CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra en el ámbito de la biotecnología y se refiere a composiciones que combinan compuestos orgánicos capaces de absorber luz solar ultravioleta (UV) para convertirla en luz roja, fomentando la fotoprotección frente a la radiación solar y la regeneración cutánea de amplio espectro. El efecto fotoprotector se debe a los compuestos de estas composiciones capaces de absorber luz UV, mientras que el efecto regenerador se debe a la emisión final de luz roja de la combinación de compuestos, que, por último, activa en el tejido una producción transitoria de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS) suficiente para estimular los programas de homeostasis y regeneración del mismo.

ANTECEDENTES

El adecuado cuidado y mantenimiento de la piel en respuesta a multitud de situaciones patológicas con gran incidencia en la población (cáncer melanoma y no melanoma, infecciones bacterianas y víricas, agresiones por agentes físico/químicos, úlceras crónicas en personas mayores o diabéticas, heridas quirúrgicas de larga duración, psoriasis, dermatitis atópica y muchos otros) es un reto fundamental para el sistema de salud con enormes repercusiones sociales y económicas, sobre todo en lo referido a la tercera edad. Las afecciones de órganos adyacentes de la piel como el folículo piloso o las glándulas sudoríparas, así como los procesos de degradación gradual del tejido asociados al envejecimiento o a la continuada exposición a contaminantes ambientales, aún sin suponer en muchos casos una amenaza directa para la salud del paciente, tienen también una gran incidencia social con una correspondiente cuota de mercado en crecimiento continuo. Mención aparte merece la exposición continuada de la piel a la radiación solar, que genera daños acumulativos en el tejido que pueden derivar en patologías graves como el cáncer melanoma. En este contexto, y debido a sus enormes repercusiones sociales, el mercado del cuidado de la piel en general, a nivel clínico y cosmético, es uno de los sectores con mayor alza continuada a nivel mundial y se espera un incremento exponencial en los próximos años. Dentro de la vertiente biotecnológica de este mercado las mayores previsiones de crecimiento son la cosmética y la medicina regenerativa con aplicaciones dermocosméticas y clínicas. En este ámbito, muchas de las terapias/ tecnologías/ productos disponibles actualmente en el mercado para tratar un importante grupo lesiones y afecciones cutáneas, tanto a nivel clínico como cosmético, presentan importantes carencias y limitaciones funcionales que afectan de forma crítica a su eficacia real, y definen, a su vez, nichos concretos y nuevos para l+D+¡.

A nivel clínico:

• Cicatrización de lesiones cutáneas de larga duración. El coste económico de las úlceras crónicas en personas mayores o diabéticas, de heridas quirúrgicas o domésticas de larga duración se mide en miles de millones de euros, constituyendo aproximadamente un 8-10% del gasto total del sistema de salud, una figura que se incrementa de forma constante debido al envejecimiento de la población. No existe un tratamiento curativo efectivo para este tipo de lesiones, siendo el tiempo de hospitalización (50%) y el gasto en cuidados de enfermería (30-35%) las mayores cargas económicas para el sistema.

A nivel cosmético:

• Protección solar y regeneración cutánea antienvejecimiento de alta eficiencia y ecosostenible basada en compuestos de origen natural. Una de las tendencias prioritarias actuales del sector es el respeto al medioambiente y el uso de compuestos naturales/orgánicos. La mayoría de los fotoprotectores solares actuales contienen filtros físicos (e. g. dióxido de titanio) o químicos (e.g. oxibenzona, avobenzona, octisalato, octocrileno, homosalato, octinosato), compuestos sintéticos que pueden afectar al paciente y al medio ambiente. Por su parte, el objetivo de las composiciones regeneradoras y antienvejecimiento es la protección y reparación simultánea de la piel y el incremento de su firmeza y tersura. Las composiciones de este tipo presentes en el mercado son en su mayoría cremas hidratantes simples que contienen diversos tipos de moléculas adicionales, normalmente sintéticas, como retinoides, coenzima Q10, antioxidantes, factores de crecimiento, colágenos, alfa y beta hidroxiácidos o péptidos como acetil hexapéptido-8 (Argilerine™) o las matriquinas (Matryxil®). En la mayoría de los casos, el efecto de estas cremas a nivel de reparación y regeneración de la piel es escaso debido fundamentalmente a que los teóricos principios activos tiene una baja penetrabilidad a través de la barrera epidérmica, o la atraviesan, pero son rápidamente degradados, o la atraviesan, pero son modificados perdiendo efectividad. En estos dos nichos existe claramente la oportunidad de innovación y desarrollo de productos competitivos que cubran necesidades esenciales para un sector muy amplio de la población. En ambos casos los procesos biológicos subyacentes son el mantenimiento homeostático y la regeneración de la piel, que dependen fundamentalmente de la actividad regulada de las células madre del tejido. Por ello, una de las líneas de desarrollo con más potencial a nivel terapéutico o cosmético en dermatología es el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan una regulación funcional eficaz de las células madre de la piel.

Por otro lado, las especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS) son intermediarios moleculares altamente reactivos e inestables que resultan de la reducción del oxígeno molecular (O2) para formar agua (H2O) durante el metabolismo aerobio en mamíferos. En los todos los sistemas biológicos la producción de ROS presenta un efecto hermético, de modo que su acumulación por encima de un umbral crítico es tóxica, mientras que en concentraciones por debajo de este umbral pueden funcionar como moléculas señalizadoras. Así, la acumulación excesiva y recurrente de estos compuestos en células y tejidos induce estrés oxidativo, involucrado causalmente en el desarrollo de múltiples enfermedades, incluyendo cáncer, y en el proceso de envejecimiento. Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que, efectivamente, en condiciones fisiológicas normales, bajos niveles de ROS pueden jugar papeles esenciales funcionando como segundos mensajeros, estando implicadas en la regulación de procesos fisiológicos como proliferación, diferenciación y supervivencia celular. En este contexto, en los últimos años se ha demostrado que las ROS actúan como segundos mensajeros que regulan mecanismos moleculares en los procesos de homeostasis y regeneración de la piel en mamíferos. Así, la activación controlada de la producción en el tejido de niveles no letales de ROS promueve la activación de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre residentes, estimulando procesos fisiológicos como la cicatrización de quemaduras y heridas o el crecimiento del pelo. Esta activación controlada de ROS en el tejido se lleva a cabo mediante un proceso fotodinámico que utiliza un compuesto fotosensible o fotosensibilizador y luz de una longitud de onda adecuada para producir ROS a partir del oxígeno molecular (Figura 1 A). En concreto, este proceso fotodinámico está dirigido a estimular la activación de una producción controlada de ROS por el fotosensibilizador endógeno Protoporfihna IX (PplX), presente en todas las células eucariotas. Este proceso fotodinámico requiere la incorporación al substrato biológico de precursores de la PplX, como el aminoácido natural ácido aminolevulínico (ALA), o su precursor metilado, metil-aminolevulinato (m-ALA), con objeto de incrementar los niveles celulares básales de PplX, y la posterior irradiación con luz roja, que fotoestimula específicamente a la PplX para producir ROS (Figura 1 B). La combinación de una adecuada concentración de precursores y dosis de luz permite controlar de forma regulada la activación de los mecanismos de homeostasis y regeneración cutánea en tejidos in vivo.

Una limitación crítica de este proceso fotodinámico para la implementación de procesos/ métodos o el desarrollo de productos para fomentar la homeostasis y regeneración cutánea a nivel cosmético o farmacológico es la necesidad de utilizar una fuente autónoma de luz roja aplicada sobre el tejido para fotoestimular intracelularmente la producción de ROS basada en la PplX, dado que la radiación de luz roja procedente del sol no tiene suficiente potencia para activar el proceso.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en un proceso de transferencia fotónica secuencial (TFS) entre compuestos orgánicos por el que se produce la absorción, por parte de un primer compuesto orgánico, de fotones de determinada longitud de onda y la posterior emisión por parte del primer compuesto orgánico de fotones de longitud de onda diferente, típicamente más larga que la del fotón inicial, que pueden ser subsiguientemente absorbidos por un segundo compuesto orgánico adyacente para emitir a su vez fotones de longitud de onda aún más larga. La estructura química de cada compuesto determina los correspondientes rangos de absorción y emisión fotónica. Una determinada combinación de compuestos orgánicos puede, en función de sus características químicas, acoplar de forma secuencial la absorción y emisión de fotones de distintas longitudes de onda. Así, en la presente invención, el proceso de TFS permite la absorción de la luz ultravioleta incidente de la radiación solar, específicamente UVB/ UVA (entre 280 y 400 nm), por parte de un primer compuesto orgánico y la posterior emisión por parte del primer compuesto orgánico de fotones de luz azul/verde (450-570 nm), donde estos fotones de luz azul/verde se absorben a su vez para convertirse en fotones de luz roja (entre 620 y 780 nm). Este mecanismo de conversión de los fotones de luz ultravioleta en fotones de luz roja previene la incidencia excesiva de rayos UVB/ UVA sobre la piel, consiguiendo así un efecto fotoprotector.

Además, la presente invención contempla acoplar dicho mecanismo de TFS, donde se absorben inicialmente fotones de luz ultravioleta (UVB/ UVA) y donde se emiten al final fotones de luz roja, con la activación transitoria de una producción endógena de ROS en sistemas biológicos, particularmente células y tejidos de mamíferos, mediante la fotoestimulación intracelular de un compuesto fotosensible/ fotosensibilizador por la luz roja generada en el proceso de TFS (Figura 2). En el contexto de la presente invención, se entiende por “compuesto fotosensible/ fotosensibilizador” aquel compuesto capaz de producir ROS en presencia de oxígeno al ser irradiado con luz de una longitud de onda adecuada, y que es administrado de forma externa (fotosensibilizador exógeno) o producido por el propio organismo a partir de un precursor (fotosensibilizador endógeno). Un compuesto fotosensible/ fotosensibilizador adecuado para su uso en el contexto de la invención es la Protoporfirina IX (PplX) o sus precursores. Este segundo mecanismo, de transferencia fotónica secuencial en la piel, permite regular y estimular funciones fisiológicas de homeostasis y regeneración cutánea. Por lo tanto, un segundo mecanismo permite la transferencia fotónica secuencial en la piel, utilizando los fotones de luz UVB/UVA procedentes de la radiación solar (los más energéticos que alcanzan la superficie terrestre) para producir una elevada generación de fotones de luz roja sobre la superficie de la epidermis, alcanzando la irradiancia suficiente para alcanzar las células de las capas interna de la piel y fotoestimular la PplX, activando de este modo la producción de niveles no letales, señalizadores de ROS en el tejido.

Así, en un primer aspecto la invención se refiere a una composición que comprende al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz UVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul/verde (450-570 nm), y al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz azul/verde (450-570 nm) y emitir luz roja (620-780 nm).

En modos de realización de la presente invención, el al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz UVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul/verde (450-570 nm) se selecciona del grupo que consiste en polifenoles, flavonoides, cannabinoides, y combinaciones de los mismos. Los flavonoides son compuestos polifenólicos que tienen una estructura química general con un esqueleto de 15 carbonos que contiene cetonas, donde la estructura general consta de dos anillos de fenilo y un anillo heterocíclico que incluye un oxígeno incrustado. Esta estructura química define las características espectrales de absorción y emisión de estos compuestos. Según la nomenclatura de la IUPAC, los flavonoides se pueden clasificar en bioflavonoides, isoflavonoides, y neoflavonoides. En el contexto de la invención, los bioflavonoides (también conocidos simplemente como flavonoides, y que incluyen flavonas, flavonoles, flavononas y antocianidinas) son derivados de una estructura de 2-fenilcromen-4-ona (2-fenil-1 ,4- benzopirona). En modos de realización de la invención, los bioflavonoides se seleccionan del grupo que consiste en luteolina, apigenina, tangeritina, quercetina, mohna, kaempferol, miricetina, fosetina, galangina, isorhamnetina, paquipodol, ramnazina, pironoflavonoles, furanoflavonoles, hesperetina, naringerina, eriodictiol, homoeriodictiol, taxifolina, anticianidina, cianidina, delfinidina, malvidina, pelargonidina, peonidina, petunidina, flavan- 3-ol, flavan-4-ol, flavan-3,4-diol, proantocianidinas. En el contexto de la invención, los isoflavonoides son derivados de la estructura 3-fenilcromen-4-ona (3-fenil-1 ,4- benzopirona). En modos de realización de la invención, los isoflavonoides se seleccionan del grupo que consiste en genisteína, daidzeína, gliciteína, equol, lonchocarpane, laxiflorane, fitoestrógenos. En el contexto de la invención, los neoflavonoides son derivados de la estructura 4-fenilcumarina (4-fenil-1 ,2-benzopirona). En modos de realización de la invención, los neoflavonoides se seleccionan del grupo que consiste en neoflavonas (calophyllolide), neoflavenes (dalbergichromene), coutareagenin, dalbergin, nivetin. En el contexto de la presente invención, los cannabinoides, también llamados fitocannabinoides, son un grupo mixto de compuestos de policétido, derivados de unidades de malonil-CoA y hexanoil-CoA preniladas con fosfato de geranilo, con un esqueleto terpenofenólico C21 multianillo característico principal. Esta estructura química general delimita las características espectrales de absorción y emisión de estos compuestos. La nomenclatura se aplica a cannabinoides parentales, a derivados de cannabinoides y a productos de transformación. Los fitocannabinoides se pueden clasificar en 11 subclases de cannabinoides: cannabichromene (CBC), cannabidiol (CBD), canna-bielsoin (CBE), cannabigerol (CBG), cannabicyclol (CBL), cannabinol (CBN), cannabinodiol (CBND), cannabitriol (CBT), (-)-A8-trans-tetrahidrocannabinol (A8-THC), (-)-A9-trans- tetrahidrocannabinol (A9-THC) y cannabinoides de tipo mixto. En modos particulares de realización de la invención, el al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz UVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul/verde (450-570 nm) se selecciona del grupo que consiste en morina, quercetina, cannabidiol, cannabinol, cannabicromeno, y combinaciones de los mismos.

Por otro lado, en modos de realización de la presente invención, el al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz azul/verde (450-570 nm) y emitir luz roja (620-780 nm) se selecciona del grupo que consiste en carotenoides, xantenos, clorofilas, ácidos oleicos, y combinaciones de los mismos. En el contexto de la presente invención, los carotenoides son tetraterpenoides que tienen una estructura química general de una cadena de hidrocarburo de polieno que consta de enlaces 9-11 que pueden terminar en derivados del anillo de benceno. Esta estructura química general delimita las características espectrales de absorción y emisión de estos compuestos. La longitud de la cola de polieno determina la longitud de onda de la luz absorbida y emitida. En el contexto de la invención, los carotenoides se pueden seleccionar de entre carotenos y xantofilas. Los carotenos son carotenoides no oxigenados que consisten en un esqueleto de hidrocarburo poliinsaturado con 40 átomos de carbono, número variable de átomos de hidrógeno y ningún otro elemento, tales como: alfa-caroteno, beta-caroteno, gamma-caroteno, delta-caroteno, licopeno. Las xantofilas son carotenos que contienen oxígeno, tales como: luteína, zeaxantina, neoxantina, violaxantina, flavoxantina, alfa y beta-critoxantina. En el contexto de la presente invención, los xantenos son compuestos heterocíclicos derivados del resto xanteno y consisten en un núcleo de xantilio o di-benzo-g-pirano como el núcleo cromóforo con amino o hidroxilo meta al oxígeno. Esta estructura cromófora delimita las características espectrales de absorción y emisión de estos compuestos. Los xantenos se pueden seleccionar de entre fluoresceínas, eosinas, y rodaminas. En el contexto de la presente invención, las clorofilas consisten en un anillo de cloro, cuyos cuatro átomos de nitrógeno rodean un átomo de magnesio central, que puede presentar diferentes cadenas laterales y una cola de hidrocarburo formada por un áster de fitol. En las clorofilas c1 y c2 el anillo de clorina se sustituye por un anillo de porfirina. El resto de cloro delimita las características espectrales de absorción y emisión de estos compuestos. En modos particulares de realización de la invención, las clorofilas se pueden seleccionar de entre clorofilas A, B, C1 , C2, D y F. En el contexto de la presente invención, el ácido oleico es un ácido graso clasificado como ácido graso monoinsaturado omega-9, abreviado con un número de lípidos de 18:1 cis-9, y un producto principal de la A9 desaturasa. Más particularmente, en modos de realización de la invención el al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz azul/verde (450-570 nm) y emitir luz roja (620-780 nm) se selecciona del grupo que consiste en clorofila A, clorofila B, clorofila C1 , clorofila C2, clorofila D, clorofila F, y combinaciones de los mismos.

En una realización particular de la invención, la composición que comprende al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz UVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul/verde (450-570 nm), y al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz azul/verde (450- 570 nm) y emitir luz roja (620-780 nm) es una composición que comprende: clorofila A y morina; o clorofila A y quercitina; o clorofila A y cannabidiol; o clorofila A y cannabicromeno; o clorofila A, morina y cannabidiol; o clorofila A, morina y cannabicromeno; o clorofila A, morina, cannabidiol y cannabicromeno; o clorofila A, quercitina y cannabidiol; o clorofila A, quercitina y cannabicromeno; o clorofila A, quercitina, cannabidiol y cannabicromeno.

En otros modos de realización de la invención, la composición comprende además al menos un compuesto fotosensible, o un precursor del mismo, capaz de absorber luz roja y estimular la producción de ROS. En modos particulares de realización de la invención el al menos un compuesto fotosensible, o precursor del mismo, capaz de absorber luz roja y estimular la producción de ROS es Protoporfirina IX (PplX), ácido aminolevulínico (ALA) y/o metil-aminolevulinato (m-ALA). Así, en una realización particular de la invención, la composición que comprende al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz LIVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul/verde (450-570 nm), al menos un compuesto orgánico capaz de absorber luz azul/verde (450-570 nm) y emitir luz roja (620-780 nm), y al menos un compuesto fotosensible, o un precursor del mismo, capaz de absorber luz roja y estimular la producción de ROS es una composición que comprende: morina y/o cannabidiol; clorofila A; y metil-aminolevulinato (m-ALA).

La composición de la invención comprende, en modos de realización adicionales, al menos un protector solar adicional, de tipo físico/ mineral y/o de tipo químico, donde el protector solar de tipo físico/ mineral puede ser, de manera no limitativa, óxido de zinc o dióxido de titanio, y donde el protector solar de tipo químico puede ser, de manera no limitativa, oxibenzona, avobenzona, octisalato, octocrileno, homosalato y/o octinoxato. Además, en modos particulares de realización de la invención, la composición no comprende lawsona.

En modos particulares de realización de la presente invención, la composición se encuentra incorporada en un sistema de vehiculización o en un sistema de liberación sostenida cosmética o farmacéuticamente aceptable que se selecciona del grupo que consiste en liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ci clod extrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípido-tensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas y soportes lipidíeos nanoestructurados. En otros modos particulares de realización de la presente invención, la composición se presenta en una formulación seleccionada del grupo que consiste en cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, serums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, y aerosoles. En aún otros modos particulares de realización de la presente invención, la composición se encuentra incorporada a un producto seleccionado del grupo formado por protector solar, correctores de ojeras, fondos de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos labiales, protectores labiales y polvos.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso tópico en piel de la combinación de compuestos orgánicos capaces de promover la transferencia fotónica secuencial entre luz UV y luz roja, y precursores de la PplX, para promover una estimulación fisiológica del tejido dependiente de ROS, abarcando la activación de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre del tejido y de células ya diferenciadas en la epidermis y la dermis, con aplicaciones cosméticas o farmacéuticas.

Estas aplicaciones se refieren a la reparación o mejora de los efectos adversos sobre la piel del estrés diario, exposición solar o a contaminantes ambientales, y el envejecimiento del tejido prematuro o no. Por “reparación o mejora” se entiende detener, revertir, mejorar, disminuir y/o reducir defectos, imperfecciones o condiciones poco estéticas de la piel, que incluyen, pero no se restringen a: arrugas finas o profundas, estrías, patas de gallo, ojeras, pérdida de cabello, arañas vasculares, hiperpigmentación, hipopigmentación, decoloración, manchas de edad, pérdida de brillo cutáneo, pecosidad, imperfecciones, fragilidad tisular, sequedad, grietas, rugosidad táctil, dermatitis atópica, acné, rosácea, psoriasis y eczemas. La reparación y mejora de estos aspectos adversos en la piel dependen de la estimulación de los procesos fisiológicos de homeostasis y regeneración cutánea, que a su vez se basan en la activación regulada de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre del tejido y otros tipos celulares del tejido como fibroblastos, queratinocitos, células de Merkel, células de Langerhans y melanocitos. De forma particular, estas aplicaciones incluyen la estimulación de la producción celular de componentes de la matriz extracelular dérmica, fundamentalmente colágenos y elastinas, para promover la tersura y firmeza de la piel y la eliminación de arrugas, así como la estimulación de los nichos de células madre de la epidermis para promover la regeneración y mantenimiento de tono cutáneo, y la estimulación de los nichos de células madre del folículo piloso para prevenir la caída del cabello o para inducir su crecimiento.

Así, en un aspecto particular la invención se refiere a una composición de acuerdo con lo descrito anteriormente para su uso como medicamento. Además, la invención se refiere a una composición de acuerdo con lo descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de defectos, imperfecciones o condiciones poco estéticas de la piel, que comprenden arrugas finas o profundas, estrías, patas de gallo, ojeras, pérdida de cabello, arañas vasculares, hiperpigmentación, hipopigmentación, decoloración, manchas de edad, pérdida de brillo cutáneo, pecosidad, imperfecciones, fragilidad tisular, sequedad, grietas, rugosidad táctil, acné, rosácea, dermatitis atópica, psoriasis y eczemas. De manera adicional, la invención se refiere a una composición de acuerdo con lo descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de los efectos de la radiación solar en la piel humana, incluyendo quemaduras y manchas solares.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso tópico en piel de la combinación de compuestos orgánicos capaces de promover la transferencia fotónica secuencial entre luz UV y luz roja para promover la fotoprotección del tejido frente a radiación solar LIVB/A para prevenir y/o reparar las quemaduras y manchas solares, así como otros efectos deletéreos de la sobrexposición de la piel a la radiación solar como envejecimiento prematuro del tejido o cáncer de piel.

Así, en otro aspecto particular la invención se refiere a un uso no terapéutico de una composición de acuerdo con lo descrito anteriormente como fotoprotector de la piel. De manera adicional, la invención se refiere a un método no terapéutico para la fotoprotección de la piel que comprende aplicar de manera tópica una composición de acuerdo con lo descrito anteriormente. Estos aspectos de la invención se refieren al uso cosmético, no terapéutico de las composiciones de la presente invención como protector solar en forma de cremas, lociones, aerosoles y similares, tal y como se ha descrito anteriormente. En el contexto de la invención, la composición para uso como protector solar es una composición con un factor de protección solar (FPS) de al menos FPS-20, de al menos FPS-25, de al menos FPS-30, de al menos FPS-35, de al menos FPS-40, de al menos FPS-45, o de al menos FPS-50.

En los ejemplos presentados más abajo se demuestra que la combinación de compuestos orgánicos como flavonoides (por ejemplo, morina) y/o cannabinodes (por ejemplo, cannabidiol) capaces de absorber luz UVB y emitir luz azul/verde, y clorofilas (por ejemplo, clorofila A), capaces de absorber luz azul/verde y emitir luz roja, en presencia de precursores de la protoporfirina IX (PplX) tales como metil-aminolevulinato (m-ALA), no solo protege a fibroblastos primarios de dosis letales de radiación UVB, sino que estimula los programas de proliferación y diferenciación de las células y activa la producción de proteínas de matriz extracelular como colágenos y elastina, en un proceso que es dependiente de ROS. Además, se demuestra que los flavonoides o cannabinoides por sí solos son capaces de proteger las células en cultivos frente a radiación UVB, pero no de estimular la proliferación o la síntesis de proteínas de matriz extracelular, mientras que la clorofila por sí misma no es capaz ni de proteger frente a radiación UVB ni de estimular a las células en ningún sentido, lo que implica de facto la existencia de un proceso de transferencia fotónica secuencial (TFS) que está finalmente acoplado al a producción intracelular de niveles no letales de ROS.

Todos los términos y modos de realización descritos anteriormente son aplicables a cualquier aspecto y modo de realización de la invención. De acuerdo con la presente invención, el término en singular “el”, “la”, “un”, “uno”, “una”, se refiere igualmente a su correspondiente en plural “los”, “las”, “unos”, “unas”, salvo que se desprenda del contexto que claramente el término se refiere a una especie en el singular. El término "comprende" o "que comprende", tal y como se usa en el presente documento, también describe "consiste en" o "que consiste en" de acuerdo con la práctica de patentes generalmente aceptada.

EJEMPLOS

La siguiente invención se describe por medio de los siguientes ejemplos, que deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

Ejemplo 1 : Concepto de transferencia fotónica secuencial (TFS)

La presente invención postula la ¡dea innovadora de utilizar un proceso de Transferencia Fotónica Secuencial (TFS) entre compuestos de origen vegetal, acoplado a una producción transitoria y estimulante de ROS en la piel, como base para diseñar composiciones/ productos dermocosméticos de aplicación tópica que promuevan eficazmente la fotoprotección y regeneración cutánea de amplio espectro. Así, los inventores han definido la Transferencia Fotónica Secuencial (TFS) como un proceso que implica la absorción por parte de un compuesto orgánico de fotones de determinada longitud de onda y la posterior emisión por parte de este compuesto de fotones de una longitud diferente, típicamente más larga en el espectro electromagnético que la del fotón inicial. Los fotones emitidos pueden ser subsiguientemente absorbidos por otro compuesto orgánico adyacente para emitir a su vez fotones de longitud de onda aún más larga. La estructura química de cada compuesto implicado determina los correspondientes rangos de absorción y emisión fotónica. Una determinada combinación de compuestos orgánicos puede, en función de sus características químicas, acoplar de forma secuencial la absorción y emisión de fotones de distintas longitudes de onda. Para implementar este proceso en la piel a nivel tópico como fotoprotector y regenerador cutáneo, los inventores proponen el diseño y uso de combinaciones de compuestos naturales de origen vegetal, para captar fotones de luz ultravioleta (UVB/ UVA), que son los más energéticos del espectro electromagnético en la región visible, y convertirlos en fotones de luz roja capaces de activar eficazmente la producción de ROS a través de la fotoestimulación a nivel cutáneo de la PplX o de sus precursores. Así, un compuesto A o una combinación de compuestos A en la superficie de la piel sería capaz de absorber fotones de luz UV, emitiendo fotones de luz azul, con efecto fotoprotector, y un compuesto B o combinación de compuestos B, adyacente al compuesto A también en la superficie de la piel, absorbería estos fotones de luz azul, emitiendo luz roja. Finalmente, estos fotones de luz roja atravesarían el epitelio cutáneo para activar un compuesto C (PplX, o sus precursores) para producir niveles de ROS en presencia del oxígeno molecular presente en las células, estimulando de este modo la regeneración cutánea (Figura 2). En función de sus características moleculares, los inventores han identificado vahos grupos de compuestos vegetales que cumplirían los requisitos del proceso de transferencia fotónica secuencial (TFS):

- Flavonoides: con picos de absorción en UVA y UVB y emisión de fotones de luz azul al ser excitados con luz UV.

- Cannabinoides: con picos de absorción en UVA y UVB complementarios a los de los flavonoides y emisión de fotones de luz azul al ser excitados con luz UV.

- Clorofilas, Xantenos, Carotenos: con picos de absorción en la región azul y emisión de luz roja al ser excitados con fotones de luz azul.

-Validación in vitro del proceso de transferencia fotónica secuencial (TFS) acoplado a la producción de ROS.

Para la validación in vitro del proceso de Transferencia Fotónica Secuencial (TFS), se han seleccionado, en primer lugar, distintas moléculas pertenecientes a alguno de los grupos de compuestos de origen vegetal previamente identificados como potenciales dianas. En particular, las moléculas seleccionadas han sido mohna y quercetina (flavonoides), cannabinol (CBN), cannabidiol (CBD) y cannabicromeno (CBC) (cannabinoides) y clorofila A, que constituyen ejemplos plenamente representativos de cada uno de los grupos de compuestos diana. De forma notoria, flavonoides y cannabinoides tienen espectros de absorción complementarios en la región UVB/A. Así, los flavonoides presentan típicamente picos de absorción en torno a 260 y 380 nm, mientras que los cannabinoides presentan picos de absorción entre 230 y 300 nm (Figura 3A). Por su parte, las clorofilas (clorofila A y clorofila B) presentan picos de absorción en la región azul del espectro visible en torno a 450 nm (Figura 3B). Para estos compuestos se ha evaluado mediante espectrofluorimetría la capacidad de emisión a 460 nm (luz azul) al ser excitados por luz de 280 y 320 nm (LIVB/A), y la capacidad de emisión a 625 nm (luz roja), al ser excitados con luz de 460 nm. Como se esperaba, los resultados obtenidos muestran que tanto flavonoides como cannabinoides (excepto, significativamente, el CBN) muestran una alta emisión de luz azul al ser excitados con luz LIVB/A (Figura 3C), y una emisión de luz roja prácticamente nula al ser excitados con luz azul (Figura 3D). Por su parte, la clorofila A muestra una emisión nula de luz azul al ser excitada con luz LIVB/A (Figura 3C) pero una fuerte emisión de luz roja al ser excitada con luz azul (Figura 3D).

Para demostrar la existencia un proceso de TFS entre flavonoides/ cannabinoides (o moléculas equivalentes) y clorofilas (o moléculas equivalentes) acoplado a la producción de ROS mediada por PplX, se ha cuantificado colorimétricamente la oxidación en disolución hidroalcohólica del Azul de Tetrazolio (Nitro Blue Tetrazolium, NBT) en presencia de distintas combinaciones de compuestos. El NBT es un sensor molecular específico de la producción de anión superóxido, el primer tipo de ROS producido durante la reducción de oxígeno molecular para generar agua. En presencia de anión superóxido, el NBT, una molécula incolora en estado reducido, se oxida para dar lugar a un cromóforo con un pico de absorción a 540 nm. Su grado de oxidación, y, por tanto, la absorbancia a 540 nm, es directamente proporcional a la producción de ROS. Como se muestra en la Figura 4, en una disolución hidroalcohólica de PplX en condiciones básales o excitada con luz UV (310 nm), no se detecta una producción significativa de ROS; sin embrago, si esta disolución es excitada con luz roja (635 nm), capaz de fotoestimular la actividad redox de la PplX para producir anión superóxido a partir de oxígeno molecular, la oxidación del NBT se incrementa enormemente, tal y como se esperaba (Figura 4). Significativamente la excitación con luz UV (310 nm) de disoluciones que contienen flavonoides y cannabinoides solos o en combinación con PplX no induce una producción significativa de ROS, indicando que la producción de luz azul por estos compuestos al ser excitados por luz UV no es capaz de estimular la producción de ROS directamente a partir de oxígeno molecular o usando como intermediario la PplX (Figura 4). Del mismo modo, la clorofila A en disolución excitada con luz UV tampoco es capaz de inducir una oxidación significativa de NBT (Figura 4). En el mismo sentido, la combinación de flavonoides y cannabinoides con clorofila A en estado basal tampoco induce una producción significativa de ROS. Sin embargo, la combinación de flavonoides y cannabinoides con clorofila A excitada con luz UV (310 nm) induce una oxidación significativa de NBT indicando que la conversión de fotones de luz UV en luz roja por sí sola es capaz de estimular en cierto grado la producción de ROS in vitro, probablemente debido al pico de absorción de luz que tiene el oxígeno molecular en la región del rojo/infrarrojo que podría ser suficiente para estimular directamente la producción de ROS (Figura 4). No obstante, la combinación de flavonoides/cannabinoides, clorofila A y PplX excitada con luz UV (310 nm) induce una potente y significativa producción de ROS equivalente a la obtenida excitando PplX con luz roja (Figura 4).

En conjunto, estos resultados demuestran la existencia de un proceso de TFS entre flavonoides/ cannabinoides y clorofila A que es capaz de convertir fotones de luz UV en fotones de luz roja/infrarroja. Estos resultados demuestran asimismo que este proceso de TFS puede acoplarse a una producción de ROS bien de forma directa o potenciado por la presencia de un fotosensibilizador adecuado, en este caso PplX.

-Evaluación de la de absorción UVB/A de distintas combinaciones de un proceso TFS.

También se ha cuantificado mediante absorbancia en soluciones alcohólicas la capacidad de distintas mezclas de compuestos orgánicos, incluyendo flavonoides, cannabinoides y clorofilas para absorber radiación UVB/A (280, 320 y 340 nm). Los resultados obtenidos indican que, tal y como se esperaba por sus características espectrocópicas (ver Figura 3), una combinación de flavonoides y cannabinoides tiene una notable capacidad para absorber radiación UVB/A que se ve significativamente potenciada por la presencia de clorofila A (Figura 5). Estos resultados indican, dados los valores de absorbancia obtenidos a distintas longitudes de onda en la región UVB/A, que la determinación in vitro y/o in vivo del Factor de Protección Solar (Sun Protection Factor; SPF) mostrará valores que oscilarán entre 20 y 35 para las combinaciones flavonoides/ cannabinoides o flavonoides/ cannabinoides/ clorofilas. de piel de la eficiencia del ión cutánea

Para validar in vitro la capacidad del proceso de TFS acoplado a la producción de ROS como un mecanismo no solo capaz de proteger a células y tejidos de mamíferos, particularmente la piel, frente a la radiación UVB/A, sino también de utilizar esta radiación UVB/A como catalizador para potenciar la proliferación celular y la regeneración tisular, se han utilizado cultivos de fibroblastos primarios de piel humana como modelo experimental.

2.1 Materiales v métodos

-Modelo

Para el desarrollo de los ensayos llevados a cabo en este proyecto, se emplearon cultivos primarios de fibroblastos humanos obtenidos a partir de biopsias de piel de voluntarios sanos y regiones de piel sana de pacientes jóvenes (neonatos-13 años de edad) como modelo in vitro. Las biopsias de piel fueron proporcionadas por la Unidad de Dermatología del Hospital Ramón y Cajal, con el consentimiento informado de los pacientes y con la aprobación del Comité Ético del Hospital Ramón y Cajal. Dichas biopsias fueron procesadas mediante disgregación mecánica, empleando bisturí, y enzimática con Colagenasa A (1 mg/ml, Roche) para la digestión del colágeno y disociación celular para la obtención de fibroblastos.

-Cultivo y mantenimiento de la línea celular de fibroblastos humanos

El cultivo de la línea celular se realizó siguiendo protocolos estándar (Ng W, Ikeda S. “Standardized, Defined Serum-Free Culture of a Human Skin Equivalent on Fibroblast- Populated Collagen Scaffold”. Acta Derm Venereol. 91 :387- 91 , 2011). La línea celular empleada fue crecida en medio de cultivo DMEM (“Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”) sin piruvato (Gibco), suplementado con 2 mM de L-glutamina Gibco), 10% de suero fetal bovino (FBS, “Fetal Bovine Serum”) (Gibco) y antibiótico con antimicótico diluido al 1X (Gibco). Todos los cultivos fueron mantenidos a 37°C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO2. Se empleó medio de cultivo sin piruvato para el posterior análisis de la liberación de la enzima citoplasmática lactato deshidrogenasa (LDH) proveniente de células muertas y/o lisadas, que cataliza la oxidación del lactato a piruvato, descrito en el apartado 3.10 de materiales y métodos.

Para el mantenimiento de la línea celular, así como para los distintos tratamientos llevados a cabo, se emplearon placas Peth de 100 cm2 de superficie (P100, Falcon) así como placas multipocillo de 6 pocilios (MW6, Falcon), respectivamente, tratadas para la adhesión celular. Las células se mantuvieron a una confluencia del 20-90%, renovándose el medio de cultivo en días alternos y realizándose los subcultivos (al alcanzar un 70-80% de confluencia) mediante la disgregación de las células con Tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich) dependiendo del tiempo de duplicación de cada una de las líneas. Además, las células también fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de cristal de 12 mm de diámetro (Superior Marienfeld) colocados en las placas multipocillo de 6 pocilios, para los análisis posteriores de inmunolocalización de proteínas.

-Ensayo de daño con luz ultravioleta B en cultivos primarios de fibroblastos humanos.

Para la determinación del tiempo necesario para la detección de daño celular tras la irradiación con luz ultravioleta B, se sembraron 700.000 fibroblastos humanos por pocilio en placas de 6 pocilios (MW6, Falcon), sobre cubreobjetos de cristal. Tras la siembra, los cultivos celulares se mantuvieron en medio completo durante 24 horas hasta alcanzar una confluencia del 80- 90%. Transcurrido este tiempo, se llevó a cabo la irradiación durante 5 minutos con una fuente de luz ultravioleta B de onda de 311 nm (Dermalight 200, Dr Hónle Medizintechnik) colocada en la parte superior de la placa, y mantenida a 2 cm de los cultivos celulares. Posteriormente los cultivos se mantuvieron en medio de cultivo DMEM completo durante los siguientes tiempos establecidos: 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas. En paralelo se llevaron los controles negativos en ausencia de luz UVB. Transcurrido el tiempo determinado, se llevó a cabo la fijación de las células con formaldehido al 3.7% en PBS para posterior análisis de inmunolocalización de proteínas.

-Tratamiento con químicos vegetales (Clorofila A y Morina o Cannabidiol) y metil aminolevulinato (m-ALA) como precursor del fotosensibilizador endógeno Protoporfirina IX (PplX) en fibroblastos humanos.

Para llevar a cabo los distintos tratamientos, se sembró el mismo número de células (700.000) en placas multipocillo de 6 pocilios (MW6, Falcon). Tras la siembra, los cultivos celulares se mantuvieron en medio completo durante 24 horas hasta alcanzar una confluencia del 80-90%. Transcurrido este tiempo, se retiró el medio completo y los cultivos celulares fueron incubados con una combinación de 1 ,6 mM de Morina (Sigma) o 1 mM de Cannabidiol y 1 ,11 mM de Clorofila A (Sigma) y 0,1 mM de m-ALA en medio DMEM completo sin FBS durante 4 horas en oscuridad a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de CO2. A continuación, las placas de cultivo fueron irradiadas con una fuente de luz ultravioleta B de longitud de onda de 311 nm (Dermalight 200, Dr Hónle Medizintechnik) durante 5 minutos. En paralelo se llevaron los controles negativos en ausencia de m-ALA, clorofila, moriría, cannabidiol y de luz. Tras la finalización del procedimiento, se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con PBS (“Phosphate-Buffered Saline”) y se mantuvieron en medio DMEM completo fresco hasta su posterior análisis. Todas las placas se mantuvieron en cultivo hasta la recogida de las muestras celulares a las 4, 24 y 48 horas para la realización de los distintos ensayos.

-Inmunolocalización de las K¡67 en las líneas celulares

Para la inmunolocalización de proteínas en fibroblastos humanos crecidos en cubreobjetos de cristal, éstos fueron fijados con formaldehido al 3.7% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT, “Room Temperature”) 4, 24 y 48 horas después de los tratamientos descritos en el apartado 3.4. A continuación, los cristales se lavaron con PBS y se añadió Tritón X-100 (0,5% en PBS, Sigma-Aldrich) durante 30 min para permeabilizar las membranas de las células fijadas. Tras la permeabilización, se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS-BSA 0,5% (albúmina sérica bovina diluida en PBS) durante 30 minutos a RT. Después, las muestras se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (rabbit-anti- K¡67 y mouse-anti-yH2AX) diluido 1 :100 en PBS-BSA O/N a 4 oC en cámara húmeda. Tras lavar las muestras con PBS, se incubaron los cubreobjetos con el anticuerpo secundario correspondiente (Alexa FluorTM 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) o Alexa FluorTM 488 goat anti-mouse IgG (H+L), Life Technologies) a una dilución de 1 :200 en PSB-BSA y DAPI (5 ng/ml, Sigma-Aldrich) para la contratinción de los núcleos celulares durante 1 hora a RT en oscuridad. Finalmente se montaron las muestras con medio de montaje acuoso Prolong (Invitrogen). Para la observación de las muestras, se empleó el microscopio de fluorescencia Nikon modelo Eclipse Ci-L 100-240V 0.2A 50/60Hz acoplado a una cámara CCD Progress (Gryphax) mediante la excitación del fluorocromo correspondiente. de viabilidad en cultivo de fibroblastos mediante tinción de cristal violeta

Con el objetivo de determinar la viabilidad celular y cuantificar la muerte celular tras los diferentes tratamientos llevados a cabo, se realizó una tinción de las células con cristal violeta (Feoktistova, M., Geserick, P., & Leverkus, M. (2016). Crystal Violet Assay for Determining Viability of Cultured Cells. Cold Spring Harbor Protocols, 2016(4), pdb.prot087379). Para ello, tras retirar el medio de cultivo en el cual se habían crecido las células, éstas fueron fijadas a las 4, 24 y 48h con Metanol frío (-20°C) durante 10 min a RT. Posteriormente, las células fueron teñidas con Cristal Violeta (0,1 %) durante 40 min RT. A continuación, tras retirar el cristal violeta y lavar con agua corriente el exceso del mismo, se incubaron las placas en estufa a 37°C durante 1 h. Por último, para disolver el tinte, se adicionó ácido acético al 10% manteniéndose en agitación durante 15 minutos a RT. Finalmente, la absorbancia fue medida en placas multipocillo de 96 pocilios a 620 nm utilizando el lector de densidad óptica Tecan’s Sunrise absorbance microplate reader. de viabilidad y estudio de ciclo celular en cultivo fibroblastos humanos mediante análisis por citometría de

Con el fin de determinar viabilidad celular, así como la fase celular en que se encontraban los fibroblastos primarios humanos, tras los distintos tratamientos a las 4, 24 y 48 horas, se realizó una tinción de Yoduro de Propidio (Pl, “propidium iodide"). El Pl es un compuesto fluorogénico que se une estequimétricamente a los ácidos nucleicos por lo que su fluorescencia es proporcional al DNA y RNA que contiene una célula y que disminuye cuando las células entran en apoptosis (Riccardi, C., & Nicoletti, I. (2006). Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols, 1 (3), 1458- 1461). Para ello, los sobrenadantes celulares junto con la suspensión celular recogida mediante tripsinización, fueron centrifugados a 1500 rpm durante 10 minutos, y los pellets celulares obtenidos fueron fijados con etanol 70% frío durante 16 horas a -20°C. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 200 G (rcf) durante 10 minutos a 4°C y, tras ser lavadas con PBS frío, se resuspendieron en una solución de PBS con la mezcla de tinción siguiente: yoduro de propidio (1mg/ml), RNasa libre de DNasas (10 pg/mL) y Tritón 0,1 % (v/v) en PBS. Por último, se trasladaron las muestras a tubos eppendorf de 1 ,5 mL y se incubaron a 37°C durante 15 minutos. Las muestras finales se conservaron a 4°C hasta el análisis por citometría de flujo (Servicio de Citometría de la UAM).

-Extracción de RNA y análisis de expresión qénica

Para la determinación de los niveles de expresión de mRNA en los pellets celulares de fibroblastos humanos recogidos mediante tripsinización a las 4, 24 y 48 horas tras los tratamientos realizados, se llevó a cabo la extracción y purificación de RNA a partir de los mismos con el kit RNeasy Mini (Quiagen), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. La concentración y pureza de RNAm se cuantificó determinando su absorbancia, empleando un espectrofotómetro de gota (SimpliNanoTM), y se llevó a cabo un RT-PCR para la generación de cDNA empleando para ello el kit FastGene Scriptase Basic cDNS Synthesis Kit (NIPPON Genetics EUROPE). -Cuantificación de la concentración de Colágeno Ia1 Humano en respuesta al tratamiento

Con el fin de estudiar la liberación de colágeno I a 1 humano en el medio de cultivo, se utilizó un kit comercial, Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA, 5 Plate, siguiendo las indicaciones de la casa comercial, y empleándose para ello los sobrenadantes obtenidos a partir de los medios de cultivos de las diferentes condiciones experimentales establecidas en el tratamiento realizado. Para ello, los diferentes sobrenadantes fueron expuestos a un anticuerpo de captura mouse Anti-Human Pro-Collagen I a1 y a concentraciones decrecientes de Recombinant Human Pro-Collagen I a1 Standard para el posterior análisis de las concentraciones obtenidas con una curva patrón. A continuación, se llevó a cabo la incubación durante 2 horas a RT y en oscuridad con el anticuerpo de detección, adicionándose posteriormente Estreptavidina-HRP durante 20 min en oscuridad. La determinación de la densidad óptica se llevó a cabo utilizando el lector Tecan’s Surnrise absorbance microplate reader a 450 y 570nm. Tras la determinación de las densidades ópticas, se restaron las absorbancias obtenidas a 450 nm y 570nm y se llevó a cabo una recta patrón para interpolar en ella los datos obtenidos de las distintas condiciones.

-Determinación de la citotoxicidad celular mediante la cuantificación de la concentración de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio tras el tratamiento

Con el objetivo de estudiar la citotoxicidad celular, se determinó la concentración de enzima lactato deshidrogenasa (LDH), gue cataliza la conversión de piruvato mediante la reducción de NAD+ a NADH, liberada al medio de cultivo celular a partir de las células muertas, utilizando el kit CyQUANT™ LDH Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen) siguiendo las indicaciones de la casa comercial y realizándose triplicados de los tratamientos. Consiste en un método colorimétrico basado en la reducción de la sal de tetrazolio (INT) formando cristales de formazán de color rojo, siendo esra proporcional a la cantidad de LDH liberada en el medio y, por lo tanto, siendo indicativo de citotoxicidad. La absorbancia se midió utilizando el lector de densidad óptica Tecan’s Sunrise absorbance microplate reader a 680 y 490nm. Tras la determinación de las densidades ópticas correspondientes, se restaron las absorbancias obtenidas a 490 nm menos las obtenidas a 680nm, obteniéndose el porcentaje de citotoxicidad de cada muestra mediante la siguiente fórmula Fórmula para el cálculo del porcentaje de citotoxicidad asociado a LDH

-Métodos estadísticos

Para todos los diseños experimentales planteados se incluyó un mínimo de muestras para la obtención de significación estadística (n>3) en las condiciones de control y tratamiento, realizándose una comparación de las variables estudiadas entre control y tratamientos. Todos los datos obtenidos en las distintas mediciones y análisis se introdujeron en un fichero Excel y los valores independientes de cada tratamiento fueron relativizados frente a su control estableciéndose los ratios y comparándose mediante la prueba t de Student, determinándose para muestras métricas o no métricas en base al análisis de la vahanza realizado por medio de la prueba t de Fisher. Posteriormente los valores fueron representados en gráficos de barras. Para los análisis estadísticos de los datos de expresión génica obtenidos por PCR, estos fueron introducidos en un fichero Excel y se analizaron mediante el método Ct comparativo, representándose los cambios en la expresión génica como valor 2 - ACt y normalizándose su expresión frente al gen control empleado (18s). Posteriormente los resultados se representaron en gráficos de barras.

2.2 Resultados

-El daño celular causado por la irradiación con luz UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos comienza a manifestarse a 24h tras la exposición.

En primer lugar, para determinar el tiempo en el cual se manifiesta el daño celular inducido por la exposición a irradiación con luz UVB durante 5 minutos en cultivos primarios de fibroblastos humanos, se analizó mediante inmunodetección, el marcador de rotura en la doble hebra de ADN, histona yH2AX, comúnmente empleado como control positivo de daño frente a UV (Yuan, J., Adamski, R., & Chen, J. (2010). Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS letters, 584(17), 3717-3724), a los distintos tiempos establecidos (10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas). Los resultados obtenidos indican, tal y como se muestra en la Figura 6, que el daño genómico tras la inducción del mismo con luz UVB comienza a manifestarse con la expresión del marcador vH2AX a las 24 horas, manteniéndose dicha expresión a las 48 horas, y seleccionándose por tanto ambos tiempos para la realización de los ensayos planteados en el presente trabajo. -Reducción del daño y la muerte celular frente a la radiación UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos tratados con la combinación de los extractos naturales (clorofila A y mohna) y m-ALA

Con objeto de analizar el papel protector de la combinación de los extractos naturales (clorofila A y mohna), junto con el precursor del fotosensibilizador endógeno PPIX(m-ALA), frente a la radiación UVB, cultivos celulares de fibroblastos primarios humanos fueron incubados con los distintos tratamientos descritos en materiales y métodos, y se sometieron a irradiación con UVB. Transcurridas 24 y 48 horas los cultivos fueron fijados. A continuación, para corroborar la reducción de la muerte celular observada y determinar el potencial papel protector del tratamiento completo frente al daño causado por el UVB en los cultivos primarios de fibroblastos humanos, se llevó a cabo la inmunodetección de la histona de daño vH2AX en las diferentes condiciones estudiadas. Como muestra la Figura 7, el control (sin irradiar y sin tratamiento) no muestra expresión de la histona vH2AX en ninguno de los tiempos estudiados. Sin embargo, la irradiación con luz UVB, tal y como está descrito, induce la expresión de la histona de daño vH2AX, disminuyendo notoriamente en las células tratadas con la combinación de clorofila A y mohna, 48h tras la irradiación con UVB de las mismas. Sin embargo, tal y como se esperaba, las células tratadas con el tratamiento concomitante con mohna, clorofila A y m-ALA, no mostraron expresión de vH2AX en respuesta a la radiación UVB, sugiriéndose un claro efecto protector de este tratamiento completo frente al daño causado por la irradiación con UVB.

Para comprobar la viabilidad celular, transcurridas 24 y 48 horas tras irradiación con UVB los cultivos fueron fijados y teñidos con cristal violeta. La viabilidad celular fue cuantificada mediante absorbancia a 620 nm, y representada en porcentaje, asumiendo un 100% de viabilidad en la condición Control. La Figura 8 muestra que, con el tratamiento con los extractos naturales, así como con la combinación de los mismos con el precursor de la protoporfihna IX aumenta la viabilidad celular con respecto a las células únicamente irradiadas con luz UVB a las 24 horas tras el tratamiento, siendo dicho aumento significativo a las 48 horas tras el mismo. Con objeto de confirmar los resultados de viabilidad celular, transcurridas 24 y 48 h de los tratamientos, se llevó a cabo el análisis de ciclo celular mediante citometría de flujo, empleando yoduro de propidio, que penetra en la membrana de las células deterioradas para intercalarse entre las dos cadenas de ADN, tiñendo las células que han sufrido muerte celular. La Figura 9 muestra que, tal y como se esperaba en base al resultado anterior, se produce un incremento significativo de la muerte celular en las células únicamente irradiadas con luz UVB tanto a las 24 como a las 48h tras la irradiación de las mismas, descendiendo dicha muerte levemente en presencia de la combinación de clorofila A y morina 48h el tratamiento. Sin embargo, tal y como estaba previsto, el tratamiento completo lleva a una drástica reducción de la muerte celular en respuesta a la irradiación con UVB, tanto a 24 como a 48h, registrándose unos niveles de muerte similares a las células control, y demostrándose un claro efecto protector del tratamiento completo frente al daño producido por la irradiación con UVB.

De manera paralela, y para corroborar estos resultados, se tomaron imágenes de campo claro de los cultivos, empleando para ello un microscopio invertido, de manera frecuente hasta que las células control llegaron a confluencia (48h). La Figura 10 muestra que, tal y como se esperaba en base a los resultados anteriores, 24 horas tras la irradiación de los cultivos celulares con luz UVB, se observaba muerte celular, manifestada principalmente como debris celular en el sobrenadante y siendo prácticamente total 48 horas tras la misma. Asimismo, se observa una disminución parcial de dicha muerte celular en las células tratadas con los extractos naturales, siendo ésta más notoria en el caso del tratamiento combinado de los extractos naturales con el precursor de la PplX (m-ALA) tanto a las 24 como a las 48 horas tras los tratamientos.

Finalmente, en base a los resultados obtenidos de la disminución en la expresión de la histona vH2AX tras la incubación de los cultivos primarios de fibroblastos humanos con el tratamiento combinado de los extractos naturales (con y sin m-ALA), indicativo de disminución de daño celular, y a la disminución de la muerte celular observada, se analizó la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo celular en todas las condiciones analizadas ya que la liberación de la misma ocurre en el momento en el que se rompe la membrana plasmática durante la muerte celular (Ana Celeste Ximenes Oliveira, Ismael Ángel Rodríguez, Ingrid Garzón, Miguel Alaminos. Estudio de viabilidad celular en un modelo experimental de fibroblastos gingivales humanos cultivados en ausencia de suero bovino fetal, Actual. Med. Vol. 95 (2010) n°780, Mayo/ agosto 2010, págs. 013 - 018). La determinación de la liberación de la LDH y el porcentaje de citotoxicidad se llevó a cabo mediante la cuantificación por colorimetría y posterior medición de la densidad óptica tal y como se describe en materiales y métodos. En base a esto, la Figura 11 muestra que la citotoxicidad asociada a la irradiación con UVB aumenta notablemente en comparación con el control, mientras que, en las muestras tratadas con clorofila A y morina, se produce una clara disminución de la citotoxicidad 24h tras el tratamiento e irradiación de las mismas con luz UVB. Dicho efecto protector se intensifica en células sometidas al tratamiento concomitante de los extractos naturales con m-ALA, 48h tras el tratamiento de los cultivos celular y la irradiación de los mismos con luz UVB.

-Incremento de la Fase S y la proliferación celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos en respuesta al tratamiento completo con clorofila A, morina y m-ALA como precursor de la PplX

Teniendo en cuenta que para el tratamiento completo se emplea m-ALA que es incorporado en la ruta biosintética del grupo hemo, dando lugar a la formación del fotosensibilizador endógeno PplX, y que su irradiación con luz de longitud de onda adecuada (635 nm) conduce a la generación de dosis no letales de ROS, que inducen un incremento en la proliferación celular (Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á., & Espada, J. (2016). Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods (San Diego, Calif.), 109, 180-189), se planteó analizar si a través de la generación de una cadena de electrones desde la luz UVB (311 nm) y tras ser absorbida por los diferentes extractos vegetales, primero morina y después clorofila A, se estimularía el pico de absorción de la PplX (635 nm), la cual tras excitarse conduciría a la generación de una dosis transitoria y subletal de ROS. En este sentido, se quiso analizar si se estaba produciendo un potencial incremento de la fase S celular (síntesis de DNA) tras la irradiación con UVB en los cultivos primarios de fibroblastos humanos tras el tratamiento concomitante de los extractos vegetales con m-ALA. Así, los cultivos de fibroblastos primarios humanos fueron incubados con el tratamiento completo con clorofila A, morina y m-ALA durante 4 horas, siendo posteriormente irradiados con luz UVB. A las 24 y 48 horas tras el tratamiento, los pellets y sobrenadantes obtenidos fueron teñidos con yoduro de propidio y analizados mediante citometría de flujo. La Figura 12 muestra que, tal y como se esperaba, se produce un aumento de la fase S celular a las 24 y 48h tras el tratamiento de los cultivos celulares con clorofila A y morina con y sin m-ALA e irradiadas con luz UVB, siendo dicho aumento muy significativo 48 horas tras el tratamiento concomitante de los extractos vegetales con el m-ALA. Además, tal y como está descrito en la bibliografía, también se produce un incremento de la fase S en los cultivos celulares únicamente irradiados con UVB (Imray, P., Mangan, T., Saul, A., & Kidson, C. (1983). Effects of ultraviolet irradiation on the cell cycle in normal and UV-sensitive cell lines with reference to the nature of the defect in xeroderma pigmentosum variant. Mutation research, 112(5), 301-309) siendo este mayor 24 horas tras la irradiación. Una vez determinado el incremento de la fase S en los cultivos celulares en respuesta al tratamiento, se quiso confirmar un aumento de la proliferación celular mediante el estudio de la expresión mediante inmunodetección del marcador de proliferación K¡67 en cultivos primarios de fibroblastos humanos. La Figura 13, muestra que, en concordancia con el resultado obtenido en el ensayo de citometría de flujo, la presencia del marcador de proliferación K¡67 aumenta en los fibroblastos incubados con el tratamiento completo que contiene m-ALA en comparación con las células únicamente irradiadas con luz UVB y manteniéndose similar al control (sin irradiar y sin tratamiento) en las células tratadas con clorofila A, morina sin m-ALA. Además, la presencia del marcador K¡67 disminuye en el cultivo de fibroblastos únicamente irradiados con luz UVB y no aumenta en los tratados con clorofila A y morina.

-Incremento de los componentes de la matriz extracelular en cultivos primarios de fibroblastos humanos con el tratamiento completo que combina clorofila A y morina con m- ALA como precursor de la protoporfirina IX

Teniendo en cuenta que la radiación UVB induce daño en los fibroblastos dérmicos como consecuencia de la generación elevada de ROS, conduciendo a una disminución de la producción y remodelación de MEC relacionada con la disminución de colágeno (Rittié, L., & Fisher, G. J. (2015). Natural and sun-induced aging of human skin. Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 5(1), a015370) y que en ensayos previos del laboratorio no publicados se había determinado el aumento de las fibras de colágeno en la dermis de ratones jóvenes, como consecuencia de la proliferación de los fibroblastos tras la generación puntual y transitoria de niveles no letales de ROS mediante el TF, se quiso analizar si el tratamiento propuesto era eficaz en la prevención del daño del UVB sobre la destrucción de fibras colágenas y si además se estimulaba la producción de las mismas asociada al incremento de la proliferación de los fibroblastos. Para ello, se llevó a cabo una cuantificación de la concentración de colágeno IcH humano liberado al medio de cultivo 24h tras los tratamientos, analizado mediante ELISA (Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas). Se apreció una disminución de la deposición de Colágeno IcH en los fibroblastos irradiados con UVB en comparación con el control. Sin embargo, las células expuestas al tratamiento con clorofila A y morina irradiadas con luz UVB, mostraron una deposición similar a las células control, aumentando ligeramente la misma en los fibroblastos tratados con la combinación de clorofila A, morina y m-ALA 24h tras la administración de los tratamientos. Finalmente, para corroborar este resultado, se llevó a cabo la validación mediante POR cuantitativa de vahos marcadores de la matriz extracelular, como Colágeno III (Col IIIA1), Colágeno II (Col IIA1) y Elastina (ELN), a partir de ADNc obtenido de muestras de cultivos primarios de fibroblastos humanos expuestos a las diferentes condiciones establecidas 24 y 48 horas tras los tratamientos y la irradiación con luz UVB y normalizando su expresión al ARN hbosómico 18s. Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 14, mostrándose un notorio incremento de la expresión de los marcadores de la matriz extracelular Col IIIA1 , Col IIA1 y ELN en los fibroblastos humanos expuestos al tratamiento completo, respecto al control y al resto de las condiciones establecidas, corroborando un papel protector de la clorofila A y la mohna frente al daño producido por la irradiación con luz UVB, así como un papel estimulador de la proliferación ante el tratamiento completo de los fibroblastos y la irradiación con luz UVB.

Ejemplo 3: Validación en un segundo modelo experimental de piel de la eficiencia del proceso TFS para promover la fotoprotección UV y la regeneración cutánea

Los cultivos organotípicos de piel humana, fundamentalmente en sus primeras etapas de establecimiento, constituyen un modelo experimental que recapitula a nivel molecular y celular de forma muy aproximada las potenciales respuestas fisiológicas del tejido cutáneo in vivo al ser sometido a distintos estímulos o a la exposición a factores exógenos/ xenobióticos. Constituye el modelo de elección en sustitución de organismos vivos recomendado por la EMA, la FDA y otros organismos internacionales para validar y evaluar la eficacia de fármacos y cosméticos.

-Mantenimiento de la integridad de la epidermis y de las fibras colágenas tras la irradiación con luz UVB en cultivos organotípicos de piel humana tratados con vahas combinaciones de los extractos naturales CBD, mohna y/o clorofila A, ¡unto con m-ALA

A continuación, con objeto de abordar el segundo objetivo, y analizar si la incubación de los cultivos organotípicos de piel humana (HSOC, del inglés “human skin organ culture”) con las composiciones descritas en la presente invención, protegía frente a los daños provocados por la irradiación con UVB, gracias a un fenómeno de TFS, se establecieron en primer lugar los cultivos HSOC de acuerdo con la técnica habitual en el campo de la invención (Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., & Bayat, A. (2015). Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society, 23(5), 685-702), y se incubaron con distintas combinaciones de los extractos naturales cannabidiol (CBD) y/o morina y clorofila A. Tras 24 horas de incubación con estos fitocompuestos, se aplicó Metvix® (aminolevulinato de metilo) en la epidermis de los HSOCs, como precursor de la PplX, durante 2 horas y media previo a la irradiación con UVB. Para determinar la dosis de UVB con la que se empiezan a producir daños estructurales en la piel no tratada, se eligió un rango de irradiación entre 6 y 12 J, que corresponde a un rango de tiempo de exposición entre 5 y 10 minutos, en base a la bibliografía (Masuma, R., Kashima, S., Kurasaki, M., & Okuno, T. (2013). Effects of UV wavelength on cell damages caused by UV irradiation in PC12 cells. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology, 125, 202-208). En primer lugar, se analizó el mantenimiento de la integridad de la piel 7 días después de la irradiación con ambas dosis de UVB, mediante tinción con H-E, en cortes histológicos de los HSOC, tratados con las combinaciones de fitocompuestos antes descritos, en presencia de m-ALA, y se compararon con los controles correspondientes.

La Figura 15, tal y como se esperaba en base a resultados previos del laboratorio, pone de manifiesto que la muestra de piel únicamente irradiada con luz UVB presentó una clara separación dermo-epidérmica, con un patrón discontinuo y asociado a las crestas epidérmicas, así como presencia de edema en la dermis, ya con 6 J de irradiación, que se incrementa proporcionalmente tras 12 J de irradiación, dosis que también provoca alteración de la morfología cúbica típica de los queratinocitos del estrato basal. Sin embargo, el pre-tratamiento con la combinación de morina, clorofila y m-ALA, previno la aparición de dichas alteraciones histológicas tras 6 J de irradiación con UVB, manteniendo la integridad de la piel similar a la del control, y parcialmente, tras 12 J de irradiación con UVB (Figura 16). Por otro lado, el tratamiento con la combinación de CBD, clorofila y m- ALA, previno parcialmente la aparición de dichas alteraciones histológicas, tanto tras 6 J de irradiación con UVB, como tras 12 J (Figura 16).

De manera paralela, se analizó el efecto de la incubación de los cultivos organotípicos con las diferentes combinaciones de fitocompuestos, en ausencia de irradiación, para descartar que estuvieran provocando toxicidad. Como muestra la Figura 16, el tratamiento con las diferentes combinaciones de fitocompuestos, en ausencia de irradiación con UVB, no indujo alteraciones estructurales en los cultivos organotípicos de piel, tal y como se esperaba, en base a los resultados previos del laboratorio.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. A) Representación esquemática del procedimiento de terapia fotodinámica, en la que se utilizan tres elementos, un agente fotosensible (PS), luz de longitud de onda adecuada capaz de ser absorbida por el PS (flecha roja) y oxígeno molecular, para producir especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS). B) Ruta biosintética de producción del fotosensibilizador endógeno PplX en la mitocondria.

Figura 2. Representación esquemática del proceso de transferencia fotónica secuencial en la piel.

Figura 3. Espectro continuo de absorción de flavonoides y cannabinoides representativos en la región UV del espectro electromagnético (200-400 nm) (A) y de clorofilas A y B en la región azul-infrarroja del espectro electromagnético (400-700 nm) (B). Cuantificación por espectrofluorimetría en soluciones hidroalcohólicas estándar de la emisión a 460 nm (región azul del espectro electromagnético) de distintos compuestos tras excitación a 280 o 320 nm (LIVB/A) (C) y de la emisión a 625 nm (región roja del espectro electromagnético) tras excitación a 460 nm (D). (Mn: Morina; Qc: Quercetina; CBD: cannabidiol; CBN: cannabinol; CBC: cannabicromeno; Cl: clorofila A).

Figura 4. Cuantificación de la producción de ROS in vitro medida como absorbancia a 540 nm del compuesto Azul de Tetrazolio (Nitro Blue Tetrazolium, NBT) oxidado por la producción de oxígeno singlete en soluciones hidroalcohólicas de distintas combinaciones de compuestos en condiciones básales o excitadas con luz UV (310 nm) o roja (635 nm). Los resultados se expresan como la media +/- desviación estándar de tres experimentos independientes. *, P<0.5; ***, P<0.01 (PplX: Protoporfirina IX; Mn: Morina; CBD: cannabidiol; Cl: clorofila A).

Figura 5. Cuantificación en soluciones hidroalcohólicas de la absorbancia a distintas longitudes de onda en la región UVB/A (280, 320 y 340 nm) de distintas combinaciones de compuestos orgánicos (Mn. Morina; CBD: cannabidiol; CBN; cannabinol; Cl: clorofila A).

Figura 6. El daño celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos tras su exposición a luz UVB comienza a manifestarse a las 24 horas tras la exposición. Inmunodetección mediante microscopía de fluorescencia del marcador de daño histona vH2AX (verde) a distintos tiempos establecidos (10 min, 30 min, 1 hora, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas) en cultivo de fibroblastos humanos primarios. En azul se muestran los núcleos con contra-tinción con DAPI. Imágenes representativas de 3 réplicas experimentales. Barra de escala = 100 pm.

Figura 7. El daño celular causado por la radiación UVB disminuye notoriamente en presencia del tratamiento completo con clorofila A, moñna y m-ALA en cultivos primarios de fibroblastos humanos. Se muestran imágenes representativas de microscopía de fluorescencia representativas de la inmunodetección del marcador de daño celular vH2AX (verde) a las 24h (a) y 48h (b) tras la realización de los tratamientos. En azul se muestra la contra-tinción de los núcleos con DAPI. Barra de escala = 100 pm. Las imágenes son representativas de una n=3. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de moñna.

Figura 8. La viabilidad celular aumenta en cultivos primarios de fibroblastos humanos tratados con clorofila A (C), moñna (M) y el precursor de la protoporfiñna IX (m-ALA) en comparación con las células únicamente irradiadas con luz UVB 24h tras el tratamiento, siendo dicho aumento significativo 48h tras el mismo. Cuantificación de la viabilidad celular mediante tinción con cristal violeta (absorbancia tratamiento/ control medida a 620 nm de longitud de onda; U.A.: unidades arbitrarias) en cultivos primarios de fibroblastos humanos tras 24 horas a) y 48 h del tratamiento b). *, significativo, p < 0,1. n=3. Las barras de error indican el error estándar. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de moñna.

Figura 9. Reducción drástica de la muerte celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos a las 48h tras la administración de la combinación de moñna o cannabidiol (A) clorofila A (B) con y sin m-ALA) irradiadas con UVB, en comparación con células únicamente irradiadas con UVB. Cuantificación de la muerte celular medida mediante citometría de flujo en fibroblastos humanos teñidos previamente con yoduro de propidio y expresada en ratio con respecto al control (sin irradiar y sin tratamiento). Las barras de error indican el error estándar. *, significativo, p < 0,1. n=3.

Figura 10. El tratamiento completo con clorofila A, moñna y m-ALA protege del daño producido en respuesta a la radiación UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos. Se muestran imágenes representativas de campo claro tomadas con microscopio invertido a las 24h (a) y 48h (b) tras la administración de los tratamientos. Imágenes representativas de 3 ensayos. Barra de escala = 100 pm. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de moñna. Figura 11. Disminución de la citotoxicidad asociada a la liberación de LDH como consecuencia del tratamiento completo combinado de morina o cannabidiol (A) clorofila A (B) y m-ALA (C) en cultivos primarios de fibroblastos humanos irradiados con UVB, 48h después. Cuantificación de la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo celular 48h tras la administración de los tratamientos e irradiación de las células con luz UVB, expresada en porcentaje de citotoxicidad empleando la fórmula: % citotoxicidad = (tratamiento-control total) / (máxima liberación de LDH-control total) x 100. n=2.

Figura 12. Aumento significativo de la fase S celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos irradiados con luz UVB en presencia o no de la combinación de morina o cannabidiol (A), clorofila A (B) con y sin m-ALA (C) con respecto al control (sin irradiar y sin tratamiento). Cuantificación de la fase S celular relativizada con respecto al control 48h después de la administración de los tratamientos mediante la tinción de las células con yoduro de propi dio , y su posterior análisis por citometría de flujo. Las barras de error indican el error estándar. *, significativo, p < 0,1. n=3.

Figura 13. Aumenta la proliferación celular en cultivos de fibroblastos primarios en presencia del tratamiento completo con morina, clorofila A, morina y m-ALA. Inmunodetección mediante microscopía de fluorescencia del marcador de proliferación K¡67 en cultivos primarios de fibroblastos humanos 24h (a) y 48h (b) tras la administración de los tratamientos. Barra de escala =100 pM. Las imágenes son representativas de 3 ensayos. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de morina.

Figura 14. Incremento de marcadores de matriz extracelular en cultivos primarios de fibroblastos humanos 24h tras el tratamiento completo con morina o cannabidiol (A), clorofila A (B) y m-ALA e irradiados con luz UVB frente al control y al resto de las condiciones establecidas. Cuantificación de la expresión de los genes de la matriz extracelular Colágeno IIA1 y Elastina mediante PCR cuantitativa. Se utilizó ARN ribosómico 18s como control endógeno. Las barras de error indican error estándar. *, p < 0,1 ; **, p < 0,05. n=3.

Figura 15. Cortes histológicos de HSOC, tratados con las distintas combinaciones descritas de fitocompuestos e irradiados con UVB, teñidos con tinción hematoxilina-eosina (H-E) y visualizados mediante microscopía de campo claro