Die regioselektive chemische Umsetzung einer Verbindung mit meh¬ reren auch unterschiedlichen reaktiven chemischen Funktionen er¬ fordert den Schutz aller dieser Funktionen bis auf diejenige(n) , mit der (denen) eine chemische Reaktion eingegangen werden soll. Zum Schutz dieser Funktionen werden Molekülgruppen (Schutzgrup¬ pen) eingeführt. Diese lassen sich im Anschluß schonend und se¬ lektiv unter Zurückbildung der ursprünglichen Funktion abspal¬ ten. Für komplexe und mehrstufige Synthesen, insbesondere von Naturstoffen, wie Oligopeptiden und Oligonucleotiden, sind ver¬ schiedene Typen von Schutzgruppen notwendig. Sie zeichnen sich durch stark unterschiedliche Bedingungen der Abspaltung aus. Ein System von Schutzgruppen, in dem die einzelnen Typen so selektiv spaltbar sind, daß jeweils alle anderen Schutzgruppen unberührt bleiben, wird orthogonal genannt. Der Fachmann ist mit dem Prin¬ zip der Schutzgruppenchemie vertraut. Verwiesen sei auf die im folgenden angeführte Literatur. Weist der Schutzgruppentyp noch eine weitere reaktive Funktion auf, so daß er kovalent und sta¬ bil mit einem Trägermaterial für die Festphasensynthese ver¬ knüpft werden kann, dann spricht der Fachmann von einer "Anker¬ gruppe" oder "Linkergruppe". Ein spezieller Typ von Schutzgruppe liegt dann vor, wenn die Schutzgruppe erst durch eine der Ab¬ spaltung vorgeschaltete chemische Reaktion in eine labile Form

ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26)

gebracht werden muß, die dann in einem zweiten Schritt unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Man spricht in die¬ sem Fall von einer geschützten Schutzgruppe beziehungsweise "sa- fety-catch group" . Obwohl hier zwei Reaktionsschritte zur Ab¬ spaltung notwending sind, kann eine derartige Gruppe doch große Vorteile bieten:

- sie kann sehr stabil gegen viele, auch sehr drastische Reakti¬ onsbedingungen sein, jedoch durch die Folge von zwei spezifi¬ schen, sehr milden Reaktionsschritten abgespalten werden kön¬ nen;

- die labile Zwischenstufe der Schutzgruppe kann stabil genug sein, daß sie gute oder bessere Möglichkeiten zur Isolierung und Reinigung des Endproduktes bietet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Verbindung vor¬ zusehen, mit der sich eine Carboxyl-Funktion (COOH) unter Ausbildung einer Esterbindung umsetzen läßt, wodurch eine Schutzgruppe und insbesondere eine Ankergruppe für die Carboxyl- Funktion vorgesehen werden kann, die folgende Merkmale aufweist:

- die Schutz- beziehungsweise Ankergruppe soll ihrerseits ge¬ schützt sein und sich in eine labile Zwischenstufe überführen lassen;

- die labile Zwischenstufe soll unter vorgegebenen Reaktionsbe¬ dingungen, beispielsweise denen einer Festphasensynthese von Peptiden, stabil sein und eine Reinigung der Zwischenprodukte erlauben;

- die labile Zwischenstufe soll in wässriger physiologischer Pufferlösung, vorzugsweise bei neutralem pH (etwa pH 7) oder nahezu neutralem pH (5 bis 9) , zerfallen und die ursprüngliche Carboxyl-Funktion zurückbilden können, so daß das Synthesepro¬ dukt mit freier Carboxyl-Funktion direkt (ohne weitere Reini¬ gung) in ein zellbiologisches oder biochemisches Testexperi¬ ment einsetzbar ist.

Insbesondere soll dieser Schutzgruppentyp als Ankergruppe für die Festphasensynthese von Peptiden einsetzbar sein, insbeson¬ dere nach der Fmoc/tBu-Methode; vergleiche beispielsweise Fields & Noble in Int. J. Peptide Protein Res., 35 (1990) 161-214.

Erfindungsgemäß wird dazu eine Verbindung der Formel

Y-C(R ₂ ) (R ₃ )-B-X vorgesehen, wobei die Verbindung mit einer Carboxyl-Funktion durch Substituieren der Y-Gruppe unter Ausbildung einer Ester¬ bindung umgesetzt werden kann, wodurch eine Schutzgruppe und insbesondere eine Ankergruppe für die Carboxyl-Funktion vorge¬ sehen wird, wobei Y = HO, Cl, Br oder I,

B = basische Gruppe, die durch X geschützt ist, nur hydroly¬ seempfindliche Acylverbindungen eingeht und entschützt intramo¬ lekular die Hydrolyse der Esterbindung katalysieren kann, X = eine Schutzgruppe für die basische Gruppe B bedeutet und deren Katalysevermögen blockiert,

R2 und R ₃ = beliebige Reste sind, die nicht die Bildung der Esterbindung und deren Hydrolyse beeinträchtigen.

Wie bereits gesagt, ist der Fachmann mit dem Prinzip der Schutz- gruppenchemie vertraut. Zur Erläuterung sei auf folgenden Stand der Technik verwiesen.

Schutzgruppe (Protective Group) : beispielsweise Greene & Wuts, Eds., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., 1991, John Wiley & Sons, NY.

Ankergruppe oder Linkergruppe: beispielsweise Breipohl et al. in Tetrahedron Lett. , 28 (1987) 5651-5654; Guibe et al. in Tetrahe¬ dron Lett. , 30 (1989) 2641-2644.

Geschützte Schutzgruppe (Safety-Catch Group): Patek in Int. J. Peptide Protein Res., 42 (1993) 97-117.

Elektronenziehende Schutzgruppe für eine basische Gruppe, wobei erstere die Basizität der basischen Gruppe herabsetzt: Gross & Meienhofer, Eds., The Peptides, Vol. 3, 1981, Academic Press, NY.; Patek in Int. J. Peptide Protein Res., 42 (1993) 97-117, insbesondere 112.

Die chemische Bindung zwischen Schutzgruppe und Carboxyl-Funk¬ tion soll also eine Esterbindung sein. Diese Esterbindung kann durch Umsetzung der Carboxyl-Funktion mit einer Hydroxyl-Funk¬ tion oder einer Halogen-Funktion der erfindungsgemäßen Verbin-

dung eingeführt werden. Carbonsäureester sind in wässriger Lö¬ sung mehr oder weniger leicht durch Katalyse von Basen hydroly¬ tisch spaltbar. Die Schutzgruppe besitzt daher eine basische Funktion B, welche intramolekular die Hydrolyse der Esterbindung katalysieren kann. Diese basische Funktion B darf selbst keine hydrolysestabilen AcylVerbindungen eingehen, da sonst die zu schützende Carboxylverbindung auf B übertragen werden könnte und somit keine hydrolytische Spaltung eintritt. Diese basische Funktion ist darüberhinaus durch eine Gruppe X geschützt, die die Basizität der Gruppe B soweit herabsetzt, daß eine intra¬ molekular katalysierte Hydrolyse der Esterbindung erst nach Ab¬ spaltung der Gruppe X erfolgen kann. Die Gruppe X ist unter den Bedingungen einer an R_ ansetzenden Synthese stabil.

Das folgende Reaktionsschema soll die Verwendbarkeit der erfin¬ dungsgemäßen Verbindung näher erläutern. Dabei bedeuten: R _l = Rest der zu schützenden Verbindung,

R2 und R3 = Reste der Schutzgruppe, welche nicht an deren Funk¬ tion teilhaben (wenn R ₂ oder R ₃ eine zusätzliche reaktive Funk¬ tion für eine Verknüpfung mit Trägermaterialien aufweisen, bei¬ spielsweise -COOH, -OH, -NH ₂ oder -SH, dann wird die Schutz¬ gruppe als Ankergruppe eingesetzt) , B = basische Funktion und X = Schutzgruppe der basischen Funktion.

(zu schuelzendc Verbindung) (Schutz- oder AnkergrÏ…ppc/Y = HO, Hai)

- H ₂ 0 bzw. - H-Hal

(geschuctzte Verbindung)

- X

+ H ₂ 0

ERSÄTZBLAIT (REGEL 26)

Erfindungsgemäß kann B ein aromatischer stickstoffhaltiger

Fünfring und/oder X eine elektronenziehende Schutzgruppe sein, die die Basizität der basischen Gruppe B stark herabsetzt, und/oder

R ₂ = H, Alkyl oder Aryl, jeweils ohne reaktive Funktion, und/oder

R ₃ = H, Alkyl oder Aryl, jeweils ohne reaktive Funktion; HOOC, wodurch eine Ankergruppe vorgesehen werden kann; oder Alkyl oder Aryl, jeweils durch eine reaktive Funktion substituiert, die HO, H ₂ N, HS oder HOOC sein kann, wodurch eine Ankergruppe vorgesehen werden kann.

Beispielsweise kann B gegebenenfalls im Ring methylsubstituiertes Imidazolyl-yl oder Imidazolyl-yl- methylen, X eine Urethan- oder Alkoxycarbonyl-Schutzgruppe, R ₂ = C ₁ _ ₁₂ -Alkyl oder Phenyl und/oder

R ₃ = C ₁ _ ₁₂ -Alkyl, Phenyl, HOOC-C ₁ _ ₁₂ -alkyl, HOOC-phenyl, H0- C ₁ _ ₁₂ -alkyl, HO-phenyl, H ₂ N-C ₁ _ ₁₂ -alkyl, H ₂ N-phenyl, HS-C- _| __ ₁₂ - alkyl oder HS-phenyl.

Vorzugsweise ist B Imidazol-4-yl-methylen, Imidazol-4-yl, Imidazol-2-yl oder 5-Methylimidazol-4-yl und/oder X tert- Butoxycarbonyl (Boc) .

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Ester von Säuren, die durch Veresterung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung gewinnbar sind. Bei derartigen Säuren kann es sich um Mono-, Di- oder Oligopeptide und deren Derivate handeln.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung schließlich die Verwendung erfindungsgemäßer Verbindungen und Ester bei der Peptidsynthese.

Experimenteller Teil :

Allgemeiner experimenteller Teil : Es wurden folgende analytisch-spektroskopische Apparaturen verwendet.- 'H-NMR/^C-NMR : Bruker Modell AM-300 und WM-400 mit Tetrametylsilan (TMS) als interner Standard.- Signalmultiplizität : s = Singulett, d = dublett, t = Triplett, q - Quartett, ⁿ J _{H H} = magnetische Kopplung über n Bindungen zwischen benachbarten Protonen.- FAB-MS : Kratos MS 50 TC RF mit neutralen Xenonstrahl (8-9 kV) und Finnigan Mat, Mass SWpectrometer 8430 mit 3-Nitrobenzylalkohol als Matrix. Die Proben wurden in DMSO vorgelegt. UN VIS : Carl Zeiss Modell PMQ II in Quarzküvetten mit 10 mm optischer Länge. ε(Dibenzofulven-Piperidin-Addukt MeOH) = 5570. RP-C _lg - HPLC : Analyt. HPLC : Pharmacia/LKB Pump P 3500, Liquid Chromatographie Controller LCC 500 Plus bzw. LKB 2249 Gradient Pump, LKB 2141 Variable Wavelength Monitor, Dreikanalflachbettschreiber auf Mach ery -Nagel Nucleosil 300-7 C ₁₈ 250x4.

Spezieller experimenteller Teil :

2-lH-fS-Methyl-imidazol-4-vn-2-hvdroxyessigsäure (1) : (C ₆ H ₈ N ₂ O ₃ ) 18.25 g (0.17 mol) 4- Methyl-5-lH-imidazolylcarbaldehyd [hergestellt nach Literaturvorschrift: Papadopoulos, E.P., Jarrar, A.und Issidorides, C.H., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 615 (1966)]werden in 80 ml Wasser gelöst und bei 0°C unter Rühren 23.65 g (0.36 mol) Kaliumcyanid, 30 ml konz. Salzsäure (37 %) und 66 ml Acetanhydrid zugesetzt. Es wird 1 h bei 0°C gerührt und weitere 24 h bei RT. Es werden bei RT 15 ml konz. Salzsäure und 66 ml Acetanhydrid zugesetzt und weitere 24 h bei RT gerührt. Nach Zusetzen von 250 ml Wasser und 250 ml konz. Salzsäure wird unter Rückfluß auf 100°C erwärmt. Nach 2 h werden weitere 250 ml konz. Salzsäure zugegeben und 12 h bei 80°C gerührt. Die Lösung wird eingeengt und entweder durch präp. HPLC-Chromatographie auf Latek RP-C ₁₈ HL lOμ 300x40 aufgereinigt (Ausb. 95 % d. Th.) oder (1) nach über das Silbersalz gereinigt [Stewart, C.P., J. Med. Chem. 130 (1923)]. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und in salpetersaurer Lösung mit Sibernitrat gefällt. Nach Filtration der Lösung wird Bariumhydroxid zugesetzt und das Silbersalz von (1) zusammen mit überschüssigen Siberoxid abfiltriert. Das Filtrat wird in Wasser suspendiert und Schwefelwasserstoff eingeleitet. Nach Filtration der Lösung wird überschüssiges Barium durch vorsichtige Zugabe von Schwefelsäure gefällt. Nach erneuter Filtration wird die Lösung eingeengt und (1) durch mehrfache fraktionierende Kristallisation aus wässrigen Ethanol gewonnen.- Ausb. 42 % d. Th.

1H-NMR (400 MHz, D ₂ O) : δ = 8.57 (s, 1H, 2-H), 5.59 (s, 1H, CHOH), 2.33 (s, 3H, CH ₃ ).- ¹³ C-NMR (75 MHz, D ₂ O) : δ = 174.0 (s, COOH), 135.2 (d, C-2), 132.3 (s, C-5), 119.9 (d,

C-4), 65.5 (d, CHOH), 9.5 (q, CH ₃ ).- MS (FAB) : M/Z (3 -NBA) = 157 ([M+H] ^® ).

2-lH-dmidazol-4-vÏ€-2-hvdroxyessigsäure (2) : (C ₅ H ₆ N ₂ O ₃ ) Die Synthese erfolgte analog zu (1) ausgehend von 4-lH-Imidazolcarbaldehyd.[hergestellt nach Literaturvorschrift: Weidenhagen, R. und Herrmann, R., Chem. Ber. 1955 (1953)] Ausb. 92 % d. Th. (RP-C ₁₈ - Chromatographie/Eluent : Wasser / 0.1 %TFA) oder wie unter (lj durch fraktionierende Kristallisation aus Wasser/Ethanol.

1H-NMR (400 MHz, D ₂ 0) : δ = 8.70 (s, 1H, 2-H), 7.51 (s, 1H.4-H), 5.54 (s, 1H, CHOH).- ¹³ C-NMR (75 MHz, D ₂ O) : δ = 173.5 (s, COOH), 135.0 (d, C-2), 131.2 (s, C-5), 117.9 (d, C-4), 65.2 (d, CHOH).- MS (FAB) : M/Z (3 -NBA) = 143 ([M+H] ^® ).

2- lH-(Imidazol-2-vO-2-hvdroxy essigsaure (3) : (C ₅ H ₆ N ₂ O ₃ ) Die Synthese erfolgte analog zu (1) ausgehend von 2-lH-Imidazolcarbaldehyd [kommerziell erhältlich, z.B. Aldrich]. Ausb. 82 % d. Th. (RP-C ₁₈ -Chromatographie Eluent Wasser / 0.1 %TFA).

1H-NMR (400 MHz, D ₂ O) : δ = 7.38 (s, 2H, H-l), 5.69 (1H, s, H-2).- ¹³ C-NMR (75 MHz, D ₂ O) : δ = 171.1 (s, COOH), 144.0 (s, C-2), 120.1 (d, C-4/C-5), 66.2 (d, CHOH).- MS (FAB) : M/Z (3-NBA) = 143 ([M+H] ^® ).

3-lH-(N' ^m -tert-Butoxycarbonyl-imidazol-4-ylV2-hvdroxy-propionsà ¤ure (4) : (C _Ï€ H ₁₆ N ₂ O ₅ ) 248 mg 3-lH-Imidazol-2-hydroxy-propionsäure (1.6 mmol) [kommerziell erhältlich, z.B. Sigma] werden unter Zugabe von 223 μl (1.6 mmol) in 2.5 ml abs. DMF unter Rühren bei 4°C suspendiert und 344 μl (2.4 mmol) tert-Butoxycarbonylazid zugegeben. Es wird 2 d bei 4°C gerührt und die Lösung bei 40°C am Rotationsverdampfer- vollständig eingeengt. Der Rückstand wird in abs. Dioxan gelöst und der entstehende kristalline Niederschlag abfiltriert. Lyophilisation im HV ergibt einen farblosen, zähen Sirup. 356 mg (1.4 mmol), Ausb. 87 % d. Th.

- 9 -

Boc H

H N

1H-NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 8.15 (d, IH, 2-H, ⁴ J _H , _H ^{= 25 Hz} )> ⁷ - ²⁷ ( ^s > ^1H > ⁴ - ^H )> ⁴ - ³⁹ (t, IH, CHOH, ³ J _H ,H ⁼⁴ - ^{5 Hz} ) _> ³ - ¹⁴ (AB-dd, IH, -CH ₂ -, ^'2 J _{H H} =14.8 Hz, ³ J _H(H = ⁴ 0 Hz), 3.02 (AB-dd, IH, -CH ₂ -, ² J _H , _H ⁼¹⁴ - ⁸ Hz. ^3J H,H ⁼⁵ -° ^Hz λ ⁵⁷ ( ^s > ^9H > ^CH 3)-" ¹³ C-NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 176.1 (s,COOH), 146.3 (s, N-COO-), 136.8 (d, C-2), 135.9 (s, C-5), 116.1 (d, C-4), 86.4 (s, C(CH ₃ ) ₃ ), 68.5 (d, CHOH), 67.0 (t, -CH ₂ -), 27.8 (q, CH ₃ ).- MS (FAB, DCHA- Derivat) : M/Z (3-NBA) = 295 ([M+K] ^® ), 279 ([M+Na] ^® ), 257 ([M+H] ^® ), 201 ([M-57] ^® , - tBu), 182 ([DCHA+H] ^® ).

2-lH-fN ^ιm -tert-Butoxycarbonyl-imidazol-4-vO-2-hvdroxy-essigsäu re (5) : (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₅ ) Die Synthese erfolgte analog zu (4) ausgehend von (2). Ausb. 52 % d. Th.

Boc H

R2 H

R ₃ COOH

B Imidazol-4-yl- X tert-Butoxycarbonyl- (Boc) H COOH

1H-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 8.15 (s, IH, 2-H), 7.27 (s, IH, 4-H), 5.14 (s, IH, CHOH), 1.58 (s, 9H, CH ₃ ).- ¹³ C-NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 176.1 (s,COOH), 146.3 (s, N-COO-), 136.8 (d, C-2), 135.9 (s, C-5), 116.1 (d, C-4), 86.4 (s, C(CH ₃ ) ₃ ), 66.5 (d, CHOH), 27.8 (q, CH ₃ ).

2-lH-CN' ^m -tert-Butoxycarbonyl-5-methyl-imidazol-4-ylV2-hvdroxy- essigsäure (6) (C _n H ₁₆ N ₂ O ₅ ) Die Synthese erfolgte analog zu (4) ausgehend von (1) durch Umsetzung mit Pyrokohlensäure-di-tert-butylester oder tert-Butoxycabonylazid in DMF. 273 mg (1.1 mmol) Ausb. 67 % d. Th. (weißes Lyophilisat aus Dioxan).

1H-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 8.15 (s, IH, 2-H), 5.14 (s, IH, CHOH), 2.46 (s, 3H, CH ₃ ), 1.58 (s, 9H, CH ₃ ).- ¹³ C-NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 174.6 (s, COOH), 147.1 (s, N-COO-), 137.0 (d, C-2), 136.2 (s, C-5), 127.2 (s, C-4), 86.4 (s, C(CH ₃ ) ₃ ), 66.5 (d, CHOH), 27.8 (q, CH ₃ ).- MS (FAB) : M/Z (3-NBA) = 279 ([M+Na] ^® ), 257 ([M+H]®), 201 ([M-57+H] ^® , tBu).

- f 0 -

2-lH-(N' ^m -tert-Butoxycarbonyl-imidazol-2-ylV2-hvdroxy-essigsäu re (7 : (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₅ ) Die Synthese erfolgte analog zu (4) ausgehend von (3) durch Umsetzung mit Pyrokohlensäure-di- tert-butylester in DMF. Ausb. 51 % d. Th.- 1H-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 8.62 (s, IH, 4-H), 7.27 (s, IH, 5-H), 5.56 (s, IH, CHOH), 1.58 (s, 9H, CH ₃ ).

3-lH-(Imidazol-4-vπ-2-(phenylalanyl-phenylalanyl-glvcylo xy)-propionyl-ß-alanin (8a):

(C ₂₉ H ₃₄ N ₆ O ₇ )

MS (FAB) : M/Z (3-NBA) = 712 ([M+Cs+H] ^® ), 579 ([M+H] ^® ).

[Σ-lH-CS-Methyl-imidazol^-vπ-Σ-fphenylalanyl-phenylala nyl-glvcyloxy^l-acetyl-ß-alaninCgaV

(C ₂₉ H ₃₄ N ₆ O ₇ )

MS (FAB) : M/Z (3-NBA) = 712 ([M+Cs+H] ^® ), 579 ([M+H] ^® ).

f2-lH-Imidazol-4-yl-2- ^('p henylalanyl-phenylalanyl-glvcyloxy ^' )l-acetyl-ß-alaninyl-carrie_fl0b :

ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26)

[Phenylalanyl-phenylalanyl-glycyloxy)l-acetyl-ß-alanin (lla)

ERSATZBLAH (REGEL 26)

Das Schutzgruppenkonzept wurde am Beispiel der oben aufgeführten Verbindungen mit B = lH-Imidazolyl und X = tert-Butyloxycarbonyl sowohl in Lösung als auch gebunden an einen festen Papierträger (Whatman 3MM) mit Hinblick auf die spezielle Verwendung als orthogonale Ankergruppe für die Festphasenpeptidsynthese überprüft.

Test in Lösung

Die Verbindungen (8) und (9) wurden an einen p-Benzyloxybenzyl-derivatisierten Polystyrol- Harz ('Wang-Harz' der Firma Novabioche ) synthetisiert. Dazu wurde N^-9- Fluorenylmethoxycarbonyl-ß-alanin an das Harz durch Aktivierung der Carboxylfunktion mit Mesitylensulfonyl-3-nitro-1.2.4-triazol (MSNT) unter Katalyse von N-Methylimidazol (Melm) in DCM verestert [Blankemeyer-Menge, B. und Frank, R., Tetrahedron Lett, 3J,, 1701 (1990)]. Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe mit einem Ãœberschuß an 20% Piperidin in DMF wurde (4) bzw. (6) durch N.N-Diisopropylcarbodiimid (DIC) (1.2 eq.) / Hydroxybenzotriazol (HOBt) (2.0 eq.)-Aktivierung der Carboxyl-Funktion in DMF an die gebundene H-ßAlanin- Einheit gekoppelt. Die schrittweise Synthese des Tripeptides H-Phe-Phe-Gly- begann mit der MSNT/Melm-aktivierten Veresterung des N ^α -Fmoc-Gly-OH an die Ankergruppe. Im weiteren wurde nach üblichen Peptidsynthesebedingungen unter Aktivierung von DIC HOBt nach der N ^α -Fmoc/tBu-Strategie verfahren [Fields, G.B. and Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res. 35. 161-214 (1990)]. Alle Kopplungsschritte verliefen unter nahezu quantitativer Ausbeute (UV/VIS-Analytik des Dibenzofulven/Piperidin-Adduktes). Die Verbindungen (8a) und (9a) wurden vom festen Träger mit Trifluoressigsäure (TFA)/ Dichlormethan(DCM) (1:1) (2.5 % Triisobutylsilan (TIBS), 2.5 % Wasser) abgespalten und RP-C ₁₈ -chromatographisch aufgereinigt. Dabei wird gleichzeitig die Imidazolylschutzgruppe X = Boc abgespalten. Als direkten Vergleich zu den hier speziell beschriebenen Ankergruppen wurde die Verbindung H-Phe-Phe-Gly-O-Glycolsäure-ßAla-OH (Ha) nach dem oben beschriebenen Verfahren an fester Phase synthetisiert, wie oben abgespalten und durch RP-C ₁₈ -HPLC aufgereinigt. Die am Imidazolyl-Rest (B) entschützten, jetzt labil geschützten Verbindungen (8a), (9a) sowie die Vergleichssubstanz (Ha) wurden in Lösung auf die Labilität der Esterbindung gegenüber den unten aufgeführten wässrigen Puffern untersucht. Tabelle 1 gibt die Ergebnisse wieder.

Verwendete Puffer :

(a) NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ /0.1M/pH 7.0/H ₂ O

(b) NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ /0.1M/pH 7.5/H ₂ O

(c) NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ /0.01M/pH 7.0/H ₂ O

(d) NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ /0.01M/pH 7.5/H ₂ O

(e) Na ₃ BO ₄ /H ₃ BO ₄ /0.05 M/pH 7.6/H ₂ O

(f) Na ₃ BO ₄ /H ₃ BO ₄ /0.05 M/pH 8.0/H ₂ O

(g) tris-Hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris.HCl)/0.01 M/pH 7.6/H ₂ O (h) tris-Hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris.HCl)/0.01 M/pH 8.0 H ₂ O (i) NaHCO ₃ /Na ₂ CO ₃ /0.05 M/pH 9.6 /H ₂ O

Ö) NaHCO ₃ /Na ₂ CO ₃ /0.05 M/pH 10.0 /H ₂ O

(k) DMF/Wasser = 1:9 (pH 7.0)

(1) Triethylam oniumacetat (TEAAc)/0.01 M/pH 7.0/H ₂ O

ERSATZBUiTT (REGEL 26)

Tabelle 1 : Reaktionsfortschritt der Esterhydrolyse [%] von (8) und (9) im Vergleich zu (H) in verschiedenen Puffern bei 25°C und 50 °C; (-) = nicht bestimmt, * = 50°C.

Test am polymeren Träger

Die analogen, polymergebundenen Verbindungen zu (8a"). (9a) und (Ha wurden wie oben aber auf Papierrundfiltern (Whatman 3MM synthetisiert). Die Behandlung mit TFA/DCM (2.5 % TIBS, 2.5 % H ₂ O) spaltet in diesem speziellen Fall nur die Imidazolylschutz-gruppe X = Boc ab, berührt jedoch die Esterbindung zwischen C-terminalen Carboxylfunktion und dem festen Träger nicht (polymergebundene Verbindungen werden im weiteren mit einem b gekennzeichnet). Zusätzlich zu (8b). (9b) und (11b) wurde eine an die feste Phase gebundene Verbindung (10b) mit dem Ankermolekül (5) synthetisiert. Nach Abspalten der Schutzgruppe X vom polymergebundenen (8b)-(10b) wird der Filter 2 x 5 min mit dem Abspaltreagenz, 3 x 10 min mit 1 % HC1 in Methanol/Wasser (1:1) und 3 x 10 min mit 1 M Essigsäure/Wasser gewaschen und im HV 12 h getrocknet. In den Waschlösungen ist kein Tripeptid H-Phe-Phe-Gly-OH nachzuweisen.

Die am Imidazolyl-Rest entschützten Verbindungen (8a). (9a) sowie die Vergleichssubstanz (11a) wurden in Lösung auf die Labilität der Esterbindung gegenüber den unten aufgeführten wässrigen Puffern untersucht. Tabelle 1 gibt die Ergebnisse wieder.

Tabelle 2 : Abspaltung des Tripeptides H-Phe-Phe-Gly-OH von den festphasengebundenen Verbindungen (8b)-(llb) in verschieden Puffern bei 50°C über 12 h. Die Meßfehler sind mit einem Fehler von ca. 20 % behaftet.

Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die mit X geschützte Schutzgruppe unter den basischen Reaktionsbedingungen (z.B.

20 % Piperidin in DMF) der Synthese von R, stabil ist daß die Esterbindung der Schutzgruppe an die Carboxylverbindung unter sauren wäßrigen

Bedingungen stabil ist und die entsprechend geschützten Verbindungen gereinigt werden können daß die basische Funktion des Typs von Schutz- bzw. Ankergruppe zu einer drastisch erhöhten Hydrolyserate im Vergleich zu den nicht substituierten Glycolsäurederivaten führt. daß eine Abspaltung der Schutzgruppe (ohne X) auch unter neutralen

Reaktionsbedingungen (pH = 7) möglich ist.

3-lH-(N ^irÏ€ -tert-ButσχvcarboÏ€yl-imidazol-4-yl)-2-bromo-propion säure (12) : (C _u H ₁₅ BrN ₂ 0 ₄ ) Die Synthese erfolgte analog zu (4) ausgehend von 3-lH-Imidazol-4-yl-2-bromo-propionsäure (z.B. kommerziell erhältlich bei Sigma). Ausb. 67 % d. Th.

und Hydroxylfunktion (-OH) ersetzt durch Brom-Funktion (-Br)

1H-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 8.15 (s, IH, 2-H), 7.27 (s, IH, 4-H), 5.55 (s, IH, CHBr), 1.58 (s, 9H, CH ₃ ).- ¹³ C-NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) : δ = 176.1 (s,COOH), 146.3 (s, N-COO-), 136.8 (d, C-2), 135.9 (s, C-5), 116.1 (d, C-4), 86.4 (s, C(CH ₃ ) ₃ ), 73.5 (d, CHOH), 27.8 (q, CH ₃ ).

Verwendete Abkürzungen :