COMPOSICIÓN PARA IMPEDIR LA FORMACIÓN DE SEMILLAS EN FRUTOS SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca dentro de la industria agroalimentaria y se refiere en concreto a una nueva composición que aplicada sobre la flor de los cultivos de plantas hortícolas y/o árboles frutales, evita la formación de semillas en los frutos de forma eficaz y sin disminución de la cosecha y/o calidad del fruto.

La composición novedosa objeto de la presente invención comprende como agente activo azufre (S) e impide la formación de semillas en el fruto una vez se aplica de acuerdo con el método de la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los mercados para el consumo en fresco son cada vez más exigentes en la calidad interna y externa de frutas y verduras Una de las características de calidad más valorada por parte de los consumidores es la ausencia de semillas _[4] .

Por ello, durante más de dos décadas, investigadores y agricultores han buscado técnicas que eviten la formación de las semillas en variedades y cultivares. La cubrición del cultivo con mallas anti-abejas o el cultivo en invernadero son las técnicas más efectivas hasta el momento _[5] , ya que evitan la presencia de polinizadores y por lo tanto la polinización y fecundación de los óvulos. Los mayores inconvenientes de estas técnicas son el elevado coste de mano de obra y materiales, y en ocasiones una reducción de la cosecha que en mandarinas, por ejemplo, se estima alrededor del 30% _{[1 ,2,5,6]}

Otras técnicas utilizadas como la aplicación de repelentes de abejas basados en complejos de zinc o en extractos de Capsicum annuum, así como las aplicaciones químicas con cobre y ácido giberélico, han obtenido efectividades muy bajas de entre el 10 y el 35% _{[1 ,2,7,8]} · En estos estudios, la escasa reducción de semillas ha sido atribuida al cobre y su efecto inhibitorio sobre la parte masculina, es decir, sobre la germinación del tubo polínico _{[7 ]} . Estas reducciones no resultan suficientes para los objetivos de mejora de calidad y por lo tanto no suponen una mejora del precio de la fruta tratada. En la actualidad, estas técnicas químicas no se usan en campo debido a su baja efectividad, que no compensa el coste del tratamiento. Por último, se pueden obtener nuevas variedades sin semillas a través de la mejora vegetal, híbridos triploides, mutaciones inducidas por rayos gamma o nuevas técnicas biotecnológicas _[9-13] .

Así, por ejemplo, la sandía sin pepitas se obtiene mediante hibridación, cruzando dos plantas, cuyo juego de cromosomas es incompatible. La clave está en poner una planta cerca de otra para que la polinice, pero no la fertilice, de modo que el fruto resultante sea una sandía sin pepitas. En este caso, se cruza el polen masculino de una sandía diploide con la flor femenina de una sandía tetraploide para obtener un híbrido estéril (una sandía triploide), que es incapaz de producir semillas.

Frutas como las naranjas y uvas sin semilla, son ejemplos de mutaciones que, por medio de la selección y el cruzamiento, han producido nuevas variedades.

En otras ocasiones la mutación para producir la fruta sin semillas se produce a través de irradiación con rayos gamma, o más recientemente a través de la técnica de edición de genes (CRISPR) para introducir deliberadamente una mutación que tenga como finalidad la producción de una fruta sin semillas. Esta técnica, está siendo probada en tomates. En este caso, la mutación aumenta los niveles de la hormona auxina, que estimula a las frutas a desarrollarse, aunque no se hayan comenzado a formar semillas.

La patente española ES2323028 describe un método que utiliza la mutación para la obtención de tomates sin semillas. El método se basa en la transferencia y expresión del gen LFY de Arabidopsis thaliana en plantas transgénicas de tomate. Los frutos de las plantas transgénicas con el gen LFY mantienen el mismo tamaño y peso que los del cultivar original, pero carecen de semillas, tienen más carne, menos pulpa y una forma ligeramente apuntillada.

La patente española ES2580166 describe una planta de pimiento generadora de frutos sin semilla, en donde dicha planta se produce de forma estable a lo largo de varias generaciones por retro-cruzamiento, y en donde la planta se obtiene por un método de cruzamiento que comprende las etapas de a) Seleccionar una planta de la primera generación filiar que sea capaz de dar frutos sin semillas y tenga rasgo de esterilidad masculina y un rasgo partenocárpico del grupo de plantas de la primera generación filial, generada por el cruzamiento de una planta de una línea estéril masculina y una planta de una línea partenocárpica; b) Cruzar la planta de la primera generación filial, así seleccionada con una planta de una línea partenocárpica fija que sea capaz de mantener el rasgo partenocárpico y el rasgo de esterilidad masculina de la planta, como un parental polinizador, para generar con ello una planta de progenie que tenga el rasgo partenocárpico y el rasgo de esterilidad masculina; c) Retro-cruzar la planta de progenie así generada de nuevo con una planta de la línea partenocárpica fija utilizada como el parental polinizador de la etapa b), como un parental polinizador, para generar con ello una planta de la progenie que tenga el rasgo partenocárpico y el rasgo de esterilidad masculina.

Pero obtener frutos sin semilla no asegura que esos frutos vayan a tener una buena aceptación en el mercado. La ausencia o presencia de semillas es sólo una de las características de calidad de un conjunto de características que el fruto deberá satisfacer. Por lo que después de muchos años de trabajo es posible que las nuevas variedades partenocárpicas no se implanten adecuadamente _[14,15] . Consecuentemente, una aproximación distinta al problema es, teniendo una variedad exitosa, buscar un tratamiento efectivo que evite la formación de sus semillas, aumentando así su valor.

La presente invención proporciona una composición que aplicada a los cultivos hortícolas y cultivos frutales, esto es, plantas hortícolas y árboles frutales, durante la fase de“flor abierta” impide la formación de semillas en los frutos sin resultar toxica para la planta y los polinizadores, así como sin afectar negativamente a la calidad y cantidad de la cosecha.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es una nueva composición que aplicada sobre la flor de los cultivos es capaz de impedir la formación de semillas en el fruto de las plantas tratadas.

La aplicación debe realizarse durante la fase de flor abierta (antesis) y la composición comprende azufre (S) en calidad de ingrediente activo cuya actividad provoca el colapso de las células papilares del estigma de la flor, y opcionalmente una hormona vegetal cuya actividad ayuda a estabilizar la cosecha. Adicionalmente, la composición comprende un tensoactivo que facilita la aplicación de la composición sobre los cultivos mediante métodos de pulverización. Los autores de la presente invención han descubierto que el azufre (S) una vez aplicado a la flor de la planta hortícola y/o árbol frutal provoca el colapso de las células papilares del estigma impidiendo de esta forma el crecimiento del tubo polínico y, por lo tanto, impidiendo la formación de semillas en el fruto.

Los autores de la presente invención han observado además un efecto reductor de la intensidad de cuajado derivado del efecto anterior. Dependiendo de la concentración a la que se aplica el producto activo, éste puede reducir el número total de frutos en el cultivo, lo que puede resultar beneficioso para obtener menos frutos, pero de mayor tamaño aumentado así el valor comercial de la cosecha. En cultivos con baja o nula capacidad partenocárpica (como por ejemplo árboles frutales de la familia rosáceas) al evitarse la fecundación se evita parcialmente la formación del fruto. Este efecto secundario derivado del efecto principal (colapso de las células papilares del estigma) puede ser de utilidad para regular la cantidad de frutos por árbol en este tipo de cultivos.

A los efectos de la presente invención, los términos “impide, evita y disminuye” la formación y número de semillas en el fruto comprende entre el 95 y el 100% de inhibición del crecimiento de tubos polínicos en el interior del estigma y por lo tanto formación de semillas en flores que puntualmente han sido tratadas de forma homogénea y con la concentración adecuada de producto.

A efectos de la presente invención el término“flor abierta” corresponde con la fase de antesis y comprende el momento en que se abre la flor y el estigma queda expuesto y receptivo para recibir los granos de polen.

A efectos de la presente invención el término“estado de pre-polinización” comprende el estado antes de la llegada de los granos de polen al estigma de la flor.

A efectos de la presente invención el término“estado de post-polinización” comprende el estado después de la llegada de los granos de polen al estigma de la flor.

Es por tanto un objeto de la presente invención, una composición para evitar la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales que comprende azufre (S) y que provoca el colapso de las células papilares del estigma. Es también objeto de la invención una composición según descrita anteriormente caracterizada porque el azufre (S) se encuentra presente en la composición en una cantidad de entre el 50 - 100% (m/m) en peso respecto al peso total de la composición.

Es igualmente objeto de invención una composición de acuerdo con los párrafos anteriores, caracterizada por comprender adicionalmente un tensoactivo para generar una disolución acuosa estable que facilite su aplicación y mejore su efectividad.

Es también un objeto de invención una composición según se describe anteriormente caracterizada porque el tensoactivo se selecciona del grupo que comprende: tensoactivos no iónicos y tensoactivos aniónicos, así como mezclas de los mismos.

También es un objeto de invención una composición como anteriormente detallada caracterizada porque el azufre (S) y el tensoactivo están presentes en la composición en una relación de 100:1 a 1 :10 (azufre : tensioactivo).

También es objeto de invención una composición como anteriormente detallada que comprende adicionalmente una hormona vegetal.

También es objeto de invención una composición como anteriormente detallada caracterizada porque la hormona vegetal se encuentra presente en la composición en una concentración de entre 0 mg.L ^-1 - 500 mg.L ^-1 .

También es objeto de invención una composición según se detalla anteriormente caracterizada porque la hormona vegetal se selecciona del grupo que comprende: ácido giberélico, auxina y citoquina, así como mezclas de los mismos.

Es también un objeto de invención una composición según detallada anteriormente caracterizada porque la hormona vegetal es ácido giberélico.

Es también un objeto de invención una composición según se detalla en párrafos anteriores caracterizada porque el azufre (S) presente en la composición se encuentra en forma de molécula octoatómica (S ₈ ).

Es también un objeto de la presente invención una composición para impedir o disminuir la formación de las semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales que comprende azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ), polisorbato 20 y ácido giberélico. Es también un objeto de la presente invención una composición caracterizada por comprender:

0,1 g.L ^-1 - 100 g.L ^-1 tensoactivo: polisorbato 20

0, 1 g.L ^-1 - 100 g.L ^-1 azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ); y

1mg/L - 300mg/L hormona vegetal: ácido giberélico.

Adicionalmente es también un objeto de invención el uso de una composición según se define en cualquiera de los párrafos anteriores para impedir o, disminuir la formación de las semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales.

Es también un objeto de invención el uso de una composición según se detalla en párrafos anteriores para regular la intensidad de cuajado (número de frutos cuajados por planta) de plantas hortícolas y/o árboles frutales.

Adicionalmente es también un objeto de la presente invención un método para evitar la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales que comprende la etapa de aplicar una cantidad efectiva de la composición según se describe en cualquiera de los párrafos anteriores, donde dicha aplicación se realiza sobre la flor de la planta hortícola y/o árbol frutal durante la fase de“flor abierta”.

También es un objeto de la presente invención un método para evitar la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales según se define anteriormente que comprende la aplicación de una composición de la presente invención según se detalla anteriormente dónde dicha aplicación se realiza sobre la flor de la planta hortícola y/o árbol frutal durante la fase de“flor abierta” en el estado de pre polinización.

También es un objeto de la presente invención un método para disminuir la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales según se define anteriormente que comprende la aplicación de una composición de la presente invención detallada en párrafos anteriores durante la fase de“flor abierta” en el estado de post-polinización.

También es un objeto de la presente invención un método para disminuir la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales según párrafos anteriores, donde la aplicación se realiza mediante pulverización, empapamiento, o métodos similares.

También es un objeto de la presente invención un método para disminuir la formación de semillas en el fruto de plantas hortícolas y/o árboles frutales según se refiere en párrafos anteriores dónde el tratamiento se realiza a través de varias aplicaciones durante el periodo de floración del cultivo.

Adicionalmente es también un objeto de la presente invención un fruto sin semillas caracterizado porque no presenta semillas en su interior a pesar de haber sido polinizado.

Es también un objeto de la presente invención un fruto sin semillas caracterizado porque no presenta semillas en su interior a pesar de haber sido polinizado que ha sido obtenido con el método según se define en párrafos anteriores.

Adicionalmente es también un objeto de la presente invención una planta hortícola y/o árbol frutal tratado con la composición de la presente invención según se ha definido en párrafos anteriores caracterizado porque la planta hortícola y/o árbol frutal se recubre con la composición.

Es también un objeto de la presente invención una planta hortícola y/o árbol frutal, caracterizado porque presenta frutos sin semillas.

Es también un objeto de la presente invención una planta hortícola y/o árbol según se define anteriormente caracterizado porque presenta colapso de las células papilares del estigma.

Y finalmente es también un objeto de la presente invención una planta hortícola y/o árbol frutal según se define en párrafos anteriores caracterizados porque no presenta tubos polínicos creciendo en el estigma una vez se ha producido la polinización de la planta hortícola y/o árbol frutal.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 representa la observación a través de TEM (Microscopía Electrónica de Trasmisión) de diferentes partes de las papilas superiores estigmáticas sanas de una célula papilar“no tratada”, dónde puede apreciarse que la célula está sana, completa y con su forma característica.

La Figura 2 representa la observación a través de TEM de diferentes partes de las papilas superiores dañadas, de una célula papilar tratada con el producto activo de la presente invención, donde puede apreciarse como la célula papilar ha perdido la turgencia y parte de sus componentes y aparece colapsada.

La Figura 3 representa la observación a través del microscopio de fluorescencia de un estigma de flor de mandarina polinizada y sin tratar, donde pueden apreciarse tubos polínicos (presencia“hilos fluorescentes”) creciendo en el interior del estigma y estilo.

La Figura 4 representa la observación a través del microscopio de fluorescencia de un estigma de flor de mandarina polinizado y tratado sólo con el ingrediente activo (S ₈ ) de la presente invención, donde puede apreciarse que no hay tubos polínicos en la zona estigmática (ausencia de“hilos fluorescentes”).

La Figura 5 representa la observación a través del microscopio de fluorescencia de un estigma de flor de mandarino polinizado y únicamente tratado con ácido giberélico sin ingrediente activo (S ₈ ). Claramente puede observarse la presencia de tubos polínicos en el interior del estigma.

La Figura 6 representa la observación a través de microscopía de un corte semi-fino de un estigma de mandarino tratado exclusivamente con el ingrediente activo (azufre), donde se observan las células papilares del estigma dañadas y sin turgencia.

La Figura 7 representa la observación a través de microscopía de un corte semi-fino de un estigma de mandarino tratado exclusivamente con ácido giberélico, donde se observan las células papilares del estigma en buen estado, funcionales y turgentes.

La Figura 8 representa los resultados de un experimento donde se compara la efectividad de 6 productos experimentales (T1-T6). El tratamiento 1 (T1) es el tratamiento con producto activo descrito en la presente invención y es el único que reduce significativamente el número de semillas con respecto al Control positivo (C+) (de 3.3 a 0.4) La Figura 9 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en uva Vitis vinífera L. Fig. 9A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 9B: Estigma tratado con PA sin TP

La Figura 10 representa imágenes de frutos de pepino Cucumis sativus L. Fig. 10A: Frutos de flores polinizadas y no tratadas (semillas). Fig. 10B: Frutos de flores polinizadas y tratadas (sin semillas)

La Figura 11 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en berenjena Solanum melongena L. Fig. 11 A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 11 B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 12 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en sandia Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. Y Nakai. Fig. 12A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 12B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 13 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en clemenules Citrus clementina hort. Ex Tanaka. Fig. 13A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 13B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 14 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en clementina fina Citrus clementina hort. Ex Tanaka. Fig. 14A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 14B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 15 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en Murcott Citrus reticulata Blanco. Fig. 15A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 15B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 16 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en Nova C. clementina x [C.paradisi x C. tangerina] Fig. 16A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 16B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 17 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en limón Citrus limón L. Burm. f. Fig. 17A: Estigma sin tratar (C+) presencia de TP. Fig. 17B: Estigma tratado con PA sin TP.

La Figura 18 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en naranjo. Flores polinizadas y tratadas con PA. No se observa TP. La Figura 19 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en pomelo. Flores polinizadas y tratadas con PA. No se observa TP.

La Figura 20 representa imágenes de microscopía de fluorescencia en lima mejicana. Flores polinizadas y tratadas con PA. No se observa TP.

Las Figuras 21 A y 21 B representan los resultados en fruto de la acción en el tiempo del producto activo de la presente invención, número de semillas x tratamiento Fig.21A (tratamiento pre-polinización) y Fig. 21 B (tratamiento post-polinización)

La Figura 22 muestra la curva de toxicidad respecto al efecto de la aplicación del producto activo en la germinación de los granos de polen.

La Figura 23 muestra el efecto en fitotoxicidad en árboles tras la aplicación del producto activo de la presente invención.

La Figura 24 muestra el efecto del producto activo sobre polinizadores. Fig. 12A muestra porcentajes de mortalidad a las 48 horas. Figura 12B representa el modelo logístico con el logaritmo de las concentraciones. Log (LD50) = 11.84 , por lo tanto, LD50 = 139.017 mg / abejorro.

La Figura 25 muestra el efecto del producto activo sobre la cantidad de la cosecha tras el tratamiento con el producto activo.

La Figura 26 (Figuras 26A - 26C) muestran el efecto de la acción del producto activo sobre la calidad de la cosecha.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención es de aplicación en la industria agroalimentaria, en concreto para la obtención de frutos sin semilla a partir de plantas hortícolas y/o árboles frutales de angiospermas.

Los cultivos de plantas angiospermas tienen la capacidad de producir flores y frutos que poseen una o más semillas en su interior. Cuando se da el proceso de la fecundación, el ovario madura y se transforma en el fruto. Sus órganos reproductores son el androceo, órgano masculino de la flor, y el gineceo o pistilo que es el órgano femenino de la flor en cuyo ovario se encuentra la oosfera o gameto femenino. Las semillas de las plantas angiospermas se encuentran ubicadas dentro del fruto.

Durante la reproducción sexual de las angiospermas, y en concreto en la etapa de polinización, se produce la transferencia del polen de la antera de una flor al estigma de otra o de la misma flor, bien a través del viento o de insectos polinizadores. Una vez el grano de polen llega al estigma, se desarrolla una prolongación en forma de tubo que permite descender al gameto masculino por el estilo y alcanzar el primordio seminal done se encuentra el gameto femenino para fecundarlo. Desde ese momento los primordios seminales se transforman en semillas y el resto del gineceo, principalmente el ovario, en el fruto.

Los estigmas en su madurez pueden ser de dos tipos, húmedos o secos, en función de que segreguen o no un exudado característico. La superficie del mismo es generalmente papilosa. El término “papila” se aplica a aquellas células receptivas estigmáticas individuales o agrupadas que se mantienen significativamente libres entre sí sobre el nivel general de la superficie del estigma. Una vez en el estigma, el polen germina, emitiendo un tubo polínico (TP) a través del cual se desplazan los 2 núcleos germinativos o espermáticos que realizan la fecundación de los gametos femeninos. El tubo polínico debe penetrar a través del tejido del estigma y del estilo para alcanzar el óvulo.

Los autores de la presente invención han descubierto un producto activo de aplicación en cultivos de flores capaz de provocar el colapso de las células papilares del estigma impidiendo de esta forma el crecimiento del tubo polínico y, por tanto, impidiendo la formación de semillas, pero sin alterar la formación del fruto. En concreto, se ha podido comprobar que el producto activo afecta a la zona estigmática de las flores. En esta zona el producto tiene dos efectos: (i) provoca el colapso de las células papilares que se encargan de la recepción del polen y (ii) disminuye la cantidad de exudado (secreción) (Figuras 1 y 2). A consecuencia de este colapso, las células papilares pierden su funcionalidad y aunque llegue polen a la flor, éste es incapaz de crecer hacia el interior (Figuras 3 y 4). Al no poder entrar el polen en la flor, no se produce la fecundación y por lo tanto no se forman semillas.

De esta forma, el producto activo de la presente invención encuentra utilidad en la industria agroalimentaria, en concreto, para la obtención de frutos sin semillas. En una realización preferente de la presente invención el producto activo es de aplicación en cultivos de angiospermas, que producen un fruto con semillas y que poseen cierta capacidad partenocárpica con o sin ayuda de una hormona vegetal. Entre otros cultivos, el producto es aplicable a especies pertenecientes a las familias: rutáceas (mandarinas, tángelos, limones, pomelos, limas, kumquats, naranjas dulces y otros), vitáceas (uva de mesa y otros), cucurbitáceas (sandía, melón, pepino, calabazas, calabacines, y otros) y solanáceas (berenjena, pimiento, tomate, y otros) entre otras familias de plantas cultivadas. El producto activo ha sido probado en familias y especies muy diversas (ver ejemplo 1) observándose siempre el mismo efecto: colapso de las células papilares del estigma que impide el crecimiento de los tubos polínicos, por lo que su acción es amplia y puede ser de utilidad para evitar la formación de semillas en una gran diversidad de cultivos.

De acuerdo con la presente invención, el producto resulta especialmente efectivo cuando se utiliza sobre las siguientes especies y/o variedades de cítricos: clemenules, clementina fina, murcott, nadorcott, nova, y otros tángelos y mandarinas, limones, lima mejicana, pomelos, naranjas dulces y kumquats, así como sobre las siguientes especies y/o variedades hortícolas siguientes: pepino, berenjena, melón, calabacín, y sandia, entre otros.

El producto activo de acuerdo con la presente invención consiste en una composición que comprende azufre (S) en calidad de principio activo de la composición. El azufre (S) se encuentra presente en la composición en una cantidad de entre el 50 - 100% (m/m) en peso respecto al peso total de la composición. De forma preferente, la composición comprende el elemento químico azufre (S) en su forma básica, es decir como molécula octoatómica (S ₈ ) y en tal caso su cantidad en la composición oscila entre el 50 - 100% (m/m) en peso respecto al peso total de la composición. Dicho principio activo puede obtenerse a partir de su forma nativa elemental en depósitos naturales (minas o depósitos subterráneos). Existen, no obstante, productos comerciales que pueden utilizarse a los fines de la invención, por ejemplo, azufre Quimetal®, Lucava®, Diranzo®, azufre agrícola Repsol®, etc.

La concentración, a la cual debe estar presente el azufre (S) en la composición dependerá del cultivo y del efecto deseado. En general, el azufre (S) y en concreto el azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) está presente en una cantidad de entre el 0,01 - 10% (m/v). Esto es, la concentración de azufre en el producto puede oscilar entre 0,1 g.L ^-1 - 100 g.L ^-1 .

En una realización particular de la presente invención, el contenido de azufre (S) en general y azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) presente en la composición es de entre 0,5 - 4 % (m/v), si el producto está destinado a su aplicación en cítricos, tales como mandarina. Si el producto está destinado a su aplicación en especies hortícolas, el contenido en azufre (S) en general y azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) en particular, presente en la composición es de entre 0, 1 - 1 ,5 % (m/v).

En una realización particular de la presente invención, el producto activo comprende de forma adicional al componente azufre (S) tal y como se ha detallado en párrafos anteriores, un tensoactivo para conseguir una disolución acuosa estable y homogénea del ingrediente activo, azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ). Los tensoactivos que pueden formar parte de la formulación del producto activo se pueden seleccionar de los siguientes grupos: (i) tensoactivos no iónicos, como: polisorbato 20 o monolaurato de polioxietilen (20) sorbitano (nombre comercial Tween®20), octyl phenol ethoxylato (nombre comercial Tritón® X-100), n-dodecil^-D-maltósido (DDM), digitonina, monooleato de polioxietilen (20) sorbitano (nombre comercial Tween®80), ésteres de sorbitano, alquil poliglucósidos (APG), nonilfenoletoxilados (nonoxinoles), alcoholes grasos propoxilados (FAPO) y polialquilenglicoleter (alcoholes grasos etoxilados (FAEO)); (ii) tensoactivos aniónicos, como: jabón de sosa o de potasa, ésteres carboxílicos, alquilcarboxilatos, derivados de ácidos carboxílicos, y tensoactivos acrílicos; así como mezclas de los mismos. De forma preferente, la composición de la presente invención comprende el tensoactivo no iónico: polisorbato 20.

En una realización particular de la presente invención, el tensoactivo y el principio activo azufre (S) aparecen en la composición en una relación desde 100:1 hasta 1 :10 (ingrediente activo: tensioactivo) dependiendo de las características del estigma que se va a tratar. Para estigmas húmedos se puede disminuir la cantidad de tensoactivo (10:1), mientras que para estigmas secos puede ser necesaria una mayor proporción (1 :5). Preferentemente, la relación entre tensoactivo y azufre (S) en la composición es de 1 : 1.

En otra realización particular de la presente invención, el producto activo de la presente invención comprende: polisorbato 20 y el principio activo azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ). En tal caso, el tensoactivo y el principio activo azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) aparecen en la composición en una relación desde 100: 1 hasta 1 : 10 (ingrediente activo: tensoactivo), dependiendo de las características del estigma que se va a tratar. Preferentemente, la relación entre tensoactivo y azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) en la composición es de 1 :1.

En otra realización particular de la presente invención, el producto activo comprende además de los componentes azufre (S) y tensoactivo, una hormona vegetal o regulador de crecimiento de plantas. Las hormonas vegetales que pueden formar parte de la formulación del producto activo de la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende: ácido giberélico (AG), auxinas y citoquinas, así como mezclas de los mismos. De forma preferente, la composición de la presente invención comprende la hormona vegetal: ácido giberélico.

El ácido giberélico (o giberelina A ₃ , AG, AG ₃ , AG _X ) es una hormona vegetal que se encuentra en las plantas. Su fórmula química es C ₁₉ H ₂₂ O ₆ . Cuando se encuentra purificada, es un polvo cristalino blanco a pálido amarillo, soluble en etanol y algo soluble en agua.

El AG ha sido ampliamente estudiado como hormona vegetal relacionada con el crecimiento y la división celular; es una hormona que estimula el crecimiento _[16-19] ·

En la fase de floración y cuajado inicial de los frutos el AG juega un papel esencial en el interior de los ovarios _[20,21] . La formación de semillas genera AG, y éste actúa como señal hormonal que acentúa el carácter sumidero del ovario; esta señal provoca que la planta envíe más carbohidratos a ese ovario en particular, lo que provoca que crezca, cuaje y termine formando un fruto _[22,23] ·

Al evitar la formación de las semillas a través de la acción del principio activo de la presente invención, se puede eliminar un estímulo (en forma de AG) importante para el cuajado, lo que podría suponer una reducción de la cosecha. Algunas variedades y cultivares sin semillas o que se cultivan bajo malla anti-abeja presentan problemas de cosecha _{[1 ,2,5,6]} . Variedades altamente productivas y partenocárpicas (sin semillas) suelen presentar altos niveles naturales y endógenos de AG _[20,21] ·

Por todo ello el formulado podría incorporar de forma ventajosa una cierta cantidad de AG u otra hormona de crecimiento como las auxinas, que contrarreste la posible pérdida de estímulo causada por la no formación de las semillas. La cantidad de hormona necesaria dependerá del cultivo, la variedad y otros factores e irá en combinación con el producto activo.

La fermentación de fuentes nitrogenadas, carbonadas y sales minerales es la forma natural de obtener giberelinas comerciales. Como fuente carbonada se emplea glucosa, sacarosa y harinas naturales, y se aplican sales minerales de fosfato y magnesio.

El proceso precisa de 5 a 7 días para una efectiva fermentación. Se requieren condiciones de agitación y aireación constante, manteniendo un promedio de 28°C a 32 C, y niveles de pH de 3-3,5.

El proceso de recuperación de las giberelinas se realiza a través de la disociación de la biomasa del caldo fermentado. En este caso el sobrenadante libre de células contiene los elementos utilizados como reguladores del crecimiento vegetal.

A nivel de laboratorio, las partículas de giberelinas pueden ser recuperadas a través de un proceso de columnas de extracción líquido-líquido. Para esta técnica se emplea el acetato de etilo como disolvente orgánico. En su defecto, se aplican resinas de intercambio aniónico al sobrenadante, logrando la precipitación de las giberelinas mediante elución por gradiente. Finalmente, las partículas son secadas y cristalizadas de acuerdo al grado de pureza establecido.

Los productos comerciales que pueden ser utilizados a los efectos de la presente invención son: Semefil®, Berelex®, Novagib®, etc.

La concentración de AG presente en la composición/producto activo de la presente invención dependerá del cultivo y de otros factores como la intensidad de la floración. En una realización particular de la presente invención, la concentración de AG en la composición/producto activo es de entre 0 mg.L ^-1 - 500 mg.L ^-1 , preferentemente de entre 1 mg.L ^-1 - 300 mg.L ^-1 .

En una realización particular de la presente invención, el producto activo de la presente invención comprende: tensoactivo no iónico, el principio activo azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) y ácido giberélico. De forma preferente, el producto activo, es decir, la composición de la presente invención comprende: polisorbato 20, el principio activo azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ) y ácido giberélico. Una realización preferente de la presente invención comprende:

0, 1 g.L ^-1 - 100 g.L ^-1 tensoactivo: polisorbato 20

0, 1 g.L ^-1 - 100 g.L ^-1 azufre (S) como molécula octoatómica (S ₈ ); y

1 mg.L ^-1 - 300 mg.L ^-1 hormona vegetal: ácido giberélico.

El procedimiento de preparación de la composición/producto activo de la presente invención se realiza de acuerdo con la práctica común conocida para el experto en la materia y comprende las etapas de: mezclar y agitar, el tensoactivo junto al azufre (S), sin adición de agua, hasta que el tensoactivo recubra adecuadamente las moléculas de azufre (S), posteriormente adicionar agua hasta obtener la disolución concentrada deseada y finalmente adicionar la hormona vegetal a la disolución concentrada del producto activo.

Los métodos de aplicación del producto activo de la presente invención sobre las flores de los cultivos, son los métodos habituales para la aplicación de productos de síntesis química sobre los cultivos. De forma particular se contempla la aplicación del producto activo/composición sobre los cultivos a través de la maquinaria convencional de atomización para tratamientos agrícolas. En concreto se contempla la aplicación mediante pulverización, empapamiento y sistemas similares.

Para ello, previo a su aplicación, el producto activo concentrado obtenido según se ha detallado en párrafos anteriores será diluido en agua hasta la obtención de la concentración recomendada según el cultivo.

Por ejemplo, para maquinaria convencional de pulverización con una cuba de 100 L y para una concentración de 2% producto activo 1 :1 tensoactivo y 40 mg. L ^-1 AG, se preparará una disolución concentrada con 2 L de polisorbato 20 + 2 kg de azufre + 0,25 L de disolución de AG (concentrada 16 g.L ^-1 de ácido giberélico) + 1 ,75 L. agua hasta conseguir una disolución homogénea de todos los componentes. Esta disolución concentrada se introduce en la cuba y se enrasar hasta 100 L (para ello se necesitarán 96 L adicionales de agua). Remover toda la mezcla con el turbo-presión de la cuba, previamente a su aplicación para homogenizar la mezcla. Por otro lado, el tiempo para la aplicación del producto activo será de forma preferente: a primera hora de la mañana para evitar los momentos de máxima insolación y temperatura tal y como ocurre con otras aplicaciones fito-reguladoras. Así, además se accede a la flor en el momento de mayor receptividad. La dosis de producto activo necesaria para la obtención de resultados efectivos se determina en función del volumen de copa o follaje y de la intensidad de la floración.

El ingrediente activo, el azufre, preferentemente como molécula octoatómica (S ₈ ), es el encargado de evitar la formación de las semillas a través de la alteración de las células papilares del estigma, mientras que el AG es el encargado de reestablecer el estímulo necesario para el cuajado y la formación del fruto, evitando así una posible disminución de cosecha. La necesidad de AG dependerá de cada cultivo y su capacidad partenocárpica. A pesar de que inicialmente se sugirió que el AG podía reducir el número de semillas por sí mismo _[7] , posteriormente se ha comprobado que en condiciones reales de campo las aplicaciones con AG no son efectivas para reducir el número de semillas, no encontrándose diferencias significativas entre el control y los tratamientos _{[1 ,2]} . En este sentido el ácido giberélico no altera las células papilares, y por lo tanto no interviene en el mecanismo básico que impide la aparición de las semillas. Este mecanismo es sustancialmente debido a la acción del azufre. Este hecho queda demostrado a través de la Figura 4 y 5 donde se han polinizado y luego tratado dos estigmas de mandarino, uno sólo con ingrediente activo (S ₈ ) (Figura 4), sin tubos polínicos, y otro sólo con AG (Figura 5), donde claramente se observa desarrollo de tubos polínicos. En las Figuras 6 y 7 se puede comparar el efecto por separado del ingrediente activo (azufre) y el ácido giberélico (AG) sobre las células papilares a través de cortes semi-finos de microscopía. La Figura 7 representa un corte semi-fino del estigma de una flor de mandarino exclusivamente tratado con AG, donde se observa que las células papilares del estigma están enteras, funcionales y turgentes; mientras que la en la Figura 6 se pueden observar células dañadas por la aplicación del azufre. Es decir, el AG por sí mismo no daña las células papilares y por lo tanto no impide el crecimiento de los tubos polínicos.

El efecto doble de eliminación de la semilla y restitución del estímulo para el cuajado, debe realizarse en la fase de flor abierta (antesis) y por lo tanto su aplicación combinada y sincrónica asegura los mejores resultados. El tensoactivo es necesario para conseguir una solución homogénea y estable del ingrediente activo en agua, permitiendo su mezcla con el tercer componente (la hormona vegetal) y su aplicación líquida en campo a través de la maquinaria convencional de atomización para tratamientos agrícolas.

De acuerdo con el trabajo experimental que a continuación se detalla, los autores de la presente invención han podido confirmar que la aplicación del producto activo de acuerdo con la presente invención produce resultados muy satisfactorios tanto al aplicarlo directamente sobre la flor, consiguiendo eficiencias del 95 - 100%, como cuando se aplica sobre árboles enteros, con una efectividad aproximada del 85% en los resultados obtenidos en árboles de mandarinas variedad Nadorcott. El producto activo fue probado simultáneamente junto a otros 5 posibles productos experimentales, siendo el producto activo el único que producía una reducción significativa del número de semillas en mandarina (Figura 8). En este experimento se probaron 3 fertilizantes inorgánicos (T1 = azufre; T2 = nitrato amónico y T3 = nitrato potásico) y 3 polisacáridos (T4 = glucosa; T5 = celulosa; y T6 = sacarosa) sobre árboles enteros de la variedad Nadorcott (mandarino). Posteriormente se recolectaron 120 frutos de cada tratamiento y se contó el número de semillas en cada fruto. El producto activo azufre fue el único que redujo significativamente el número medio de semillas al compararlo con el control positivo.

Tabla 1 : Efecto de los diferentes tratamientos sobre el número de semillas de los frutos. Se ha utilizado el test de Kruskal Wallis (KW) de comparación de medias debido a la no normalidad de los residuos. Diferentes letras significan diferencias significativas. El producto activo de acuerdo con la presente invención presenta además importantes ventajas respecto a otros métodos y productos del estado de la técnica utilizados a los mismos fines. En concreto las ventajas destacadas son:

Mayor efectividad que el resto de tratamientos agronómicos (más del doble).

Efecto duradero y acción permanente en cultivos tratados: la flor tratada queda permanentemente disfuncional para el crecimiento de tubos polínicos hacia el interior del ovario y por lo tanto incapaz de formar semilla durante toda su vida útil.

- Capacidad para abortar polinizaciones ya iniciadas: el producto activo es capaz de evitar fecundaciones aun cuando el tubo polínico ha recorrido la mitad de su trayecto hacia el óvulo.

No presenta toxicidad para la planta, es decir, a las concentraciones recomendadas para cada cultivo (por ejemplo, por debajo del 4% para cítricos), no produce necrosis, clorosis o defoliaciones.

No es tóxico para insectos polinizadores, en particular, abejorros.

No tiene efecto significativo sobre la cantidad de cosecha.

No tiene efecto sobre los parámetros de calidad del fruto: % cáscara, % de zumo, % de pulpa, vitamina C, grados Brix, acidez total, índice de madurez, peso unitario y color de los frutos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Efectividad del producto activo en distintos cultivos

El producto activo ha sido probado en multitud de cultivos, a diferentes escalas:

Flor: tratamientos a flores individualizadas y observación al microscopio de fluorescencia. En este caso se evaluó la presencia o ausencia de tubos polínicos (TP) en el estigma y su porcentaje de reducción frente a los controles positivos. Fruto: tratamientos a flores individualizadas y observación posterior del fruto que se ha formado a partir de la flor tratada.

Árbol: árbol individualizado.

Campo: tratamientos con tractor sobre filas enteras de árboles adultos.

Los resultados que se muestran a continuación confirman la efectividad del producto según se ha descrito en la presente memoria, tal y como puede observarse a través de las imágenes de microscopía de fluorescencia en las correspondientes Figuras, según los siguientes parámetros: Todas las flores primero polinizadas y luego tratadas o no tratadas. C+ = Control positivo = flor polinizada pero NO tratada con producto activo; TP = Tubos polínicos (hilos fluorescentes); PA = Producto activo.

Ejemplo 2: Experimentos sobre la acción en el tiempo del producto activo de la invención

Para estudiar la acción en el tiempo del producto se realizaron dos experimentos sobre flores de mandarino Nadorcott, uno de pre-polinización y otro de post-politización. En el experimento de pre-polinización se trataron con el producto de la invención (S ₈ ), 300 flores que posteriormente fueron polinizadas por tandas. Una tanda fue polinizada el mismo día (DO), otra tanda al día siguiente (D1), y así sucesivamente hasta el D9.

Resultado: en la Figura 21A se observa que el Control positivo (C+) presentó 4,67 semillas de media, mientras que el fruto del resto de tratamientos de DO a D9 no presentaron ni una sola semilla. Esto quiere decir que la acción del producto es permanente: una vez una flor ha sido tratada con el producto, aunque reciba polen en los días sucesivos (1-9), ha quedado permanente inhabilitada para formar semillas.

En el experimento de post-polinización primero se polinizaron 360 flores. En este caso, después de haber sido polinizadas una tanda fue tratada con el producto el mismo día (DO), otra tanta el día siguiente (D1) y así sucesivamente hasta el día 9 (D9).

Resultado: en la Figura 21 B se puede observar que los frutos del Control positivo (C+) presentaron 4,7 semillas de media. El producto activo fue capaz de evitar el 100% de las semillas (a pesar de estar desarrollándose el polen) durante los 4 primeros días (DO a D3), y aproximadamente el 50% de semillas durante los siguientes 6 días (D4-D9).

Ejemplo 3: Experimento del efecto de aplicación del producto activo de la presente invención en la germinación de los granos de polen

Se estudió la acción del producto sobre la germinación del grano de polen. Para ello se sembró granos de polen en placas petri en condiciones de laboratorio en cuyo medio de crecimiento se añadieron concentraciones crecientes del producto activo (S ₈ ). A las 72 horas se evaluó y contó el número de granos de polen germinados en cada placa petri.

Se usó un producto neutro (testigo) No tóxico, el KN0 ₃ para poder comparar los resultados con los obtenidos con el producto activo (PA). Resultado: Según se muestra en la Figura 22, el producto activo tiene efecto inhibitorio sobre la germinación de los granos de polen. La curva de toxicidad se inicia a 2, 20, 200, y la inhibición es total a 2000 mg/l.

Ejemplo 4: Experimento sobre fitotoxicidad

Las pruebas de fitotoxicidad se realizaron sobre árboles adultos de mandarino Nadorcott. Para ello se pulverizaron los árboles con diferentes concentraciones de producto activo (S ₈ ). Se evaluó el grado de afección sobre clorosis, necrosis y defoliaciones, en una escala del 1 al 6, siendo el 1 muy bajo y el 6 muy alto.

Resultados: según se muestra en la Figura 23, las pruebas preliminares indican que el producto activo no es fitotóxico para mandarinos a las concentraciones recomendadas (por debajo del 4%). A estas concentraciones no presenta clorosis, necrosis o defoliaciones.

Ejemplo 5: Experimento sobre el efecto del ingrediente activo sobre los polinizadores

Los experimentos para estudiar el efecto del producto sobre los polinizadores se realizaron en laboratorio sobre abejorro común (Bombus sp.) siguiendo protocolos oficiales. El número total de abejorros utilizados para los experimentos fue de 560.

Resultados: en la Figura 24A se observa la frecuencia de mortalidad a las 48h según el tratamiento. Los 4 primeros tratamientos no presentan diferencias significativas con el control (H ₂ O) y tienen una moralidad de entre el 14 al 18% muy por debajo del 50% característico de la Dosis Letal 50 (LD50). PAP_10 representa 1000 mg / abejorro.

La escala internacional establece: - altamente tóxico (LD50 aguda < 2 mg / abeja) - moderadamente tóxico (LD50 aguda 2 - 10.99 mg / abeja) - levemente tóxico (LD50 aguda 11 - 100 mg / abeja) - no tóxico (LD50 aguda > 100mg / abeja ).

Es decir que si la LD50 está por encima de 100 mg /abejorro es clasificado como“no tóxico”. En este caso la dosis 1000 mg / abejorro sigue sin matar al 50% de los individuos de la población. Es el tratamiento PAP_1000 el que, produce una mortalidad del 50% de abejorros, y se equipara con el tratamiento MCP (metil-Clorpirifos: insecticida utilizado como control negativo). Por lo tanto, se necesita una concentración de 100.000 mg / abejorro para producir una mortalidad del 50% y por lo tanto el ingrediente activo puede clasificarse como“no tóxico” para abejorro.

En la Figura 24B se observa el ajuste al modelo logístico. El modelo aporta una DL50 = 139.017 mg / abejorro lo que coincide con la Figura 24A de porcentajes de mortalidad (PAP_1000). Ejemplo 6: Experimento sobre el efecto del producto activo sobre la cosecha

El efecto sobre la cantidad total de cosecha por árbol de mandarino se midió en un experimento de campo, realizado con tractor sobre filas enteras de árboles adultos de mandarina Nadorcott y con 3 concentraciones crecientes de producto activo (S ₈ + polisorbato 20 1 :1) (D, E y F). La cosecha se midió en 56 árboles enteros.

Tabla 2: Resultados de la anova de las cosechas en cada tratamiento

Resultado: la Tabla 2 y Figura 25 muestran que no hay diferencias significativas en la cantidad total de cosecha entre los tratamientos ya que en el test HSD todos los tratamientos muestran la misma letra“a”. Los parámetros de calidad de cosecha se midieron en el experimento“árbol 2017” sobre tratamientos a árboles jóvenes de mandarina Nadorcott. Las mediciones se realizaron sobre 48 mandarinas por tratamiento. Cada columna representa un tratamiento distinto.

Resultado: Según se muestra en la Figura 26 (A - C), el producto activo (PA) no tiene efecto sobre los parámetros de calidad: % cascar, % de zumo, % de pulpa, vitamina C, Brix, acidez total, índice de madurez, peso unitario, o color de los frutos. Referencias bibliográficas

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