Compositions et méthodes comprenant des peptides pénétrants

La présente demande concerne des composés et leur utilisation en santé, en particulier dans le traitement préventif ou curatif de pathologies prolifératives, inflammatoires ou ophtalmiques.

L’invention décrit des peptides doués de propriétés de Cell Penetrating Peptide (CPP) et capables de s’opposer aux pathologies associées à ou résultant de l’activation de cascades d’inflammation, l’altération de barrières épithéliales, les infections microbiennes, les infections bactériennes, en particulier à Gram négatif, l’angiogenèse ou le développement de métastases, comme par exemple les cancers, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique, les maladies inflammatoires de la peau, les maladies neurodégénératives, ainsi que des pathologies ophtalmiques.

L’invention concerne notamment l’utilisation de peptides particuliers, combinant des propriétés biologiques d’intérêt et de pénétration cellulaire, comme agents thérapeutiques, en particulier immunomodulateurs via un ou plusieurs des effets suivants : l’inhibition de la voie inflammatoire activée par le récepteur TLR4, la neutralisation des endotoxines (LPS), et/ou un effet antibactérien.

La présente invention découle de l’identification et la caractérisation de peptides aux propriétés de pénétration cellulaire (« CPP »), qui sont particulièrement utiles et adaptés pour le traitement de ces pathologies. Ces peptides ont été identifiés et générés initialement à partir de la séquence de la protéine MD2 humaine et du récepteur TLR4. Ces peptides et leurs propriétés étaient inconnus de l’art antérieur. La présente demande montre que ces peptides présentent des propriétés CPP remarquables, et peuvent être utilisés comme vecteurs d’agents actifs. L’invention montre par ailleurs que ces peptides possèdent des propriétés biologiques intrinsèques d’intérêt pour des applications dans le traitement des désordres prolifératifs, inflammatoires et ophtalmiques.

Un objet de l’invention réside dans un peptide de l’invention.

Un autre objet de l’invention réside dans une composition comprenant un peptide de l’invention.

Un autre objet de l’invention réside dans un procédé de synthèse d’un peptide de l’invention. Un autre objet de l’invention réside dans un acide nucléique codant un peptide de l’invention.

Un objet de la présente demande réside dans un peptide, acide nucléique ou composition de l’invention pour son utilisation dans le traitement des maladies inflammatoires, des maladies inflammatoires liées à une infection microbienne ou bactérienne, en particulier une infection à bactéries à Gram négatif ou à la dérégulation du système immunitaire inné d’une pathologie néoplasique, proliférative, inflammatoire, ou ophtalmique, notamment un cancer.

Un autre objet de l’invention réside dans une méthode de traitement d’une maladie inflammatoire, d’une infection microbienne, d’une infection bactérienne, d’une pathologie néoplasique, proliférative, inflammatoire ou ophtalmique, comprenant l’administration à un sujet d’un peptide, acide nucléique ou composition de l’invention.

Un autre objet de l’invention réside dans une méthode de traitement de maladies inflammatoires, par exemple des maladies inflammatoires liées à une infection bactérienne microbienne ou bactérienne, en particulier une infection à bactéries à Gram négatif, ou à la dérégulation du système immunitaire inné comprenant l’administration à un sujet d’un peptide, acide nucléique ou composition de l’invention.

Un autre objet de l’invention réside dans l’utilisation d’un peptide, acide nucléique, ou composition de l’invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement d’une maladie inflammatoire, d’une infection microbienne ou d’une infection bactérienne, en particulier de maladies inflammatoires, par exemple des maladies inflammatoires liées à une infection microbienne ou bactérienne, de préférence une infection à bactéries à Gram négatif, ou à la dérégulation du système immunitaire inné, d’une pathologie néoplasique, proliférative, inflammatoire, ou ophtalmique.

Les peptides peuvent être utilisés selon plusieurs modes opératoires. Sous forme libre (seuls ou associés ensemble selon différentes combinaisons possibles), ils peuvent être utilisés par administration directe à un patient, ou dans un contexte de thérapie ex vivo par exemple, pour leur effet biologique bénéfique sur les cellules tumorales et les cellules de leur environnement. Ils peuvent également être fusionnés avec des agents actifs, notamment anticancéreux, de nature peptidique ou non, composés cytostatiques ou cytotoxiques, afin d’améliorer l’adressage de ces traitements à l’intérieur des cellules et tissus ciblés. Dans cette approche, ces peptides, en plus d’un rôle de véhicule, peuvent également exercer leurs propres effets biologiques. Par ailleurs, les peptides peuvent également être utilisés pour fonctionnaliser des vésicules, telles que des exosomes ou liposomes, afin d’en favoriser la pénétration dans les cellules et tissus à traiter. Ce mode peut ainsi combiner un effet lié à l’action intrinsèque des peptides de l’invention et un effet exercé par toute(s) molécule(s) d’intérêt contenue(s) dans les vésicules et dont l’invention va favoriser l’adressage cellulaire et intracellulaire.

Un autre objet de l’invention réside ainsi dans une molécule comprenant un peptide de l’invention fusionné ou couplé à un agent actif, notamment anti-inflammatoire, immunomodulateur, antibactérien, antiseptique ou anticancéreux.

Un autre objet de l’invention réside dans une vésicule contenant un agent actif et un peptide de l’invention. Le peptide de l’invention peut être présent dans la vésicule et/ou exposé à sa surface.

L’invention peut être utilisée dans le traitement d’infections microbiennes ou bactériennes ou de maladies inflammatoires liées à une infection bactérienne, en particulier une infection à bactéries à Gram négatif. Elle peut être utilisée pour réduire ou inhiber ou bloquer la fixation de bactéries à leurs récepteurs et/ou la multiplication des bactéries.

Alternativement, l’invention peut être utilisée dans le traitement de toute pathologie néoplasique ou proliférative. Elle est notamment utile dans le traitement de tout cancer, de tout stade, comme les cancers solides ou du sang. Elle peut être utilisée pour réduire ou inhiber ou bloquer le développement ou la sévérité d’un cancer, réduire ou inhiber l’apparition ou le développement de métastases, réduire les symptômes, augmenter la survie de patients et/ou leur qualité de vie.

L’invention peut être mise en œuvre chez tout mammifère, de préférence chez un sujet humain, mais également en santé vétérinaire.

Peptides de l’invention

La présente invention découle de l’identification et la caractérisation de peptides aux propriétés de pénétration cellulaire (« CPP »), qui sont particulièrement utiles et adaptés pour le traitement de maladies inflammatoires, en particulier liées à une infection microbienne ou bactérienne ou pour le traitement de désordres prolifératifs, dont les cancers.

Ces peptides ont été identifiés et générés initialement à partir de la séquence de la protéine MD2 humaine et du récepteur TLR4. La présente demande montre que ces peptides et leurs dérivés présentent des propriétés CPP remarquables, et peuvent être utilisés comme vecteurs d’agents actifs, par exemple antibactériens, antiseptiques, anticancéreux ou anti-angiogéniques. L’invention montre par ailleurs que ces peptides possèdent des propriétés biologiques intrinsèques d’intérêt pour des applications dans le traitement d’infections bactériennes, des désordres prolifératifs et inflammatoires.

Au sens de l’invention, le terme peptide désigne une molécule comprenant un enchaînement de résidus d’acides aminés, qui peuvent être naturels ou non, éventuellement modifiés ou fonctionnalisés, et liés entre eux par des liaisons peptidiques, non peptidiques ou peptidiques modifiées. Les peptides peuvent présenter, le cas échéant, une ou des extrémités protégées.

L’activation des signaux initiés par les LPS et médiés par le complexe formé par TLR4 et MD2 est impliquée dans certains cancers et dans les maladies inflammatoires, par exemple les maladies inflammatoires de l’intestin, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI ; inflammatory bowel diseases, IBD), la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ainsi que des pathologies ophtalmiques.

L’invention décrit des peptides dérivés de MD2 ou du TLR4, doués de propriétés de Cell Penetrating Peptide (CPP), et capables de s’opposer aux bactéries à Gram négatif ou aux pathologies associées à l’activation de cascades d’inflammation, l’altération des barrières épithéliales, l’angiogenèse et le développement de métastases.

Plus précisément, l’invention décrit le peptide 1 : KRSKGLLHIFYIPRR (SEQ ID NO : 1 ) qui correspond aux acides aminés 55 à 69 de la protéine MD2 humaine, de même que le peptide 2 : KGLLHIFYIPRR (SEQ ID NO : 2).

Ces peptides dérivent du domaine de MD2 impliqué dans l’interaction avec TLR4, interaction nécessaire à la signalisation initiée par les LPS.

L’invention décrit également le peptide 3 : KRSKGLLHIWYIPRR (SEQ ID NO : 3) ainsi que le peptide 4 : KGLLHIWYIPRR ((SEQ ID NO : 4).

L’invention décrit aussi des peptides issus des domaines de TLR4 impliqués dans son homo-dimérisation nécessaire à son activation lors de sa liaison avec MD2/LPS.

Le peptide 5 : FPTLKLKSLKRL (SEQ ID NO : 5), qui correspond aux résidus 345 à 356 du TLR4 humain, et le peptide 6 : LKLKSLKRL (SEQ ID NO : 6) qui correspond aux résidus 348 à 356. Ces séquences sont dérivées du domaine extracellulaire et/ou intraluminal du récepteur TLR4. Le peptide 7 : RHIFWRRLRKAL (SEQ ID NO : 7) correspond aux résidus 804 à 815 de TLR4, et le peptide 8 : RHIFWRRLR (SEQ ID NO : 8) correspond aux résidus 804 à 812. Ces séquences sont dérivées du domaine TIR, intracellulaire, responsable de l’interaction de TLR4 avec ses effecteurs.

Le peptide 9 : CRHIFWRRLRKALC (SEQ ID NO : 9) ; le peptide 10 : d(R)HIFWRRLRKAd(L) (SEQ ID NO : 10) ; le peptide 11 : WRRLRKAL (SEQ ID NO : 11 ) ; le peptide 12 : RHIFWRRLRK (SEQ ID NO : 12) ; le peptide 13 : RHIFWRRL (SEQ ID NO : 13) ; et le peptide 14 : RHIFWRRLRKALLD (SEQ ID NO : 14) sont des peptides dérivés des peptides 7 et 8.

En particulier, le peptide selon l’invention est un peptide cyclique, par exemple tel qu’un peptide de SEQ ID NO :9. De préférence, la forme cyclique du peptide est obtenue par la création d’un pont disulfure entre deux acides aminés cystéines ajoutés aux extrémités N- et C-terminales.

En particulier, le peptide selon l’invention est un peptide comprenant des extrémités protégées.

L’invention revendique l’utilisation de ces peptides et de tout sous-peptide de taille minimale de 6 acides aminés qui peut en découler.

Plus particulièrement un objet de l’invention concerne tout peptide comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en une séquence en acides aminés choisie parmi SEQ ID NOs : 1 à 8 ou SEQ ID NOs : 1 à 14, ou un fragment de celles-ci contenant au moins 6 acides aminés.

Plus particulièrement un objet de l’invention concerne tout peptide comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences décrites sous les SEQ ID NO : 1 à 14, de préférence SEQ ID NO: 1 à 4 et 7 à 14, de manière préférée SEQ ID NO: 1 , 2, 7, 9, 10, 11 ou 14, de manière toute préférée de SEQ ID NO : 1 , 7, 9, 11 ou 14.

Selon certains aspects, le peptide consiste essentiellement en, ou consiste en la SEQ ID NO : 1 ou un variant de celle-ci comprenant (i) une substitution, un ajout ou une suppression de 1 à 3 acides aminés, de préférence en la SEQ ID NO :1 .

Plus particulièrement un objet de l’invention concerne tout peptide comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en une séquence en acides aminés choisie parmi l’une des séquences définies sous les SEQ ID NO : 7 à 14, de préférence sous les SEQ ID NO : 7-12 et 14, de manière préférée sous les SEQ ID NO : 7, 9, 11 et 14 ou un variant de celles-ci comprenant (i) une substitution, un ajout ou une suppression de 1 à 3 acides aminés.

Selon certains aspects, le peptide selon l’invention consiste essentiellement en, ou consiste en la SEQ ID NO : 7, 9, 11 ou 14.

Les peptides de l’invention ont de préférence une longueur totale inférieure à 30 acides aminés, plus préférentiellement inférieure à 25 acides aminés, plus préférentiellement encore inférieure à 16 acides aminés.

De préférence, le peptide selon l’invention a une longueur de 5 à 20 acides aminés, de 10 à 20 acides aminés, de 15 à 20 acides aminés, de 5 à 15 acides aminés, de 8 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés ou de 10 à 15 acides aminés. De manière préférée, le peptide selon l’invention a une longueur de 8 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés ou de 12 à 15 acides aminés.

L’invention vise non seulement les séquences listées ci-dessus mais également leurs variants.

Le terme « variant » désigne tout peptide comportant une ou plusieurs modifications structurales par rapport à un peptide de référence, comme par exemple (i) une substitution, un ajout ou une suppression d’un ou plusieurs acides aminés, de préférence de 1 à 3 maximum, (ii) une modification chimique sur un ou plusieurs acides aminés, de préférence sur 1 à 3 maximum, (iii) une ou les extrémités protégées, (iv) une ou des liaisons non-peptidiques, ou (v) une combinaison de ces modifications. Des exemples particuliers de variants sont des peptides comportant un acide aminé modifié.

De préférence, l’invention concerne tout peptide comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 14, de préférence parmi les séquences SEQ ID 1 , 7, 9, 11 et 14 ; ou un variant de celles-ci comprenant une substitution, un ajout ou une suppression de 1 à 3 acides aminés dans les séquences indiquées et optionnellement : (i) une modification chimique sur un ou plusieurs acides aminés, de préférence sur 1 à 3 maximum, (ii) une ou les extrémités protégées, (iii) une ou des liaisons non-peptidiques, ou (iv) une combinaison de ces modifications.

En particulier, l’invention concerne tout peptide comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en une séquence en acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 14, de préférence parmi les séquences SEQ ID 1 , 7, 9, 11 et 14, ou un variant de celles-ci comprenant une substitution, un ajout ou une suppression de 1 à 3 acides aminés dans les séquences indiquées et une ou les extrémités protégées.

A titre d’exemple, l’acide aminé leucine (Leu, L) ou acide 2-amino-4-méthylpentanoïque, peut être remplacé par un analogue tel que la norleucine (Nie) ou acide 2- aminohexanoïque, la 3-hydroxyleucine, la 6-hydroxynorleucine, la tert-leucine (Tie) ou acide 2-amino-3,3-diméthylbutanoïque, l’homoleucine ou acide 3-amino-5- méthylhexanoïque, la 2,3-déshydroleucine, le leucinol ou 2-amino-4-méthylpentanol.

De même, l’arginine (Arg, R) ou acide 2-amino-5-guanidinopentanoïque ou acide 2- amino-5-(diaminométhylidène amino)pentanoïque, peut être remplacée par l’homoarginine ou acide 2-amino-6-guanidinohexanoïque, la N-hydroxyarginine, la citrulline (Cit) ou acide 2-amino-5-(carbamoylamino)pentanoïque, l’acide 2-amino-5-(4- carbamimidoylphényl)pentanoïque, l’acide 2-amino-5-(1 /-/-imidazol-2- ylamino)pentanoïque, la canavanine ou acide 2-amino-4-(guanidinooxy)butanoïque, l’argininol.

L’asparagine (Asn, N) ou acide 2-amino-3-carbamoylpropanoïque ou acide 2- aminosuccinamique peut être remplacée par ses dérivés N-substitués, la N- éthylasparagine (EtAsn), l’asparaginol.

L’histidine (His, H) ou acide 2-amino-3-(1 H-imidazol-4-yl)propanoïque peut être remplacée par l’histidinol.

La sérine (Ser, S) ou acide 2-amino-3-hydroxypropanoïque peut être remplacée par ses dérivés O-substitués (éthers, etc.), l’acide 2-amino-4-hydroxybutanoïque ou homosérine (Hse) et ses dérivés O-substitués (éthers, etc.), le sérinol ou 2-amino-propan-1 ,3-diol.

Les peptides de l’invention peuvent par ailleurs être modifiés à des fins d’expérimentation, d’utilisation pharmacologique ou cosmétique de façon à les protéger de l’action des protéases, notamment des exo protéases, en modifiant leurs extrémités N- et C- terminales selon les techniques bien connues et décrites dans la littérature.

Comme indiqué précédemment, les peptides de l’invention peuvent comprendre des liaisons peptidiques, non-peptidiques et/ou peptidiques modifiées. Dans un mode préféré, les peptides comprennent au moins une liaison peptidomimétique, choisie de préférence parmi l’intercalation d’un groupe méthylène (-CH2-) ou phosphate (-PO2-), amine secondaire (-NH-) ou oxygène (-O-), des alpha-azapeptides, alpha-alkylpeptides, N-alkylpeptides, phosphonamidates, depsipeptides, hydroxyméthylènes, hydroxyéthylènes, dihydroxyéthylènes, hydroxyéthylamines, retro-inverso, méthylèneoxy, cétométhylène, esters, phosphinates, phosphiniques, phosphonamides, analogues carba.

Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en œuvre, les peptides de l’invention comprennent une fonction N-terminale et/ou C-terminale respectivement protégée, par exemple, par une acylation, ou par une amidation ou une estérification.

Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en œuvre, les peptides de l’invention comprennent une fonction N-terminale et/ou C-terminale respectivement protégée.

Selon certains modes de réalisation, les peptides selon l’invention comprennent en outre un Tag Histidine à leur extrémité N-terminale et/ou C-terminale. Ce Tag Histidine comprend de préférence 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,12, 13, 14 ou 15 histidines, de préférence 6 histidines.

Selon certains modes de réalisation, les peptides selon l’invention comprennent en outre un Tag S19 à leur extrémité N-terminale et/ou C-terminale, par exemple tel que décrit dans Suzuki et al., Biochem Biophys Res Commun 2022 Jan 1 ;586:63-67. doi: 10.1016/j.bbrc.2021.11.065. Epub 2021 Nov 20).

Des exemples particuliers de peptides selon l’invention sont des peptides comprenant ou consistant en l’une des séquences SEQ ID NO : 1 -14.

Comme illustré dans les exemples, les peptides ont, de préférence, des propriétés CPP, c’est-à-dire sont capables de pénétrer dans une cellule. Dans un mode particulier, les peptides de l’invention ont une conformation en hélice alpha ou feuillet beta.

L’invention décrit que grâce aux propriétés CPPs de ces peptides, il est possible de cibler aussi bien la signalisation TLR4 dépendante initiée au niveau de la membrane plasmique que celle découlant de l’activité de TLR4 internalisé dans les endosomes.

Ce point confère un avantage particulier à l’invention puisque ces deux loci d’initiation des signaux entraînent des cascades de signalisation différentes, même si elles sont toutes relayées par le domaine TIR, qui coopèrent et qui sont impliquées dans les pathologies mentionnées dans l’invention.

Les peptides de l’invention peuvent être synthétisés par toute technique connue en soi de l’homme du métier (synthèse chimique, biologique, génétique, etc.). Ils peuvent être conservés tels quels, ou formulés en présence d’une substance d’intérêt ou de tout excipient acceptable. Pour les synthèses chimiques, sont utilisés des appareils commerciaux permettant d’incorporer aussi bien des acides aminés naturels que non naturels, tels que les énantiomères D et des résidus ayant des chaînes latérales avec des hydrophobicités et des encombrements stériques différents de ceux de leurs homologues naturels, ou une séquence peptidique contenant une ou plusieurs liaisons peptidomimétiques pouvant inclure notamment l’intercalation d’un groupe méthylène (-CH2-) ou phosphate (-PO2-), d’une amine secondaire (-NH-) ou d’un oxygène (-O-).

Au cours de la synthèse, il est possible d’introduire diverses modifications chimiques, comme par exemple, mettre en N-ter, C-ter ou sur une chaîne latérale un dérivé lipidique (ou phospholipidique) ou un constituant d’une nanoparticule, de façon à pouvoir incorporer le peptide de l’invention au sein d’une membrane lipidique telle que celle d’un liposome constitué d’une ou plusieurs couches ou bicouches lipidiques, ou d’une nanoparticule.

Les peptides peuvent être également chargés à l’intérieur des vésicules, exosomes ou liposomes en tant qu’un actif thérapeutique.

On peut également obtenir les peptides de l’invention, ou partie de ceux-ci de nature protéique à partir d’une séquence d’acide nucléique codant pour celui-ci. La présente invention a aussi pour objet une molécule d’acide nucléique comprenant, ou constituée par, une séquence nucléique codant pour un peptide tel que défini ci-avant. Plus particulièrement l’invention concerne une molécule d’acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour un peptide ayant l’une des séquences de l’invention. Ces acides nucléiques peuvent être des ADN ou ARN et être associés à des séquences de contrôle et/ou être insérés dans des vecteurs d’expression. Le vecteur d’expression utilisé est choisi en fonction de l’hôte dans lequel il sera transféré. Il peut s’agir par exemple d’un plasmide, cosmide, virus, etc. Ces acides nucléiques et vecteurs d’expression biologiques constituent des objets particuliers de l’invention, et sont utiles pour produire les peptides de l’invention, ou partie de ceux-ci de nature protéique, dans un hôte cellulaire. La préparation de ces vecteurs d’expression biologiques ainsi que la production ou l’expression dans un hôte des peptides peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l’homme de l’art.

Les peptides peuvent être formulés dans toute composition adaptée, connue en tant que telle. Des exemples de telles compositions/formulations sont fournis dans la présente description. és peptidiques

Les peptides de l’invention peuvent exercer des effets anti cancéreux, antiinflammatoires, immunomodulateurs, antibactériens ou antiseptiques bénéfiques en étant aussi utilisés comme vecteurs d’agents d’intérêt, améliorant la pénétration de ceux- ci au niveau des cellules et des tissus à traiter et en en améliorant la biodisponibilité.

Ainsi, l’invention vise également des molécules chimériques comprenant (i) un peptide tel que défini ci-dessus conjugué ou couplé à (ii) une (ou plusieurs) molécule(s) d’intérêt, en particulier un agent actif, de préférence un agent anticancéreux, un agent antiinflammatoire ou un agent antibactérien ou antiseptique.

La conjugaison ou le couplage peut être réalisé par toute technique connue en soi de l’homme du métier, de manière covalente ou non, directe ou non (via un linker), sur tout résidu ou fonction du peptide (résidu terminal, chaine latérale, etc.). Par ailleurs, plusieurs agents actifs (identiques ou différents) peuvent être couplés sur un même peptide. Réciproquement, plusieurs peptides (identiques ou différents) peuvent être conjugués à un agent actif.

Le couplage peut ainsi être réalisé par une ou plusieurs liaisons covalentes, ioniques, hydrogènes, hydrophobes ou de Van der Waals, clivables ou non à l’intérieur de cellules. Le couplage peut être effectué via un groupement fonctionnel réactif tel que -OH, -SH, - CO2H, -NH2, -SO3H, -PO2H naturellement présent ou ayant été introduit sur tout site du peptide.

Un mode de couplage préféré est un couplage covalent. La substance d'intérêt peut être couplée directement au peptide (synthèse en tandem) soit à l'une de ces extrémités terminales (N-ter ou C-ter), soit au niveau d'une chaîne latérale d'un des acides aminés constitutifs de la séquence. La substance d'intérêt peut aussi être couplée indirectement par le biais d'un bras de liaison ou bras espaceur (synthèse via linker), soit à l'une des extrémités terminales des peptides, soit au niveau d'une chaîne latérale d'un des acides aminés constitutifs de la séquence. Le couplage chimique peut ainsi être réalisé au moyen de tout agent bi- ou multifonctionnel contenant des groupements alkyle, aryle ou peptidique par des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle ou d'aryle, des groupements anhydrides, sulfhydriles ou carboxyles, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cyanogène, du carbonyldiimidazole, des esters de succinimide ou des halogénures sulfoniques. A cet égard, un objet de l’invention réside également dans un procédé de préparation d’un composé conjugué tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de couplage entre un peptide et un agent actif, de préférence par voie chimique, biochimique, enzymatique, ou par génie génétique.

Le ou les agents actifs d’intérêt peuvent être toute molécule d’intérêt pharmaceutique, notamment thérapeutique. Il peut s’agir en particulier de toute entité chimique ayant un intérêt biologique telle qu’une petite molécule chimique (immunomodulateur, antiinflammatoire, antibactérien, anticancéreux, etc.), un lipide, un peptide ou polypeptide, une protéine (enzyme, hormone, cytokine, etc.), ou un acide nucléique (acide ribonucléique ou acide désoxyribonucléique), etc. De manière générale, l’agent actif peut être tout principe actif anticancéreux, anti-inflammatoire, antibactérien ou antiseptique, qu'il s'agisse d'un produit chimique, biochimique, naturel ou synthétique.

Parmi les agents anti-cancéreux pouvant être couplés en tant que cargos, il peut être mentionné le méthotrexate, le Paclitaxel, la doxorubicine et le cisplatine.

Parmi les agents antibactériens pouvant être couplés en tant que cargos, il peut être mentionné un antibiotique comme la pénicilline, la tyrothricine, la quinolone, l’isatine, des nanoparticules d’argent ou des composés comprenant un motif indolique tel que le motif 3'-indolyl méthylamine, 2-(3'-indolyl)éthylamine, le motif 1 ,2-diamine indolique ou le motif l-(3'-indolyl)-1 ,2-diaminoéthane 3a.

Parmi les agents antiseptiques pouvant être couplés en tant que cargos, il peut être mentionné l’iode ou l'un de ses dérivés, la povidone iodée, la chlorehexidine et les composés chlorés.

Peuvent également être attachés de façon covalente aux peptides de l’invention des oligonucléotides, notamment des siRNA, des ARN antisens ou toute autre séquence nucléotidique susceptible d’exercer une action antitumorale, antibactérienne ou antiseptique.

Utilisation dans le traitement d'infections bactériennes, des des maladies des maladies inflammatoires ou de maladies

En raison de leurs propriétés biologiques et de CPP, les peptides de l’invention peuvent être utilisés pour traiter différentes pathologies, en particulier associées ou résultant de l’activation de cascades d’inflammation, l’altération de barrières épithéliales, l’angiogenèse et le développement de métastases. L’invention peut ainsi être utilisée dans le traitement de maladies inflammatoires, d’infections microbiennes ou bactériennes, de désordres intestinaux, cancéreux, néovasculaires ou ophtalmiques.

L’activation des signaux initiés par les lipopolysaccharides (LPS) et médiés par le complexe formé par TLR4 et MD2 est impliquée dans la réponse aux infections à bactéries à Gram négatif, dans certains cancers et dans les maladies inflammatoires, en particulier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI ; inflammatory bowel diseases, IBD), la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ainsi que des pathologies ophtalmiques.

Pour le traitement de ces pathologies, les peptides (ou acides nucléiques ou vecteurs ou compositions) peuvent être administrés directement au patient, ou utilisés dans un traitement ex vivo ou extra corporel. Ils peuvent être utilisés sous forme libre (seuls ou en combinaisons), agissant ainsi sur les fonctions du MD2/TLR4.

Ils peuvent être utilisés pour délivrer efficacement des agents actifs dans les cellules cancéreuses ou environnantes. Ils peuvent également être utilisés pour favoriser l’adressage de vésicules aux cellules cancéreuses ou environnantes. Ces différents modes de mise en œuvre, qui peuvent être combinés, offrent de multiples stratégies anticancéreuses efficaces pour le traitement de toute pathologie proliférative.

Utilisation de peptides sous forme libre (seuls ou en combinaisons)

Dans cette application, les peptides sont avantageusement modifiés à leur extrémité N- terminale et/ou C-terminale, par exemple respectivement par carboxylation et amidation, de façon à les protéger de l’action d’exopeptidases.

Mis au contact de cellules tumorales et/ou de leur environnement ou les cellules dans un état inflammatoire ou avec une altération de l'activité du système immunitaire, en tant que peptides libres seuls ou en combinaison les uns avec les autres, et/ou couplés à des molécules telles que des protéines et/ou à des structures vésiculaires, telles des exosomes, des nanoparticules, des liposomes, les peptides de l’invention sont typiquement internalisés directement ou par endocytose ou par macropinocytose. Ils peuvent ensuite exercer une action dominante négative sur les fonctions du MD2/TLR4/MyD88 et/ou TRIF. Cette approche est particulièrement pertinente dans le domaine maladies inflammatoires liées aux infections microbiennes ou bactériennes, des cancers et des pathologies oculaires liées à l’angiogenèse telle la dégénérescence maculaire.

Les peptides de l’invention, seuls ou en combinaison, libres ou décorant la surface de vésicules ou de nanoparticules, pénètrent les cellules par endocytose et/ou par macropinocytose et peuvent par conséquent atteindre leurs cibles impliquées dans la résistance aux traitements déjà existants.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans le traitement de maladies inflammatoires, par exemple liées à une infection bactérienne à Gram négatif, notamment par inhibition de l’activation de la cascade inflammatoire initiée via le récepteur TLR4.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans la neutralisation d’endotoxines (LPS) et/ou la désinfection de surfaces pouvant comprendre des bactéries à Gram négatif et ou des fragments de membranes bactériennes, comme par exemple la peau ou des surfaces hospitalières ou chirurgicales. L’invention vise l’utilisation des peptides selon l’invention en tant que désinfectant ou agent neutralisant du LPS.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans le traitement de maladies néoplasiques ou prolifératives par inhibition de de l’angiogenèse.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation inhiber ou réduire ou retarder la formation de métastases chez des patients présentant une maladie néoplasique ou proliférative.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation pour inhiber ou réduire la résistance à la chimiothérapie chez des patients présentant une maladie néoplasique ou proliférative.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation pour le traitement d’un cancer en combinaison avec la chimiothérapie, la radiothérapie, l’hormonothérapie, ou l’immunothérapie.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement de l’acné. Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans la prévention de la formation de cicatrices hypertrophiques dans les maladies prolifératives des fibroblastes dermiques qui produisent des quantités abondantes de collagène et de matrice extracellulaire dans la peau après de graves brûlures, inflammations et traumatismes.

Utilisation sous forme de coniuqués

Outre les effets mentionnés ci-avant, la présente invention propose d’utiliser aussi les peptides décrits comme vecteurs d’agents actifs, améliorant la pénétration de ceux-ci au niveau des cellules et des tissus à traiter et en en améliorant la biodisponibilité.

Parmi les agents actifs pouvant être adjoints en tant que cargos, il peut être mentionnés les anti-cancéreux, tels le méthotrexate, le Paclitaxel, le cisplatine et la doxorubicine. De tels agents thérapeutiques peuvent non seulement être couplés aux peptides de l’invention, mais également en plus à des « gold nanorods » (GNRs) , c’est à dire des particules d’or de façon à exercer une action thérapeutique combinant un traitement chemo- photothermal avec une approche de chimiothérapie ainsi optimisée.

Parmi les agents antibactériens pouvant être couplés en tant que cargos, il peut être mentionné un antibiotique comme la pénicilline, la tyrothricine, la quinolone, l’isatine, la lactoferrine, des nanoparticules d’argent ou des composés comprenant un motif indolique tel que le motif 3'-indolyl méthylamine, 2-(3'-indolyl)éthylamine, le motif 1 ,2-diamine indolique ou le motif l-(3'-indoly l)-1 ,2-diaminoéthane 3a.

Parmi les agents antiseptiques pouvant être couplés en tant que cargos, il peut être mentionné l’iode ou l'un de ses dérivés, la povidone iodée, la chlorhexidine et les composés chlorés.

L’avantage des peptides proposés par l’invention est qu’ils combinent des capacités antimicrobiennes ou antibactériennes intrinsèques et des capacités pénétrantes. Lorsque couplés à d’autres agents antibactériens ou antiseptiques, ils favorisent l’internalisation d’autres composés antibactériens ou antiseptiques dans les bactéries, et permettent d’obtenir une action antibactérienne, antiseptique ou désinfectante renforcée.

Les peptides de l’invention peuvent aussi être liés de façon covalente avec des anticorps, des fragments d’anticorps, des ScFv, ayant pour visée d’inhiber la croissance tumorale et/ou les métastases. Peuvent également être attachés de façon covalente aux peptides de l’invention des oligonucléotides, notamment des siRNA, des ARN antisens ou toute autre séquence nucléotidique susceptible d’exercer une action antitumorale.

L’administration de conjugués permet d’améliorer l’efficacité de l’agent actif.

Utilisation sous forme de vésicules fonctionnalisées

Les peptides de l’invention peuvent également être ancrés à la surface de vésicules, exosomes ou liposomes afin d’en favoriser la pénétration dans les cellules et tissus à traiter.

Ce traitement pouvant s’opérer par l’action intrinsèque des peptides de l’invention ou par celle des molécules cargos contenues dans ces vésicules et dont l’invention va favoriser l’adressage cellulaire et intracellulaire.

Dans un exemple particulier de l’invention, les peptides de l’invention sont insérés dans la membrane grâce à un groupement stéaryl qui leur est adjoint de façon covalente. Dans un mode particulier, le groupement stéaryl est adjoint en N-terminal des peptides alors que leur extrémité C-terminale est modifiée par un groupement amide de façon à les protéger de l’action des exopeptidases. Les peptides peuvent être insérés dans des vésicules pendant la production des vésicules, ou après la production des vésicules. Typiquement les peptides sont couplés chimiquement à un phospholipide utilisé dans la structure de la vésicule. Le phospholipide modifié est ainsi mélangé aux autres constituants (phospholipide non modifié, cargo, autres lipides éventuels, cholestérol, etc.), et les vésicules sont produites par des techniques connues de l’homme du métier, comme illustré dans les exemples. Les vésicules lipidiques et exosomes ainsi modifiés ont une capacité accrue à interagir avec les membranes cellulaires cibles et à être internalisées dans les cellules par macropinocytose.

Ces vésicules ainsi décorées peuvent être utilisées comme véhicules d’agents thérapeutiques tels des molécules utilisées classiquement en thérapie anticancéreuse, anti-inflammatoire, antimicrobienne ou antibactérienne. Les agents actifs inclus dans ces vésicules armées par les peptides peuvent être également des peptides.

Par exemple, les peptides 1 et 2 et leurs dérivés peuvent décorer l’extérieur d’exosomes à visées thérapeutiques de façon à cibler les tissus, les cellules qui présentent une activation des récepteurs TLR4/MD2. Les exosomes ainsi décorés sont à même d’inhiber les signaux pathologiques en étant recrutés à la membrane plasmique, action qui sera prolongée dans les endosomes après internalisation des exosomes.

Dans le même but peuvent être utilisés les peptides 3 et 4, ainsi que 5 et 6 et leurs dérivés respectifs.

Les exosomes peuvent également être modifiés de façon à contenir les peptides 7 et 8 et leurs dérivés. Ces peptides, après fusion membranaire au niveau de la membrane plasmique ou au niveau de la membrane des endosomes, sont relargués dans le cytosol des cellules cibles de façon à s’opposer aux différentes voies de signalisation pathologiques initiées par TLR4.

De préférence, les exosomes peuvent également être modifiés de façon à contenir un peptide ayant une séquence de SEQ ID NO : 1 , 7, 9, 11 ou 14, ou un mélange de ceux- ci.

Les peptides peuvent être également chargés à l’intérieur des vésicules, exosomes ou liposomes en tant qu’un actif thérapeutique.

Modes particuliers de mise en œuyre

L’invention est utilisable pour traiter toute maladie inflammatoire, en particulier une maladie liée à une infection microbienne ou bactérienne, en particulier à Gram négatif ou pathologie néoplasique ou proliférative.

Tel qu'utilisé ici, le terme « traitement » ou « traiter » se réfère par exemple à toute intervention clinique dans une tentative de modifier le cours naturel de l'individu traité, et peut être effectué à des fins préventives ou curatives. Les effets souhaitables du traitement comprennent, sans s'y limiter, la prévention de l'apparition ou de la récurrence de la maladie, l'atténuation des symptômes, la diminution de toute conséquence pathologique directe ou indirecte de la maladie, la diminution du taux de progression de la maladie, l'amélioration ou la palliation de l'état pathologique ou la rémission ou l'amélioration du pronostic. Dans certains modes de réalisation, les compositions et les procédés de l'invention sont utilisés pour retarder le développement d'une maladie ou d'un trouble ou pour ralentir la progression d'une maladie ou d'un trouble. L’invention peut être mise en œuvre chez tout mammifère, de préférence chez l’être humain. Elle est utilisable quel que soit l’âge du patient, et quel que soit le stade de développement et/ou la nature de l’inflammation, d’une infection microbienne ou bactérienne ou de la néoplasie.

De préférence, l’invention est utilisable pour traiter les maladies inflammatoires liées à la présence des bactéries Gram négatif et/ou la dérégulation/ suractivation de l’expression du récepteur TLR4 dans les maladies inflammatoires indépendantes de la présence des bactéries à Gram négatif.

Des exemples d’infections bactériennes à Gram négatif que la présente invention permet de traiter sont notamment la Brucellose, les infections à Campylobacter, la maladie des griffes du chat, les infections à Escherichia coli, à Haemophilus influenzae, à Pseudomonas ou à Klebsiella, la légionellose, la Salmonellose, la Shigellose, la peste ou le choléra. Les bactéries à Gram négatif peuvent également provoquer de nombreuses infections, telles que la méningite, la pneumonie, la péritonite, les infections des voies urinaires ou du sang ainsi que les infections des plaies et des sites chirurgicaux.

Selon un mode particulier, l’invention vise une méthode de traitement des maladies inflammatoires liées à la présence des bactéries à Gram négatif chez un sujet comprenant l’administration d’un peptide, conjugué ou vésicule tels que définis dans l’invention.

Selon un mode particulier, l’invention est utilisée en combinaison avec toute autre thérapie visant à traiter les maladies inflammatoires liées à une infection bactérienne, telle que par exemple une antibiothérapie, une immunothérapie ou une phagothérapie. Dans ce cadre, l’invention peut être mise en œuvre avant, pendant et/ou après la thérapie combinée.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides, conjugués ou vésicules tels que définis dans la présente demande pour leur utilisation pour :

- inhiber les interactions entre le récepteur TLR4, MD2, TLR4/MyD88 et/ou TRIF

- empêcher la liaison du LPS à son récepteur TLR4/MD2

.- augmenter la perméabilité membranaire bactérienne

- inhiber ou réduire la résistance des bactéries aux antibiotiques ou aux bactériophages ;

Selon un mode particulier, l’invention vise une méthode de traitement des maladies inflammatoires liées à une infection bactérienne ou la dérégulation du système immunitaire innée (en particulier où le récepteur TLR4 serait impliqué), comprenant l’administration d’une quantité thérapeutique efficace d’un peptide selon l’invention ou d'une composition comprenant un tel peptide.

Selon un mode particulier, l’invention vise une méthode de traitement d’une maladie inflammatoire.

Alternativement, l’invention est utilisable pour traiter une maladie inflammatoire. Des exemples particuliers de maladies inflammatoires que la présente invention permet de traiter sont notamment les maladies inflammatoires de la peau, de l’intestin (inflammatory bowel diseases, IBD), la maladie de Crohn, de la rectocolite hémorragique et des ulcères diabétiques.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides, conjugués ou vésicules tels que définis dans la présente demande pour leur utilisation pour inhiber l’inflammation, en particulier l’inflammation médiée par la voie TLR4.

Selon un mode particulier, l’invention vise une méthode de traitement d’une maladie inflammatoire, comprenant l’administration d’une quantité thérapeutique efficace d’un peptide selon l’invention ou d'une composition comprenant un tel peptide.

Alternativement, l’invention est utilisable pour traiter le cancer.

Des exemples particuliers de cancers que la présente invention permet de traiter sont notamment des cancers solides tels que le cancer du pancréas, le mélanome, le cancer du poumon, de l'œsophage ou du pharynx, le rétinoblastome, le cancer du foie, du sein, de l'ovaire, du rein, de l'estomac, du duodénum, de l'utérus, du col de l'utérus, de la thyroïde, de la vessie, de la prostate, de l'os, le cancer du cerveau ou colorectal.

Selon un mode particulier, l’invention vise une méthode de traitement d’une maladie néoplasique ou maladie proliférative chez un sujet, de préférence d’un cancer, comprenant l’administration au sujet d’un peptide, conjugué ou vésicule tels que définis dans l’invention. De préférence, l’administration permet d’inhiber ou réduire l’angiogenèse, et/ou d’inhiber ou réduire ou retarder la formation de métastases, et/ou d’inhiber ou réduire la résistance à la chimiothérapie chez le sujet.

Selon un mode particulier, l’invention est utilisée en combinaison avec toute autre thérapie du cancer, comme par exemple la chimio-, l’immuno-, l’hormono- ou la radiothérapie. Dans ce cadre, l’invention peut être mise en œuvre avant, pendant et/ou après la thérapie combinée. Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides, conjugués ou vésicules tels que définis dans la présente demande pour leur utilisation dans le traitement de maladies néoplasiques ou prolifératives, notamment de cancer.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides, conjugués ou vésicules tels que définis dans la présente demande pour leur utilisation pour

. inhiber l’angiogenèse,

. inhiber ou réduire ou retarder la formation de métastases, et/ou

. inhiber ou réduire la résistance à la chimiothérapie ou à l’hormonothérapie chez des patients présentant une maladie néoplasique ou proliférative.

Selon un mode particulier, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement de l’acné. Selon un mode particulier, Un autre objet de l’invention réside dans l’utilisation d’un peptide, acide nucléique, ou composition de l’invention pour la fabrication d’un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l’acné.

Un autre objet de l’invention réside dans une méthode de traitement de l’acné.

De préférence, l’invention vise les peptides de l’invention pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement de cicatrices hypertrophiques dans les maladies prolifératives des fibroblastes dermiques. Ces maladies produisent notamment des quantités abondantes de collagène et de matrice extracellulaire dans la peau après de graves brûlures, inflammations et traumatismes.

Formulation et/ou

L’invention a également pour objet toute composition comprenant un peptide de l’invention, de préférence en une quantité thérapeutique efficace. Il s’agit de préférence de compositions pharmaceutiques, comprenant par exemple un ou plusieurs excipients acceptables. Les peptides, conjugués, vésicules et autres agents de l'invention peuvent être formulés dans toute composition ou formulation appropriée, telle que des compositions pharmaceutiques.

Une « composition pharmaceutique » fait référence à une formulation d'un agent de l'invention (ingrédient actif) et d'un milieu généralement accepté dans l'art pour la délivrance de composés biologiquement actifs à un sujet qui en a besoin. Un tel véhicule comprend tout véhicule, diluant, milieu ou support pharmaceutiquement acceptable. La pratique pharmaceutique conventionnelle peut être employée pour fournir des formulations ou des compositions appropriées aux sujets, par exemple sous une forme posologique unitaire.

Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être formulés sous forme de pommade, gel, pâte, solutions liquides, suspensions, comprimés, gélules, gélules, suppositoire, poudres, gouttes nasales, ou aérosol, de préférence sous forme de produit injectable, solution ou suspension. Pour les injections, les agents sont généralement conditionnés sous forme de suspensions ou solutions liquides, qui peuvent être injectées via des seringues ou des perfusions par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques ou tamponnées, compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou excipients choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Les agents ou excipients utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, gélatine, lactose, huiles végétales, acacia, etc. Le support peut également être choisi par exemple parmi la méthyl-bêta-cyclodextrine, un polymère d'acide acrylique (tel que le carbopol), un mélange de polyéthylène glycol et polypropylène glycol, la monoéthanolamine et l'hydroxyméthyl cellulose.

Les compositions comprennent généralement une quantité efficace d'un composé de l'invention, par exemple, une quantité qui est efficace pour traiter, seul ou en combinaison(s), une maladie inflammatoire, une infection bactérienne, de l’acné, des cicatrices hypertrophiques, d’un trouble néoplasique ou d’un trouble prolifératif. La posologie peut être ajustée par l'homme du métier en fonction de l'agent et de la maladie.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre en outre un ou plusieurs composés actifs supplémentaires, pour une utilisation séparée, simultanée ou séquentielle. Des exemples de composés actifs supplémentaires comprennent, sans s'y limiter, un médicament chimiothérapeutique, des composés anti-inflammatoires, des antibiotiques, des antiseptiques, des agents antiparasitaires, des agents antifongiques ou des agents antiviraux.

Dans un mode de réalisation particulier, l'agent de l'invention est utilisé en association avec autre thérapie antimicrobienne, antibactérienne ou antiseptique, telle qu’une antibiothérapie, une immunothérapie ou une phagothérapie. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'agent de l'invention est utilisé en association avec une chimiothérapie ou une hormonothérapie.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'agent de l'invention est utilisé en association avec un autre agent anti-inflammatoire.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'agent est utilisé en combinaison avec une radiothérapie, une thérapie par ultrasons ou une thérapie par nanoparticules.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'agent est utilisé en association avec des inhibiteurs de point de contrôle (« check-point »), une immunothérapie ou des vaccins anticancéreux.

La forme des compositions pharmaceutiques, la voie d'administration, la posologie et le régime dépendent de l'affection à traiter, de la gravité de la maladie, de l'âge, du poids et du sexe du patient, etc.

Les doses utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie considérée, ou encore de la durée de traitement souhaitée.

Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées pour une administration topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intraoculaire et similaire.

De préférence, la formulation pharmaceutique est une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir notamment de solutions salines isotoniques, stériles (phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues ou mélanges de tels sels), ou de compositions sèches, notamment lyophilisées qui, lors de l'addition, selon le cas, d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutions injectables.

Des solutions injectables stériles peuvent être préparées en incorporant les composés actifs dans la quantité requise dans le solvant approprié avec divers des autres ingrédients énumérés ci-dessus, selon les besoins, suivi d'une stérilisation filtrée. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les méthodes de préparation préférées sont des techniques de séchage sous vide et de lyophilisation qui donnent une poudre de l'ingrédient actif plus tout ingrédient souhaité supplémentaire à partir d'une solution préalablement stérile filtrée de celui-ci. Les peptides, conjugués, vésicules et compositions selon l’invention (et tout agent thérapeutique additionnel) peuvent être administrés par tout moyen et toute voie approprié(e), notamment parentéral, intrapulmonaire, et intranasal et, si souhaité pour un traitement local, administration intra-lésionnelle. Les administrations (e.g., injections, perfusions) parentérales comprennent l'administration intramusculaire, intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale ou sous-cutanée. Le dosage peut se faire par toute voie appropriée, par ex. par des injections, telles que des injections intraveineuses ou sous- cutanées, selon en partie si l'administration est brève ou chronique. Divers schémas posologiques comprenant, mais sans s'y limiter, des administrations uniques ou multiples sur divers instants, une administration en bolus et une perfusion pulsée sont envisagés ici.

D’autres aspect et avantages de l’invention sont illustrés dans les figures et exemples qui suivent.

Description des Figures

Figure 1 : Effet des peptides sur l’inhibition des voies inflammatoires NF-KB (A) et IFNs (B) induites par TLR4 dans la lignée cellulaire humaine monocytaire ThP1 -Dual™. Incubation des cellules ThP1 -Dual™ pendant 24h avec les peptides T4MD, T4Ex5, T4ln7, T7ln7c, T4ln7-isoD, T4ln7sh, T4ln7v1 et T4ln7v3 à [2,5 μM - 5 μM - 10 μM - 20 pM] en présence de LPS [10 ng/mL],

Figure 2 : Effet des peptides sur la sécrétion de l’interleukine 8 (IL-8) dans les cellules épithéliales du cancer du côlon SW480 stimulées par le LPS. Incubation des cellules SW480 pendant 24h avec les peptides T4MD, T4Ex5, T4ln7, T7ln7c à [2,5 μM - 5 μM - 10 μM - 20 μM] (A) ou de 0,156 μM à 40 μM (B) en présence de LPS [100 ng/mL], CLI- 095 [100 nM] (nom commercial Resatorvid ou TAK-242) utilisé comme inhibiteur TLR4.

Figure 3 : Effet des peptides sur la sécrétion de TNFa dans les macrophages murins RAW 264.7 stimulés par le LPS. Incubation des cellules RAW 264.7 pendant 24h avec les peptides T4MD, T4Ex5, T4ln7, T7ln7c à [2,5 μM - 5 μM - 10 μM - 20 μM] en présence de LPS [10 ng/mL],

Figure 4 : Spécificité de l'inhibition de la signalisation TLR4. Incubation des cellules ThP1 -DUAL™ pendant 24h avec les peptides T4MD, T4Ex5, T4ln7, T7ln7c à [2 μM - 2,5 pM - 20 μM] en présence des agonistes HKLM (10 ⁷ cellules/ml), FLA-BS (150 ng/ml), Pam2CSK4 (1 ng/ml), TL8-506 (700 ng/ml) ou Pam3CSK4 (50 ng/ml).

Figure 5 : Evaluation de la toxicité des peptides par test XTT après 24h d’incubation. La cytotoxicité est mesurée dans les cellules monocytaires humaines ThP1 -Dual™ (A), cancéreuses du colon SW480 (B) et les macrophages murins RAW 264.7 (C).

Figure 6 : Evaluation de la toxicité des peptides par cytométrie en flux sur ThP1 -Dual™ après 24h d’incubation.

Figure 7 : Evaluation de la liaison des peptides au LPS. PMB (Polymyxine B).

Figure 8 : Evaluation des propriétés antibactériennes des peptides.

La densité optique à 625 nm est mesurée après incubation des bactéries avec les peptides pendant 24h.

Figure 9 : Potentiel d'internalisation des peptides dans les différentes lignées cellulaires. Le signal fluorescent a été mesuré après incubation des cellules à 37°C (plein) ou 4°C (hachuré) pendant 10 minutes avec 2,5 μM (A), 5 μM (B), 10 μM (C) ou 20 μM (D) de peptide couplé à la Cyanine 3.

EXEMPLES

I. Matériels et Méthodes

Design et études in silico des peptides

Les peptides dérivés du récepteur TLR4 : T4Ex5, T4ln7 et ses dérivés T4ln7_v1 , T4ln7_v3, T4ln7sh, T4ln7LD, T4ln7-isoD et T4ln7c (Tableau 1 ) ont été désignés à partir de la séquence protéique humaine publiée du récepteur (UniProt #000206). Le peptide T4MD est dérivé de la protéine MD2 obtenue à partir de la séquence protéique publiée sur UniProt (#Q9Y6Y9). Les entrées UniProt des protéines TLR4 et MD2 répertorient toutes les données publiées concernant les différents domaines et régions d’interaction spécifiques (interactions MD2/LPS/TLR4, dimérisation de TLR4, recrutement des protéines adaptatrices TIRAP et TRAM au domaine cytoplasmique TIR de TLR4). Ces informations permettent de cibler préférentiellement ces régions clés pour le design des peptides CPPs candidats afin de perturber la formation du complexe TLR4-MD2-LPS, la dimérisation du récepteur voire de la formation intracellulaire du complexe multiprotéique responsable de la cascade de signalisation. Pour compléter les analyses in silico effectuées MLCPP (tableau A), différents logiciels de prédiction in silico ont été utilisés. Les données obtenues sont présentées dans les Tableaux 2 à 5. Les logiciels CelIPPD, MLCPP2.0 ont permis de déterminer les scores de probabilités que les peptides candidats soient des CPPs, et de leur efficacité d’être internalisé par la cellule (Tableau 2, SVM based prediction method). Des logiciels complémentaires (Postparam, HeliQuest, ADP3 et PepCalc) ont été utilisés pour confirmer la structure coiled-coil et en hélice a plus stable et ayant de meilleures propriétés de perméabilisation membranaire pour les différents peptides. Les propriétés physico-chimiques telles que la charge nette, le point isoélectrique, le caractère amphipathique et l’hydrophobicité notamment sont également déterminées et renforcent la nature CPPs des peptides (Tableau 3). Le Facteur D qui détermine le potentiel "Membrane-Binding" de chaque peptide est calculé à partir du moment hydrophobique (pH) et de la charge nette (Z) selon l'équation D = 0.994(<pH>) + 0.33(Z). A partir de ce score de facteur D, les peptides CPPs peuvent être classés en 3 catégories : (1 ) D < 0.68, le peptide est considéré comme ne se liant pas aux lipides (structure en hélice ou coiled-coil aléatoirement), (2) 0.68 < D < 1 .34, le peptide est considéré comme une hélice pouvant se lier aux lipides et (3) D > 1 .34, le peptide est considéré comme une hélice se liant aux lipides. Enfin, le logiciel « DeepTMHMM » permet d’évaluer la localisation cellulaire des CPPs (Tableau 4). Les potentielles réponses immunologiques (score d’immunogénicité IEDB, toxicité, allergie) ainsi que le potentiel hémolytique (SVM (HemoPI-2) based method) des différents peptides CPPs sont évaluées. La demi-vie de chacun des peptides dans le sang est également estimée (Tableau 5).

Synthèse des peptides

Tous les peptides ont été synthétisés à l'échelle de 100 pmoles à l'aide de Fmoc-SPPS (Symphony X , Protein Technologies, Inc., USA). Les réactifs Fmoc-AA de qualité synthèse et les résines amides HATU et RINK (200-400 mesh, 0,42 mmol/g) ont été achetées à IRIS Biotech. Le DMF, le DCM, le méthanol, l'éther diéthylique et l'acétonitrile de qualité HPLC ont été achetés à Aldrich. Le cycle standard de déprotection-couplage pour chaque résidu comprenait six étapes :

1 . Lavage avec 5 ml de DMF (3 x 30 sec)

2. Déprotection du groupe Fmoc avec 5 ml de 20% de pipéridine dans du DMF (3 x 3 min)

3. Lavage avec 5 ml de DMF (3 x 30 sec)

4. Couplage avec Fmoc-AA (2 x 60 min) a. 5 ml de Fmoc-AA dissous à 200 mM dans du DMF b. 2 ml de HATU dissous à 500 mM dans la NMP c. 2 ml d'iPr2NEt dissous à 1 M dans NMP

5. Capping avec 5 ml d'Ac2O à 10 % dans du DMF (7 min)

6. Lavage avec 5 ml de DMF (3 x 30 sec)

Une fois la synthèse terminée, les résines peptidiques ont été lavées 3 fois avec du DMF et 3 fois avec du DCM. Les résines peptidiques ont ensuite été clivées avec des cocktails de clivage TFA (par synthèse à l'échelle de 100 pmoles) : 35 mL de TFA, 1000 μL de TIS, 2000 μL d'eau, 1000 mg de DTT

Après 3 h de clivage au TFA, la solution de clivage a été filtrée de la résine, et les peptides ont été précipités par addition à 160 mL d'éther glacé. Après >1 h à -20 °C, les solutions d'éther ont été centrifugées à 3500 RCF, et les surnageants ont été décantés. Les culots ont été lavés deux fois de plus avec de l'éther, puis séchés pendant >3 h dans un dessiccateur sous vide avant d'être dissous, caractérisés et purifiés.

Analyse et purification

Les peptides ont été analysés par UPLC et spectrométrie de masse ESI-MS. Les instruments étaient équipés de BEH C18 (WATERS), 150*2,1 mm (150 x 2.1 mm) (débit : 0,6 mL/min). Les solvants A et B étaient 0,1 % de TFA dans l'eau et 0,1 % de TFA dans l'acétonitrile.

Les purifications des peptides bruts ont été effectuées à l'aide d'un système HPLC préparatif en phase inverse (Waters Delta Prep 4000) utilisant une colonne en phase inverse (Vydac Denali prep C-18, 10 pm, 120 A, 50 x 300 mm) et un gradient approprié de concentration croissante de tampon B dans le tampon A (débit de 80 mL/min). Les fractions contenant le peptide cible purifié ont été identifiées par mesure UV (détecteur UV/Visible Waters 2489) à 214 nm et les fractions sélectionnées ont ensuite été combinées et lyophilisées.

Un groupement acétyl en N-terminal et un groupement amide en C-terminal ont été ajoutés pour protéger les peptides contre les exopeptidases. Les peptides fluorescents sont couplés à la cyanine 3 en C-terminal sur la chaine latérale d’une cystéine additionnelle.

Deux variants du peptide T4ln7 sont synthétisés. Le premier variant synthétisé, T4ln7- iso D (peptide NR5 dans le tableau de séquences), correspond au peptide T4ln7 dont les acides aminés arginine (R, en N-terminal) et leucine (L, en C-terminal) sont des isomères en conformation « D ». Le second variant, T4ln7c, est la forme cyclique du peptide obtenu par la création d’un pont disulfure entre deux acides aminés cystéines ajoutés aux extrémités N- et C-terminales (peptide NR6 dans le tableau de séquences). La synthèse de ces deux variants a pour but d’augmenter la stabilité du peptide T4ln7.

Culture des cellules

Les cellules ThP1 -Dual™ (InvivoGen) sont cultivées à 37°C, 5% de CO2, en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de SVF, 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine, 100 μg/mL de normocine, 10 μg/mL de blasticidine et 100 μg/mL de zéocine.

Les cellules SW480 (ATCC) sont cultivées à 37°C en absence de CO2, en milieu L-15 supplémenté avec 10% de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine.

Les cellules HeLa et RAW 264.7 (ATCC) sont cultivées à 37°C, 5% de CO2, en milieu DMEM-GlutaMAX™ supplémenté avec 10% de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine.

Stimulation des cellules avec les agonistes

Les cellules ThP1 -Dual™ et RAW 264.7 sont stimulées avec 10 ng/mL de LPS-EK (InvivoGen). Les cellules SW480 sont stimulées avec 100 ng/mL de LPS-EK.

Lors de expériences pour déterminer la spécificité des peptides, les cellules ThP1 -Dual™ sont stimulées avec 150 ng/ml de FLA-BS (InvivoGen), 700 ng/ml de TL8-506 (InvivoGen), 1 ng/ml de Pam2CSK4, 50 ng/ml de Pam3CSK4 et 10 ⁷ cellules/ml de HKLM.

Mesure de cytotoxicité

Par test de viabilité

La cytotoxicité est évaluée par le test CyQUANT XTT Cell Viability Assay (ThermoFisher). Soixante-dix μL de réactif XTT sont ajoutés sur les cellules dans 100 μL de milieu de culture. Les échantillons sont ensuite incubés 4h à 37°C. L’absorbance à 450 et 660 nm est mesurée à l’aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3 (Molecular Devices).

Par cytométrie en flux

La cytotoxicité des peptides sur les cellules ThP1 -Dual™ est en parallèle évaluée par cytométrie en flux. En plaque 48 puits, 2,0.10 ⁵ cellules sont ensemencées dans 400 μL de milieu de culture en présence des peptides à différentes concentrations. Les cellules sont incubées pendant 24h. Après incubation, les cellules sont centrifugées et lavées au PBS deux fois puis marquées avec le marqueur de viabilité Viobility 405-452 (Miltenyi Biotec) pendant 15 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. Les cellules sont à nouveau lavées au PBS puis resuspendues en milieu de culture sans SVF et filtrées à 70 pm avant d’être analysées avec le cytomètre FACSymphony A1 (BD Biosciences). Chacune des analyses est réalisée sur 20 000 évènements.

Analyse des voies NF-KB et interférons de type I

La lignée cellulaire double rapportrice ThP1 -Dual™, dérivée des monocytes humains ThP1 , permet l’étude simultanée de la voie NF-KB (en suivant l’activité de la SEAP) et de la voie des interférons (en évaluant l’activité de la Lucia Luciférase). L’activation de la voie NF-KB dans les cellules ThP1 -Dual™ est mesurée à l’aide du réactif QUANTI-Blue™ (InvivoGen). En plaque 96 puits, 1 ,0.10 ⁵ cellules ThP1-Dual™ sont ensemencées dans 200 μL de milieu de culture et traitées avec les agonistes et peptides pendant 24h. Après incubation, 20 μL de suspension cellulaire sont prélevés et 180 μL de réactif QUANTI- Blue™ sont ajoutés. Les échantillons sont incubés 3h à 37°C puis l’absorbance à 655 nm est mesurée à l’aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3.

L’activation de la voie des interférons dans les cellules ThP1 -Dual™ est mesurée à l’aide du réactif QUANTI-Luc™ (InvivoGen). Vingt μL de suspension cellulaire sont prélevés et 50 μL de réactif QUANTI-Luc™ sont ajoutés. La luminescence est mesurée immédiatement à l’aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3.

Dosage des cytokines par ELISA

Les cytokines IL-8 et TNFa sont dosées par ELISA sur les surnageants de culture. En plaque 96 puits, 1 ,7.10 ⁴ cellules RAW 264.7 ou 1 ,5.10 ⁴ cellules SW480 sont ensemencées dans 200 μL de milieu de culture. Vingt-quatre heures après ensemencement, les cellules sont traitées avec les agonistes et peptides pendant 24h. Après incubation, le surnageant de culture est prélevé puis centrifugé à 450 g pendant 3 minutes. Les ELISA sont réalisés suivant les recommandations du fournisseur. Brièvement, l’anticorps de capture est mis à adsorber dans les puits sur la nuit à 4°C. Le lendemain, les puits sont lavés avec le tampon de lavage puis une étape de blocage est réalisée pendant 1 h à température ambiante et sous agitation à 500 RPM. Les puits sont à nouveau lavés puis les échantillons sont incubés pendant 2h à température ambiante et sous agitation à 500 RPM. Après incubation, les puits sont lavés et l’anticorps de détection est ajouté et incubé pendant 1 h à température ambiante et sous agitation à 500 RPM. Ensuite, les puits sont lavés et le couplage avec l’avidine-HRP est réalisé pendant 30 minutes à température ambiante et sous agitation à 500 RPM. La solution de révélation est ensuite ajoutée et le tout est incubé pendant 15 à 20 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. La réaction est stoppée par l’ajout de solution stop. Les absorbances à 450 et 570 nm sont mesurées à l’aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3.

Mesure d’internalisation par cytométrie en flux

En plaque 96 puits, 2,0.10 ⁵ cellules sont incubées pendant 10 minutes à 37°C ou 4°C avec les peptides couplés à la cyanine 3. Elles sont ensuite centrifugées et lavées au PBS deux fois puis marquées avec le marqueur de viabilité Viobility 405-452 (Miltenyi Biotec) pendant 15 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. Les cellules sont à nouveau lavées au PBS puis resuspendues en milieu de culture sans SVF et filtrées à 70 pm avant d’être analysées avec le cytomètre FACSymphony A1 (BD Biosciences). Chacune des analyses est réalisée sur 20 000 évènements.

Evaluation de la liaison des peptides au LPS

La liaison des peptides au LPS a été déterminée à l'aide d'un kit de quantification des endotoxines chromogènes Thermo Scientific™ Pierce™ LAL. Brièvement, 25 μL des peptides, à différentes concentrations (0,15625 μM , 0,625 μM , 2 μM ou 10 μM ) sont ajoutés à 25 μL de LPS d'Escherichia coli 0111 :B4 (concentration finale de 1 EU/mL) pendant 30 min à 37°C. À la suite de l’incubation, 50 μL de lysat d'amibocyte de Limulus est ajouté pendant 10 min à 37°C. Cent μL du substrat chromogénique (Ac-lle-Glu-Ala- Arg-p-Nitroaniline) sont ajoutés et incubés à 37°C pendant 6 min. La réaction est stoppée par l'ajout de 50 μL d'acide acétique à 25 % et l’absorbance à 405 nm est mesurée à l'aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3. Le pourcentage de liaison pour chaque peptide est calculé à partir des valeurs d’absorbance obtenues en comparaison avec la valeur obtenue pour le LPS seul.

Evaluation des propriétés antibactériennes

Les propriétés antibactériennes des peptides sont évaluées sur la souche bactérienne Escherichia coli ATCC-25922. Afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice des peptides (CMI), les bactéries sont cultivées sur la nuit à 37°C, sous agitation à 225 RPM, puis diluées en bouillon Mueller-Hinton jusqu’à obtenir une densité optique entre 0,1 et 0,2 à 625 nm. La suspension est ensuite diluée au 20ème afin d’obtenir un inoculum à 5,0.10 ⁶ CFU/mL. En plaque 96 puits, 90 μL de peptides dilués en bouillon Mueller-Hinton et 10 μL d’inoculum sont ajoutés par puits. Les bactéries sont cultivées pendant 24h à 37°C sous agitation à 225 RPM. Après incubation, la densité optique à 625 nm est mesurée à l’aide du spectrophotomètre SpectraMax iD3. Analyses statistiques

Les expériences ont été répétées de façon indépendante au minimum deux fois. Les données sont représentées sous la forme de moyennes +/- SEM et analysées avec le test de Kruskall-Wallis suivi d’une comparaison multiple de Dunn. Les valeurs de P inférieures à 0,05 sont considérées comme significatives (*, P<0,05 ; **, P<0,001 ; ***, P<0,001 ; ****, P<0,0001 ).

II. Résultats

Exemple 1 :

La lignée cellulaire double reportrice THP1 -Dual™ permet l'étude simultanée de l’activation de la voie NF-KB, facteur de transcription qui joue un rôle important dans l’activation de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et de la voie IRF, les interférons de type I, facteur de transcription impliqué dans la production des interférons de type I (IFNs). Une activation par le LPS du récepteur TLR4 va induire l’activation de ces deux voies qui peut être quantifiée par mesure de l'activité de SEAP (voie NF-KB) et de l'activité luciférase Lucia (voie IFNs).

Une concentration de LPS-EK de 10 ng/mL permet l'activation maximale de ces deux voies inflammatoires dans la lignée ThP1 -Dual™. Les différents peptides ont été testés aux concentrations suivantes : 2,5 μM , 5 μM , 10 μM et 20 μM en présence de LPS-EK pendant 24 heures. Sur la figure 1 , une diminution de l’activité SEAP (A) et/ou Luciférase (B) signifie un effet antagoniste potentiel sur les voies NF-KB et IFNs respectivement. Seuls les peptides T4MD, T4ln7 et T4ln7 cyclique ont un effet antagoniste dose- dépendant significatif sur les deux voies de signalisation étudiées. Cet effet inhibiteur sur la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNFa) de ces peptides est ensuite étudié dans différentes lignées cellulaires.

Exemple 2 :

Pour évaluer l'activité anti-inflammatoire des peptides, leur effet sur la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 a été quantifiée par ELISA dans les cellules SW480 stimulées par LPS. La figure 2 montre une baisse significative de la sécrétion d’IL-8 dans les conditions de traitement avec T4MD, T4ln7 et T4ln7c par rapport aux cellules stimulées avec le LPS à 100 ng/mL. Un effet dose réponse significatif est observé pour les peptides T4MD et T4ln7c avec un pourcentage d’inhibition compris entre 23 et 90 %. Ces résultats montrent l'effet anti-inflammatoire des peptides in vitro sur des cellules cancéreuses du colon SW480 en présence de LPS. Les expériences ont ensuite été reproduites avec une gamme de concentrations plus étendue permettant de déterminer la concentration inhibitrice médiane (CI50) des peptides (Figure 2B). Le peptide T4MD présente la plus grande efficacité (CI50 : 1 ,9 μM). Le peptide T4ln7 montre un profil très similaire (CI50 : 2,4 μM ) alors que le peptide T4ln7 présente une efficacité plus faible (CI50 : 4,2 μM).

Exemple 3 :

Pour évaluer l'activité anti-inflammatoire des peptides, leur effet sur la production de la cytokine pro-inflammatoire TNFa dans les cellules RAW 264.7 stimulées par LPS a été déterminé par ELISA. La Figure 3 montre que la stimulation des cellules RAW 264.7 par le LPS a entraîné une augmentation de la concentration de TNFa dans le surnageant de culture. Cette sécrétion de TNFa est réduite par le traitement avec les peptides T4MD, T4ln7 et T4ln7c, de façon dose-dépendante. Bien que tous les peptides testés aient un effet inhibiteur sur la production de TNFa induite par le LPS, leur puissance individuelle varie. Parmi ceux-ci, le peptide T4ln7c exerce l'activité inhibitrice la plus puissante, avec un pourcentage d’inhibition de la sécrétion de TNFa allant de 65,4 à 88,5 % selon la concentration. Les activités inhibitrices sont moins prononcées pour les peptides T4ln7 et T4MD avec une inhibition de la sécrétion de TNFa comprise entre 42,8 et 78 % et entre 34,8 et 82,2 %, respectivement. Le peptide contrôle T4Ex5 ne montre quant à lui pas d’effet inhibiteur, confirmant les résultats obtenus dans les lignées ThP1 -Dual™ et SW480 (Figures 1 et 2).

Exemple 4 :

Pour déterminer la spécificité des peptides dérivés de TLR4/MD2 qui inhibent TLR4, l’effet de ces peptides a ensuite été testé sur la signalisation induite par les agonistes de TLR2, TLR5 et TLR8 dans les cellules monocytaires ThP1 -Dual™. La co-incubation des peptides avec les différents agonistes n'a montré aucun effet inhibiteur sur l'activation des TLRs autres que TLR4. Les résultats significatifs observés pour les peptides T4ln7 et son analogue cyclique T4ln7c sont liés à la toxicité de ces peptides in vitro dans la lignée ThP1 -Dual™ (Figures 5A et 6). Exemple 5 :

Afin d’évaluer la toxicité propre des peptides sur les cellules ayant fait l’objet des études fonctionnelles (Figures 1 , 2 et 3), ces dernières sont incubées en présence des peptides à 4 concentrations pendant 24 heures sans LPS dans la lignée monocytaire ThP1 -Dual™ (Figure 5A) ou en présence de LPS dans les lignées SW480 et RAW 264.7 (Figure 5B et C). Sur les cellules ThP1 -Dual™, aucune toxicité n’est observée pour la majorité des candidats. Seuls les peptides T4ln7, son analogue cyclique T4ln7c et T4ln7LD, T4ln7, son analogue cyclique induisent une toxicité à 20 μM avec plus de 50 % de mortalité dans la lignée ThP1-Dual™ (Figure 5A). Concernant les cellules SW480 et RAW 264.7, aucun effet toxique significatif n’est observé après 24h d’incubation avec les peptides fonctionnels (Figures 5B et C).

Exemple 6 :

Une analyse supplémentaire par cytométrie en flux a été effectuée pour évaluer la toxicité des peptides fonctionnels - T4MD, T4ln7 et son analogue cyclique T4ln7c - sur les cellules ThP1 -Dual™. Après 24h d’incubation, une mortalité cellulaire significative a été observée à la concentration de 20 μM pour le peptide T4ln7 et T4ln7c, avec respectivement 36,1 % et 17,9 % de cellules viables. Le peptide T4MD n’est pas toxique comme déjà démontré par le test XTT (Figure 5A).

Exemple 7 :

Les inventeurs ont testé la capacité des peptides à se fixer au LPS à différentes concentrations. Lors de ces expériences, le polypeptide Polymyxine B, connu pour son affinité pour le LPS a été utilisé comme contrôle positif. Comme le montre la Figure 7, les peptides T4MD, T4Ex5, T4ln7, T4ln7c et T4ln7_v3 présentent des profils de liaison au LPS différents. Ainsi, le peptide T4MD possède une capacité de liaison au LPS la plus élevée (62 % de liaison à 10 μM ). Le peptide T4ln7 et son analogue cyclique se lient faiblement au LPS (à 10 μM les pourcentages sont respectivement de 9 % et 23,6 %). Le peptide contrôle T4Ex5 et le peptide T4ln7v3 ne se lient pas au LPS.

Bien que les peptides T4MD, T4ln7 et T4ln7c ont la même efficacité antagoniste que TLR4 sur les lignées SW480 et RAW 264.7 à 10 et 20 μM (Figures 2A et 3), ces derniers ne montrent pas la même capacité de liaison au LPS. Ces données mettent en évidence qu’il ne s’agit pas du seul mécanisme impliqué dans l’inhibition de la cascade inflammatoire initiée par le LPS.

Exemple 8 :

Afin d’évaluer les propriétés antibactériennes des peptides d’intérêt, des bactéries à Gram négatif - souche Escherichia coli ATCC-25922 (utilisées couramment pour contrôler la qualité des antibiotiques) - ont été mises en contact avec les peptides pendant 24h. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée par la mesure de la densité optique à 625 nm après co-incubation. Concernant le peptide T4MD, une inhibition de la croissance bactérienne est observée avec une CMI évaluée entre 100 et 150 μM . Concernant le peptide T4ln7 et son variant cyclique T4ln7c, une inhibition de la croissance bactérienne est observée avec une CMI évaluée entre 25 et 50 μM . Concernant le peptide contrôle T4Ex5, aucune inhibition significative de la croissance n’est observée aux concentrations testées.

Exemple 9 :

Les différentes lignées cellulaires ont été incubées pendant 10 minutes avec des peptides couplés au fluorochrome Cyanine 3 (Cy3). L’incubation a été réalisée à 37°C afin de mesurer l’internalisation des peptides réalisée de façon indépendante (translocation passive) et dépendante de l’énergie (endocytose). En parallèle, une incubation à 4°C a été réalisée afin de mesurer la part d’internalisation réalisée par les mécanismes indépendants de l’énergie. Le potentiel pénétrant des peptides à différentes concentrations (2,5, 5, 10, 20 μM) a été évalué en quantifiant l’intensité de fluorescence émise par les cellules par cytométrie en flux. Les résultats sont comparés à ceux obtenus avec un peptide pénétrant de référence, le peptide R8.

Tout d’abord, les résultats confirment la capacité des peptides sélectionnés à être internalisés par les différentes lignées cellulaires. L’augmentation du signal fluorescent en fonction de la concentration en peptides appliquée indique une internalisation dose- dépendante, quelle que soit la lignée cellulaire (Figure 9).

A 37°C, peu de différences entre les peptides sont observées à 2,5 μM (Figure 9A). A partir de 5 μM, le peptide T4ln7 se distingue par une internalisation plus importante et ce dans les quatre lignées cellulaires étudiées (Figure 9B, C et D). Une différence significative par rapport au peptide de référence R8 est notamment observée dans les lignées SW480 et HeLa avec la concentration 10 μM et dans la lignée SW480 avec la concentration 20 μM (Figure 9C et D).

Concernant le peptide T4MD, à 2,5 μM, le signal obtenu à 4°C représente en moyenne entre 31 et plus de 100 % du signal obtenu à 37°C, selon la lignée cellulaire. A 5 μM, il représente entre 25 et 57 %. A 10 μM, il représente entre 16 et 30 % du signal et à 20 pM, entre 9 et 21 %.

Concernant le peptide T4ln7, à 2,5 μM, le signal obtenu à 4°C représente en moyenne entre 34 et 87 % du signal obtenu à 37°C, selon la lignée cellulaire. A 5 μM, il représente entre 14 et 69 %. La translocation passive du peptide T4ln7 est plus importante que pour le peptide R8 et T4MD. Cet effet est visible à partir de la concentration 10 μM et est particulièrement marqué à 20 μM . A 10 μM, il représente entre 8 et plus de 100 % du signal et à 20 μM, entre 23 et plus de 100 %.

Exemple 10 :

Les peptides de séquences SEQ ID No : 1 à 8 sont synthétisés au moyen d’un synthétiseur chimique. Ils sont purifiés et formulés dans une solution aqueuse.

Les propriétés de CPP des peptides ont été évaluées et validées pour tous les peptides. Elles sont résumées pour certains peptides dans le tableau ci-dessous :

Tableau A Cette analyse confirme les caractéristiques de CPP des peptides décrits dans l'invention.

Tableau 1

Tableau 2 Tableau 3

Tableau 4 Tableau 5

Le score IEDB (Immune epitope database) reflète la disposition d'un peptide à se lier au CMH. Ces scores indiquent une faible immunogénicité des peptides.