발명의 명칭 :프로바이오틱스를유효성분으로포함하는이� �성 골다공증의 예방또는치료용조성물 기술분야

[1] 본발명은대한민국농림축산식품부의지원하에 서과제번히 PET117051-3에 의해이루어진것으로서,상기과제의연구관리� �문기관은

농림식품기술기획평가원,연구사업명은 "고부가가치식품기술개발사업 ", 연구과제명은 "원발성및이차성골다공증개선효과를갖는기� �성

프로바이오틱스제품개발”,주관기관은（주� �종근당바이오,연구기간은

2017.06.15-2019.12.31이다.

[2] 본특허출원은 2018년 W월 30일에대한민국특허청에제출된대한민국

특허출원제 10-2018-0131060호에대하여우선권을주장하며,상� �특허출원의 개시사항은본명세서에참조로서삽입된다.

[3] 본발명은프로바이오틱스를유효성분으로포함 하는이차성골다공증의 예방 또는치료용조성물에관한것이다.

[4]

배경기술

[5] 골다공증（Osteoporosis）은연령과폐경등정상생 리적변화에기인하여골량이 감소하는일차성골다공증（원발성, primary）과,연령과관계없이질환이나 약물에노줄되어초래되는이차성골다공증（속 발성 , secondary）,크게두가지로 분류된다.흔히골다공증은노년기의질병이라� �생각하기쉽지만,이차성 골다공증의경우노령이아닌경우에도발병할수 있고,이경우향후환자의 삶의질에미치는영향이매우크기때문에이차성 골다공증의치료및예방 방법을개발하는것은매우중요하다.

[6] 이차성골다공증의원인들은매우다양하다.여� �전신질환과약물등이

원인으로알려져있으나,이중글루코코르티코� �드복용으로인한골다공증이 가장흔하다.글루코코르티코이드（Glucocorticoid : GC）는항염증과면역억제 기능이 있어류마티스관절염,천식,아토피피부염,관절 염등여러질병의 치료에보편적으로사용되는약제이다. GC의장기간투여는이러한질병을 효과적으로억제하지만,대부분환자에게서조� �세포와파골세포의정상적인 활성을저해하여골다공증을초래한다.통계적� �로살펴보면, GC를투여하는 환자의경우 1년이내골밀도의 12%가급격히감소되고그이후로는뼈의 손실이서서히진행되어 2~5%정도의골밀도가매년점차적으로감소됨이 보고된바있다.위와같은 GC투여에의한이차성골다공증을예방하기 위해서는 GC의투여를중단하는것이가장이상적인방법이� ��는하나,해당 질병의치료를위해서는소량이라도복용이지속 되어야한다는점에서문제가 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317 된다.

[7] GC의장기투여로인한골다공증을예방할수있는� ��품을함께섭취하는것도 좋은대안이될수있지만,시중에서판매중인제� �들은대부분폐경기여성,및 노인성골다공증과같은’원발성골다공증’을 개선하기위한건강기능식품이며, 이차성골다공증을예방할수있는제품은아직까 지개발된바없다.따라서 이차성골다공증의예방,개선또는치료용도의� �품또는의약품의개발이 절실히필요한실정이다.

[8]

발명의상세한설명

기술적과제

[9] 본발명자들은향후골다공증의 예방,개선또는치료용도의식품및

의약품으로응용이가능한프로바이오틱스균주 및이를이용한발효유를 개발하고자하였다.그결과,프로바이오틱스균� ��를사용하여발효유를제조한 후이를글루코코르티코이드-유도이차성골다� �증실험동물에게경구 투여하면골밀도및골비율의증가되고,칼슘관� �흡수및대사에관련된 유전자의발현이증가됨을규명함으로써,본발� �을완성하게되었다.

[1이 따라서,본발명의목적은수탁번호 KCTC13686BP인락토바실러스플란타럼 ( Lactobacillus plantarum) A41균주를제공하는것이다.

[11] 본발명의다른목적은상기락토바실러

A41균주를유효성분으로포함하는골다공증의 예방또는치료용약제학적 조성물을제공하는것이다.

[12] 본발명의또다른목적은상기락토바실러스플란 타럼 (LactoZ?예

) A41균주를유효성분으로포함하는골다공증의예 방또는개선용

식품조성물을제공하는것이다.

[13] 본발명의또다른목적은상기락토바실러스플란 타럼 (LactoZ?예

) A41균주를유효성분으로포함하는조성물을대상 체에투여하는단계를 포함하는골다공증의예방,개선또는치료방법� �제공하는것이다.

[14] 본발명의다른목적및이점은하기의발명의상세 한설명,청구범위및도면에 의해보다명확하게된다.

[15]

과제해결수단

[16] 본발명의일양태에따르면,본발명은수탁번호 KCTC13686BP인

plantarum) A41균주를제공한다.

[17] 본발명자들은락토바실러스플란타럼 (LactoZ?예 i plantarum) A41

균주 (수탁번호 : KCTC13686BP)를신규분리하였다.또한,본발명자들� ��상기 락토바실러스 plantarum) A41균주 (수탁번호 :

KCTC13686BP)를이용하여발효유를제조하였다.상� �균주에의해제조된 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317 발효유는이차성골다공증을유도한실험동물모 델에투여한결과,골밀도및 골비율이증가되는효과가있음을확인하였다.� �아가,상기 발효유를투여한 실험동물모델의장내에서발현되는칼슘흡수관 련단백질의 발현량이 증가되고,혈중칼슘농도가증가되며 ,파골세포분화억제 및조골세포분화 촉진과관련된유전자의 발현량을조절함을확인하였다.

[18] 위결과로부터，본발명의락토바실러스플란타 럼 (LactoZwd// plantarum) A41 균주 (수탁번호 : KCTC13686BP)를이용하여 제조된발효유는이차성

골다공증의 예방,개선,또는치료에유용하게사용될수있음� ��확인하였다.

[19]

[20] 본명세서에서용어 "골다공증 (osteoporosis)”은”골량의감소와미세구조의

이상을특징으로하는전신적인골격계질환으로 ,결과적으로뼈가약해져서 부러지기 쉬운상태가되는질환”을말한다.골강도는골� � (quantity)과

골질 (quality)에 의해결정된다.골량은주로골밀도 (BMD)에의해표현되고 골질은구조,골교체율,무기질화,미세손상축적 등으로구성된다.현재는 골밀도를측정하여골다공증을진단하고있다.

[21] 골다공증은일차성과이차성골다공증으로분류 된다.일차성골다공증또는 원발성 골다공증은폐경으로인한제 1형 골다공증과노화로인한제 2형 골다공증으로편의상분류하지만거의같은시기 에 병합되어 진행되므로 정확히분류하기 어려운것으로알려져 있다.이차성골다공증은기저질환이나 약물에 의해뼈의 미세구조가변하고골량이감소하여 골절위험도가증가한 것을말한다.이차성골다공증의 원인으로내분비질환 (갑상선중독증,당뇨병, 부갑상선기능항진증등),위장관질환 (위절제줄,만성 간질환,흡수장애증후군, 염증성장질환,알코올중독등),골수질환,결체� �직질환 (강직성척추염, 류마티스관절염,골형성부전증등),약물등이 있다.남성에서 가장흔한원인은 성선기능저하증,글루코코르티코이드투여등� �다.

[22] 본발명의 일구현예에서,상기골다공증은이차성골다공� �이고,보다

구체적으로는글루코코르티코이드계 약물투여에의한이차성골다공증이다. 상기글루코코르티코이드계 약물은코르티솔,프레드니손,프레드니솔론, 메틸프레드니솔론,코르티손,하이드록시코르� ��손,트리암시놀론,베타메타손, 또는덱사메타손이나,이에 한정되는것은아니다

[23]

[24] 본발명에있어서,상기락토바실러스플란타럼(1 ^¾^0& _<¾ ^7/ 1 때11111)쇼41 균주는 "한국생명공학연구원미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC)”에수탁번호” KCTC13686BP”로기탁된것이다.

[25] 상기락토바실러스플란타럼 (LactoZ¾?cz7/i«· plantarum) A41균주의균체성상은 다음과같다:

[26] -서열번호 1의 16s rRNA서열을포함함

[27] -그람양성 막대모양또는구형간균의 형태임 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317

[28] -인간의 입,위장,여성성기관의정상세균총의 일부이며,일반적으로음식에 사용하는것에 대해 안전하다고여겨진다 (probiotics와발효음식 ). L. plantarum은 Lactobacillus속구성원이며,일반적으로많은발효� ��품과혐기성식물의 물질에서 발견되며타액에도존재하기도한다.

[29]

[3이 따라서，본발명의다른일양태에따르면,본발� �은수탁번호

KCTC13686BP인락토바실러스플란타럼 (Lac plantarum) A41균주, 또는이의 배양물을유효성분으로포함하는골다공증예방 또는치료용 약제학적조성물을제공한다.

[31] 본발명의또다른일양태에 따르면,본발명은수탁번호 KCTC13686BP인

락토바실러스플란타럼 plantarum) A41균주,또는이의 배양물을 유효성분으로포함하는골다공증예방또는개선 용식품조성물을제공한다.

[32]

[33] 본발명의 일구현예에서,상기조성물은유효성분으로락� �바실러스퍼멘텀 ( Lactobacillus fermentum),락토바실러스카제이 {Lactobacillus casei),

락토바실러스애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus),락토바실러스

불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus),락토코커스락티스 (

Lactococcus lactis),엔테로코커스페시움 (Enterococcus faecium),엔테로코커스 페칼리 :느 (Enterococcus fecalis),스트렙토코커스써모필러스 ( _« Sireptococci thermophilus),비피도박테리움비피덤 (Bifidobacterium bifidum),및비피도 박테리움락티스 (Bifidobacterium lactis)로이루어진군으로부터선택되는 1종 이상의균,또는이의 배양물을추가적으로포함한다.

[34] 본발명의구체적인구현예에서 ,상기 락토바실러스퍼멘텀은락토바실러스 퍼멘텀 SRK414균주 (수탁번호 KCTC13687BP)일수있다.

[35] 본발명에 있어서,상기락토바실러스퍼멘텀 SRK414균주는

"한국생명공학연구원미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture,

KCTC)’’에수탁번호’’KCTC13687BP”로기탁� �것이다.

[36] 상기락토바실러스퍼멘텀 SRK414균주의균체성상은다음과같다:

[37] -서열번호 2의 16s rRNA서열을포함함

[38] -그람양성 막대모양또는구형간균의 형태임

[39] -인간의 입,위장,여성성기관의정상세균총의 일부이며,일반적으로음식에 사용하는것에 대해 안전하다고여겨진다 (probiotics와발효음식). L. fermentum 은 Lactobacillus속구성원이며,이속에속하는종들은� ��양한활용이

가능하다고한다.이러한활용은식품과사료발� �를포함한다. L. fermentum중 몇균주들은항생제 및화학요법제에 대해자연내성을갖는것으로밝혀져 있다.

[4이

[41] 본발명의조성물들의유효성분인상기균주,또� �이의 배양물은상기균주를 단리 및/또는정제한균체외에균체를포함하는배양� �,균체의추출물,배양물 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317 상층액,이들의농축액,농축물,건조물,또한필� �에 따라서 희석액,희석물 등이며 ,배양액 ,배양물을처리하여 얻어지는모든상태의 것을포함한다.

[42] 상기균체의 배양법,추출법,분리법,농축법,건조법,희석법� ��은특별히

한정되지 않는다.

[43] 균체를배양하기 위한배지로는통상적으로탈지유,훼이 ,카제인등의우유 단백질,당류,효모엑기스등을포함하고있으며, 배양방법으로는일반적인 각종호기적또는혐기적인방법을적당히사용할 수있다.

[44] 배양온도로는예를들어 35 45 ^O C를설정하고,배양중에는수산화나트륨등� �� 알칼리를사용하여 배지의 pH를중성으로부터산성,예를들어 pH가 5~6정도가 되도록유지하는중화배양법을사용할수도있다 .이와같은중화배양법외에 회분배양법등의 임의의 배양방법을사용할수있으며,배양한후에는필� �에 따라서 배양물이나그상층액을농축,건조,희석등을할� ��도있다.

[45] 또한원심분리법이나막분리법을사용하여 배양물의상층액과균체를

분리하여균체를농축한상태로회수할수도있다 .그리고균체에초음파처리나 효소처리등을행하여균체내의성분을추출하거 나,배양물이나그상층액, 균체나그추출물등을건조할수도있다.이들은� �발명의상기조성물의유효 성분으로서사용할수있다.

[46] 본발명의조성물이식품조성물로제조되는경우 ,유효성분으로서상기

유산균뿐만아니라,식품제조시에통상적으로� �가되는성분을포함할수 있다.상기 첨가성분은예컨대단백질,탄수화물,지방,영양 소,조미제및 향미제를포함한다.상기탄수화물로는모노사� �라이드（예를들어,포도당,과당 등）,디사카라이드（예를들어 말토스,수크로스,올리고당등）및

폴리사카라이드（예를들어 덱스트린,사이클로덱스트린등과같은통상적� �당 및자일리톨,소르비톨,에리트리톨등의 당알콜이다.향미제로서천연향미제 （타우마틴,스테비아추출물（예를들어 레바우디오시드 A,글리시르히진등））및 합성 향미제（사카린,아스파르탐등）를사용할수� �다.

[47] 예컨대,본발명의식품조성물이드링크제로제� �되는경우에는본발명의 유효성분인상기균주이외에구연산,액상과당,� ��탕,포도당,초산,사과산, 과즙,대추추출액또는감초추출액등을추가로� �함시킬수있다.

[48] 본발명의식품조성물은식품,기능성식품（funct ional food）,

영양보조제（nutritional supplement）,건강식품（heal比 i food）및식품첨가제（food additives）등의모든천연소재의가공형태를포함 한다.상기유형의식품 조성물은당업계에공지된통상적인방법에 따라다양한형태로제조될수있다.

[49] 예를들면,건강식품으로는상기유산균자체를� �,주스및드링크의 형태로 제조하여 음용하도록하거나,과립화,캡슐화및분말화하� �� 섭취할수있다. 또한,식품으로는음료（알콜성음료포함）,과� ��및그의 가공식품（예:

과일통조림,병조림,잼,마아말레이드등）,어� �,육류및그가공식품（예:햄, 소시지콘비이프등）,빵류및면류（예:우동,메 밀국수,라면,스파게티,마카로니 2020/091179 1»（：1/10公019/007317 등）,과즙,각종드링크,쿠키,엿,유제품（예:요 거트,발효유,버터,치즈등）, 식용식물유지,마아가린,식물성단백질,레토르 트식품,냉동식품,각종 조미료（예:된장,간장,소스등）등본발명의유 산균을첨가하여제조될수있다. 또한,본발명의유산균을식품첨가제의형태로� �용하기위해서는분말또는 농축액형태로제조하여사용할수있다. 본발명의조성물이약제학적조성물로제조되는 경우,본발명의약제학적 조성물은약제학적으로허용되는담체를포함한 다.본발명의약제학적 조성물에포함되는약제학적으로허용되는담체 는제제시에통상적으로 이용되는것으로서,락토스,덱스트로스,수크로 스,솔비톨,만니톨,전분, 아카시아고무,인산칼슘,알기네이트,젤라틴,� �산칼슘,미세결정성

셀룰로오스,폴리비닐피롤리돈,셀룰로오스,물 ,시럽,메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트,프로필히드록시벤� �에이트,활석,스테아르산 마그네슘및미네랄오일등을포함하나,이에제� �되는것은아니다.본발명의 약제학적조성물은상기성분들이외에윤활제 ,습윤제 ,감미제 ,향미제 ,유화제 , 현탁제,보존제등을추가로포함할수있다.

본발명의약제학적조성물은경구또는비경구투 여할수있으며 ,

바람직하게는경구투여방식으로적용된다.본� �명의약제학적조성물은 하기의다양한경구또는비경구투여형태로제형 화할수있으나,이에 한정되는것은아니다.

[53] 경구투여용제형으로는예를들면정제,환제,경/ 연질캅셀제,액제,현탁제, 유화제,시럽제.과립제,엘릭시르제등이있는데 ,이들제형은상기유효성분 이외에통상적으로사용되는충진제 ,증량제 ,습윤제，붕해제 ,활택제 ,결합제 , 계면활성제등의희석제또는부형제를 1종이상사용할수있다.붕해제로는 한천,전분,알긴산또는이의나트륨염,무수인산 일수소칼슘염등이사용될수 있고,활택제로는실리카,탈크,스테아르산또는 이의마그네슘염또는칼슘염 , 폴리에틸렌글리콜등이사용될수있으며,결합� �로는마그네슘알루미늄 실리케이트,전분페이스트,젤라틴,트라가칸스 ,메틸셀룰로오스,

나트륨카복시메틸셀룰로오스,폴리비닐피롤� �딘,저치환도

하이드록시프로필셀룰로오스등이사용될수있 다.이외에도락토즈, 덱스트로오스,수크로오스,만니톨,소르비톨,� �룰로오스.글리신등을 희석제로사용할수있으며,경우에따라서는일� �적으로알려진비등혼합물, 흡수제,착색제,향미제,감미제등을함께사용할 수있다.

상기조성물은멸균되거나또는방부제,안정화� �,수화제또는유화촉진제, 삼투압조절을위한염,완충제등의보조제및기� �치료적으로유용한물질을 함유할수있으며,통상적인방법인혼합,과립화� ��는코팅방법에따라 제제화할수있다.

[551 본발명의약제학적조성물의적합한투여량은제 제화방법 ,투여방식 ,환자의 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317 연령,체중,성,병적상태,음식,투여시간,투여경 로,배설속도및반응 감응성과같은요인들에의해다양하게처방될수 있다.

[56] 본발명의약제학적조성물은당해발명이속하는 기술분야에서통상의

지식을가진자가용이하게실시할수있는방법에 따라,약제학적으로허용되는 담체및/또는부형제를이용하여제제화함으로� �단위용량형태로제조되거나 또는다용량용기내에내입시켜제조될수있다.� �때제형은오일또는수성 매질중의용액,현탁액,시럽제또는유화액형태� ��거나엑스제,산제,분말제, 과립제,정제또는캅셀제형태일수도있으며,분� ��제또는안정화제를 추가적으로포함할수있다.

[57] 본발명의일양태에따르면,본발명은수탁번호 KCTC13686BP인

plantarum) A41균주,또는이의배양물을 유효성분으로포함하는조성물을대상체에투여 하는단계를포함하는, 골다공증의 예방,개선또는치료방법을제공한다.

[58] 본발명의치료방법,또는개선방법의대상질병� �골다공증은상기약제학적 조성물의치료대상질환과관련하여정의한것과 같다.

[59] 본발명의일구현예에서 ,상기대상체는포유동물또는인간이다.

[6이 본발명의골다공증의치료방법또는개선방법은 상술한수탁번호

plantarum) A41균주, 또는이의배양물을유효성분으로포함하는조성 물과동일한유효성분을 사용하는방법이므로,중복되는내용에대해서� �본명세서의과도한복잡성을 피하기위하여그기재를생략한다.

[61]

발명의효과

[62] 본발명의특징및이점을요약하면다음과같다:

[63] (a)본발명은수탁번호 KCTC13686BP인락토바실러스플란타럼 (LactoZwd/to plantarum) A41균주를제공한다.

[64] (b)본발명은수탁번호 KCTC13686BP인락토바실러스플란타럼 (Lactose plantarum) A41균주,또는이의배양물을유효성분으로포함� �는약제학적 조성물및식품조성물을제공한다.

[65] 본발명의균주및그배양물은골다공증,특히이� �성골다공증을예방하거나 개선,또는치료하기위한목적의식품조성물및� �제학적조성물로유용하게 사용될수있다.

[66]

도면의간단한설명

[67] 도 1은실험그룹별골밀도 (bone mineM density, mg/cm ³ )를나타낸도이다.

[68] 도 2는실험그룹별골비율 (percent bone volume, %)을나타낸도이다.

[69] 도 3은실험그룹별장내칼슘수용단백질인 TRPV6의 mRNA발현량을 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317 나타낸도이다.

이 발현량을 나타낸도이다.

1] 도 5는실험그룹별장내칼슘수용단백질인 PMCA1의 mRNA발현량을

나타낸도이다.

2] 도 6은실험그룹별혈중칼슘농도를나타낸도이다.

3] 도 7은실험그룹별 RANKL mRNA의발현량을나타낸도이다.

4] 도 8은실험그룹별 OPG mRNA의발현량을나타낸도이다.

5] 도 9는실험그룹별 BSP mRNA의발현량을나타낸도이다.

6]

발명의실시를위한형태

7] 이하,실시예를통하여본발명을더욱상세히설� �하고자한다.이들실시예는 오로지본발명을보다구체적으로설명하기위한 것으로,본발명의요지에 따라본발명의범위가이들실시예에의해제한되 지않는다는것은당업계에서 통상의지식을가진자에있어서자명할것이다.

8]

9] 실시예

[8이

[81] 본명세서전체에걸쳐,특정물질의농도를나타� �기위하여사용되는 는 별도의언급이없는경우,고체/고체는（중량/중 량） %,고체/액체는（중량/부피）

%，그리고액체/액체는（부피/부피） %이다.

[82]

[83] 실시예 1:프로바이오틱스균주및발효유의제조

[84] 본실험에사용된프로바이오틱스균주들은영유 아의분변과전통

발효식품으로부터분리되었다（표 2） .본발명의발효유를제조하기위하여,탈지 우유知난!!! 1¾배지에상기에서분리한프로바이오틱스균주 를각각접종하여 37ᄋ（：에서 48시간동안배양하였다.발효가완료된발효유는 동결건조후분말화 하여 1 0 ¹⁰ 0^/1111농도로현탁하여실험동물에게급여하였� �.본 발명에사용된탈지우유배지의조성과,프로바� �오틱스균주목록은표 1및표 2에나타내었다.

[85] 2020/091179 1»(：1^1{2019/007317

[86] [표 1]

본발명의탈지우유 (Skim milk)배지의조성

[87] [표 2]

본발명의프로바이오틱스균주목록

[88]

[89] 실시예 2:이차성골다공증동물모델의제작및실험군설� ��

[9이 2.1이차성골다공증동물모델의제작

[91] 이차성골다공증동물모델은다음과같이제작하 였다.체중 175-185 g내외의 8주령 Wistar계암컷랫드 (Samtako, South Korea)를펠렛형사료와물을충분히 공급하여 1주일간개별케이지에적응시킨후실험에사용� �였다.이차성 골다공증모델의수립은 Lucinda et al.(PHYTOTHERAPY RESEARCH 27(4), (2012), 515-520)와 Sousa et al. (Archives of Oral Biology 77 (2017) 55-61)에 의거하여근육내주사법으로글루코코르티코이 드의일종인

덱사메타손 (Dexamethasone, DEX)을 7 mg/kg BW의농도로주 1회씩 5주간 투여하였다.

[92]

[93] 2.2실험군의설정및발효유의급여

[94] 본발명의프로바이오틱스균주및발효유의이차 성골다공증에대한

치료효과를확인하기위하여,실험군을하기표 3과같이총 9개의그룹으로 분류하였다.각그룹별로실험동물을 7마리씩배정하였고, Normal그룹을 제외한모든그룹은상기 2.1의방법대로덱사메타손 (DEX)을주 1회 7 mg/kg(BW)의농도로 5주간투여하였다.

[95] 모든발효유는 lxl0 ^1Q CFU/ml의농도로 PBS(Phosphate buffer saline)에희석하여 2020/091179 1»(：1^1{2019/007317 위관영양법 (0¾1 으로경구투여하였다.한편,본실험의목적이 프로바이오틱스를이용한우유발효물의항골다 공증효과를확인하기 위함이기때문에대조군으로는발효를진행하지 않은 3 111 111뾰투여군 (SMP)을 사용하였다.

[96] [표 3]

본발명의실험군설정

[97]

[98] 실시예 3:본발명의발효유투여에따른골의형태학적분� ��

[99] 골밀도 (Bone mineral density)와골비율 (Percent bone volume)은뼈의강도를 측정할때가장기본적으로확인하는지표이다.� �발명의프로바이오틱스균주 및발효유의골밀도개선효과를측정하기위하여 , Micro Ct영상분석기 (Sky Scan 1176)와이를재구성하는프로그램 (NRecon),그리고이를분석하는

프로그램 (CT An)을이용하였다.

[10이 실험결과,덱사메타손을투여한 DEX그룹에서는골밀도및골비율이 Normal 그룹대비유의적으로감소한것으로보아이차성 골다공증이유도됨을확인할 수있었다.이차성골다공증약물 (alendrcmate)을덱사메타손과함께투여한 Drug 그룹에서는덱사메타손투여로인해감소된골밀 도와골비율이회복된것으로 나타났다.본발명의프로바이오틱스균주로발� �시킨발효유를투여한 A41 그룹, SRK414그룹, B719그룹,및 393그룹도 drug그룹과유사한정도의골밀도 및골비율회복효과를나타내었다. (도 1및도 2)

[101] 상기결과로부터,본발명의프로바이오틱스균� �인 L. plantarum A41, L.

fermentum SRK414, L. plantarum B719, L. casei 393으로발효시킨발효유가 덱사메타손의투여로유발된이차성골다공증의 증상인골밀도,골비율감소를 회복시킴을확인하였다.

[102] 2020/091179 1»(：1^1{2019/007317

[103]

[104] 실시예 4.본발명의발효유투여에의한칼슘흡수관련지� ��분석

[105] 혈중칼슘농도가부족할경우,뼈에있는칼슘이� �중으로유리되어골소실이 증가하게된다.따라서장내에서칼슘흡수를촉� �시킴으로써혈중칼슘농도를 증가시키는것은골소실을낮출수있는중요한예 방책이될수있다.칼슘은 장에서칼슘을이동시

등에의해소장에서혈관으로유입되는데,이들� �발현량이증가한다면칼슘 흡수가원활히진행된다고볼수있다.따라서본� �명자들은본발명의발효유 투여에따른장내칼슘수용단백질의 mRNA발현량을알아보기위해서 다요! - 1（11분석을실시하였으며,혈중칼슘농도와의� �련성을확인하였다.

[106]

[107] 4.1장내칼슘수용체유전자발현확인

[108] 발효유가 발현량에 미치는효과를알아보기위해서다요! -：的¾분석을진행하였다.구체적으로,실험 기간종료후각실험동물의회장을적출하여균질 화（110111（ _¾£11 뇨 _£ （1）과정을거친 후 1요뇨01（111 1]'（¾11句을사용하여조직에포함되어있는 RNA를추출하였다. 정제된 RNA는역전사효소 01^0（（11）프라이머와함께 cDNA합성에

사용되었으며 , 1＞幻1조건은 95ᄋ（：에서 3분이후, 94ᄋ（：에서 초 60ᄋ（:에서

30초로,총 44주기반복하였다. _¾ 요1'-1）（그분석을위한프라이머는표 4에 나타내었다.총전사의정도는（3 - 전사레벨로부터

정규화 010]111 뇨 1011）하여그래프로나타내었다（도 3내지도 5）.

[109]

[110] [표 4]

[111] 도 3내지 5에서나타낸바와같이,본발명의발효유투여그� ��중에서쇼41 그룹및 3요 414그룹이다른그룹에비해상대적으로높은장내 칼슘수용 단백질（ 발현량을나타내었다（도 3내지도 5）.

[112]

[113] 4.2혈중칼슘농도조절효과

[114] 본발명의발효유투여가혈중칼슘농도에미치는 영향을확인하기위하여, 2020/091179 1»(：1^1{2019/007317 혈중칼슘농도를확인하였다.구체적으로,동물� ��험기간종류후

심장천자 (heart puncture)법으로혈액을채취하였으며원심분리 (2500 g, 15분, 4 )하여수집한혈청을분석전까지 -70 에보관하였다.혈청내에있는 칼슘 (Ca)농도는 Calcium activity assay kit ((주)엠비엘, Korea)를사용하여 분석하였다.결과는도 6에나타내었다.

[115] 도 6에나타낸바와같이,장내칼슘수용단백질의발� ��량과마찬가지로본 발명의발효유투여그룹중에서 A41그룹및 SRK414그룹이다른그룹에비해 상대적으로높은혈중칼슘농도를나타냄을확인 하였다.따라서본발명의 L. plantarum A41,및 L. fermentum SRK414균주에의해발효된발효유는,발효유가 투여된동물의소장내칼슘흡수를촉진시킴으로 써높은혈중칼슘농도 유지하여골소실을효과적으로예방할수있다고 사료된다.

[116]

[117]

[118] 실시예 5.본발명의발효유투여에따른골대사관련지표� ��석

[119] 조골세포또는활성화된면역세포에서 RANKL(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand)이발현되면파골전구세포세포막의 RANK(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B)와결합하여파골세포의분화가

이루어지는데,이경우뼈흡수가촉진되어골다� �증이유발될수있다.반면 OPG(Osteoprotegerin)는 RANKL대신 RANK에수용되는인자로, OPG가

RANK와 RANKL의결합을방해함으로써파골세포의분화를� ��제시킬수있다.

[120] 본발명자들은본발명의발효유투여가골대사에 미치는영향을확인하기 위하여 ,골대사관련마커인 RANKL, OPG,및 BSP의 mRNA발현양을

qRT-PCR을통해분석하였다.구체적으로,실험동물 의넙다리뼈와골피질을 균질화 (homogenization)한후 TRIzol reagent(Thermofisher, USA)를이용해종 RNA를추출하였다.정제된총 RNA는 cDNA합성을위해사용하였다. PCR은 Biorad RT-PCR을사용하였으며 95 ^O C에서 3분간처리한후, 94 ^O C에서 10초, 60 OC에서 30초를총 44주기반복하였다. qRT-PCT분석을위한프라이머는표 5에 나타내었다.총전사의정도는 (3-actin전사레벨로부터

정규화 (normalization)하여그래프에나타내었다 (도 7내지 9).

[121] [표 5]

2020/091179 1»（：1^1{2019/007317

[122] 도 7에나타낸바와같이,쇼41그룹,및 311X414그룹에서 그룹에비해 미하게감소하여쇼41과 311X414발효유가 파골세포의분화를감소시키는것을확인하였다 .

[123] 또한,도 8에나타낸바와같이, 제외한 모든발효유투여그룹에서모두유의미하게증가 하여파골세포분화의억제를 확인하였다.

[124] 마지막으로,도 9에나타낸바와같이,궁극적인조골세포분화표� ��인자인 681 ⁵ 여01祀 8 1애] 11）발현량역시쇼41, 811X414그리고 6기 9그룹에서 상대적으로높은발현량을나타내어조골세포분 화가촉진되어골다공증의 치료효과가뛰어남을확인할수있었다.

[125] 상기결과를바탕으로본발명의 I」. _]3 1&1^표1'11111쇼41균주,및 I」. 6]1116111；11111 811X414균주로발효시킨발효유를동물모델에투� �하였을때체내조골세포가 0?0생성을촉진시키고 RANKL의생성을억제시켜파골세포의분화를 억제하고,조골세포의분화를촉진함으로써이� �성골다공증에대한예방 효과를나타내는것을확인하였다.

[126]

[127] [수탁번히

[128] [기탁기관명]한국생명공학연구원

[129] [수탁

[130] [수탁일자] 20181025

[131]

[132] [기탁기관명]한국생명공학연구원

[133] [수탁

[134] [수탁일자] 20181025

[135]

\¥0 2020/091179 1»（：1^1{2019/007317

[1 36] 특허奪차상 며營 ^· 還 ^· 기학의 국제적 승'?]에; #¾

부다 스 £조약 국제: 성식

급： ¾ 시에 의혜 발행 ¾

원기탁에 대한 수탁증

기#자: 薄.근당과이모

祭#근당 4이:오

대:한만국， ¾기도, 안산서 受  구 신 II로 2授

정정용지 （규칙 제 91조） / \¥02020/091179 1»（：1^1{2019/007317

[137]

，허奪聲公피 ^. 寒卷 지탁의 국#적 安안에 德意

추 4쨍스 £또약 국체 서석

규:력 ?,1예 의해 #  

¾기탁에 대한 수탁증

정정용지 （규칙 제 91조） /