면� �개시된모든내용은본 출원에원용된다.본발명은김치로부터분리한� �규한균주및이를포함하는 염증,비만또는지방간질환의예방,개선또는치� ��용조성물에관한것이다. 배경기술

[2] 지방간 (fatty liver)은지방의과도한섭취와간내의축적및합성 의증가,배출 감소등의원인으로정상적인지방대사가이루어 지지못해간세포내에 중성지방이축적되는질환으로,지방이전체간� �게의 5%이상을차지하게될 때,지방간이라고분류한다.

[3] 또한,최근서구화된고지방,고열량의서구화된� ��생활과문명의발달로인한 운동부족등으로인하여지방간환자가급증하고 있으며,연령또한 W대부터 60대이후까지발병되고있다.지속적으로간에지 방이축적되면염증을 수반하는지방간성간염으로진행되며,만성염� �으로인한간조직괴사,간의 섬유화로인해간경화가발생할수있다.더욱증� �이악화되는경우,간암으로 발전할가능성이있다.따라서지방간은간염 ,간경화및간암에가장큰 원인이다.

[4] 현재시중에이용되고있는약물은비만치료를통 한지방간개선을나타내는 오르리스타트 (orlistat)를주원료로하는제니칼 ä(Roche),

시부트라민 (sibutramin)을주원료로하는리덕틸 ä(Abbott)등이 있으나설사, 복통,불면증등의부작용을보이며,지방간의치� ��제로는

클로피브레이트 (clofibrate)로대표되는피브레이트계약제등이임 상에서 사용되고있으나,간기능장애등의부작용이보� �되고있다.

[5] 한편,하기의특허문헌 1에서의다양한유산균이지방간개선효과를나� �내고 있기는하지만지방간의근본적인예방또는개선 효과를가지며전술한 부작용이나타나지않는지방간치료제의개발이 절실히필요하다.

[6] 한편,특허문헌 1에서는비피도박테리움속,락토바실러스속등� ��다양한 유산균의지방간개선효과를개시하고있으나,� �직까지지방간에대한 근본적인치료효과를가지면서도전술한부작용 이나타나지않는치료제는 개발되지않은실정이다.따라서 ,지방간의근본적인치료가가능하면서도 부작용이없는치료제의개발이절실히필요하다 .

[刀 (특허문헌 1) KR특허출원제 10-193 ⁷ 365호 ( ² 018.08.08.)

발명의상세한설명 2020/175939 1»（：1/10公020/002844

2 기술적 과제

[8] 본발명은지방간질환의 예방또는개선효능이우수한신규한와이셀라

헬레니카속유산균을제공하고자한다.

과제 해결수단

[9] 이에,본발명자들은전통발효식품으로부터지� �간질환의 예방또는개선 효과를나타내는유산균균주를찾고자노력한결 과,신규한와이셀라속유산균

동정하여본발명을완성하게되었다.

[1이 본발명의 일구현예는와이셀라헬레니카 \¥0산1110103（\¥ 8861 1161노11노&

\ 꾜1110103;수탁번호 KCCM12419P）,이의 배양물,이의파쇄물또는이의 추출물을유효성분으로포함하는염증,비만또� �지방간질환의 예방또는 개선용조성물을제공한다.

[11] 상기지방간질환은단순지방간,비알코올성지� �간염 ,간섬유화및간경화로 이루어진군에서선택된어느하나이상일수있다 .

[12] 상기조성물은식품조성물,식품발효용유산균� �타터조성물,사료또는사료 첨가제조성물,또는약학조성물일수있다.

[13] 상기식품조성물은건강기능식품,음료,바또는� ��효유를포함할수있다.

[14] 본발명의다른구현예는와이셀라헬레니카 \¥0산1110103（\¥ 8861 1161노11노& \ 꾜1110103;수탁번호 KCCM12419P）,이의 배양물,이의파쇄물또는이의 추출물의 염증,비만또는지방간질환의 예방,개선또는치료용도를제공한다.

[15] 상기지방간질환은단순지방간,비알코올성지� �간염 ,간섬유화및간경화로 이루어진군에서선택된어느하나이상을포함할 수있다.

[16] 식품조성물,식품발효용유산균스타터조성물,� ��료또는사료첨가제

조성물,또는약학조성물로사용될수있다.

[17] 본발명의 일구현예는와이셀라헬레니카 \¥0산1110103（\¥ 8861 1161노11노&

\ 꾜1110103;수탁번호 KCCM12419P）,이의 배양물,이의파쇄물또는이의 주줄물을포함하는조성물을이를필요로하는개 체에투여하는단계를 포함하는,염증,비만또는지방간질환을예방,개 선또는치료하는방법을 제공한다.상기 개체는인간을포함하는동물일수있다.

[18] 상기지방간질환은단순지방간,비알코올성지� �간염 ,간섬유화및간경화로 이루어진군에서선택된어느하나를포함하는것 인염증,비만또는지방간 질환을예방,개선또는치료하는방법을제공한� �.

[19] 본발명은와이셀라헬레니카 \ 꾜1110103（ Weissella 此 ? \ 꾜1110103）을 제공한다.

[2이 본발명의 와이셀라헬레니카 \ 꾜1110103（ Weissella 此 切? \ 꾜1110103）은 김치유래의와이셀라헬레니카신규균주이다.� �록본발명에서의와이셀라 헬레니카 \¥0산1110103을김치에서분리 ,동정하기는했으나,이의 입수경로가 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

3 이에한정되는것은아니다.

[21] 본발명에의실시예를통해분리된유산균균주는 미생물의동정및분류를

위한 16S rDNA염기서열분석결과, SEQ ID NO: 1의핵산서열을갖는것으로 나타났다.

[22] 따라서 , SEQ ID NO: 1의 16S rDNA염기서열을갖는본발명의미생물을

와이셀라헬레니카 WiKim0103( Weissella hellenica WiKim0103)로명명하였으며 , 한국미생물보존센터에 2018년 12월 14일자로기탁하였다 (수탁번호

KCCM12419P).

[23] 본발명의와이셀라헬레니카 WiKim0103은그람양성균이고호기적조건과 혐기적조건에서모두성장이가능한통성혐기성 (facultative anaerobe)이며, 포자를형성하지않고운동성이없으며세포는간 균의형태를취하고있다.

[24] 하기실시예에서는,본발명의와이셀라헬레니� � WiKim0103이간세포 (HepG2 cells)에서 SREBP-lc(Sterol regulatory element-binding protein- lc), FAS(fatty acid synthase), SCD(lipogenic -related gene), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-a(Tumor necrosis factor-alpha)및 NF-K(inflammatory related gene)의발현을저해하는것을 확인하였다.이는와이셀라헬레니카 WiKim0103( Weissella hellenica

WiKim0103)균주가 HepG2세포의지방간생성을약 28내지 35%저해함으로써 지방간을예방또는개선할수있음을확인하였다 .따라서,본발명에따른 와이셀라헬레니카 WiKim0103은사람또는동물의지방간질환의예방,� �료 또는개선용도를위해다양하게활용될수있다.

[25] 또한,하기실시예에서확인할수있는바와같이,� ��이셀라헬레니카

WiKimOHB을유효성분으로포함하는조성물은간세� �� (HepG2 cells)내지방 축적및염증을저해하고,체중감소효능및혈중� �기능수치를개선하며,간 조직내지방대사,염증및간섬유화관련인자유� �자의발현을감소시키는 것으로확인되었다.따라서상기조성물은염증,� ��만,또는단순지방간, 비알코올성지방간염 ,간섬유화및간경화군으로부터선택되는하나� �상의 지방간질환의예방,치료또는개선용조성물의� �효성분으로사용될수있다.

[26] 본발명은와이셀라헬레니카 WiKim0103,이의배양물,이의파쇄물,또는이의 추출물을유효성분으로포함하는염증,비만또� �지방간질환의 예방,개선 또는치료용조성물을제공한다.

[27] 본발명에따른조성물에포함되는와이셀라헬레 니카 WiKim0103은생균체 또는사균체로서존재할수있으며,또한건조또� �동결건조된형태로존재할 수도있다.다양한조성물내에포함시키기적합� �유산균의형태및제제화 방법은당업자에게잘알려져있다.예를들어,와� ��셀라헬레니카 WiKim0103은 공지의 액체배지또는고체배지에서배양시켜수득한배 양물이거나,상기 균주와추가의성분을함께배양하여수득한발효 물이거나,상기균주를 유기용매로추출한추출물,상기균주의세포막� �용해시키거나,파쇄또는 균질화처리한용해물 (또는파쇄물)등의형태로제제화할수있으나이� �� 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

4 제한되는것은아니다.

[28] 한구체예에서 ,상기조성물은생균또는사균으로존재하는와� �셀라

헬레니카 WiKimOHB균주를포함하는조성물일수있다.

[29] 본발명에 있어서 ,상기지방간질환은단순지방간,비알코올성지� ��간염 , 간섬유화및간경화를포함할수있다.

[3이 또한상기지방간질환은알코올성지방간과비알 코올성지방간을모두포함할 수있으며,예컨대고지방식이에의해유도되는� �알코올성지방간일수있다. 상기 비알코올성지방간질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 원발성과속발성에따른비알코올성지방간을모 두포함할수있으며，예컨대 원발성고지혈증,당뇨또는비만으로부터발생� �는비알코올성지방간일수 있다.

[31] 한구체예에서,상기조성물은와이셀라헬레니� � WiKim0103균주의 배양물, 파쇄물,발효물또는추출물을포함하는염증,비� ��또는지방간질환의 예방 또는치료용약학조성물일수있다.

[32] 본발명에 따른조성물이 약제학적조성물로활용될경우,본발명의 약제학적 조성물은상기와이셀라헬레니카 WiKim0103균주이외에 약제학적으로 적합하고생리학적으로허용되는보조제를사용 하여 제조될수있으며 ,상기 보조제로는부형제 ,붕해제 ,감미제 ,결합제 ,피복제 ,팽창제 ,윤활제 ,활택제 또는향미제등을사용할수있다.

[33] 상기 약제학적조성물은투여를위해서상기 기재한유효성분이외에추가로 약제학적으로허용가능한담체를 1종이상포함하여 약제학적조성물로 바람직하게제제화할수있다.

[34] 예를들어,정제또는캡슐제의 형태로의제제화를위해,유효성분은에탄올, 글리세롤,물등과같은경구,무독성의 약제학적으로허용가능한불활성 담체와 결합될수있다.또한,원하거나필요한경우,적합 한결합제,윤활제,붕해제및 발색제또한혼합물로포함될수있다.적합한결� �제는이에제한되는것은 아니나,녹말,젤라틴,글루코스또는베타-락토� �스와같은천연당,

옥수수감미제,아카시아,트래커캔스또는소듐� ��레이트와같은천연및합성검, 소둠스테아레이트,마그네슘스테아레이트,소� ��벤조에이트,소둠아세테이트, 소둠클로라이드등을포함한다.붕해제는이에� �한되는것은아니나,녹말, 메틸셀룰로스,아가,벤토니트,잔탄검등을포함 한다.액상용액으로

제제화되는조성물에 있어서 허용가능한약제학적 담체로는,멸균및생체에 적합한것으로서，식염수,멸균수,링거액 ,완충식염수,알부민주사용액 , 덱스트로즈용액,말토덱스트린용액,글리세롤, 에탄올및이들성분중 1성분 이상을혼합하여사용할수있으며,필요에 따라항산화제,완충액,정균제등 다른통상의 첨가제를첨가할수있다.또한희석제,분산제 ,계면활성제 ,결합제 및윤활제를부가적으로첨가하여수용액,현탁� �,유탁액등과같은주사용 제형 ,환약,캡슐,과립또는정제로제제화할수있다. 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

5

[35] 나아가해당분야의 적절한방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는방법을이용하여 각질환에 따라 또는성분에따라바람직하게제제화할수있다.

[36] 한구체예에서,본발명은와이셀라헬레니카 WiKim0103,이의 배양물,이의 파쇄물,이의 발효물또는이의추출물을유효성분으로포함하 는염증,비만 또는지방간질환예방또는개선용식품조성물을 제공한다.상기식품 조성물은건강기능식품또는음료,바등의 형태를포함할수있다.

[37] 본발명에 있어서,상기균주를유효성분으로포함하는식� �조성물은발효유 등의 음료를포함할수있다.이에,본발명은와이셀라� ��레니카 WiKim0103 또는이의 배양물로이루어지는발효용유산균스타터를제 공한다.

[38] 본발명에 따른식품조성물은상기 약제학적조성물과동일한방식으로

제제화되어 기능성식품으로이용하거나,각종식품에 첨가할수있다.본 발명의조성물을첨가할수있는식품으로는예를 들어,음료류,비타민복합제, 건강보조식품류등이 있다.

[39] 본발명의식품조성물은식품제조시에통상적으 로첨가되는성분을포함할 수있으며 ,예를들어 ,단백질,탄수화물,지방,영양소,조미제 및향미제를 포함한다.상술한탄수화물의 예는모노사카라이드,예를들어,포도당,과당등 ; 디사카라이드,예를들어 말토스,슈크로스,올리고당등;및폴리사카라이 드, 예를들어 덱스트린,사이클로덱스트린등과같은통상적� �당및자일리톨, 소르비톨,에리트리톨등의 당알콜이다.향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아추출물（예를들어 레바우디오시드 A,글리시르히진등]）및

합성향미제（사카린,아스파르탐등）를사용� �수있다.예컨대,본발명의식품 조성물이드링크제와음료류로제조되는경우에 는구연산,액상과당,설탕, 포도당,초산,사과산,과즙,및각종식물추출액� �을추가로포함시킬수있다.

[4이 상기본발명에따른조성물은사료첨가제또는사 료로서 이용될수있다.

[41] 사료첨가제로서 이용될경우,상기조성물은 20내지 90%고농축액이거나 분말또는과립 형태로제조될수있다.상기사료첨가제는구연� �,후말산, 아디픽산,젖산,사과산등의유기산이나인산나� ��륨,인산칼륨,산성

피로인산염,폴리인산염（중합인산염）등의 인산염이나,폴리페놀,카테킨, 알파-토코페롤,로즈마리추출물,비타민 C,녹차추출물,감초추출물,키토산, 탄닌산,피틴산등의천연항산화제중어느하나� �는하나이상을추가로 포함할수있다.사료로서 이용될경우,상기조성물은통상의사료형태로 제제화될수있으며,통상의사료성분을함께포� �할수있다.

[42] 상기사료첨가제 및사료는곡물,예를들면분쇄또는파쇄된밀,귀� ��,보리, 옥수수및쌀;식물성단백질사료,예를들면평지, 콩,및해바라기를

주성분으로하는사료;동물성단백질사료,예를� ��면혈분,육분,골분및 생선분;당분및유제품,예를들면각종분유및유� ��분말로이루어지는 건조성분등을더포함할수있으며,이외에도영� �보충제,소화및흡수향상제, 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

6 성장촉진제등을더포함할수있다.

[43] 상기사료첨가제는동물에게단독으로투여하거 나식용담체중에서다른

사료첨가제와조합하여투여할수도있다.또한,� ��기사료첨가제는

탑드레싱으로서또는이들을동물사료에직접혼 합하거나또는사료와별도의 경구제형으로용이하게동물에게투여할수있다 .상기사료첨가제를

동물사료와별도로투여할경우,당해기술분야� � 잘알려진바와같이 약제학적으로허용가능한식용담체와조합하여 ,즉시 방출또는서방성 제형으로제조할수있다.이러한식용담체는고� �또는액체 ,예를들어 옥수수전분,락토오스,수크로오스,콩플레이크 ,땅콩유,올리브유,참깨유및 프로필렌글리콜일수있다.고체담체가사용될� �우,사료첨가제는정제, 캡슐제 ,산제 ,트로키제또는함당정제또는미분산성 형태의탑드레싱일수 있다.액체담체가사용될경우,사료첨가제는젤� ��틴연질캡슐제,또는 시럽제나현탁액,에멀젼제,또는용액제의 제형일수있다.

[44] 또한,상기사료첨가제 및사료는보조제 ,예를들어보존제 ,안정화제 ,습윤제 또는유화제,용액촉진제등을함유할수있다.상� ��사료첨가제는침주,분무 또는혼합하여동물의사료에 첨가하여 이용될수있다.

[45] 본발명의사료또는사료첨가제는포유류,가금� �어류를포함하는다수의 동물식이에 적용할수있다.

[46] 본발명에 있어서동물을포유류를포함하고포유류로서돼 지,소,양,염소, 실험용설치동물,및실험용설치동물뿐만아니� �,애완동물 (예:개,고양이) 등에게사용할수있으며,상기가금류로서 닭,칠면조,오리,거위,꿩,및 메추라기등에도사용할수있고,상기 어류로서송어등에 이용될수있으나, 이에 한정되는것은아니다.

[47] 본발명에 따른조성물에포함되는와이셀라헬레니카 WiKim0103균주의 양은 1회를기준으로약 10 ⁶ 내지 10 ¹² cfu/g일수있으며,예컨대 10 ⁷ 내지 10 ¹¹ cfu/g, 10 ⁸ 내지 10 ¹⁰ cfu/g일수있다.균주를투여할경우에는생균상태 로투여하는 것이 바람직하며，섭취 전에사멸시키거나감쇄 (attenuation)상태로투여할수 있다.또한,배양상등액등을사용하여제조할경� ��에는열처리과정을통한 멸균화과정을추가적으로거칠수있다.최소의� �능을가지는데필요한균주량 및 일일섭취 정도는섭취자의신체또는건강상태에따라달라 질수있으나, 일반적으로약 10 ⁶ 내지 10 ¹² cfu/g일수있으며,예컨대 10 ⁷ 내지 10 ¹¹ cfu/g, 10 ⁸ 내지 10 ^1Q cfu/g일수있다.

[48] 본발명의다른구현예는와이셀라헬레니카 WiKim0103의사람또는동물의 염증,비만또는지방간질환의 예방,치료또는개선용도로제공될수있다.

[49] 본발명의다른구현예는와이셀라헬레니카 WiKim0103( Weissella hellenica WiKim0103;수탁번호 KCCM12419P),이의 배양물,이의파쇄물또는이의 추출물의 염증,비만또는지방간질환의 예방,개선또는치료용도를제공한다.

[5이 본발명의다른구현예는염증,비만또는지방간� �환의 예방,개선또는 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

7 치료를위한와이셀라헬레니카 WiKim0103( Weissella hellenica WiKim0103; 수탁번호 KCCM12419P),이의 배양물,이의파쇄물또는이의추출물을 제공한다.

[51] 본발명의 일구현예는와이셀라헬레니카 WiKim0103( Weissella hellenica WiKim0103;수탁번호 KCCM12419P),이의 배양물,이의파쇄물또는이의 주줄물을포함하는조성물을이를필요로하는개 체에투여하는단계를 포함하는,염증,비만또는지방간질환을예방,개 선또는치료하는방법을 제공한다.상기 개체는인간을포함하는동물이며,상기동물의 예는사료를 섭취하는상기 언급된동물이면모두본발명의 범위에포함될수있다.상기 지방간질환은단순지방간,비알코올성지방간� � ,간섬유화및간경화로 이루어진군에서선택된어느하나이상을포함할 수있다.

[52] 본발명의 이점 및특징,그리고그것들을달성하는방법은상세� �게

후술되어있는실시예들을참조하면명확해질것 이다.그러나본발명은 이하에서 개시되는실시예들에 한정되는것이 아니라서로다른다양한형태로 구현될것이며,단지본실시예들은본발명의 개시가완전하도록하고,본 발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진 자에게발명의범주를 완전하게 알려주기위해제공되는것이며,본발명은청구� �의 범주에의해 정의될뿐이다.

[53]

발명의효과

[54] 본발명에 따른와이셀라헬레니카 WiKim0103은김치로부터분리된

유산균으로서,세포내지방축적 저해 및지방간관련유전자의 발현감소를 통한지방간생성 저해효과를나타내므로,염증,비만또는지방간� ��환의 예방, 개선,및치료용도를위해다양하게활용될수있� �.나아가,발효용스타터로서 유용하게사용할수있다.

[55]

도면의간단한설명

[56] 도 1은본발명에 따른 WiKim0103균주

저해효과를육안으로관찰한사진이다.

L-LAB2는 W. oreeniz 를나타낸다.

[57] 도 2는본발명에 따른 WiKim0103균주처리에 따른 HepG2세포관련유전자 발현정도를측정한그래프이다. L-LAB1은 W. hellenica WiKim0103을,

L-LAB2는 W. koreensis #나타낸다. *P<0.05, compare to the CON; #P<0.05, compare to the PA; PA, palmitic acid

[58] 도 3는본발명에 따른 WiKim0103균주처리에 따른 HT-29세포관련유전자 발현정도를측정한그래프이다. L-LAB1은 W. hellenica WiKim0103을,

L-LAB2는 W. koreensis를나타낸다. *P<0.05, compare to the CON; #P<0.05, 2020/175939 1»（：1/10公020/002844

8 compare to the PA; PA, palmitic acid

도 4a내지도 4c는본발명에따른 WiKim0103균주섭취에따른지방간마우스 모델의체중,혈중간기능수치 (GPT, GOT)를나타낸그래프이

hellenica WiKim0103을, L-LAB2는 W. koreensis #나타낸다. *P<0.05, compare to the ND; #P<0.05, compare to the HFD.

60] 도 5a내지도 5c는본발명에따른 WiKim0103균주섭취에따른지방간마우스 모델의간조직관련유전자발현정도를측정한그 래프이다. L-LAB 1은 hellenica WiKim0103을, L-LAB2는 W. koreensis #나타낸다. *P<0.05, compare to the ND; #P<0.05, compare to the HFD.

도 6은본원의서열번호 1을보여준다.

[62]

발명의실시를위한형태

[63] 이하,본발명을실시예를통해상세히설명한다.� ��기실시예는본발명을

예시하는것일뿐본발명의범위가하기실시예에 한정되는것은아니다.

[64]

[65] ［실시예］

[66] 실시예 1:와이셀라헬레니카 WiKim0103의동정

[67] 김치추출물의원액을 MRS배지에도말하여얻은균단일집락을루프로

수거하여 MRS broth에배양하였다. DNA추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen, Germany)를사용하여추출하였다.추출된 DNA는 1%아가로스겔을이용하여 확인하였으며, 16S rDNA gene을증폭하기위하여추출된유전체 (genomic)

DNA를주형으로하여중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 진행하였고, PCR조건은변성 (denaturation) 95°C 1분,결합 (annealing) 45°C 1분,

] ] ] ] 신장 (extension) 72°C 1분 30초로 30사이클을수행하였다.얻어진 PCR산물은 9281

77 566691 마크로젠 (Seoul, Korea)에의뢰하여서열을분석하였다.세균의동� �은 16S rDNA 서열·: National Center for Biotechnology Information(NCBI,

www.ncbi.nlm.rdh.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)검색엔진의 유도분석을통해수행하였다. 본발명의실시예를통해분리된균주는미생물의 동정을위한 16S rDNA 염기서열분석결과, SEQ ID NO: 1의핵산서열을갖는것으로나타났다.

[70] 이에,본발명의미생물을와이셀라헬레니카 WiKim0103 ( Weis sella hellenica WiKim0103)으로명명하였으며,한국미생물보존센� ��에 2018년 12월 14일자로 기탁하였다 (KCCM12419P). 실시예 2:와이셀라헬레니카 WiKim0103의간세포 (HepG2 cells)내지방축적 및염증저해효능확인 2020/175939 1»（：1/10公020/002844

9 인체장-간죽 (gut-liver axis)에유사하도록트랜스웰 (transwell)을이용하여 in vitro실험법을고안하였다.

[74]

와이셀라헬레니카 WiKim0103유산균은 MRS배지에서 30°C, 24시간동안 배양하였다.배양이종료된시점에서균체를회� �하기 위해 6,000 rpm에서 5분 동안원심분리하고, PBS로행궈남아있는배지성분을모두제거하여

준비하였다.

[76] 장세포 (HT-29 cells)와간세포 (HepG2 cells)배양을위해

페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin), 10%우태아혈청 (fetal bovine serum)을첨가한 RPMI-1640배지를사용하였으며 , 6 -웰 (6-well)플레이트 트랜스웰을이용하여공배양을준비하였다.공� �양전에트랜스웰맴브레인 막 (membrane)에장세포를분주하고, 6 -웰 (6-well)늘레이트에는간세포를 분주하여 각각 3rc, 5% co ₂ 조건에서 배양하여준비하였다.

[78] 배양디쉬 (dish)내에서장세포 (HT-29 cells)와간세포 (HepG2 cells)가 80%정도 자랐을때 ,배양액은 FBS free배지로교체하여 16시간배양하였다.배양후 준비된유산균 1X10 ⁷ CFU를장세포에 처리하고,트랜스웰을조립하여유산균, 장세포,간세포의 공배양을수행하였으며, 0.1 mM팔미트산 (palmitic acid)을 48시간처리하여간세포내지방생성을유도하였� ��. 0.1 mM팔미트산과 48시간 배양한뒤 ,장세포와간세포를각각회수하였다.간세포내� ��방생성은오일 레드 -0염색,지방대사및염증관련유전자의 발현을통해확인하였으며, 장세포의투과성은장세포내밀착연접 (tight junction)관련유전자의 발현을 통해확인하였다.

] ]

9 o 21

77 887 ^{7 735} 1)오임 레드- 0스테 ?1 (Oil red-0 stain)음통한지방축적량확이

[8 배양액을제거하고 PBS로세척한다음 10%포름알데히드로 W분간

고정시켰다. 10%포름알데히드를제거하고다시포화된포름알 데히드를넣어 1시간이상세포를고정시켰다.그후 60%이소프로판올을넣고바로제거한후 증류수로세척하고,오일레드- 0용액으로 30분간지방구를염색한후증류수로 세척하였다.오일레드 -0용액에 의해축적된지방은빨간색을나타낸다 (도 1). 그결과, 0.1 mM팔미트산을처리한간세포 (대조군)에 비해 0.1 mM팔미트산과 와이셀라헬레니카 WiKim0103를공배양한간세포 (HepG2 cells)에서지질 축적이감소하는것을확인할수있었다.

83；

84； 2)가세포 지방분화밀염증과려유저자밤혀수주확이

85 와이셀라헬레니카 WiKim0103균주처리에따른간세포내지방대사,염� � 관련유전자의발현수준을알아보기 위해,실시간중합효소

연쇄반응 (quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)을실시하였다. 2020/175939 1»（：1/10公020/002844

10 그결과,도 2에서볼수있듯이, 0.1 mM팔미트산을처리한간세포 (대조군)에 비해 0.1 mM팔미트산과와이셀라헬레니카 WiKim0103를공배양한간세포에서 지방대사관련인자 SREBP-lc(Sterol regulatory element-binding protein- lc), 지방산합성효소 (Fatty acid synthase, FAS),불포화지방산생합성

효소 (Stearoyl-CoA desaturase, SCD)와염증관련인자 COX-2(Cyclooxygenase-2), TNF-a(Tumor necrosis factor-alpha), NF-KB (Nuclear factor-kappa B)유전자 ^· 발현이 유의적으로감소하는것을확인할수있었다.

[88]

[89] 3)장세포 iHT-29 cells ^' )내밑착여접 (tight junction)과려유저자밤혀수주확이

[9이 와이셀라헬레니카 WiKim0103균주처리에따른장세포내밀착연접관련 유전자의발현수준을알아보기위해,실시간중� �효소연쇄반응 (qPCR)을 실시하였다. 그결과,도 3에서볼수있듯이, 0.1 mM팔미트산을처리한장세포 (대조군)에 비해 0.1 mM팔미트산과와이셀라헬레니카 WiKim0103를공배양한장세포에서 밀착연접관련 ZO-l(Zonula occludens-1),오클루딘 (Occludin)유전자의발현이 유의적으로증가되는것을확인할수있었다.

[93]

[94] 실시예 3:체중감소효능및혈중간기능수치 개선확인

[95] 5주령수컷생쥐 (C57BL/6J)를온도 20±2°C습도 50+5%및명암주기 (light-dark cycle) 12시간단위인조건의사육실환경하에서차우식� ��요법 (chow diet) (CD; Purina, Korea)로 1주간적응시켰다.실험동물은정상식이 (D12450B, Research

] ] ] ] Diets, New Brunswick, NJ)또는총칼로리의 45%가지방인고지방식이 (D12451, 7261

9988 Research Diets, New Brunswick, NJ)를섭취하도록하였으며 , 1주동안식이에 적응시킨후실험을수행하였다.실험군은정상� �이섭취군 (ND),고지방식이 섭취군 (HFD),고지방식이와함께와이셀라헬레니카 WiKim0103을 2 X 10 ⁹ CFU/200M농도로매일경구투여한섭취군 (HFD+L-LAB1),고지방식이와함께 와이셀라코리엔시스를 2 X 10 ⁹ CFU/200M농도로매일경구투여한

섭취군 (HFD+L-LAB2)총 4개의그룹으로구성하였으며 , 20주동안식이공급을 통해지방간을유도하였다.정상식이섭취군 (ND)와고지방식이

섭취군 (HFD)은이와동일한양의인산완중식염수 (phosphate buffered saline,

PBS)을매일경구투여하였다.실험수행 20주후,각실험군의체중을

즉정하였다 (도 4a내지도 4c).또한,실험군의혈중간기능수치 (serum GOT, serum GPT)를측정하기위해,실험종료 16시간전부터절식시키고

복강대정맥에서채혈한후,혈청을분리하여실� �에사용하였다.혈청내 GOT, GPT는자동생화학측정기 (FUJI DRI-CHEM 7000i, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여측정하였으며,도 3에혈중글루타메이트-옥살로아세테이트 2020/175939 1»（：1^1{2020/002844

11 트랜스아미네아제 (GLUTAMATE-OXALO ACETATE TRANSAMINASE, GOT), 글루타메이트-파이루베이트트랜스아미네이� � (GLUTAMATE-PYRUVATE TRANSAMINASE, GPT)를그래프로나타내었다.

[96] 그결과,도 4a내지도 4c에나타난바와같이 ,고지방식이와와이셀라

헬레니카 WiKim0103을함께섭취한경우 (HFD+L-LAB 1),고지방식이섭취 마우스 (HFD)와비교하여체중과혈중간기능수치가유의� ��으로감소하는것을 확인할수있었다.

[97]

[98] 실시예 4:간조직내지방대사,염증및간섬유화관련유전 자발현수준확인

[99] 와이셀라헬레니카 WiKim0103균주섭취에따른간조직내지방대사,염� �,간 섬유화관련유전자의발현수준을알아보기위해 ,실험종료후적출한간 조직을이용하여 qPCR(quantitative real time polymerase chain reaction)을 실시하였다.

0이

[101] 그결과,도 5a내지도 5c에서볼수있듯이,와이셀라헬레니카 WiKim0103 균주섭취에따라지방대사관련인자 SREBP- lc(Sterol regulatory element-binding protein- lc),염증관련인자 NF-KB(Nuclear factor-kappa B),간섬유화관련인자 Collal(Collagen type I alpha 1)유전자의발현이감소하는것을확인할수 있었다.

[102]

[103]

산업상이용가능성

[104] 본발명은신규한균주를제공한다.또한본발명� �균주는염증,비만또는 지방간질환의예방,개선또는치료용식품,사료� ��는사료첨가제 ,약학조성물 등으로이용될수있다.

[105]

[106] [수탁번히

[107] 기탁기관명 :한국미생물보존센터 (국외)

[108] 수탁번호 : KCCM12419P

[109] 수탁일자 : 20181214