MEMORIA DESCRIPTIVA

CAM PO TÉCNICO

La presente invención se relaciona con la industria apícola. Específicamente, la invención se relaciona con una composición para la prevención y tratamiento de Loque Americana causada por Paenibacillus larvae en abejas melíferas. La invención además se relaciona con un proceso de elaboración y el uso de dichas composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las abejas son de vital importancia en el medio ambiente al polinizar las flores silvestres y muchos cultivos agrícolas, contribuyendo con la polinización del 90% de las plantas con flor, además de producir miel y cera de abejas.

Al igual que otros animales de ganado, las abejas melíferas están sujetas a muchas enfermedades y plagas, que son el obstáculo principal en la apicultura.

Dado que las abejas mantienen constante contacto entre ellas, un organismo patógeno se extenderá con gran facilidad en la colonia.

A pesar de los mecanismos de defensa de las colonias, en donde se elimina o reduce la entrada de parásitos, incluyendo el uso de propóleo que se aplica dentro de las celdas de cría, uno de los mecanismos de defensa más importantes de las colonias de abejas, es su comportamiento de higiene que comprende la identificación y remoción de las crías o abejas adultas afectadas o enfermas.

La enfermedad Loque americana o americano, LA (American Foulbrood, AFB), es una de las principales enfermedades que atacan a las abejas, causada por la bacteria Paenibacillus larvae que afecta a las crías, desarrollándose en su intestino y posteriormente causando la muerte de la larva. La enfermedad es difícil de controlar debido a que P. larvae forma esporas que son extremadamente resistentes al medioambiente, al frío y al calor, la humedad, los desinfectantes químicos y la radiación UV, pudiendo sobrevivir hasta 40 años en un ambiente natural, aunque experimentan disminución de su viabilidad en ese período. Por ello, la forma de tratamiento más efectiva es la total incineración de la colmena y material de trabajo, siendo la más usada mundialmente. La Loque americana es particularmente letal en las primeras 48 horas de vida de las larvas, de modo que las acciones curativas no son efectivas y se deben tomar medidas de control preventivo, para evitar que la enfermedad se propague en la colmena.

En la etapa inicial de la infección, serán observables solo unas pocas larvas o pupas viejas muertas. Posteriormente, la enfermedad se propagará dentro de la colonia y puede extenderse rápidamente a otras colonias en el colmenar, ya que las abejas adultas, que no son el blanco de la enfermedad, propagan las bacterias y esporas entre las celdas de crías y durante sus trabajos de polinización. La transferencia natural ocurre usualmente dentro de un radio de 1 km alrededor del apiario.

En general, un método de control de enfermedades eficiente pero costoso, considera la inspección frecuente de las colmenas por parte de inspectores de apiarios calificados, acompañada de una estrategia de búsqueda y destrucción, para minimizar el daño a los colmenares, donde toda la población de abejas infectadas se elimina usando gas venenoso y los materiales de la colonia afectada se desinfectan con hidróxido de sodio o se queman, enterrando las abejas muertas y el material eliminado para evitar que las abejas obreras de colonias sanas se expongan a material contaminado.

Los métodos químicos para controlar el AFB implican la administración de antibióticos, tales como lincomicina o tilosina, o sulfatiazol sódico, en diversas formulaciones, mezclados con azúcar en polvo o en jarabe. Dado que los antibióticos y las sulfonamidas evitan la multiplicación de la bacteria patógena, pero no matan las esporas, la multiplicación de P. larvae puede comenzar nuevamente poco después de administrar el tratamiento, por lo que el tratamiento químico debe repetirse periódicamente en intervalos cada vez más cortos y mayores concentraciones, debido a la generación de cepas resistentes, junto con la desinfección simultánea de las colmenas, con el riesgo de contaminar la miel con residuos de antibióticos o sulfatiazol sódico. El tratamiento químico para el control de AFB se puede realizar solo en los países donde esté permitido (EEUU y Canadá, por ejemplo), bajo supervisión de un médico veterinario; sin embargo, en Europa este método está prohibido. Según el estándar norteamericano, se usa oxitetraciclina y el sulfatiazol sódico, aunque en EE.UU se ha dejado de usar sulfatiazol por la alta residualidad que tiene en miel, incluso más de un año, y por la aparición de cepas bacterianas resistentes. En cuanto al tartrato de tilosina, éste aún es considerado como una alternativa efectiva, porque no es tóxico para las abejas, su residualidad en miel es baja (aunque se recomienda aplicarlo antes de la temporada de producción de miel) y la enfermedad no presenta recurrencia hasta un año después de efectuado el tratamiento. Lamentablemente, dado que el tratamiento no elimina las esporas, múltiples mercados, incluyendo el Europeo, rechazan este tipo de tratamientos e importaciones con trazas de antibióticos químicos, debido a que son una potencial amenaza de ingreso de esporas.

Se debe tener en cuenta, además, que la miel de un colmenar afectado podría estar contaminada con esporas de P. larvae, por lo que se debe tener atención con las zonas de procesamiento de miel y de eliminación de residuos.

Ante esto, gran parte de los países productores de miel, incluyendo Chile, optan por la incineración de todo el material apícola que ha estado en contacto con el brote de AFB, con la consiguiente pérdida económica.

Estado del Arte

En la literatura y el estado del arte, se encuentran diversos documentos que han abordado este problema técnico con diferentes estrategias. Por ejemplo, el documento US2013064796 Al donde se propone, para evitar que las abejas sean afectadas por Paenibacillus larvae, que estas se contacten con una mezcla que contiene microorganismos probióticos los que permitirían prevenir la infección. La mezcla se administra en el alimento o mediante espray para fortalecer el sistema inmune de las abejas. La mezcla comprende una o más bacterias formadoras de esporas (i.e. Bacillus thuringensis and Brevibacillus laterosporus), opcionalmente asociada con una bacteria ácido-láctica (BAL), como Saccharibacter sp. A diferencia de la presente invención, una composición probiótica como la descrita en este documento, podría alterar la microbiota normal de las abejas y además requiere tomar medidas adicionales durante la aplicación, al tratarse de una composición que comprende microorganismos vivos.

Por otra parte, en la publicación de Marche, M.G. et al (2019), se muestra como solución a este patógeno el uso de una fracción de proteína extracelular de Brevibacillus laterosporus con actividad inhibitoria sobre el crecimiento vegetativo y la germinación de esporas de P. larvae. El análisis proteómico de la fracción identificó como el principal componente a la proteína bacteriocina laterosporulina, además de otras proteínas y compuestos antimicrobianos tales como lectinas, chaperoninas, enzimas y proteínas putativas. A diferencia de la presente invención, el uso de la proteína de B. laterosporus descrita en este documento no logra una eficiencia de inhibición completa de P. larvae. Asimismo, Jaouani I. et al (2014) analiza el potencial inhibitorio del crecimiento de organismos patógenos, entre ellos Paenibacillus larvae, por distintas cepas de Enterococcus (E. faecium, E. faecalis, E. hirae, E. mundtii y E. durans), entre las que se evalúan e identifican 19 cepas de E. faecalis con actividad biocida contra P. larvae. Adicionalmente, atribuyen el efecto biocida a proteínas denominadas bacteriocinas, sugiriendo su aplicación en la industria alimenticia o como biocontrolador para la enfermedad de loque. La mayor concentración obtenible de las proteínas inhibitorias de E. faecalis por sí sola no logra una completa inhibición del crecimiento de P. larvae, por lo que sus resultados son inferiores a los alcanzados por la presente invención.

En resumen, han habido esfuerzos en la búsqueda de nuevos métodos biológicos de control de P. larvae, en estudios de inhibición con flavonoides con actividad antimicrobiana, diversas investigaciones con fagos o lactobacillus y propóleos como tratamiento contra esta bacteria patógena. Si bien, dichas investigaciones habrían demostrado potencial a nivel laboratorio, han fallado en generar una solución concreta para suplir el mercado mundial.

Por lo tanto, aún existe la necesidad de tecnologías eficientes para prevenir y tratar infecciones causadas por P. larvae en la industria apícola, que sean efectivas e inocuas tanto para las abejas como para los consumidores finales de los productos obtenidos. En este escenario, los inventores han desarrollado una solución efectiva para el control de esta enfermedad, que se diferencia en su constitución y efectividad de las soluciones existentes en el estado de la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Bacterias separadas. Mediante técnicas epectrofotométricas se mide el crecimiento de P. larvae, se considera crecimiento efectivo el aumento de turbidez. Se mide densidad óptica 600 nm del medio de cultivo (BHI suplementado con tiamina), control de crecimiento de P. larvae, las proteínas contra P. larvae provenientes de B. laterosporus, E. faecalis y el consorcio microbiano (proteínas A, B y C, respectivamente), y el patógeno presentado a los diferentes tratamientos A, B y C. Se gráfica el promedio ± la desviación estándar. Significativamente diferente al control: ****, p<0,0001, análisis ANOVA y test de Tukey.

Figura 2. Esporas. Germinación y desarrollo de P. larvae a partir de sus esporas en medio líquido (BHI+t) con proteínas del consorcio (concentración 1.029,84 pg/mL). Se mide densidad óptica 600 nm del medio de cultivo estéril ("Medio de cultivo"); las proteínas del consorcio ("Proteínas C"); control de crecimiento y germinación de esporas ("Germinación de esporas"); esporas en medio BH I tratadas con proteínas C ("Esporas tratadas"); y las esporas que fueron tratadas previamente con proteínas C, lavadas y resuspendidas en medio BHI libre de tratamiento ("Esporas resuspendidas"). Se gráfica el promedio ± la desviación estándar. Significativamente diferente al control: ****, p<0,0001, análisis ANOVA y test de Tukey.

Figura 3. Bactericida. Medición de turbidez, relacionada a crecimiento de P. larvae. Se mide la densidad óptica a 600 nm el medio BHI estéril; control de crecimiento normal de P. larvae ATCC 9545; P. larvae tratada con proteínas del consorcio (1.029,84 pg/mL); y el patógeno lavado con PBS y resuspendido en medio BHI posteriormente a ser tratado con proteínas del consorcio (1.029,84 pg/mL). Se gráfica el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas.

Figura 4A. Crecimiento de P. larvae enfrentado a diversas concentraciones v/v del biocontrolador (de 10 a 100%) frente a la cepa ambiental del SAG (a) y cepa ATCC 9545 (b). Se observa la medición de la densidad óptica a 600 nm versus los controles y las diferentes concentraciones del biocontrolador v/v. Se gráfica el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas.

Figura 4B. Dosis Mínima. Crecimiento de P. larvae enfrentado a diversas diluciones del biocontrolador frente a la cepa ATCC 9545. Se observa la medición de la densidad óptica a 600 nm versus los controles (Medio de cultivo y Crecimiento P. larvae), y las diferentes concentraciones de las proteínas del consorcio (205,96 pg/mL, 411,93 pg/mL, 617,9 pg/mL y 2.059,68 pg/mL). Se gráfica el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas.

Figura 5. Citotoxicidad. Resultados de porcentaje de citotoxicidad de las proteínas del consorcio a concentración máxima obtenida (2mg/mL), comparado a su medio regular de crecimiento (Grace's Insect Medium de Gibco® y DMEM de Gibco®, para células SF9 y Caco-2, respectivamente) y un máximo de LDH de CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay de Promega® (indica máxima muerte celular con un 100% citotoxicidad). Se gráfica el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas. Figura 6. Ensayo Larvas. Ensayo de inocuidad y eficacia en larvas de Apis mellifera de máximo 24 horas de su eclosión. Se mide la tasa de sobrevida de las larvas en diferentes dietas (n=300); Dieta JR (Jalea Real, dieta regular por 8 días), JR + Proteínas (Jalea Real con proteínas del consorcio 1.029,84 pg/mL, por 8 días), Infectadas (alimentadas el día 1 con Jalea Real y P. larvae, posterior 7 días se mantiene dieta de Jalea Real normal), Pre Infección (alimentadas día 1 con dieta JR+Proteínas, día 2 con dieta de Infectadas, y posterior 6 días con JR), Post Infección (alimentadas día 1 con dieta Infectadas, día 2 con dieta JR+Poteínas, posterior 6 días con dieta JR). Se gráfica el resultado tras los 8 días de experimento con el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas.

Figura 7. Crecimiento de P. larvae a partir de sus esporas en medio líquido con el biocontrolador al 50% v/v. Se observa la medición de la densidad óptica a 600 nm versus los controles (Medio BH I, cepa SAG y cepa ATCC) y los diferentes tratamientos (biocontrolador + cepa SAG y cepa ATCC. Se gráfica el promedio ± la desviación estándar. Significativamente diferente al control: ****, p<0,0001, análisis ANOVA y test de Tukey.

Figura 8. Crecimiento de Lactobacillus kunkeei. Medición de turbidez, relacionada a crecimiento de L kunkeei. Se mide la densidad óptica a 600 nm el medio MRS estéril, control de crecimiento normal de L. kunkeei, las proteínas del consorcio (Proteínas C) y L. kunkeei tratada con las proteínas (37,37 pg/mL). Se gráfica el promedio ± la desviación estándar, ANOVA y comparación múltiple por Tukey (p<0,05), los valores con la misma letra no tienen diferencias significativas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde a una composición que comprende la fracción proteica del cultivo de un consorcio bacteriano que comprende cepas de Brevibacillus laterosporus, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis y Clostridium perfringens. Este consorcio se encuentra depositado en la ATCC® con fecha 14 de febrero de 2022 bajo el número PTA-127132.

La composición de la invención inhibe de forma eficiente el crecimiento de Paenibacillus larvae, causante de la enfermedad loque americana, eliminando incluso las esporas de la bacteria. Al tratarse de una composición proteica, se trata de un formato más seguro para su aplicación en comparación con composiciones químicas sintéticas o antibióticos. Una composición proteica es ventajosa respecto del uso de probióticos bacterianos vivos directamente, pues el manejo de una composición proteica es más conveniente y además no altera la microbiota de la abeja.

Así, la composición se puede administrar como un suplemento nutricional, en mezcla con el alimento de las abejas o en jarabe.

En la presente invención se obtiene un conjunto de proteínas elaboradas por un consorcio bacteriano, en donde la composición que contiene distintas proteínas producidas por las bacterias del consorcio son capaces de inhibir el crecimiento de Paenibacillus larvae.

Las cepas bacterianas que forman parte del consorcio fueron seleccionadas a partir de colonias aisladas, en función de la actividad antimicrobiana contra P. larvae, en donde se determinó que los compuestos antimicrobianos son secretados al medio, y también se observó que el porcentaje de inhibición aumentaba significativamente al utilizar el sobrenadante del consorcio en lugar de utilizar sobrenadante de las colonias por separado. En la Figura 1 se muestra una comparación entre tratamientos con proteínas de B. laterosporus (tratamiento A), E. faecalis (tratamiento B) y el consorcio microbiano, demostrando que el uso del consorcio (tratamiento C) es el que reduce el crecimiento efectivo mucho mejor que el uso de B. laterosporus y E. faecalis por separado, lo que concuerda con un efecto sinérgico.

Análogamente, al evaluar la germinación y desarrollo de esporas de P. larvae (Figura 2), se demuestra que el uso del consorcio también logra inhibir la germinación de las esporas tratadas con las proteínas del consorcio (proteínas C), o bien resuspendidas, post-tratamiento con dichas proteínas. La inhibición de esporas fue efectiva en ambos tratamientos, con una diferencia no muy significativa a favor del tratamiento directo.

Adicionalmente, el consorcio ha demostrado un efecto bactericida, que se comprueba al evaluar el crecimiento en medio de cultivo normal, al tratarlo con proteínas del consorcio y al cultivar posterior al tratamiento con dichas proteínas, en ambos tratamientos con una concentración de 1.029,84 pg/mL, equivalente a una concentración de alrededor del 50%, de proteínas del consorcio (véase la Figura 3). Proceso de elaboración

En términos generales, el proceso de producción de proteínas por parte del consorcio bacteriano comprende las siguientes etapas:

1) Preparar el medio de cultivo. Se utiliza preferentemente medio BHI (Brain Heart Infusion Broth) de Merck suplementado con 1 - 5 mg/mL de clorhidrato de tiamina.

2) Agregar un inoculo del consorcio microbiano depositado en la ATCC bajo el número de depósito PTA-127132 compuesto por bacterias de los géneros Brevibacillus laterosporus, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis y Clostridium perfringens. Cultivar sin agitación en condiciones aeróbicas, entre 2 a 7 días a 37-C ±2°C.

3) Centrifugar una vez finalizado el cultivo entre 3.000 a 6.000 rpm por 20 - 50 minutos. Recolectar el sobrenadante y ajustar el pH entre 7,0 a 7,6 (el pH obtenido una vez finalizada la etapa de cultivo es del orden de 6, 7-6, 8) con una solución alcalina, como NaOH 1M.

4) Filtrar con un tamaño de poro de 0,2 pm, preferentemente utilizando una membrana de baja afinidad a proteínas, de modo de evitar disminuir la concentración de las proteínas en el eluido. Por ejemplo, un filtro de membrana de polietersulfona (PES), celulosa regenerada (RC), acetato de celulosa (CA) o fluoruro de polivinilideno (PVDF).

5) Se obtiene un líquido de color amarillo-dorado, libre de bacterias con una concentración de proteínas entre de 0,5 - 2,0 mg/mL

La concentración de proteínas del consorcio (principio activo) obtenidas se puede diluir de acuerdo a la concentración final deseada.

Composición

Este sobrenadante proteico estéril constituye la composición de la invención, y puede ser administrado directamente a la colmena mediante aplicación directa en los marcos de cría o mezclado con fructosa o dextrosa, u otros azúcares, a modo de jarabe. La fructosa o dextrosa u otros azúcares, se utilizan en una concentración entre 20 a 50% p/v.

Opcionalmente, la composición y/o proteínas obtenidas a partir del consorcio de la presente invención se puede administrar en mezcla con otros vehículos, tales como agua, medio de cultivo, suplemento nutricional, alimento, cera u otros sustratos sólidos.

También se puede mezclar con cualquier ingrediente de grado alimenticio para ser incorporado a la colmena, tales como Sorbato de potasio: entre 3 y 8 mg/L; propionato de sodio: entre 3 y 8 mg/L, ácido cítrico: entre 18 y 26 mg/L, propionato de calcio: entre 3 y 8 mg/L, harina de soja: entre 200 a 300 g/L, huevo deshidratado: entre 200 y 300 g/L, fructosa o dextrosa: entre 300 y 700 g/L, entre otros.

Para aplicación directa en las colmenas, sin mezclar con azúcares, se puede aplicar a las abejas adultas, las larvas y a cualquier instrumento apiario que puede estar en contacto directo con la colmena de abejas: a los marcos de cría, tableros y cubiertas de la colmena, en el estampado y/o en el alimentador de la colmena mediante aplicación mecánica. La composición se puede administrar mediante aspersión, inmersión, impregnación o combinaciones de ellos, como también puede ser administrado a través del alimentador de la colmena. La dosis recomendada es de 500 mi por colmena en un rango de concentración final desde 205 pg/ml hasta 2 mg/mL de proteínas del consorcio.

Si bien es posible usar la composición obtenida directamente (al 100%), en una realización de la invención, la composición se diluye a concentraciones equivalentes a una concentración de proteína de 409,4 pg/mL o superiores. Y en cualquier caso, la concentración de proteínas del consorcio siempre se aplicará en concentraciones mayores a 37 pg/ml.

En la Figura 4A se aprecia que incluso a partir de diluciones al 15% se podría lograr inhibición del crecimiento de P. larvae, por lo que se realizó una evaluación de la dosis mínima, usando concentraciones de 205,96 pg/mL, 411,93 pg/mL, 617,9 pg/mL y 2.059,68 pg/mL (Figura 4B); de ello se obtiene que las concentraciones por sobre 617,9 pg/mL logran el máximo efecto biocontrolador. Por lo tanto, el efecto biocontrolador se observa preferentemente en un rango de concentración desde 205,96 pg/mL hasta 2.060 pg/mL, en donde las diluciones pueden ser realizadas con agua, medio de cultivo o el vehículo utilizado para su aplicación en la colmena.

Los rangos indicados se derivan de los resultados experimentales en donde el sobrenadante del consorcio microbiano aislado es capaz de inhibir el crecimiento y germinación de esporas de Paenibacillus larvae a concentraciones superiores a 20% y 50% v/v, respectivamente.

En una realización preferente de la invención, la composición tiene una concentración proteica de aproximadamente 1.500 a 2.500 pg/mL para cada lote de producción, preferentemente 2.040 ± 10 pg/mL, con una vida de estante de 32 y 40 semanas almacenados a temperatura ambiente y 4°C, respectivamente, manteniendo sus características inhibidoras frente a P. larvae.

Durante el desarrollo de la invención, para determinar la concentración proteica del sobrenadante se utilizó el Pierce™ Coomassie (Bradford) Protein Assay kit de Thermo-Fisher. Posterior al filtrado y neutralización de pH, se midió la concentración de proteínas frente al reactivo de Bradford en el equipo NanoQuant Tecan Infinite m200 PRO a OD 595nm, con factor de dilución 1/4. Los resultados de absorbancia se extrapolan a una curva de calibración de BSA del kit entre los rangos de 25pg/mL hasta 1.500 pg/mL para determinar la concentración proteica del biocontrolador. No obstante lo anterior, la concentración proteica se podrá determinar de acuerdo a cualquier método disponible en el estado de la técnica, sin que por ello varíe el alcance de la presente invención.

Inocuidad

Se realizaron pruebas de toxicidad en las líneas celulares de Sigma-Aldrich®: Sf9, tejido ovárico pupal de Sodoptera frugiperda cultivada en Grace's Insect Medium de Gibco®, y CaCo-2, carcinoma de colon humano caucásico en DMEM (Gibco®), mediante dicho ensayo se obtuvo la primera aproximación de la composición al ser enfrentada a un organismo biológico superior. Todos los experimentos se realizaron con una densidad de 40.000 células/cm ² .

Las líneas celulares se expusieron al sobrenadante según el protocolo del kit CytoTox 96® Non- Radioactive Cytotoxicity Assay de Promega®. En una placa de 96 pocilios se dispuso medio con células y el sobrenadante, como también un control de máxima liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), se incubaron a 37°C para la línea celular CaCo-2 y a 27°C para Sf9 por un período de 3 horas. Posteriormente se dejó a temperatura ambiente en oscuridad por 30 minutos para luego agregar la solución de Stop y se midió absorbancia a 490nm a la hora de agregar la solución de Stop. Los resultados fueron calculados según la Ecuación 1.

Ecuación 1. Cálculo de porcentaje de citotoxicidad del kit CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay de Promega®.

Liberación Experimental de LDH (OD 490)

Porcentaje de citotoxicidad = 100 x - - - - - - - - - - - - —

Liberación Maxima de LDH (OD 490)

Mediante el experimento realizado, se obtuvieron resultados favorables, ya que en ambas líneas celulares la toxicidad producida por la composición es similar a la producida por el control sin tratamiento con la composición de la invención (se utilizó la máxima liberación de LDH como control positivo, ver Figura 5), lo que sugirió que la composición puede ser aplicada en su estado puro.

Adicionalmente, se realizaron ensayos en dos modelos: Abejas adultas y larvas, observando que el uso de la composición no afecta el ciclo normal de vida de los organismos ya mencionados y muestra una alta eficiencia al controlar el desarrollo de la enfermedad en

1 larvas de abeja (ver Figura 6, donde se observa además el efecto protector al administrar las proteínas del consorcio previo a la infección).

Los ensayos de toxicidad oral y por contacto en Apis mellifera determinaron una DL5O superior a 100 pg/abeja para ambos ensayos, lo que significa una baja letalidad asociada al biocontrolador.

Finalmente, para los ensayos de toxicidad oral e inhalatoria en ratas Spragüe - Dawley, no se registró mortalidad. Se determinó una DL50 superior a 2.000 mg/Kg de peso para toxicidad oral y por contacto. Para la toxicidad inhalatoria se estima una concentración letal superior a l,6mg/Litro de aire, lo que significa una letalidad no significativa asociada al producto.

En resumen, la composición se caracteriza por no producir toxicidad por ingesta, por contacto o por inhalación en mamíferos.

Ventajas de la composición

La composición de la invención ha demostrado inhibir el crecimiento de la bacteria Paenibacillus larvae y al utilizar la composición contra esporas de P. larvae, se logra evitar su desarrollo y crecimiento.

Además la composición es capaz de eliminar solo la bacteria P. Larvae, sin dañar la microbiota benéfica de las abejas. Por ejemplo, la bacteria Lactobacillus kunkeei, la que ha sido reportada como una bacteria predominante en el intestino de la abeja no se ve afectada al utilizar la composición de acuerdo a la invención.

Por otro lado, la composición de la presente invención tiene potencial bacteriolítico, bactericida y bacteriostático, los que permite afirmar que una vez controlada la enfermedad, evitará su reincidencia en la colmena.

Al ser un suplemento alimenticio, en una de sus presentaciones preferidas, no requiere un manejo especializado para su administración, y puede ser incorporado en la colmena como parte del manejo normal por parte de cada apicultor.

Dado que las bacterias del consorcio están presentes en la microbiota normal de las colmenas, la composición de acuerdo a la presente invención es de origen natural y no deja residuos en los productos que puedan afectar su comercialización.

El uso de las proteínas en lugar de las bacterias del consorcio microbiano lo hace una opción más atractiva para el control de enfermedades en abejas. El uso de bacterias como biocontroladores pueden alterar la microbiota normal de las abejas, se podrían fermentar azúcares o alimento, o también pueden no darse las condiciones para que las bacterias

1 biocontroladoras se repliquen, lo que conllevaría a concentraciones que no logran el efecto controlador. En cambio, el uso de las proteínas del sobrenadante del consorcio no afecta el comportamiento de las abejas; son altamente específicas, por lo que solo actúan sobre el microoganismo patógeno evitando la alteración en la microbiota normal de la abeja, y además muestran un efecto benéfico sobre los microorganismos probióticos encontrados en las abejas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Obtención de sobrenadante libre de células

El consorcio microbiano compuesto por bacterias de los géneros Brevibacillus laterosporus, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis y Clostridium perfringens (número de depósito PTA-127132) se creció en medio BHI con 3 mg/mL de tiamina durante 6 días a 37°C, se centrifugó a 10000 rcf por 30 minutos a temperatura ambiente, recolectando 0,5 L del sobrenadante.

Se ajustó el pH agregando NaOH 1M hasta alcanzar pH 7,2.

Para volúmenes de sobrenadante inferiores a 100 mL, se esterilizó mediante un filtro de jeringa de 0,2 pm (Minisart®) y jeringas estériles de 20 mL (N I PRO). En el caso de volúmenes de 100 mL o superiores, se utilizaron unidades de filtro desechables y estériles con membrana de poliétersulfona (PES) (Nalgene™ Rapid-Flow™).

Ejemplo 2: Administración de la composición mediante el alimento

Se utilizaron tortas o barras sólidas para alimentar a las abejas, estas fueron colocadas sobre los marcos y por debajo de la tapa superior de la colmena. Los alimentos elaborados con la composición de la invención que comprende el sobrenadante libre de células opcionalmente pueden contener jarabe azucarado como se indica a continuación.

La cantidad de composición proteica se determinó de modo que la dosis final del sobrenadante sea mayor a 205,96 ug/ml y menor a 2 mg/ml, de acuerdo con lo recomendado.

1 Tabla 1: Composición de las barras sólidas

* Indicada en base al contenido por cada 0,1 L de agua.

Ejemplo 3: Elaboración de la composición como jarabe

El jarabe es un producto basado en azúcar que normalmente se administra a través de los alimentadores de cada colmena.

Para la elaboración de jarabe se utilizó azúcar granulada diluida en agua para llegar a una consistencia viscosa. Por cada kilo de azúcar granulada, se utilizaron 0,5 litros de agua. El agua estaba caliente a aproximadamente 60°C, se incorporó el azúcar lentamente sin dejar de revolver de manera que se disolviera todo el azúcar y se formara un jarabe homogéneo sin cristales en suspensión. Se dejó enfriar a 35°C y se incorporó la misma cantidad del sobrenadante libre de células, por cada litro de agua en el jarabe, es decir, 0,5 litros de sobrenadante libre de células. La cantidad de composición proteica permitió que la dosis final recomendada del sobrenadante sea mayor a 37 ug/ml y menor a 2 mg/ml

Tabla 2: Rangos de composición del jarabe

* Indicada en base al contenido por cada 0,1 L de agua.

1 Alternativamente, se podría elaborar un jarabe donde el azúcar es diluido directamente en el sobrenadante libre de células, en donde por cada kilo de azúcar granulada se utiliza 1 litro de sobrenadante libre de células.

Ejemplo 4: Evaluación de efectividad a diferentes concentraciones

Mediante dilución seriada, se utilizaron concentraciones desde 10% hasta 100% v/v del sobrenadante libre de células del consorcio contra P. larvae en medio de cultivo líquido. Por ejemplo para obtener 10 mL a una concentración de 30% v/v, se utiliza 3 mL de sobrenadante libre de células y 7 mL de medio de cultivo. Para esto, se midió la densidad óptica (OD, del inglés optical density) mediante la observación de su curva de crecimiento en el tiempo en el equipo NanoQuant Tecan Infinite m200 PRO a OD 600nm. Como control se utilizó la cepa ATCC 9545 sin la adición de sobrenadante, bajo las mismas condiciones.

Tabla 3: OD a 660nm para distintos tratamientos en P. larvae ATCC 9545 Ejemplo 5: Evaluación de capacidad inhibitoria frente a germinación de esporas.

El procedimiento para promover esporulación en P. larvae consistió en cultivar en placas de BHIT a 37°C de 6 a 7 días, monitoreando microscópicamente el crecimiento celular y esporulación. Pasado el tiempo de incubación, se removieron las esporas mediante tres lavados con agua estéril y posterior centrifugación a 12.000 x g por 15 minutos a 4°C para concentrar las esporas. El sedimento se resuspendió en 30 mL de agua estéril fría, centrifugado y lavado, cuatro veces más, desechando sobrenadante. La resuspensión final se realizó en 5 mL de agua estéril fría y se almacenó a 4°C. Para determinar la concentración de esporas, se tomó una alícuota de 100 pL y se calentó a 65°C por 15 minutos, se realizó una dilución seriada y cultivo en placa BHIT a 37°C por 48 horas para el conteo de colonias, cada colonia significa una espora.

Para evaluar la capacidad inhibitoria se estimó una concentración de 800 a 1.000 esporas en medios BHI suplementados con tiamina y con biocontrolador al 50%, se mantuvo la concentración de BHIT al IX, se incubó por 48 horas a 37°C.

Los resultados mostrados en la Figura 7 muestran que transcurridas 48 h de incubación, tanto la cepa P. larvae ATCC 9545 como la cepa P. larvae SAG, no muestra crecimiento en presencia del biocontrolador al 50%, por lo tanto, logra inhibir la germinación de las esporas y el consecuente crecimiento de P. larvae.

Ejemplo 6: Evaluación de la toxicidad del biocontrolador por administración oral aguda en abejas adultas (Apis mellifera).

Abejas obreras adultas (Apis mellifera), fueron expuestas al biocontrolador, disuelto en una solución de sacarosa al 50%, en 5 dosis. Se analizaron grupos de 10 abejas en triplicado en un total de 30 abejas, por dosis.

Teniendo en consideración los resultados de concentración proteica, se establecieron las dosis respecto del peso de la abeja (Tabla 4). Se realizaron observaciones, buscando signos de toxicidad y mortalidad en las abejas experimentales. Estas observaciones se realizaron a las 4, 24 y 48 horas de administrado biocontrolador.

1 Tabla 4. Resumen de dosis y mortalidad del biocontrolador. El Control Positivo utilizado fue

Dimetoato, el cual fue evaluado en 5 dosis (0,06, 0,13, 0,25, 0,50 y 1,00 pg/abeja).

* Control positivo: Dimetoato (DL ₅ o: 0,24 pg/abeja, a las 24 horas)

Al finalizar el estudio a las 48 horas, se observó mortalidad del 3,3% en la dosis 6,3 pg/abeja de biocontrolador, también se observó un 6,7% en las dosis 12,5 y 25,0 pg/abeja, un 5,0% de mortalidad en la dosis 50,0 pg/abeja y finalmente un 13,3% de mortalidad en la mayor dosis la cual corresponde a 100,0 pg/abeja. El grupo control no presentó mortalidad a lo largo del estudio. Se estima que, al finalizar el estudio a las 48 horas, existiría un 50,0% de mortalidad a una dosis superior a 100,0 pg/abeja del biocontrolador

En cuanto a los signos clínicos toxicológicos, no se registraron alteraciones físicas ni de comportamiento en las abejas tratadas con biocontrolador, que pudieran asociarse al consumo de éste. Al momento de hacer una inspección visual todas se encontraron en óptimas condiciones y presentaron un comportamiento normal durante todo el periodo de ensayo. Ejemplo 7: Evaluación de la toxicidad aguda del biocontrolador por contacto en abejas adultas (Apis mellifera).

Para este ensayo, las abejas obreras adultas fueron expuestas al biocontrolador disuelto en solución acuosa, en 5 dosis, administradas al tórax mediante una pipeta. Se analizaron un total de 30 abejas por dosis. Se realizaron observaciones, buscando signos de toxicidad y mortalidad en las abejas experimentales. Las cuales ocurrieron a las 4, 24 y 48 horas de administrado el biocontrolador (Tabla 5).

Tabla 5. Resumen de dosis y mortalidad de abejas presentadas al biocontrolador. El estándar tóxico Dimetoato el cual fue evaluado a 0,06, 0,13, 0,25, 0,50 y 1,00 pg/abeja.

* Control positivo: Dimetoato (DLso: 0,35 pg/abeja, a las 48 horas)

Al finalizar el estudio a las 48 horas, se registró una mortalidad de un 3,3% en las dosis 6,3, 12,5, 25 y 50 pg/abeja, estas mortalidades se deben probablemente a una condición fisiológica de cada abeja. No se registró mortalidad en el grupo control o la dosis 100 pg/abeja.

En cuanto a los signos clínicos toxicológicos, no se registraron alteraciones físicas ni de comportamiento en las abejas tratadas con el biocontrolador, que pudieran asociarse al contacto con éste. Al momento de hacer una inspección visual todas se encontraron en óptimas condiciones y presentaron un comportamiento normal durante todo el periodo de ensayo.