La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, y se refiere a compuestos para el tratamiento del astrocitoma de alto grado. También se proporcionan composiciones de estos compuestos y preparaciones combinadas, junto con otros principios activos.

ESTADO DEL ARTE

El splicing es el proceso por el cual las regiones codificantes y no codificantes de un gen se reestructuran y reorganizan para generar una variedad de transcritos de ARN, lo que determina la aparición de diferentes variantes e isoformas de proteínas que, en muchos casos, ejercen funciones biológicas distintas e incluso opuestas. La alteración de la maquinaria que lo lleva a cabo puede llevar a la generación de variantes de splicing aberrantes, las cuales se han relacionado con el desarrollo y/o progresión de diversas enfermedades, entre las que se encuentra el cáncer.

En concreto, la importancia del spliceosoma en la fisiopatología de las enfermedades metabólicas y el cáncer se ha puesto de manifiesto recientemente debido a su versatilidad en la generación de variantes de splicing alternativo aberrantes.

Las variantes de splicing aberrantes se han asociado directamente con el desarrollo y la progresión de tumores producto de una alteración del proceso de splicing y el control de calidad del ARNm. En este sentido, estudios recientes indican que la maquinaria celular que controla el proceso de splicing también conocida como spliceosoma, se encuentra alterada en diferentes tipos de tumores dando lugar a este splicing aberrante que da lugar a variantes de diferentes genes (GFAP3, VEGF4, TP535, BCL2L16, etc) con diferentes implicaciones oncogénicas. Esta alteración es causada principalmente por la presencia, alteración o pérdida de componentes relevantes de esta maquinaria molecular clave que se encarga de procesar adecuadamente el pre-ARNm para obtener ARNm maduro que regule la fisiología celular. Recientemente, varios componentes del spliceosoma, como el factor de splicing SRSF3, se han identificado como inductores oncogénicos en la fisiopatología de los tumores cerebrales. Los tumores cerebrales malignos son los tumores más letales en pacientes menores de 40 años y no tienen una tasa de supervivencia superior a 14 meses después del diagnóstico. En particular, los glioblastomas, el tumor cerebral más agresivo, no tiene un tratamiento antitumoral eficaz provocando la mayor pérdida de pacientes en comparación con otros tipos de cáncer más prevalentes, pero menos mortales. Además, este tipo de tumores poseen una alta tasa de recurrencia posquirúrgica y resistencia al tratamiento. Por lo tanto, seguir explorando el spliceosoma como una fuente de moléculas susceptibles de ser dianas de nuevos fármacos, podría significar un enfoque novedoso para abordar los tumores cerebrales malignos, manteniéndonos alejados de las dianas farmacológicas estándares ineficaces que se utilizan actualmente contra el glioblastoma. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. SF3B1 está mutado y sobreexpresado notablemente en muestras de GBM humano en comparación con muestras de cerebro no tumorales. (a) Mutaciones somáticas de IDH1, TP53, ATRX, PTEN, IDH2 y SF3B1 en muestras de glioma (n = 284) del conjunto de datos CGGA. (b) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para pacientes con glioma con SF3B1 mutado y de tipo wild-type del conjunto de datos CGGA (prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon, p = 0,0934 +). (c) Niveles de ARNm de SF3B1 en muestras de control y glioblastoma (GBM) en nuestra cohorte de pacientes y en la cohorte externa de Rembrandt (d). (e) Fleatmap no jerárquico generado comparando los niveles de expresión de SF3B1 en tejidos cerebrales de control y/o muestras de GBM utilizando nuestra cohorte, cohortes de Rembrandt y CGGA. (f) Curva de característica operativa del recepto (ROC): análisis de la curva de la expresión de SF3B1 utilizando muestras de control y GBM de nuestra cohorte y las cohortes externas de Rembrandt. Caracterización a nivel de célula individual de SF3B1 a través de poblaciones de células humanas intratumorales: [(g) Análisis de componentes principales que discrimina las células del microambiente tumoral (TME) de las células de tipo tumoral del conjunto de datos de una sola célula (h) Distribución de la expresión de SF3B1 en un grupo distintivo de Aproximación y Proyección de Manifold Uniforme (UMAP, en inglés) (panel izquierdo: coincidencia de grupos UMAP con subtipos de células intratumorales; panel derecho: gráfico de características UMAP que muestra la expresión de SF3B1). (i) Expresión de SF3B1 a través de diferentes subtipos de células intratumorales identificados (j) Células de glioblastoma clasificadas por programas transcripcionales en representación bidimensional utilizando la puntuación relativa del metamódulo [log2 (| SC1-SC2 | +1)]. Cada cuadrante corresponde a un estado celular (k) Expresión de SF3B1 a través de diferentes programas transcripcionales de células GBM] Correlación de SF3B1 con diferentes biomarcadores de pronóstico clave (I) y componentes de spliceosoma relevantes (m) en muestras de GBM de cohortes CGGA (panel superior) y Rembrandt (panel inferior), con muestras no tumorales para el conjunto de datos de Rembrandt

Figura 2. Sf3b1 se sobreexpresa en diferentes modelos de ratón con glioma. (a) Generación de modelos de ratón de glioblastoma (GBM) mediante inyección de mezcla de ADN plasmídico en el ventrículo lateral izquierdo después de la electroporación del cerebro de ratón (EP) (adaptado Breunig et al., 2016). (b) niveles de expresión de ARNm y, (c) análisis de la curva ROC de Sf3b1 en las muestras control y tumorales del modelo de ratón electroporado. (d) Correlación de Sf3b1 con diferentes biomarcadores de pronóstico clave y componentes de spliceosoma relevantes en muestras de GBM de estos modelos.

Figura 3. La sobreexpresión de SF3B1 se asocia con una baja tasa de supervivencia. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de pacientes con glioblastoma (GBM) dividiendo los pacientes según sean sus niveles de expresión de SF3B1 altos o bajos en nuestra cohorte (a), así como en los conjuntos de datos de Rembrandt (b) y CGGA (c).

Figura 4. La inhibición farmacológica de SF3B1 con pladienolide-b in vitro disminuye los parámetros funcionales críticos de agresividad y los marcadores clave de desarrollo/ progresión/agresividad tumoral en células de glioblastoma (GBM) en comparación con las condiciones de control (a) Representación esquemática del efecto del inhibidor de SF3B1, pladienolide-b. Tasa de proliferación en respuesta a la administración de pladienolide-b en líneas celulares humanas de GBM (U-87 MG y U-118 MG; n = 5) (b), en células de GBM primarias derivadas de pacientes (n = 6) (c), y en cultivo de células cerebrales primarias no tumorales (n = 3) (d). (e) Tasa de migración después de la administración de pladienolide-b en células U-118 MG (también se incluyen imágenes representativas de la capacidad de migración; n = 5). (f) Ensayo de formación de tumoresferas que muestra el área de la esfera y el número de tumorosferas por pocilio en respuesta a la administración de pladienolide-b en células U-87 MG y U-118 MG (n = 3; también se incluyen imágenes representativas de la formación de tumorosferas). (g) Secreción de VEGF en respuesta a pladienolide-b en células U-87 MG y U- 118 MG (n = 3). (h) T asa de apoptosis después de la administración de pladienolide-b en células U-87 MG y U-118 MG (n = 3). (i) Niveles de proteína de caspasa 3 degradada después de 24h de incubación con pladienolide-b determinados por Western blot (n = 3). (j) Resumen del efecto de pladienolide-b a través de los diferentes parámetros funcionales mencionados anteriormente. Expresión de diferentes marcadores de progresión tumoral después del tratamiento con pladienolide-b en las dos líneas celulares GBM (k) y células GBM primarias derivadas del paciente (I). Expresión de diferentes biomarcadores oncogénicos de componentes del spliceosoma después del tratamiento con pladienolide-b en las dos líneas celulares GBM (m) y en células GBM primarias derivadas de pacientes (n).

Figura 5. La inhibición farmacológica in vivo de SF3B1 con pladienolide-b altera la progresión y vascularización del glioblastoma (GBM). (a) Generación de un modelo de GBM de xenoinjerto preclínico mediante inoculación de células U-87 MG (n = 6). Volumen promedio del tumor (b) y peso (c) tras la inyección de pladienolide-b intratumoralmente frente a los tumores tratados con el control. La flecha verde en (b) indica el momento del tratamiento correspondiente (inyección intratumoral con pladienolide-b o control) (d) Las imágenes de cada tumor en el momento del sacrificio se muestran individualmente (e) Imágenes de Micro-CT 2D y 3D de un modelo de GBM de xenoinjerto preclínico representativo (f) Número de mitosis (x10 HPF; panel izquierdo) e imágenes representativas de tinción H&E (panel derecho) que comparan la inyección intratumoral de pladienolide-b frente a muestras tumorales tratadas con el control (g) Evaluación de la proliferación vascular e imágenes representativas de la tinción H&E (panel izquierdo) así como evaluación de la necrosis tumoral e imágenes representativas de la tinción H&E (panel derecho) de la inyección intratumoral de pladienolide-b frente a las muestras de tumor tratadas con control. Todas estas evaluaciones fueron determinadas por patólogos experimentados. Expresión de diferentes marcadores de progresión tumoral (h) y biomarcadores de componentes de spliceosoma oncogénico (i) después del tratamiento con pladienolide-b en el modelo GBM preclínico con xenoinjerto.

Figura 6. El bloqueo farmacológico de SF3B1 revela las vías de señalización de AKT-mTOR y b-catenina y el splicing alternativo de BCL2L1 como los principales impulsores de los efectos antitumorales de pladienolide-b en glioblastomas (GBM). (a) Heatmap que muestra el nivel de proteína fosforilada y (b) los niveles de proteína total de varios componentes de las vías AKT/mTOR y b-catenina en células de GBM (U-87 MG y U-118 MG) después de la administración de pladienolide-b. (c) Imágenes de resultados de Western blot mostradas en (a) y (b). (d) Diagrama de las vías de AKT-MTOR y b-catenina que muestra los componentes /procesos regulados a la baja (en rojo) y regulados al alza (en verde) después de la administración de pladienolide-b identificados en este trabajo. Niveles de ARNm de CCND1 (e) y MYC (f) como criterios de valoración de las vías de AKT/mTOR y b-catenina en células GBM (U-87 MG y U-118 MG), células de GBM primarias derivadas de pacientes y en un modelo preclínico de GBM después de la administración de pladienolide-b. (g) Variantes de splicing de BCL2L1 producidas por un evento de splicing en el sitio de splicing 5 'alternativo (5 ^' SS) y asociadas con la vía de apoptosis y muerte celular (h) Relación BCL2L1-xS / BCL2L1-xL determinada por qPCR en líneas celulares de GBM (U-87 MG y U-118 MG), en el modelo GBM preclínico y en células de GBM primarias derivadas de pacientes en respuesta a tratamiento con pladienolide-b. (i) Relación BCL2L1-xS / BCL2L1-xL determinada por qPCR en cultivo de células cerebrales primarias no tumorales después de la administración de pladienolide-b. PSI del evento BCL2L1 5 ^' SS en líneas celulares de GBM (U-87 MG y U-118 MG) (j), en células de GBM primarias derivadas del paciente (k) y en el modelo GBM preclínico con xenoinjerto (I) en respuesta al tratamiento pladienolide-b.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La subunidad 1 del factor de splicing 3B (SF3B1) es un componente central esencial del spliceosoma siendo la subunidad más grande del complejo SF3B. SF3B1 junto con el factor de splicing 3a, U2AF y un ARN 12S constituyen el complejo de ribonucleoproteína de núcleo pequeño U2 (complejo U2-snRNP) que se une al preARNm aguas arriba del sitio de ramificación del intrón, siendo un paso clave en la formación y funcionalidad del núcleo de splicing. Asimismo, este componente del spliceosoma es esencial en el compljo formado conjunto con U12 siendo crucial en ambas maquinarias de splicing, el spliceosoma mayor y menor. SF3B1 es uno de los varios componentes del spliceosoma cuyo gen se ha identificado mutado con frecuencia en numerosos tipos de cáncer tales como síndrome mielodisplásico, cáncer de mama, prolactinomas, melanoma uveal y adenocarcinoma ductal pancreático.

Sin embargo, la implicación oncogénica de este componente del spliceosoma, sus mutaciones somáticas y su perfil de expresión, no se han caracterizado en glioblastomas ni su asociación con características moleculares y parámetros clínicos.

Tal y como se muestra en los ejemplos de la presente invención, el factor de splicing SF3B1 está notablemente mutado y ampliamente sobreexpresado en muestras de glioblastoma en comparación con muestras no tumorales en diferentes modelos de glioblastoma (véase figura 1 y 2) y está asociado con características moleculares/ clínicas como la supervivencia del paciente (Figura 3).

En concreto, los autores de la presente invención evaluaron las acciones antitumorales utilizando un inhibidor específico de SF3B1 , pladienolide B, que impide el ensamblaje del spliceosoma. El efecto del pladienolide B, redujo varios parámetros funcionales in vivo e in vitro a través de la modulación de las vías de señalización y el desequilibrio de eventos de splicing específicos (Figura 4-5). En concreto, el bloqueo de SF3B1 ejerce efectos antitumorales a través de un mecanismo molecular que involucra vías de señalización de supervivencia (es decir, mTOR/b- catenin/Cell-death) que involucran a su vez, la distinta alteración de los factores de splicing oncogénicos como SRSF1 y el desequilibrio de las variantes splicing de Bcl-x dando como resultado una disminución en la agresividad y progresión del tumor (Figura 6).

Estos resultados ponen de manifiesto que el gen SF3B1 sirve como biomarcador de diagnóstico y pronóstico y es, simultáneamente, una nueva diana farmacológica para un mejor abordaje de los glioblastomas mejorando el manejo del paciente.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un agente modulador de la actividad de SF3B1 , de ahora en adelante agente modulador de la invención, para la prevención, mejora, alivio o tratamiento del astrocitoma/glioma de alto grado.

En esta memoria se entiende por SF3B1 , también denominado Splicing Factor 3b Subunit 1, SF3b155, SAP155, Splicing Factor 3b, Subunit 1, 155kDa, Spliceosome-Associated Protein 155, Splicing Factor 3B Subunit 1, Hsh155, PRPF10, Pre-MRNA Splicing Factor SF3b, 155 KDa Subunit, Pre-MRNA-Splicing Factor SF3b 155 KDa Subunit, Splicing Factor 3b, Subunit 1 , 155kD, Pre-MRNA Processing 10, SAP 155, PRP10, SF3B1, Prp10, MDS. Este gen codifica la subunidad 1 del complejo proteico del factor de splicing 3b. El factor de splicing 3b, junto con el factor de splicing 3a y una unidad de ARN 12S, forman el complejo de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas U2 (U2 snRNP). El complejo del factor de splicing 3b / 3a se une al pre-ARNm aguas arriba del sitio de ramificación del intrón de una manera independiente de la secuencia y puede anclar el componente U2 snRNP al pre-ARNm. El factor de splicing 3b también es un componente del spliceosoma menor de tipo U12. Los dos tercios carboxi-terminales de la subunidad 1 tienen 22 repeticiones HEAT en tándem no idénticas que forman estructuras helicoidales. El splicing alternativo da como resultado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas.

En el contexto de la presente invención, SF3B1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína SF3B1, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SF3B1. Preferiblemente, es la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 1

MAKIAKTHEDIEAQIREIQGKKAALDEAQGVGLDSTGYYDQEIYGGSDSRFAGYVTS IAATELEDDDDDYSSSTSLLGQK

KPGYHAPVALLNDIPQSTEQYDPFAEHRPPKIADREDEYKKHRRTMIISPERLDPFA DGGKTPDPKMNARTYMDVMRE

QHLTKEEREIRQQLAEKAKAGELKVVNGAAASQPPSKRKRRWDQTADQTPGATPKKL SSWDQAETPGHTPSLRWDE

TPGRAKGSETPGATPGSKIWDPTPSHTPAGAATPGRGDTPGHATPGHGGATSSARKN RWDETPKTERDTPGHGSG

WAETPRTDRGGDSIGETPTPGASKRKSRWDETPASQMGGSTPVLTPGKTPIGTPAMN MATPTPGHIMSMTPEQLQA

WRWEREIDERNRPLSDEELDAMFPEGYKVLPPPAGYVPIRTPARKLTATPTPLGGMT GFHMQTEDRTMKSVNDQPS

GNLPFLKPDDIQYFDKLLVDVDESTLSPEEQKERKIMKLLLKIKNGTPPMRKAALRQ ITDKAREFGAGPLFNQILPLLMSP

TLEDQERHLLVKVIDRILYKLDDLVRPYVHKILVVIEPLUDEDYYARVEGREIISNL AKAAGLATMISTMRPDIDNMDEYV

RNTTARAFAVVASALGIPSLLPFLKAVCKSKKSWQARHTGIKIVQQIAILMGCAILP HLRSLVEIIEHGLVDEQQKVRTISA

LAIAALAEAATPYGI ESFDSVLKPLWKGIRQFI RGKGLAAFLKAIGYLIPLMDAEYANYYTREVMLILIREFQ.SPDEEMKKIV

LKVVKQCCGTDGVEANYIKTEILPPFFKHFWQHRMALDRRNYRQLVDTTVELANKVG AAEIISRIVDDLKDEAEQYRKM

VMETIEKIMGNLGAADIDHKLEEQUDGILYAFQEQTTEDSVMLNGFGTVVNALGKRV KPYLPQICGTVLWRLNNKSAK

VRQQAADLISRTAVVMKTCQEEKLMGHLGVVLYEYLGEEYPEVLGSILGALKAIVNV IGMHKMTPPIKDLLPRLTPILKN

RHEKVQENCIDLVGRIADRGAEYVSAREWMRICFELLELLKAHKKAIRRATVNTFGY IAKAIGPHDVLATLLNNLKVQER

QNRVCTTVAIAIVAETCSPFTVLPALMNEYRVPELNVQNGVLKSLSFLFEYIGEMGK DYIYAVTPLLEDALMDRDLVHRQ TASAVVQHMSLGVYGFGCEDSLNHLLNYVWPNVFETSPHVIQAVMGALEGLRVAIGPCRM LQYCLQGLFHPARKVR DVYWKIYNSIYIGSQDALIAHYPRIYNDDKNTYIRYELDYIL

SEQ ID NO: 2

AGTT CCGT CT GT GT GTT CG AGTGG ACAAAAT G GCG AAG AT CGCCAAG ACT CACG AAG AT ATT G AAGC ACAG ATT C

GAGAAATTCAAGGCAAGAAGGCAGCTCTTGATGAAGCTCAAGGAGTGGGCCTCGATT CTACAGGTTATTATGACC

AGGAAATTTATGGTGGAAGTGACAGCAGATTTGCTGGATACGTGACATCAATTGCTG CAACTGAACTTGAAGATG

ATGACGATGACTATTCATCATCTACGAGTTTGCTTGGTCAGAAGAAGCCAGGATATC ATGCCCCTGTGGCATTGCT

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TCTTGAAGGCTATTGGGTATCTTATTCCTCTTATGGATGCAGAATATGCCAACTACT ATACTAGAGAAGTGATGTTA

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AA AATT CT G C A AG C AG C ATT AGTATATAACTACT ACT GTAAGT A AA ACT G CCT ATT G AC ACTTT AG G AGTTCCTG CT TCAGAAGCTTAGTTAAGAAACAGCTTGTGGCCGGGTGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCC AGCACTTTGGGAGGC TGAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACGCGGTGAAGTC CCGTCTACTAAAAA TACAAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTAGGGAGGCTGA GGCAGGAGAATGGC TTGAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATAGCGCTGCTACACTCCAGCCTGG GCGACAGAGACTCC GT CT CAAAAAAAAAAAAAAAATTG ACTTT C AAC AAATTG AT AGTG AGC ATT AAGGGTTTCCAAGTTGG ATTT GT AA CTCCT CAT C ATT CCTT GT ATG ACAACTTT CTG AAT AT AT GT C ACT AT GT AGT AAAATT AAAC ACTCCAAACT CAT CTTT CT GTT GTT AG AAGTTTT CAGCG GT ACTTCCATGC AACTTT AAAT CT CACTGCT CT CT AT GGTTG AT GT C AAAT G ACCT T C AGT AATG ACTG AG AATTG AAT ACAAAT AG ATT AC AAAGCCAAAATTTG AT GTT AAATG ACT CAGG AAATTTT AG TTGT ATTTT C AATT C A AGT ACTT AGT AG CCT ACGTTT G CTT G G CCTCTG GTT CTTT AT G G A AA AT AG G CTTT GTAGTG GCATTGTGGAGCAAAGGAGACTGTTACACCTTAATTAACTTTTTTTACTGATGCAAATAA TTTGAGGATAGAGAGG AGGGAAGTAGTGAAAGCTATGACCTAAAACATTGGGACCAAATAGAGGCTCACAGATATT TGGATTATTTTATGT GCTTATTATTAAATAAGGAAAGCATTTTGTGATATGTGGAAGACGCTATGTGAAGTTTTA CCTATCTTCTCAAAGAC CTTTT CTTTT GT ATTTT CTTTT G GT GTTT CTT A A AG CC A AACA AAG AA AT GTT CTT AAG G AG AC AG G GT G GGTTTTT C TGTGGGCCTTTGTTGGTTTTTCTGTGGGCCATCGCCCTCTAATGGAATTGATCTCTGGCT GTTTGATTTTTTTCATAT T GT ATTTTT AAAATTT GTT GT ACAGTGCCCT GT G AGCACCAAGT ACC ACT AG ATG AAT AAAACGT ATT AT AT CT AAA

El término "que modula la actividad" como se usa aquí, se refiere principalmente a que inhibe (disminuye) el nivel de actividad de SF3B1. La actividad de SF3B1 puede ser modulada por la modificación de los niveles y/o de la actividad de SF3B1 , o por la modificación de los niveles a los que se transcriben el gen que codifica SF3B1 tal que los niveles de actividad de la proteína SF3B1 en la célula es modulada. Los agentes moduladores pueden ser tanto agonistas (sustancias que son capaces de unirse a un receptor y provocar una respuesta en la célula, preferiblemente una disminución de la actividad de SF3B1) como antagonistas (sustancias que no solamente no activan el receptor, sino que bloquean su activación por los agonistas). En el contexto de la presente invención, la inhibición directa es la forma preferida de modulación.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agente modulador de la invención se selecciona de una lista que consiste en: a) una molécula orgánica, b) una molécula de ARN, c) un oligonucleótido antisentido, d) un anticuerpo, o e) una ribozima. o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agente modulador de SF3B1 de la invención es una molécula orgánica que se selecciona de la lista que consiste en WNT-C59, Rapamycin, IWP-2, Pilaralisib, Staurosporine, Dactolisib, GSK1904529A, Alpelisib, Crizotinib, CZC24832, Foretinib, PRIMA-1MET, PDGFRVinorelbine, Cediranib, Docetaxel, PDGFRB, Paclitaxel, ML323, TTK_3146, MK-2206, AICA, GSK2606414Flavopiridol, TAK-715, RO-3306, Linsitinib, AZD5438, NVP-ADW742,

Palbociclib, Fulvestrant, THZ-2-102-1, VE-822Weel, Mirin, Embelin, BIBR-1532, AZD5582, VX-lle, Staurosporine, KRAS, Motesanib, Lapatinib, SB505124, Cyclophosphamide, PD173074, Doxorubicin, Tivozanib, Mitomycin-C, Pazopanib, PyridostatinPD173074, Etoposide, Flavopiridol, CarmustineRO-3306, BDP-00009066, AZD5438, PAK_5339GSK343, l-BET-762, GSK591, JQ1, OF-1, PFI-1, Vorinostat, PFI3, Entinostat, EPZ5676, ACY-1215, Dacinostat, PCI-34051, Pladienolides A-G, E7107, Herboxiedene (GEX1A), FR901463, FR901465, Meayamycin, Spliceostatin A, TG003, SRPIN340, Cpd-1, Cpd-2, Cpd-3, PROTAC- 0412, FI3B-8800, Isoginkgetin, Madrasin, Tetrocarcin A, Jerantinine A, Thailanstatin A, Sudemycin K, FD- 895, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, el agente modulador de SF3B1 es un inhibidor, y más preferiblemente es un compuesto de fórmula (I), de ahora en adelante compuesto de la invención:

Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:

R ¹ es H,OH o alcoxi;

R ² es H o CH3;

R ⁴ es H o CH3;

R ³ es alquilo, cicloalquilo, arilo o heterocicloalquilo; Es decir, un aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la prevención, mejora, alivio o tratamiento del astrocitoma/glioma de alto grado. Los compuestos descritos en el presente documento pueden inhibir una enzima o una ruta bioquímica. Los términos "inhibir" e "inhibición" se refieren a ralentizar, detener o revertir el crecimiento o la progresión de una enfermedad, infección, afección, vía o grupo de células. La inhibición puede ser mayor de aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% o 99%, por ejemplo, en comparación con el crecimiento o la progresión que ocurre en ausencia del tratamiento o contacto.

El término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena lineal, ramificada y / o cíclica ("cicloalquilo") que tiene de 1 a 20 (por ejemplo, 1 a 10 o 1 a 4) átomos de carbono. Los grupos alquilo que tienen de 1 a 4 carbonos se denominan "alquilo inferior". Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, 4,4-dimetilpentilo, octilo, 2,2, 4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo. El término "alquilo" puede incluir grupos "alquenilo" y "alquinilo". Un alquilo puede estar sustituido con un cicloalquilo. Un ejemplo de un grupo cicloalquilo sustituido con un alquilo es 1 -etil-4-metil-ciclohexilo, y el grupo puede unirse a un compuesto en cualquier átomo de carbono del grupo.

El término "cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo cíclico que tiene de 1 a 20 (por ejemplo, 1 a 10 o 1 a 6) átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y adamantilo.

El término "alquenilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal, ramificada y / o cíclica que tiene de 2 a 20 (por ejemplo, de 2 a 10 o de 2 a 6) átomos de carbono, e incluye al menos un doble enlace carbono-carbono. Los restos alquenilo representativos incluyen vinilo, alilo, 1- butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2- butenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1-heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 1-nonenilo, 2-nonenilo, 3-nonenilo, 1-decenilo, 2-decenilo y 3- decenilo.

El término "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a, -OCH ₃ , -OCH ₂ CH ₃ , -0(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , -0(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -0(CH ₂ ) ₄ CH ₃ y -0(CH ₂ ) ₅ CH ₃ .

El término "arilo" se refiere a un anillo aromático o un sistema de anillo aromático o parcialmente aromático compuesto de átomos de carbono e hidrógeno. Un grupo arilo puede comprender múltiples anillos unidos o fusionados entre sí. Los ejemplos de restos arilo incluyen, pero no se limitan a, antracenilo, azulenilo, bifenilo, fluorenilo, indan, indenilo, naftilo, fenantrenilo, fenilo, 1,2,3,4-tetrahidro-naftaleno y tolilo.

El término "heteroalquilo" se refiere a un resto alquilo en el que al menos uno de sus átomos de carbono ha sido reemplazado por un heteroátomo (por ejemplo, N, O ó S). El término "heteroarilo" se refiere a un resto arilo en el que al menos uno de sus átomos de carbono ha sido reemplazado por un heteroátomo (por ejemplo, N, O ó S). Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, acridinilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzoisotiazolilo, benzoisoxazolilo, benzoquinazolinilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, indolilo, isotiazolilo, pirilazol, pirilazol, pirilazol, pirilazol, pirilazilo, pirilazol, pirilazol, pirilazol, pirilazol, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirilazol, pirazinil, pirámido, pirazil y pirilazol. , pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, tetrazolilo, tiazolilo y triazinilo.

El término "heteroarilalquilo" se refiere a un resto heteroarilo unido a un resto alquilo.

El término "heterociclo" se refiere a un anillo o sistema de anillo aromático, parcialmente aromático o no aromático, monocíclico o policíclico compuesto de carbono, hidrógeno y al menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O o S). Un heterociclo puede comprender múltiples (es decir, dos o más) anillos fusionados o unidos entre sí. Los heterociclos pueden incluir heteroarilos. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, benzo [1,3] dioxolilo, 2,3-dihidro-benzo [1 ,4] dioxinilo, cinolinilo, furanilo, hidantoinilo, morfolinilo, oxetanilo, oxiranilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo. , tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y valerolactamilo.

El término "heterocicloalquilo" se refiere a un heterociclo no aromático.

El término "sustituido", cuando se usa para describir una estructura o resto químico, se refiere a un derivado de esa estructura o resto en el que uno o más de sus átomos de hidrógeno está sustituido con un resto químico o grupo funcional tal como, pero no limitado a, alcohol (p. ej. , hidroxilo, alquil-OH), aldehilo, alcanoiloxi, alcoxicarbonilo, alquilo (p. ej., metilo, etilo, propilo, t- butilo), alquenilo, alquinilo, alquilcarboniloxi (-OC (O) R), amida (-C (O) NHR — o — RNHC (O) - ), amidinilo ( — C (NH) NHR o — C (NR) NH 2 ), amina (primaria, secundaria y terciaria como alquilamino, arilamino, arilalquilamino), aroilo, arilo, ariloxi, azo, carbamoilo (-NHC (O) OR- u - OC (O) NHR-), carbamilo (por ejemplo, -CONH 2, así como CONH-alquilo, CONH-arilo y CONH- arilalquilo (p. ej., Bn)), carbonilo, carboxilo, ácido carboxílico, anhídrido de ácido carboxílico, cloruro de ácido carboxílico, ciano, éster, epóxido, éter (p. ej., metoxi, etoxi), guanidino, imina (primaria y secundaria), isocianato, isotiocianato, cetona, halo (F, Cl, Br o I), haloalquilo (p. ej., fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo), hemiacetal, heterociclo, nitrilo, nitro, fosfodiéster , sulfuro, sulfonamido (p. ej., S02NH 2 ), sulfona, sulfonilo (incluidos alquilsulfonilo, arilsulfonilo y arilalquilsulfonilo), sulfóxido, tiol (p. ej., sulfhidrilo, tioéter) y urea ( — NHCONHR — ). Los grupos mencionados anteriormente pueden ser elementos de un grupo R como se describe en el presente documento, incluyendo R, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ y/o R ⁵ . Además, uno o más de los grupos mencionados anteriormente pueden excluirse explícitamente de una definición de uno de los grupos R mencionados anteriormente. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de ácidos o bases no tóxicos farmacéuticamente aceptables que incluyen ácidos y bases inorgánicos y ácidos y bases orgánicos. Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, entre otras, sales metálicas hechas de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc o sales orgánicas hechas de lisina, N, N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína. Los ácidos no tóxicos adecuados incluyen, entre otros, ácidos inorgánicos y orgánicos tales como acético, algínico, antranílico, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etenosulfónico, fórmico, fumárico, furoico, galacturónico, glucónico, glucurónico, glutámico, glicólico. , bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, mucico, nítrico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, propiónico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, sulfúrico, ácido tartárico y ácido p- toluenosulfónico. Los ácidos no tóxicos específicos incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, sulfúrico y metanosulfónico. Los ejemplos de sales específicas, por lo tanto, incluyen clorhidrato y sales de mesilato. Otros son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Otros son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Otros son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (18 ^a ed., Mack Publishing, Easton Pa .: 1990) y Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19 ^a ed., Mack Publishing, Easton Pa .: 1995). En una realización más preferida de este aspecto de la invención el compuesto de fórmula (I) es el pladienolide B, de fórmula (II):

Fórmula(ll)

El pladienolide B, o [(2 S , 3 S , 4 E , 6 S , 7 R , 10 R ) -7, 10-dihidroxi-2 - [(2 E , 4 E , 6 S ) -7 - [(2 R , 3 R ) -3 - [(2 R , 3 S ) -3-hidroxipentan-2-il] oxiran-2-il] -6-metilhepta-2,4-dien-2-il] -3,7-dimetil- 12 -oxo-1 -oxaciclododec-4-en-6-il] acetato, es un compuesto de número CAS: 445493-23-2. COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y FORMA FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un agente modulador de la invención, de ahora en adelante composición de la invención, para la prevención, mejora, alivio o tratamiento del astrocitoma/glioma de alto grado.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica. Más preferiblemente, la composición además comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende un agente modulador de SF3B1 de la invención, o la composición de la invención.

En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.

En otra realización preferida de la presente invención, las composiciones y formas farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes/jarabes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio. Otras formas farmacéuticas pueden ser los sistemas coloidales, dentro de los cuales se incluyen nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas poliméricas.

Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.

Las composiciones y formas farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes.

Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia. Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.

La administración de los compuestos, composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, tópica o parenteral. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes.

La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1, 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE LA INVENCIÓN

Las enfermedades en las que la alteración de la actividad de SF3B1 puede tener potencial diagnóstico, y en concreto el astrocitoma/glioma de alto grado, pueden ser detectadas midiendo la cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o ARNm) que codifican para SF3B1, o la cantidad de proteína SF3B1 que se expresa, en comparación con células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN ó ADN-ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, la RT-PCR). Procedimientos para detectar la expresión de la proteína SF3B1 también son bien conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica (IHC) y FACS ( fluorescence activated cell sorting).

Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe un método para la obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de astrocitoma/glioma de alto grado, que comprende: a) determinar la expresión de SF3B1 en una muestra extraída de un mamífero, b) comparar los valores de la expresión de SF3B1 obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.

MÉTODO DE SCREENING DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de selección de agentes terapéuticos útiles en la prevención, mejora, alivio, y/o el tratamiento de astrocitoma/glioma de alto grado, que comprende: a) determinar la actividad de SF3B1 a una concentración establecida del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar la actividad de SF3B1 a una concentración del compuesto a analizar diferente de la de a).

Los compuestos que se unen al polipéptido SF3B1 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente al astrocitoma/glioma de alto grado.

Como se ha dicho, estos ensayos pueden implicar el polipéptido completo SF3B1, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una proteína de fusión que implique toda o una porción del polipéptido SF3B1. Determinar la capacidad de un compuesto para modular la actividad de SF3B1 puede realizarse, por ejemplo, determinando la capacidad de SF3B1 de unirse o interaccionar con una molécula diana de dicho compuesto, de manera directa o indirecta. Pueden ser también ensayos de actividad, midiendo de manera directa o indirecta la actividad de SF3B1. También puede ser un ensayo de expresión, determinando de manera directa o indirecta la expresión del ARNm de SF3B1 o de la proteína SF3B1. Estos ensayos también pueden combinarse con un ensayo in vivo midiendo el efecto de un compuesto test sobre los síntomas de enfermedades relacionadas con SF3B1 , y en concreto el astrocitoma/glioma de alto grado (por ejemplo, pero sin limitarse, sobre modelos animales u otros sistemas modelo conocidos en la técnica).

Los compuestos a testar empleados en el método de selección de agentes terapéuticos no se limitan a moléculas orgánicas de bajo peso molecular, proteínas (incluyendo anticuerpos), péptidos, oliogonucleótidos, etc. Pueden ser compuestos naturales y/o sintéticos.

Por ejemplo, anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de SF3B1 , que pueden ser empleados terapéuticamente, como se ha expuesto anteriormente, pueden emplearse también en ensayos inmunohistoquímicos, como Western blots, ELISAs, radioinmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, u otros ensayos inmunohistoquímicos conocidos en el estado de la técnica. Los polipéptidos SF3B1 pueden emplearse para inmunizar a un animal, para obtener anticuerpos policlonales. También se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas que permiten la producción de anticuerpos por líneas celulares en cultivo, entre las que se incluyen, pero sin limitarse, hibridomas, hibridomas de células B humanas. Técnicas para producir anticuerpos quiméricos, humanizados o sintéticos son conocidas.

Los agentes terapéuticos identificados por el método de selección aquí descrito pueden ser usados en un modelo animal o de otro tipo para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Más aún, los agentes terapéuticos seleccionados por el método aquí descrito se emplearían en el tratamiento de enfermedades que cursen con la alteración de SF3B1 y, en concreto, el astrocitoma/glioma de alto grado.

En otro aspecto de la invención se describe un método de selección de agentes terapéuticos útiles en la prevención, mejora, alivio, y/o el tratamiento del astrocitoma/glioma de alto grado, que comprende: a) determinar la actividad de SF3B1 a una concentración establecida del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar la actividad de SF3B1 a una concentración del compuesto a analizar diferente de la de a).

Compuestos que den lugar a una actividad diferente de SF3B1 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente al astrocitoma/glioma de alto grado.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Reactivos

A menos que se indique lo contrario, los reactivos y productos se compraron a Sigma-Aldrich. Se administró pladienólido-b (CAS 445493-23-2) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-391691) in vitro a 10 ⁷ M en base a un experimento de respuesta a la dosis y la determinación de IC50.

Pacientes v muestras.

Se obtuvieron muestras frescas de astrocitomas de alto grado (AAG)/glioblastoma (AIII/IV; n=22) mediante cirugía intracraneal de pacientes previamente diagnosticados con un tumor cerebral. También se obtuvieron muestras no tumorales de 4 donantes de cerebro sano mediante autopsia. Todas las muestras fueron estudiadas histológicamente por anatomopatólogos expertos para confirmar que eran muestras de glioblastoma y no tumorales. Porciones de cada muestra se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción para el ARN total o muestras incluidas en parafina (FFPE, en inglés) para el análisis de inmunohistoquímica (IHC) (ver más abajo). Se recogieron características demográficas y clínicas para realizar correlaciones clínicas. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Reina Sofía y se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las personas incluidas en el estudio.

Análisis bioinformático v estadístico.

Toda la metodología bioinformática se implemento en lenguaje R 3.5. Obtención y manipulación de conjuntos de datos públicos de bulk RNAseq. Los datos de bulk RNAseq del Atlas de China del genoma de glioma (CGGA) (datos de RNAseq, n = 388; datos del exorna completo, n = 236) y el microarray de Rembrandt (GBM, n = 219; no tumoral, n = 28) se interrogaron mediante las herramientas de GlioVis (http://gliovis.bioinfo.cnio.es) y filtrados por el paquete dplyr R. Obtener, filtrar, normalizar, agrupar y analizar conjuntos de datos públicos de RNAseq de célula única. Los datos de RNAseq de célula única del glioblastoma adulto se descargaron de Single Cell Portal - Broad Institute (GSE131928; células adultas totales, n = 5528) y se analizaron utilizando el paquete Seurat. El filtrado se llevó a cabo eliminando células con <200 genes y > 8000 genes junto con el filtrado de células que tienen un porcentaje de genes mitocondriales superior a 0,9, siendo las 5123 células el número de células filtradas. Los datos se normalizaron utilizando el método LogNormalize y se escalaron con un factor de escala igual a 10000. Se aplicaron los métodos PCA y UMAP para realizar un agrupamiento de células. Se utilizaron los 10 marcadores principales para caracterizar cada grupo. Procesamiento, normalización y análisis de ARNseq masiva de extremos emparejados. Los datos de bulk RNAseq de extremos emparejados del modelo de ratón EPed se alinearon con el genoma UCSC hg19 usando STAR2. La normalización, el recuento por asociaciones de genes y el análisis de expresión diferencial se lograron mediante el software Partek Flow® (Partek Incorporated, St. Louis, MO, EE. UU).

Obtención y manipulación de conjuntos de datos proteómicos públicos CPTAC. Los datos proteómicos del estudio de descubrimiento de GBM del Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) (GBM, n = 99; Non-tumor, n = 9) se descargaron de https://cptac-data- portal.georgetown.edu y se filtraron mediante el paquete dplyr R. Obtención v manipulación de la base de datos de Genomics of Druq Sensitivity in Cáncer (GDSC). La resistencia y sensibilidad de los compuestos probados en 18 líneas celulares GBM se descargaron de https://www.cancerrxgene.org, se filtraron con el paquete dplyr R y se combinaron con la expresión SF3B1 de las líneas celulares de GBM de la Broad Institute Cáncer Cell Line Encyclopedia (CCLE https: //portáis. broadinstitute.org/ccle).

Análisis de supervivencia. Los grupos de supervivencia se seleccionaron en función de los puntos de corte determinados por el paquete survminer R.

Análisis de enriquecimiento. Base de datos STRING (https://string-db.org) para determinar la posible asociación funcional entre varios genes correlacionados con SF3B1 (r> ± 0,8000). El análisis de enriquecimiento se realizó con base en el análisis de vías de KEGG. La base de datos de Reactome se utilizó para profundizar más en las vías relevantes asociadas a la expresión de SF3B1 y se utilizó el paquete ggplot2 R.

Modelos de ratón electroporados (EPed).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Cedars-Sinai. Conjuntos de datos de bulk RNAseq de extremos emparejados de modelos de ratones con glioma generados por electroporación del ventrículo lateral posnatal después de una inyección de mezcla de ADN plasmídico con mutaciones oncogénicas que se habían identificado como mutaciones oncogénicas en modelos anteriores o en tumores de pacientes (Erbb2-V664E-EGFP / Hras-G12 EGFP / Tumor de Kras- G12V-EGFP frente a modelos de control de EGFP).

Aislamiento de ARN, RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y matriz dinámica qPCR personalizada basada en tecnología de microfluídica. Se extrajo el ARN total de muestras humanas normales y tumores frescos, seguido de un tratamiento con ADNasa utilizando el Mini Kit de ADN / ARN / Proteína AllPrep y el Complejo de ADNasa sin ARNasa (Giagen, n° 80004 / n° 79254), respectivamente. El ARN total de las líneas celulares de glioblastoma se extrajo con reactivo TRIzol (ThermoFisher-Scientific, n° 15596026). En todos los casos, la concentración y pureza de ARN total se evaluó mediante el espectrofotómetro de UV-Vis Nanodrop One Microvolume (ThermoFisher-Scientific). Para los análisis de qPCR, se retrotranscribió el ARN total utilizando cebadores hexámeros aleatorios y el kit de transcripción inversa RevertAid RT (ThermoFisher-Scientific, n° K1691). Además, implemento una matriz dinámica qPCR basada en tecnología microfluídica (Fluidigm, # BMK-M-48.48) para determinar la expresión de SF3B1 simultáneamente en muestras humanas y líneas celulares utilizando Biomark System y Fluidigm® Real-Time PCR Software de análisis v.3.0.2 y software de recopilación de datos v.3.1.2 (Fluidigm). Los cebadores específicos para transcripciones humanas que incluyen SF3B1 , marcadores tumorales clave de glioblastoma, genes de puntos clave de las vías seleccionadas y 3 genes constitutivos que se diseñaron específicamente con el software Primer3. Para controlar las variaciones en la eficiencia de la reacción de retrotranscripción, se ajustó el número de copias de ARNm de las diferentes transcripciones analizadas mediante un factor de normalización, calculado con los niveles de expresión de 3 genes internos [b-actina (ACTB), hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HPRT), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH);] y el software GeNorm 3.3 como se informó anteriormente.

Análisis inmunohistoquímico.

El análisis IHC de SF3B1 se realizó en muestras de FFPE obtenidas mediante cirugía intracraneal de pacientes diagnosticados con AAG/glioblastomas (n = 13) y muestras de control / no patológicas (n = 4). Específicamente, se usaron anticuerpos policlonales de conejo contra SF3B1 humano (Abcam, # ab172634) siguiendo las instrucciones del fabricante. Específicamente, las secciones desparafinizadas se incubaron con el anticuerpo durante la noche a 4 °C. Luego, se usó ImmPRESS® Anti-Mouse / Rabbit IgG PEROXIDASE (Vector Laboratories, # MP-7500-50) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Finalmente, las secciones se desarrollaron con 3,39 diaminobencidina (EnvisionSystem 2-KiTSolution-DAB ThermoFisher-Scientific, # 34065), en contraste con hematoxilina (# MHS128). Como se informó anteriormente, los patólogos realizaron el análisis histopatológico de las muestras siguiendo un protocolo ciego. En el análisis, 1 (+), 2 (++), 3 (+++) indican intensidades bajas, moderadas y altas de tinción de la región tumoral en comparación con la región adyacente o de muestra control normal.

Líneas celulares.

Las líneas celulares de glioblastoma (U-87 MG y U-118 MG) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, # HTB-14 / # HTB 15, respectivamente) y se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor siendo el número de pases menor que 15. Estas líneas celulares se comprobaron previamente para detectar contaminación por micoplasmas y, con frecuencia, mediante PCR, como se informó anteriormente.

Glioblastoma primario derivado del paciente / cultivo de células cerebrales no tumorales. Se recolectaron muestras de tejido fresco dentro de los 15 minutos posteriores a la cirugía intracraneal y se transportaron inmediatamente a la sala de cultivo celular en medio S-MEM frío estéril (Gibco, # 11380-037) complementado con 0.1% BSA (# A2153), 0.01% L glutamina ( # G7513), solución antibiótico-antimicótica al 1% (Gibco, # R01510) y HEPES al 2,5% (# H3537). Las muestras de tejido frescas se dispersaron en células individuales dentro de los siguientes 30 minutos mediante un protocolo mecánico / enzimátic. Las células individuales se cultivaron en placas de cultivo de tejido de revestimiento de poli-L-lisina (# P1524-25MG) en un FBS al 10% (# F6765) que contenía D-MEM (Bl, # 06-1055-09-1 A) complementado como S -MEM medio.

Determinación de dosis-respuesta v IC50.

Se usó el ensayo de proliferación (ver más abajo) para desarrollar una respuesta a la dosis y una determinación de IC50 de pladienolide-b en células de glioblastoma. Las dosis seleccionadas de pladienolide-b, basadas en estudios in vitro previamente informados, fueron 10 ^-9 , 10 ⁷ y 10 ^-5 M medidos 48 h después de la administración del inhibidor de SF3B1 en líneas celulares de glioblastoma y cultivo de células de glioblastoma primario derivado de pacientes. Se utilizó la regresión de mínimos cuadrados como método de ajuste a la determinación de IC50.

Medidas de tasas de proliferación y migración.

Como se describió anteriormente, la migración de la proliferación celular en respuesta al tratamiento con pladienolide-b se analizó usando el ensayo de azul alamar (3.000 células / pocilio para líneas celulares y 10.000 células / pocilio para cultivos de células primarias; Biosource International, # BUF012B) y la cicatrización de heridas técnica (150.000 células MG U-118 / pocilio), respectivamente. Para el ensayo de migración, las células U-118 MG cultivadas en confluencia se privaron de suero durante 24 h para lograr la sincronización celular y, luego, se hizo la herida con una punta de pipeta estéril de 200 pl. Los pocilios se reemplazaron y las células se incubaron durante 6 h y 24 h con medio suplementado sin FBS. La cicatrización de la herida se comparó con el área inmediatamente después de la realización de la herida. Se adquirieron aleatoriamente tres imágenes a lo largo de la herida por pocilio para calcular el área mediante el software ImageJ.

Análisis de apoptosis.

Como se informó anteriormente, la inducción de la apoptosis en respuesta al tratamiento con pladienolide-b en líneas celulares de glioblastoma (5.000 células / pocilio en placas luminométricas de múltiples pocilios de paredes blancas) se realizó utilizando el ensayo Caspase-Glo® 3/7 (Promega Corporation, # G8091). Las células se privaron de suero durante 24 h antes de las mediciones que se llevaron a cabo siguiendo los protocolos del fabricante. Además, el nivel de proteína de Caspasa 3 escindida se identificó mediante transferencia Western (véase más adelante) después del tratamiento con pladienolide-b. Formación de tumoresferas.

Este ensayo se llevó a cabo con ambas líneas celulares de glioblastoma (1000 células / pocilio) cultivadas en una placa de baja adherencia Corning Costar (# CLS3473) usando DMEM F-12 (Gibco, # 11320033) con EGF (20ng / pl) (# SRP3027) durante 10 días (refrescado cada 48h, tratamiento con EGF y pladienolide-b). Se tomaron fotografías para visualizar y medir el número de células y el área después de 10 días de incubación con el inhibidor SF3B1. Luego, las esferas tumorales se tripsinizaron para determinar el número de células por esfera tumoral.

Secreción de VEGF.

Se utilizó el kit de ELISA humano VEGF (ThermoFisher Scientific, n° KHG0112) para cuantificar la secreción de VEGF en respuesta a pladienolide-b en líneas celulares de glioblastoma, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sembraron células silenciadas (150000 células / pocilio) y se incubaron durante 24 h en medio FBS. Luego, las células se privaron de FBS durante 1 hora y se incubaron en las mismas condiciones durante 4 horas y 24 horas. El medio se recogió, se centrifugó y se almacenó para la determinación de VEGF.

Western blot.

Para determinar los niveles de proteína, los sedimentos de células se resuspendieron usando tampón de muestra SDS-DTT precalentado [Tris-HCI 62,5 mM (# 10708976001), SDS al 2% (# 71726), glicerol al 20% (# 17904), DTT 100 mM (# D0632-5G) y azul de bromofenol al 0,005% (# B0126)] seguido de sonicación durante 10 segundos y ebullición durante 5 min a 95 °C. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en SDS-PAGE con diferente porcentaje de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, n° 1704270). Las membranas se bloquearon con leches sin grasa en polvo al 5% (# T145.3), en solución salina tamponada con Tris / 0.05% -Tween 20 (# 93773) y se incubaron con el anticuerpo primario [SF3B1 (Abcam, # ab172634), Cleaved-Caspasa 3 (CST, n.o 9664), fosfo AKT (CST, n.o 4060), AKT (CST, n.o 9272), fosfo-MTOR (CST, n.o 2971), MTOR (CST, n.o 2972), fosfo-p70-S6K1 ( CST, # 9205), p70-S6K1 (CST, # 9202), phosphoPDKI (CST, # 3061), phosphoTP53 (SCBT, # se- 135772), TP53 (Cusabio, # CSB-MA0240771A0m), HIF1A (Novus Biological, # NB100-134) y CTNNB1 (CST, # 8480)], y sus anticuerpos secundarios apropiados [anti-conejo (CST, # 7074) o anti-ratón (CST, # 7076)]. Las proteínas se desarrollaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado (GE Healthcare) con marcadores de peso molecular teñidos. Se realizó un análisis densitométrico de las bandas con el software lmageJ61 utilizando la carga de proteína total (tinción de Ponceau, # P3504-10G) o la señal de proteína total (en el caso de AKT y ERK) como factor de normalización.

Modelo de ratón preclínico, imágenes de Micro-CT y examen de hematoxilina y eosina. Se desarrolló un modelo preclínico de ratón de xenoinjerto para probar pladienolide-b in vivo. A ratones ATHYMFoxnlnu / nu de 5 semanas de edad (n = 6; Janvier-Labs) se les inyectó por vía subcutánea 3x10 ⁶ de células U-87 MG en ambos flancos [en 100 pl de extracto de membrana basal (Trevigen, # 3432-010-01)]. Una vez que el tumor fue claramente medible (10 días después de la inoculación celular), cada ratón recibió una inyección intratumor con 50 pl de pladienolide- b (10 ⁷ M) en un flanco y vehículo (1x DPBS, Sigma-Aldrich, # D1408) usado como control en otro flanco. El crecimiento del tumor se controló cada 2 días usando un calibre digital. 20 días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se disecó, fijó y seccionó cada tumor para el examen histopatológico después de la tinción con hematoxilina y eosina. El examen del número de mitosis, la proliferación vascular y la necrosis fue realizado por patólogos expertos. Las piezas adicionales del tumor estuvieron en nitrógeno líquido hasta la extracción de ARN usando el reactivo Trizol y extracción de proteínas usando tampón SDS-DTT, como se informó anteriormente. Un individuo fue evaluado por imágenes de micro-CT usando SkyScan1176 Bruker y un entorno de software para mostrar la ubicación del tumor in vivo antes de la disección. El análisis 2D junto con la representación de imágenes 3D se realizó utilizando el software VolView 3.4 (KitWare Inc). Estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Regulaciones Europeas para el Cuidado Animal bajo la aprobación de los comités de ética de investigación de la universidad / gobierno regional.

Detección de variantes de splicing en respuesta al tratamiento con pladienolide-b mediante PCR de punto final.

La PCR de punto final se desarrolló utilizando ADNc de líneas celulares de glioblastoma, glioblastoma primario derivado del paciente y modelos de ratón de xenoinjerto U-87 MG en respuesta a pladienolide-b frente a la condición de control para detectar variantes de splicing de BCL2L1-xS y BCL2L1-xL con solo un par de cebadores. El diseño de los cebadores se realizó utilizando cebadores con un apareamiento específico en Exonlla (secuencia directa) y Exonlll (secuencia inversa) junto al evento de splicing (figura 8f). Se estimaron amplicones de diferentes tamaños y posteriormente se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa (BCL2L1- xS, 305 pb; BCL2L1-xL, 494 pb). Los detalles de la PCR de punto final para detectar eventos de splicing se ha optimizado previamente.

Análisis estadístico.

Se evaluó la heterogeneidad de varianza de los datos mediante la prueba de Kolmogorov- Smirnov. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante la prueba T, la prueba U de Mann- Whitney o ANOVA de 1 vía seguida de la prueba exacta de corrección de Fisher. Las correlaciones se estudiaron mediante la prueba de correlación de Pearson. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Los valores de P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los datos representan la mediana (rango intercuartílico) o medias ± SEM. * P, 0,05; ** P, 0,01; *** P, 0,001, diferente significativamente de las condiciones de control.

Disponibilidad de datos.

Los datos externos de RNAseq masivos analizados durante el estudio actual están disponibles en GlioVis Tools (http://gliovis.bioinfo.cnio.es) y en el Portal-Broad Institute de una sola célula para datos de una sola célula (https: //singlecell. broadinstitute.org) para datos de RNAseq de una sola célula. Los conjuntos de datos generados durante y/o analizados durante el estudio actual están disponibles mediante una solicitud razonable al autor correspondiente.