DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION EN MATIERE DE BREVETS (P

(51) Classification internationale des brevets^ : (11) Numéro de publication internationale: WO 88/ 05 C07C 177/00, A61K 31/557 Al (43) Date de publication internationale: 14 juillet 1988 (14.07

(21) Numéro de la demande internationale: PCT/FR87/00518 (74) Mandataire: LE GUEN, Gérard; Cabinet Lavoi place d'Estienne-d'Orves, F-75441 Paris Cedex

(22) Date de dépôt international: (FR).

29 décembre 1987 (29.12.87)

(81) Etats désignés: AT (brevet européen), BE (brevet e

(31) Numéro de la demande prioritaire: 86/18297 péen), CH (brevet européen), DE (brevet europé FR (brevet européen), GB (brevet européen), IT (

(32) Date de priorité: 29 décembre 1986 (29.12.86) vet européen), JP, LU (brevet européen), NL (br européen), SE (brevet européen), US.

(33) Pays de priorité : FR

Publiée

(71) Déposants (pour tous les Etats désignés sauf US): INSTI¬ Avec rapport de recherche internationale.

TUT PASTEUR [FR/FR]; 28, rue du Docteur-Roux, Avant l'expiration du délai prévu pour la modifica F-75724 Paris Cedex 15 (FR). INSTITUT NATIO¬ des revendications, sera republiée si de telles modi NAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE tions sont reçues. MEDICALE (INSERM) [FR/FR]; 101, rue Tolbiac, F-75654 Paris Cedex 13 (FR).

(72) Inventeurs; et

(75) Inventeurs/Déposants (US seulement) : DRAY, Fernand [FR/FR]; 4, rue Guynemer, F-75006 Paris (FR). VUILLIEZ LE NORMAND, Brigitte [FR/FR]; 114, avenue Danielle-Casanova, F-94200 Ivry-sur-Seine (FR). GOUYETTE, Alain [FR/FR]; 19, avenue de Verdun, F-92170 Vanves (FR).

(54) Title: COMPOSITIONS CONTAINING SULPHUR PROSTAGLANDINES

(54) Titre: COMPOSITIONS CONTENANT DES PROSTAGLANDINES SOUFREES

(57) Abstract

Therapeutical compositions containing products obtained from the addition of thiols to prostaglandines or a logues of prostaglandines. Thèse compositions hâve an antitumoral activity.

(57) Abrégé

Compositions thérapeutiques contenant des produits d'addition de thiols sur des prostaglandines ou des analogu de prostaglandines. Ces compositions ont une activité antitumorale.

UNIQUEMENT A TITRE D'INFORMAπON

Codes utilisés pour identifier les Etats parties au PCT, sur les pages de couverture des brochures publiant des demandes internationales en vertu du PCT.

AT Autriche FR France ML Mali

AU Australie GA Gabon MR Mauritanie

BB Barbade GB Royaume-Uni MW Malawi

BE Belgique HU Hongrie ' ML Pays-Bas

BG Bulgarie _T Italie NO Norvège

BJ Bénin JP Japon RO Roumanie

BR Brésa KP République populaire démocratique SD Soudan

C République Centrafiicaine de Corée SE Suède

CG Congo KR République de Corée SN Sénégal

CH Suisse LI Liechtenstein SU Union soviétique

CM Cameroun LK Sri Lanka TD Tchad

DE Allemagne, République fédérale d' LU Luxembourg TG Togo

DK Danemark MC Monaco US Etats-Unis d'Amérique

H Finlande MG Madagascar

Compositions contenant des prostaglandines soufrées.

La présente invention concerne une compo¬ sition thérapeutique contenant à titre de principe ac¬ tif un dérivé de prostaglandine ou d'un analogue de prostaglandine, ayant notamment une activité antitu¬ morale.

On a déjà décrit des prostaglandines ayant une activité antitumorale. Ainsi Masanori Fukushima et Taketoshi Kato ont décrit 1'activité antitumorale de prostaglandines et notamment de PGA ₁ , Δ PGA. , 12 epi

Δ7PGA ₁ , PGJ ₂ , Δ 12PGJ ₂ etΔ12, 14PGJ ₂ (Icosanoids and

Cancer, H. Thaler-Dao et al, Raven Press N.Y.; Cancer

Research 46, 35-38, 1986) ainsi que de clavulones et de punaglandines (Advance in Prostaglandin, Thrombo- xane and Leukotriene Research Vol. 15 0. Hayarshi et

S. Ya omoto Raven Press New York). Ces auteurs ont considéré que l'activité antitumorale était liée à

1'insaturation α , β dans le noyau cyclopentènone de ces composés.

On a maintenant trouvé que des produits d'addition de thiols sur des prostaglandines ou des analogues de prostaglandines ayant un noyau cyclopen- tène ont une activité antitumorale.

La présente invention a en conséquence pour objet des compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre de principe actif un composé choisi parmi les composés de formule

dans lesquelles Z_. et Z- sont deux chaînes appartenant aux chaînes des prostaglandines ou des analogues de prostaglandines,

R est un groupe hydrocarboné éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes NH-, ou un groupe de for¬ mule

dans laquelle n = 1 ou 2 . est un atome d'hydrogène, un résidu d'acide aminé ou un résidu dérivant d'un enchaînement d'acides ami¬ nés, ₂ est un groupe hydroxy, un résidu d'acide aminé ou un résidu dérivant d'un enchaînement d'acide aminé,

R ₁ est un atome d'hydrogène, un groupe hydrocarboné ou un atome halogène,

R.. est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy ou un groupe acyloxy.

La chaîne Z. peut être notamment une chaîne de formule

la chaîne Z 1 o

COOH correspondant à la chaîne Z 1 de PGA ₂ ou GJ ₂

^COOH

La chaîne Z_ peut être notamment une chaîne de formule

correspondant à la chaîne Z. de PGA ou de PGJ

OH

OH

ainsi que les chaînes cetoniques correspondantes.

Il peut s'agir également de chaînes qui cor¬ respondent au raccourcissement ou à l'allongement de ces chaînes, ou de chaînes obtenues par des réactions de réduction ou d'oxydation. Comme exemples de telles chaînes on peut citer pour Z_ les chaînes de formule

Les chaînes Z ₁ et Z ~ comprennent également celles présentées dans Les clavulones et les puna- glandines (voir article dans Advance in Prostaglandins déjà cité) .

Certains composés de formule I et II sont connus. C'est ainsi que E.A. Ha et coll. (Prostaglan- dins 10, 217, 1975) ont mentionné le produit d'addi¬ tion de la cysteine et. du glutathion sur PGA.. Cajen et coll. (J. Biol. Che . 251, 6550, 1976) ont en outre décrit le produit de réduction du produit d'addition du glutathion avec PGA.. Les composés de formules I et III peuvent être obtenus à partir des cyclopentènones correspon¬ dantes de formule

et VI

par une réaction avec des thiols de formule

RSH VII

La réaction peut être effectuée en milieu aqueux au voisinage de la neutralité (par exemple tampon Tris, HC1, PH 7.4).

Comme exemple de thiols utilisables on peut citer notamment la cysteine de formule

H

I S

CH, I 2

H ₂ N C - COOH I H

la cysteinylglycine de formule

H i

S i CH l 2

H„N - C - CO - NH - CH, - COOH 2 | ^

H

le glutathion de formule

H I

S I

CH, I ²

HOOC-HC!-CH,_-,-CH___.-CO-HN-C|-CO-NH~ Δ-CH.,-COOH H ₂ H

la cysteamine de formule

HS-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂

Les composés de formule II et IV peuvent être obtenus par réduction respectivement des composés de formule I et III, notamment par le borohydrure de sodium.

En variante, un certain nombre de composés de formule II peuvent être obtenus in vitro. C'est ainsi que les composés 9-hydroxy-11-cysteinyl-PGA, et 9-hydroxy-11-cysteinylglycyl-PGA ₁ peuvent être obtenus par incubation de la prostaglandine PGA.. avec des cel¬ lules tumorales de rat, notamment des neuroblastomes B 104 et des gliomes C6, et séparation des métabolites.

Les exemples suivants illustrent la prépara¬ tion des composés utilisés dans la présente invention.

Exemple 1

Obtention in vitro de produits d'addition de cystéine etde cystéinylglycine sur la 9-hydroxy-PGA_..

4 a) On ensemence 2.10 cellules de neuroblas¬ tomes B104 et on les fait incuber pendant 24 h dans un milieu complet (2ml) constitué par un mélange 1/1 mi¬ lieu de Eagle modifié par Dulbecco (DME ) et tamponné par du bicarbonate/milieu F12 de Ham complété par du sérum de foetus de veau inactivé par la chaleur (FCS, 2,5%) et du sérum de cheval (HS, 5% ) , 15 oH de Hepes, 100 ϋ/ml de pénicilline, 50 micro g/ml de streptomy¬ cine et 0,25 micro g/ml de fungizone. Puis on effectue une culture à 37 ^* C dans un incubateur humidifié à 5\ de C0 ₂ sur un milieu comprenant les mêmes ingrédients que le milieu complet précédent, à l'exception du sé¬ rum qui est remplacé par 5 μg/ml d'insuline, 100 μg/ml de transférine, 20 nM de progestérone, 100 pM de pu- trescine et 30 nM de séleniure de sodium.

On ajoute un mélange de prostaglandine PGA ₁ -6 3 à la dose de 10 M et de ( H)PGA- utilisé comme tra¬ ceur et on laisse incuber.

On élimine les cellules par centrifugation et on dépose le surnageant sur une cartouche Sep Pak

C ₁₈ (Water) préalablement lavée avec 2 ml de méthanol et 10 ml d'eau.

On lave l'échantillon avec 10 ml d'eau puis on élue avec 6 ml de méthanol.

On amène à sec les fractions méthanoliques

-2 et on les redissout dans un tampon phosphate 10 M pH

7,4 et on introduit sur une colonne de Sephadex G10 (1,8 x 25 cm). On élue avec le même tampon.

On effectue une élimination de sel sur car¬ touche Sep Pak C.g, puis on réalise une chromatogra-

phie liquide haute performance à phase inversée (rp HPLC) sur une colonne de Nucleosil C_.g. On élue à un débit de 1 l/mn avec un mélange de deux solvants : A (eau contenant 0,2% d'acide acétique) et B (méthanol) comme suit : un gradient linéaire pendant 10 mn de 47 à 57% de B; 57% de B pendant 40 mn; gradient linéaire pendant 20 mn de 57 à 80% de B.

On analyse les fractions recueillies par comptage par scintigraphie. Les résultats sont reportés sur la Fig. 1 qui fait apparaître 4 pics de radioactivité corres¬ pondant à 4 métabolites de PGA.. ( étabolites I, II, III et IV) .

A titre de contrôle PGA., ajouté au même milieu pendant 3 jours à 37 ^* C, en l'absence de cel¬ lules a été purifié par la même méthode chromatogra- phique. On observe seulement un pic de rétention à 71 minutes . b) On opère comme en a) mais en utilisant des cellules gliomes C6 et en utilisant le milieu de culture suivant : DMEM complété avec 10% de FCS, 100 ϋ/ml de pénicilline et 50 micro g/ml de streptomycine.

Les résultats sont reportés sur la Fig. 2 qui met en évidence également 4 pics . c) Détermination des produits obtenus par spectrométrie de masse (Technique FAB) .

Les métabolites obtenus selon a) et b) sont les mêmes : Métabolites I et II masse moléculaire 516 composition élémentaire C--H.. N,0 ₇ S Ces métabolites sont- deux isomères corres¬ pondant au produit d" "addition" de la cysteinyl gly¬ cine sur la 9-hydroxy PGA. , par abbréviation 9-0H- PGA^Cys-Gly.

i Les spectres RMN de H enregistrés sur un appareil Brucker 300 MHz en solution dans CD-OD, en utilisant le TMS comme référence interne présentent les caractéristiques suivantes :

- PGF ^ (comparaison) (H _g : 4,10 ppm; H^ : 3,81 ppm; H ₁₃ _ ₁₄ : 5,50 ppm; H _1g : 3,99 ppm) .

- Métabolite I, CH (α , cystéine) : 4,62 ppm, SCH ₂ : 3,07 ppm, H _g : 4, 18 ppm, H^ : 3,75 ppm, H ₁₃ _ ₁₄ : 5,51 ppm, et H„ I 0 _c : 4,05 ppm.

Métabolite II CH ( α , cystéine) 4,60, SCH ₂

3,07, H _g 3,65, H ₁₁ 3,88, H ₁₃ _ ₁₄ 5,52 et H.,.. 4,02 ppm.

Les formules suivantes peuvent en conséquen¬ ce être attribuées aux 2 isomères

METASOLITE n

Métabolites III et IV masse moléculaire 459 composition élémentaire C ^' 2,3 ^H 41 N0 _C oS Ces métabolites correspondent à deux iso¬ mères du produit d' "addition" de la cystéine sur la 9-hydroxy-PGA. , par abréviation 9-0H-PGA.-Cys . L'étude des spectres RMN a permis d'attri¬ buer les formules suivantes aux 2 métabolites isomères

METABOLITE IIX

METABOLITE TV

Exemple 2

On fait réagir 1 mmole de PGA.. et 1 mmole de cystéine dans du tampon 0,2 M Tris HCl pH 7,4 pendant une heure à 37 ^* C.

On obtient un produit d'addition PGA.-Cys. Exemple 3

On opère comme à 1'exemple 2 en utilisant comme thiol la cystéinylglycine.

On obtient un produit d'addition PGA.-Cys- Gly de formule

On pense toutefois que le produit d'addition est de configuration 11 ^σ .

Exemple 4

On opère comme à 1 ' exemple 2 en utilisant comme thiol le glutathion (par abréviation GSH) .

On obtient un produit d'addition PGA.-SG. Exemple 5

On ajoute à la solution obtenue à l'exemple 2 du borohydrure de sodium. Puis on ajuste le pH à 3,5 avec de l'acide for ique . On extrait à l'acétate d' é- thyle. On effectue un passage sur une cartouche Sep Pack C. _g puis une chromatographie en phase liquide sur colonne Nucleosil C. „ comme à l'exemple 1.

On sépare ainsi deux isomères de 9-OH-PGA..- Cys . Exemple 6

On opère comme à l'exemple 5 avec la solution de l'exemple 3.

On sépare finalement deux isomères 9-OH- PGA. _j -Cys-Gly.

Les essais suivants mettent en évidence l'activité antitumorale des composés.

On a mesuré 1 ' inhibition de la prolifération de neuroblastomes B104 dans le même milieu qu'à l'exemple 1a avec une concentration initiale de 2.10 4 cellules/ml après addition du produit à tester. On a réalisé une incubation pendant 24 h et on a mesuré le nombre de cellules au bout de 24 h à l'aide d'un comp-teur Coulter . On a calculé le pourcentage d'inhibition par rapport à une culture témoin.

Les résultats figurent dans le tableau ci-après

TABLEAU I

Concentration

Produit 10 ^{" 6} M 10~ ⁷ M

Métabolite I 28 - 3 26 - 2

Métabolite II 49 ± 41 ±

Métabolite III 19 ± 17 ±

Métabolite IV 13 ± 10 10 ±

PGA.,-Cys 51 i 10 43Î

PGA.-Cys-Gly 46 - 10 18 - 19

9-0H-PGA.-Cys (isomère 1) 24 - 8

9-0H-PGA.-Cys (isomère 2) 34 - 8 26 - 1

9-0H-PGA ₁ -Cys-Gly (isomère 1 ) 54 - 23 26 î 23

9-0H-PGA ₁ -Cys-Gly (isomère 2) 49 ± 6 30 - 12

Les compositions thérapeutiques selon l'in¬ vention peuvent être administrées à 1 ' homme par voie orale ou parentérale. Compte tenu de la solubilité élevée dans l'eau des composés utilisés, on peut généralement les administrer sous forme de solutions aqueuses .

La quantité de principe utilisée dépend gé¬ néralement du patient et de la sévérité de la maladie. Chez l'homme de 70 kg on peut généralement administrer de 50 à 500 mg/jour par voie parentérale.

Les compositions peuvent en outre contenir plusieurs principes actifs de formule I à IV ainsi que d'autres composés à activité antitumorale.