Compuestos derivados de 4-amino-N-(4-am¡nofen¡l)benzamida v análogos v uso de los mismos

La presente invención se refiere a derivados de 4-amino-N-(4-aminofen¡l)benzam¡da y análogos, así como a su uso en el tratamiento de enfermedades, tanto de afectación humana como animal, provocadas por protozoos tales como tripanosomátidos (leishmaniasis, tripanosomiasis). Por tanto, la invención se enmarca en el sector farmacéutico y veterinario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La leishmaniasis humana es una enfermedad con distribución mundial, cuya prevalencia alcanza los 12 millones de casos. Aparece sobre todo en las áreas tropicales y subtropicales, aunque se encuentra también en los países del Mediterráneo. Además, hay una fuerte incidencia de infección por Leishmania en pacientes inmunodeprimidos, especialmente entre los enfermos con SIDA (Alvar, J. et al. Adv. Parasitol. 2006, 61 , 223-74). Los parásitos del género Leishmania producen diferentes formas de la enfermedad que van desde la leishmaniasis cutánea, más leve, a la leishmaniasis visceral, una forma mucho más grave de la enfermedad que resulta mortal si no se trata adecuadamente. La especie de Leishmania que aparece en la zona mediterránea y en concreto en España es L. infantum, que produce formas cutáneas y viscerales de la enfermedad. Las opciones terapéuticas para tratar la leishmaniasis incluyen los derivados antimoniales pentavalentes (estibogluconato sódico y antimoniato de meglumina), el antibiótico anfotericina B y su formulación liposomal AmBisome®, el antibiótico paromomicina, el derivado de alquilfosfocolina miltefosina, la 8- aminoquinolina sitamaquina y la diamidina pentamidina (Mishra, J. et al. Curr. Med. Chem. 2007, 14, 1 153-69). Sin embargo, estos fármacos presentan vahas limitaciones como son su toxicidad, su difícil administración, el alto precio y, lo más preocupante, la aparición de cepas resistentes a los antimoniales (Croft, S. L. et al. Clin Microbiol Rev 2006, 19, 11 1 -26) y miltefosina (Srivastava, S. et al. Parasites & Vectors 2017,10, 49). Además, el tratamiento de las formas más complejas de la enfermedad, así como en los casos de co-infección con VIH es poco eficaz. El protozoo patógeno Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana; esta parasitosis es endémica de 21 países latinoamericanos, donde provoca más de 7.000 muertes anuales y mantiene alrededor de 25 millones de personas en riesgo de contraer la infección. En la zona afectada originalmente por la enfermedad, ésta es transmitida principalmente a través de las heces contaminadas de chinches hematófagas de la Familia Reduvüdae, aunque existen rutas alternativas de infección como son la vía oral, la transfusión de sangre contaminada o la vía congénita, entre otras. Como consecuencia de las migraciones internacionales producidas en las últimas décadas, la enfermedad de Chagas es una patología emergente en países como Estados Unidos o España, considerándose que en la actualidad afecta a cerca de 7 millones de personas en todo el mundo.

Tras la infección, la fase aguda inicial de la enfermedad de Chagas es generalmente leve o asintomática y tiene una duración de 1 -2 meses. La infección persiste toda la vida, aunque un 60-70% de los individuos infectados entran en lo que se denomina fase indeterminada de la enfermedad, y nunca desarrollan manifestaciones clínicas. Sin embargo, el 30-40% restante, 10-30 años después de la infección inicial desarrollan la fase crónica de la enfermedad, caracterizada por una gravísima cardiomiopatía y/o severos problemas digestivos (megacolon y megaesófago).

No se dispone de vacuna para la enfermedad de Chagas, y los dos únicos fármacos disponibles, los nitroheterociclos nifurtimox y benznidazol, son efectivos en la fase aguda, pero muestran una eficacia limitada en la fase crónica. Por otra parte, ambos compuestos pueden producir efectos secundarios severos y además, existen cepas del parásito naturalmente resistentes a ambos fármacos. No existen actualmente alternativas terapéuticas que puedan sustituir al nifurtimox y al benznidazol.

La tripanosomiasis africana humana (TAH o enfermedad del sueño) es una parasitosis, transmitida por la mosca tsé-tsé, provocada por dos subespecies de Trypanosoma brucei: T. b. gambiense y T. b. rhodesiense. Otras especies y subespecies de Trypanosoma (T. congolense, T. brucei subs, brucei) infectan el ganado, causando la enfermedad denominada nagana, con grandes daños económicos en el África subsahañana. Las opciones de tratamiento para la enfermedad del sueño se han basado durante décadas en fármacos relativamente tóxicos que requieren largos protocolos de administración y hospitalización de los pacientes (H.P. De Koning, Trav. Med. Infect. Dis. 2020, 5 (1 ), 14). En los últimos años, se ha registrado un nuevo fármaco activo por vía oral, el fexinidazol, para ambas etapas de la TAH gambiense. Si bien la aprobación del fexinidazol constituye un avance importante en la batalla contra la enfermedad, no debe pasarse por alto la posible aparición de resistencia cruzada entre estos dos fármacos de la familia de los nitroimidazoles, fexinidazol y nifurtimox (ambos utilizados para la TAH gambiense en etapa tardía). Además, la TAH rhodesiense sigue siendo la enfermedad más desatendida del mundo con solo la suramina (etapa temprana) y el melarsoprol (un derivado de arsénico extremadamente tóxico) en propilenglicol para tratar la enfermedad en etapa tardía.

Por otra parte, está aumentando el fenómeno de resistencia a los fármacos veterinarios (diminaceno, bromuro de etidio) utilizados para tratar la tripanosomiasis animal en el ganado. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos fármacos tñpanocidas para uso veterinario es un tema altamente prioritario.

Se ha descrito la actividad ¡n vivo sobre Leishmania y Trypanosoma cruzi de bisañlimidamidas derivadas de 4,4'-(furan-2,5-diyl)dianilina (Batista, D. D. G. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2010, 54, 2940). Además, se han descrito bisañlimidamidas derivadas de 4,4'-(furan-2,5-diyl)dianilina con actividad sobre parásitos apicomplejos Besnoitia besnoiti, Neospora caninum y Toxoplasma gondii (Kropf, C. Parasitology 2012, 139, 208). También, se han descrito bisañlimidamidas derivadas de bencidina, benceno-1 ,4-diamina, 4,4'-metilenodian¡l¡na, 4,4'-oxidianilina y 4,4'-(oxibis(metileno))dianilina con actividad leishmanicida (Banerjee, M. Eur. J. Med. Chem. 2012, 55, 449) y añlimidamidas derivadas de 9H-carbazol-2,7-diamina, 4,4'- (etino-1 ,2-diyl)dianilina y 1 ,3-fenilenedimetanamina (Timm, B. L. Antimicrob. Agents Chemother. 2014, 58, 3720) o [1 ,1 ':3',1"-terphenyl]-diamina (Guedes-Da-Silva, F. H. Antimicrob. Agents Chemother. 2016, 60, 2425) sobre T. cruzi. Por otra parte, se han descrito mono-añlimidamidas con actividad sobre Leishmania (Zhu, X. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 2551 ).

Los documentos WO2016033635 y W02005051296 también se refieren a compuestos para tratar o prevenir una infección por protozoos. Sin embargo, no se han descrito compuestos de bis-arilimidamida o bis-2- aminobenzimidazol derivados de N-fenilbenzamida, 1 ,3-difenilurea, 1 ,2-difeniletano, o N-(piridin-2-il)picolinamida como agentes leishmanicidas y tripanocidas.

Se han descrito derivados de bis-2-aminoimidazolina con esqueleto de N- fenilbenzamida con actividad sobre T. brucei (Rodriguez et al J. Med. Chem. 2008, 51 , 909-923). Sin embargo, no se han descrito derivados de bis-2-aminoimidazolina con dos sustituyentes en el esqueleto de N-fenilbenzamida.

Unas ventajas de los compuestos descritos en la presente patente son sus mejoradas propiedades fisicoquímicas (es decir, su mayor lipofilia y un pK _a reducido) que los hacen más biodisponibles y, por ende, más potentes contra las formas amastigotas intracelulares (i.e. forma clínicamente relevante en humanos) de los parásitos protozoarios, especialmente de los géneros Leishmania y/o Trypanosoma. Además, estos compuestos son más activos y/o selectivos frente a dichos géneros que los fármacos de referencia miltefosina y benznidazol, respectivamente, de manera que pueden utilizarse frente a cepas fármaco-resistentes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención presenta una familia de compuestos que poseen actividad antiprotozoaria en el rango micromolar y que, por tanto, resultan útiles para el tratamiento de enfermedades causadas por protozoos, preferiblemente pertenecientes a los géneros Leishmania y Trypanosoma.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I), o cualquiera de sus isómeros, solvatos o sales farmacéuticamente aceptables, donde:

Ri y R2 se seleccionan independientemente entre H, O'Pr, y halógeno;

Rs y Rs’ se seleccionan independientemente entre

Z se selecciona entre

X e Y se seleccionan independientemente entre CH y N, para su uso como medicamento.

El término "solvato" pretende indicar una forma de solvato farmacéuticamente aceptable de un compuesto especificado que mantiene la eficacia biológica de dicho compuesto. Los ejemplos de solvatos incluyen compuestos de la invención junto con agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO (dimetilsulfóxido), acetato de etilo, ácido acético o etanolamina. El término "hidrato" se emplea cuando dicho disolvente es agua. Los métodos de solvatación son de conocimiento general en la materia.

El término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales preparadas a partir de bases farmacéuticamente aceptables no tóxicas incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre, férricas, ferrosas, de litio, de magnesio, sales mangánicas, manganosas, de potasio, de sodio, de cinc y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluidas aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas, y resinas de intercambio iónico básicas, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, A/,A/’-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2- dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etil-morfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares. Cuando el compuesto de la presente invención es básico, pueden prepararse sales a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y orgánicos. Tales ácidos incluyen el ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, ptoluenosulfónico y similares.

Los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio, y las formadas a partir de ácidos maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, pamoico, succínico, clorhídrico, sulfúrico, bismetilensalicílico, metanosulfónico, etanodisulfónico, propiónico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, aspártico, esteárico, palmítico, itacónico, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencenosulfónico, ciclohexilsulfámico, fosfórico y nítrico.

El término isómero hace referencia principalmente a isómeros estructurales, tales como los tautómeros. Específicamente, el término tautómero se refiere a uno de dos o más isómeros estructurales de un compuesto que existen en equilibrio y que se convierten fácilmente de una forma isomérica a otra. Pares tautoméricos comunes son, por ejemplo, amina-imina.

El término halógeno se refiere a F, Cl, Br o I.

En adelante, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, solvatos o sales farmacéuticamente aceptables serán referidos como compuestos de la invención.

En una realización preferida de los compuestos de la invención para su uso, R1 y R2 son ¡guales y, más preferiblemente, R1 y R ₂ son H.

En otra realización preferida, R1 y R ₂ son Cl.

En otra realización preferida, Ri y R2 son O'Pr. En otra realización preferida, R1 y R2 son F.

En una realización preferida, X e Y son CH.

En otra realización preferida, X es CH e Y es N.

En otra realización preferida, X e Y son ambos N.

En una realización preferida, Z es y, más preferiblemente, Z es ,

En una realización preferida, R3 y R3’ son ¡guales.

En una realización preferida, R3 y R3’ son ¡guales y son:

En otra realización preferida,

En otra realización preferida, En otra realización preferida, R ₃ y R ₃ ’ son ¡guales y son:

En otra realización preferida, Z es y R ₃ y R ₃ ’ son

En otra realización preferida, los compuestos de la invención para su uso se seleccionan de la lista que comprende:

- 4-(picolinimidamido)-N-(4-(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a)

- 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)pic olinamida (3b)

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3c)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d)

- 2-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3e)

- 2-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3f)

- 2-isopropoxi-N-(2-isopropoxi-4-(picolinimidamido)fenil)-4-

(picolinimidamido)benzamida (3g)

- 4-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)ben zamida (3h)

- di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-

(picolinimidamido)benzamida (3i)

- di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-

(picolinimidamido)benzamida (3j)

- di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-

(picolinimidamido)benzamida (3k)

- di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-

(picolinimidamido)benzamida (3I)

- N,N"-(etano-1 ,2-diilbis(4, 1 -fenileno))dipicolinimidamida (17)

- N,N"-((carbonilbis(azanediil))bis(4,1 -fenileno))dipicolinimidamida (18)

- 4-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)-N-(4-((1 ,3-dihidro-2H- benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)fenil)benzamida (1a)

- 5-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)-N-(5-((1 ,3-dihidro-2H- benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)piridin-2-il)picolinamida (1 b)

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)fenil)-4-((1 ,3- dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)benzamida (1 c)

- 3-chloro-N-(3-chloro-4-((1 ,3-dihydro-2H-benzo[d]imidazol-2-ylidene)amino)phenyl)-4- ((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)benzamida (1d)

- 2-cloro-N-(2-cloro-4-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)fenil)-4-((1 ,3- dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)benzamida (1 e)

- 2-cloro-N-(3-cloro-4-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)fenyl)-4-((1 ,3- dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)benzamida (1 f)

- 4,4'-(etano-1 ,2-diil)bis(N-(1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)anilina(13)

- 1 ,3-bis(4-((1 ,3-dihidro-2H-benzo[d]imidazol-2-ilideno)amino)fenil)urea (14).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o cualquiera de sus isómeros, solvatos o sales farmacéuticamente aceptables, tal y como se ha definido en el primer aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios. Estas enfermedades se producen en un animal, preferiblemente en un mamífero, incluyendo a humanos.

La expresión “tratamiento o prevención” tal y como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica en tales términos, uno o más síntomas de tal trastorno o afección.

En una realización preferida, los compuestos para su uso se administran a un animal, más preferiblemente mamífero. En otra realización 'preferida, el mamífero es un humano.

En una realización preferida, los parásitos protozoarios son del género Leishmania o Trypanosoma. Más preferiblemente los parásitos son de las especies L. aethiopica, L. amazonensis, L. arabica, L. archibaldi, L. aristedesi, L. braziliensis, L. chagasi (syn. L. infantum), L. colombiensis, L. deanei, L. donovani, L. enriettii, L. equatorensis, L. forattinii, L. garnhami, L. gerbili, L. guyanensis, L. herreri, L. hertigi, L. infantum, L. killicki , L. lainsoni, L. major, L. mexicana, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, L. pifanoi, L. shawi, L. tarentolae, L. tropica, L. turanica, L. venezuelensis, T. brucei, T. cruzi, T. congolense, T.equinum, T. equiperdum, T. evansi, T.vivax. Aún más preferiblemente, los parásitos son de las especies T. brucei, T. cruzi y L. donovani. En otra realización preferida, la enfermedad causada por parásitos protozoarios se selecciona entre leishmaniasis, tripanosomiasis africana humana (enfermedad del sueño), tripanosomiasis en animales, o tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas).

En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto seleccionado de:

- 4-(picolinimidamido)-N-(4-(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a)

- 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)pic olinamida (3b)

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3c)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d)

- 2-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3f)

- 2-isopropoxi-N-(2-isopropoxi-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3g)

- 4-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)ben zamida (3h)

- N,N"-(etano-1 ,2-diilbis(4,1 -fenileno))dipicolinimidamida (17) , más preferiblemente:

- 4-(picolinimidamido)-N-(4-(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a)

- 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)pic olinamida (3b)

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3c)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d)

- N,N"-(etano-1 ,2-diilbis(4, 1 -fenileno))dipicolinimidamida (17), para su uso para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios del género Leishmania, más preferiblemente de la especie L. donovani y, aún más preferiblemente, de la especie L. donovani en sus formas promastigotas y/o amastigotas intracelulares.

Otra realización preferida de la invención se refiere a un compuesto seleccionado de: -4-(picolinimidamido)-N-(4-(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a)

- 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2-il)pic olinamida (3b)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d) para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios del género Trypanosoma, más preferiblemente, de la especie T. brucei, aún más preferiblemente, de la cepa sensible T. brucei s427 y/o la cepa fármaco- resistente T. brucei B48. En una realización preferida, la invención se refiere a un compuesto seleccionado de:

- 4-(picolinimidamido)-N-(4-(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a)

- 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)pihdin-2-il)pico linamida (3b)

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3c)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d)

- 2-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3e)

- 2-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3f)

- 2-isopropoxi-N-(2-isopropoxi-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3g)

- N,N"-(etano-1 ,2-diilbis(4, 1 -fen ileno))dipicolinimidamida (17)

- di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3i)

- di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3j)

- di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3k)

- di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3I), más preferiblemente:

- 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3c)

- 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3d)

- 2-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4-(picolinimid amido)benzamida (3f) para su uso para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios del género Trypanosoma, más preferiblemente, de la especie T. cruzi.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) o cualquiera de sus isómeros, solvatos o sales farmacéuticamente aceptables, como se han descrito en el primer aspecto de la invención, con la condición de que el compuesto no es: ni ninguno de sus tautómeros. Las realizaciones preferidas de los compuestos de la invención referidos en este último aspecto de la invención son los ya mencionados en el primer aspecto de la invención que hacía referencia a dichos compuestos para su uso.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en ¹³ C o ¹⁴ C o un nitrógeno enriquecido en ¹⁵ N, están dentro del alcance de esta invención.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de fórmula (I) como se han definido previamente, cualquiera de sus isómeros, solvatos, o sales farmacéuticamente aceptables, con un excipiente, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión “excipientes, adyuvantes y/o vehículos” se refiere a entidades moleculares o sustancias con las que se administra el ingrediente activo. Tales excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como aguas y aceites, incluyendo aquellas de petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, excipientes, disgregantes, agentes humectantes o diluyentes.

La “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, así como la edad y estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

Dicha composición terapéutica se puede preparar en forma sólida o en suspensión, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.

Los compuestos descritos en la presente invención para su uso, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención.

Por tanto, en una realización preferida, la composición de la invención comprende además al menos otro principio activo. Preferiblemente, este principio activo es un agente antiparasitario, más preferiblemente, es un agente antiprotozoario.

La presente invención también se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), o cualquiera de sus isómeros o sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento, preferiblemente para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios.

La presente invención también se refiere a un método para tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos protozoarios que comprende la administración a un sujeto (humano o animal) de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o cualquiera de sus isómeros, solvatos o sales farmacéuticamente aceptables.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos descritos en la presente invención. Ejemplo 1. Síntesis de compuestos de fórmula (I) de acuerdo a la presente invención

Esquema 1 : Síntesis de compuestos de la invención de fórmula (I) (compuestos dentro de las fórmulas 1 y 3 indicadas en el esquema 1 ) donde Z es -CONH- en dicha fórmula.

Esquema 1 : Reactivos y condiciones: (i) SOCI ₂ , 80 ^° C; (¡i) anilina, DIPEA, tolueno anhidro; (iii) SnCI ₂ .2H ₂ O, HCI _ca t, EtOH, 50 ^° C; (iv) H ₂ , Pd-C 5%; (v) CI ₂ CS, Et ₂ O:H ₂ O (3:1 ), 25 ^° °; (vi) 1 ) benceno-1 ,2-diamino, DMF, 25 ^° C; 2) EDC.HCI, DMF, 60 °C; (vii) metil-N-(terc-butoxicarbonil)piridin-2-carbimidotioato (7), HgCl2, EtsN, DMF anh., 50 ^° C;

(viii) hidrobromuro de naftalen-2-ilmetil piridino-2-carbimidotioato (8), EtOH/CHsCN (3:1), 0 °C— >25 °C; (ix) CF3CO2H, CH2CI2, 0 ^° C.

Esquema 2: Síntesis de compuestos de la invención 13 y 17 de fórmula (I) donde Z es - CH2CH2- en dicha fórmula y 14 y 18 donde Z es -NHCONH-.

Esquema 2: Reactivos y condiciones, (i) CSCI2, Et2O:H ₂ O (3:1 ); (¡i) 1 ) benceno-1 ,2- diamino, DMF, 25 ^° C; 2) EDC.HCI, DMF, 60 °C (iii) 7, HgCI ₂ , Et ₃ N, DMF anh., 50 ^° C; (iv) CF3CO2H, CH2CI2, 0 ^° C; (v) 8, EtOH/CH ₃ CN (3:1), 0 °C 25 °C.

1.1. Procedimiento general para la síntesis de N-fenilbenzamidas 4a-l

Las reacciones se llevaron a cabo en matraces con tapón de rosca resistentes a altas presiones. Una disolución de ácido carboxílico (todos los ácidos carboxílicos utilizados están disponibles comercialmente) (1 ,5 eq.) en SOCI2 (25 mL) fue agitada a 80 ^° C por el tiempo indicado en cada caso. Una vez a temperatura ambiente, el matraz se abre cuidadosamente, debido a la presión interna de SO2 y HCI. La disolución se concentra a vacío para eliminar el exceso de SOCI2, se añade CH2CI2 al matraz para eliminar trazas de SOCI y se elimina el disolvente. El cloruro de ácido que se obtiene como un aceite, se añade lentamente con ayuda de una jeringa sobre una solución en agitación de la nitroanilina (1 ,0 eq.) y DIPEA (2,0 eq.) en tolueno anhidro (20 mL) bajo atmósfera de Argón. La mezcla de reacción se agita toda la noche a temperatura ambiente. Luego el disolvente se elimina bajo vacio y al crudo se le añade MeOH, para facilitar la precipitación de un sólido. El precipitado se filtra sobre placa y se lava sucesivamente (3x) con HCI acuoso 0,1 M (10 mL) y MeOH (20 mL) para obtener el producto como un sólido en polvo.

5-nitro-N-(5-nitropiridin-2-il)picolinamida (4b). A una suspensión de ácido 5- aminopicolinico (1 ,9 g; 1 1 ,2 mmol) en diclorometano anhidro (10 mL) enfriada con un baño de hielo, se le añade gota a gota una cantidad catalítica de DMF (10 gotas), bajo atmósfera de argón. A continuación, se añade cloruro de oxalilo (1 ,4 g; 1 mL; 1 1 ,2 mmol) gota a gota y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. A continuación, se añade Et ₃ N a la mezcla de reacción enfriada con un baño de hielo, seguido de una disolución de 5-nitropiridin-2-amina (1 ,1 g; 8 mmol) en tolueno anhidro (15 mL) añadida lentamente. La mezcla de reacción se agita durante 12 h a temperatura ambiente. A continuación, se enfría con un baño de hielo y se le añade metanol trio para precipitar el producto en forma de sólido grisáceo (1 ,9 g; 81%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) δ 11 ,02 (s, 1 H), 9,51 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 9.25 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 8,86 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1 H), 8,74 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1 H), 8,46 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 8,43 (d, J = 8,6 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 161 ,4, 154,5, 152,3, 146,3, 145,0, 144,2, 140,8, 134,8, 134,0, 123,7, 1 13,1. HPLC (UV) > 95 %. LRMS (ESI ): m/z 288,3 [M-H],

3-cloro-N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4c). Una mezcla de ácido 3-cloro-

4-nitrobenzóico (850 mg; 1 ,5 mmol) y SOCI ₂ (5 mL) reaccionaron siguiendo el método general. Después de 12 h reacción, el cloruro de ácido se obtuvo en forma de aceite amarillento. El cloruro de ácido se añadió sobre una suspensión de 2-cloro-4-nitroanilina (485 mg; 2,8 mmol) y DIPEA (728 mg; 0.98 mL; 5,6 mmol) en tolueno anhidro (20 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 16 h, obteniéndose el compuesto 4c como un sólido de color marrón (760 mg; 76%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,73 (s, 1 H), 8,44 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 8,32 (d, J = 1 ,8 Hz, 1 H), 8,29 (dd, J = 8,9, 2,6 Hz, 1 H), 8,27 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 8,13 (dd, J = 8,5, 1 ,8 Hz, 1 H), 8,02 (d, J = 8,9 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO) 5 163,2, 149,5, 145,1 , 140,7, 138,1 , 131 ,0, 128,7, 128,3, 127,5, 125,9, 125,2, 125,1 , 123,0. HPLC (UV) > 95 %. LRMS (ESI ): m/z 354,3 [M-H],

3-cloro-N-(3-cloro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4d). Una mezcla de ácido 3-cloro-

4-nitrobenzóico (3 g; 15 mmol) y SOCI2 (50 mL) reaccionaron siguiendo el método general. Después de 12 h reacción, el cloruro de ácido se obtuvo en forma de aceite amarillo oscuro. El cloruro de ácido se añadió sobre una suspensión de 3-cloro-4- nitroanilina (1 ,7 g; 10 mmol) y DIPEA (2,6 g; 3,5 mL; 20 mmol) en tolueno anhidro (20 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 16 h, obteniéndose el compuesto 4d como un sólido de color marrón (2,7 g; 77%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 1 1 ,09 (s, 1 H), 8,32 (d, J = 1 ,8 Hz, 1 H), 8,27 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 2,4 Hz, 1 H) 8,20 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 8,12 (dd, J = 8,4, 1 ,8 Hz, 1 H), 7,93 (dd, J = 8,9, 2,4 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,5, 149,4, 143,5, 142,2, 138,5, 130,9, 128,3, 127,5, 126,6, 125,9, 125,1 , 121 ,7, 1 19,0. HPLC (UV) > 95 %. LRMS (ESI ): m/z 354,3 [M-H], 2-cloro-N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4e). Una mezcla de ácido 2-cloro- 4-nitrobenzóico (1 ,5 g; 7,5 mmol) y SOCh (30 mL) reaccionaron siguiendo el método general. Después de 12 h reacción, el cloruro de ácido se obtuvo en forma de aceite amarillento. El cloruro de ácido se añadió sobre una suspensión de 2-cloro-4-nitroanilina (863 mg; 5 mmol) y DIPEA (1 ,5 g; 11 ,25 mmol) en tolueno anhidro (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 24 h, obteniéndose el compuesto 4e como un sólido de color marrón (1 ,5 g; 83%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 10,89 (s, 1 H), 8,43 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 8,41 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 8,32 (dd, J = 8,4, 2,2 Hz, 1 H), 8,30 (dd, J = 9,0, 2,6 Hz, 1 H), 8,22 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 7,96 (d, J = 8,4 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,3, 148,6, 144,6, 141 ,4,

140.2, 131 ,3, 130,3, 126,8, 125,9, 125,1 , 124,6, 123,1 , 122,5. HPLC (UV) > 95 %. LRMS (ESI ): m/z 354,2 [M-H],

2-cloro-N-(3-cloro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4f). Una mezcla de ácido 2-cloro- 4-nitrobenzóico (1 ,7 g; 8,4 mmol) y SOCI2 (20 mL) reaccionaron siguiendo el método general. Después de 12 h reacción, el cloruro de ácido se obtuvo en forma de aceite amarillento. El cloruro de ácido se añadió sobre una suspensión de 3-cloro-4-nitroanilina (970 mg; 5,6 mmol) y DIPEA (1 ,5 g; 2,0 mL; 1 1 ,3 mmol) en tolueno anhidro (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 12 h, obteniéndose el compuesto 4f como un sólido amarillento (1 ,3 g; 65%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 11 ,41 (s, 1 H), 8,46 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 8,34 (dd, J = 8,4, 2,2 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 8,13 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 7,98 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,79 (dd, J = 9,0, 2,2 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,3, 148,8, 143,1 , 142,4, 141 ,2,

131.2, 130,3, 127,7, 126,9, 124,8, 122,7, 121 ,1 , 118,5. HPLC (UV) > 95 %. LRMS (ESI- ): m/z 354,3 [M-H],

2-isopropoxi-N-(3-isopropoxi-4-nitrofenil)-4-nitrobenzami da (4g). Una mezcla de ácido 2-¡sopropoxi-4-nitrobenzo¡co (0,5 g, 2,2 mmol) y SOCI2 reaccionaron siguiendo el método general. Después de 12 h de reacción, el cloruro de ácido se obtuvo como un aceite amarillento. El cloruro de ácido se añadió sobre una suspensión de 2-¡sopropox¡- 4-nitroanilina (291 mg; 1 ,5 mmol) y DIPEA (383 mg; 0,5 mL; 3.0 mmol) en tolueno anhidro (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 48 h, obteniéndose el compuesto 4g como un sólido amarillento (410 mg; 69%) por recñstalización en MeOH. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 10,07 (s, 1 H), 8,65 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 8,15 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 8,00 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 7,95 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 7,93 - 7,89 (m, 2H), 5,06 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 4,95 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 1 ,44 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 1 ,39 (d, J = 6,0 Hz, 6H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d6) 5 162,8, 156,0, 150,8, 147,0, 143,6, 134,5, 133,1 , 128,9, 120,3, 117,2, 116,1 , 110,4, 108,5, 74,3, 73,0, 22,0.

3-fluoro-N-(2-fluoro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4i). Una mezcla de ácido 3- fluoro-4-nitrobenzoico (1 ,13 g, 6,1 mmol) y SOCI2 (5 mL) reaccionaron siguiendo el método general. Después de 17 h reacción, el cloruro de ácido se obtuvo en forma de sólido amarillento. El cloruro de ácido 610 mg, 3 mmol) disuelto en THE anhidro (2 mL) se añadió sobre una suspensión de 2-fluoro-4-nitroanilina (312 mg, 2 mmol) y DIPEA (0,7 mL, 4 mmol) en THE anhidro (5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 3 días, obteniéndose el compuesto 4i como un sólido blanquecino (620 mg, 96%). P.f. 204,3 ^e C. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 11 ,06 (s, 1 H), 8,43 - 8,12 (m, 6H), 8,00 (dd, J = 7,0, 1 ,3 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-de) 5 162,1 , 158,7 (d, J = 253,1 Hz), 152,4 (d, J = 250,9 Hz), 149,7 (d, J = 9,2 Hz), 143,8 (d, J = 8,4 Hz), 132,1 (d, J = 11 ,4 Hz), 131 ,5 (d, J = 3,4 Hz), 129,6 (d, J = 15,8 Hz), 123, 5, 120,6 (d, J = 3,5 Hz), 119,7 (d, J = 3,8 Hz), 112,1 (d, J = 27,3 Hz), 11 1 ,9 (d, J = 24,7 Hz).

3-fluoro-N-(3-fluoro-4-nitrofenil)-4-n¡trobenzam¡da (4j). Siguiendo el método general, se obtuvo 4j como sólido (230 mg, 65%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 11 ,18 (s, 1 H), 8,35 (t, J = 8,0 Hz, 1 H), 8,25 (t, J = 8,9 Hz, 1 H), 8,19 - 8,08 (m, 1 H), 8,09 - 7,92 (m, 2H), 7,80 - 7,67 (m, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-de) 5 163,6, 155,4 (d, J = 259,8 Hz), 154,2 (d, J = 262,3 Hz), 145.6 (d, J = 1 1 ,5 Hz), 140,5 (d, J = 7,5 Hz), 138,9 (d, J = 7,8 Hz), 131 ,9 (d, J = 7,0 Hz), 127,5, 126,7 (d, J = 2,7 Hz), 124,8 (d, J = 4,1 Hz), 1 18,1 (d, J =

22.7 Hz), 1 15,9 (d, J = 3,3 Hz), 108,3 (d, J = 26,1 Hz).

2-fluoro-N-(2-fluoro-4-nitrofenil)-4-n¡trobenzam¡da (4k). Siguiendo el método general, se obtuvo 4k como sólido blanquecino (270 mg, 77%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 1 1 ,07 (s, 1 H), 8,45-8,12 (m, 5H), 8,00 (dd, J = 6,9, 8,5 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-de) 0 162,1 , 158,7 (d, J = 253,3 Hz), 152,3 (J = 250,8 Hz), 154,0, 150,7,

149.7 (d, J = 9,1 Hz), 143,8 (d, J = 8,4 Hz), 132,1 (d, J = 11 ,6 Hz), 131 ,5 (d, J = 3,3 Hz), 129,6 (d, J = 15,7 Hz), 123,5, 120,6 (d, J = 3,3 Hz), 119,7 (d, J = 3,8 Hz), 112,1 (d, J = 27,5 Hz), 1 11 ,9 (d, J = 24,7 Hz). 2-fluoro-N-(3-fluoro-4-nitrofenil)-4-nitrobenzamida (4I). Siguiendo el método general, se obtuvo 4I como sólido (272 mg, 77%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 11 ,46 (s, 1 H), 8,33 (dd, J = 2,2, 9,7 Hz, 1 H), 8,30 - 8,17 (m, 2H), 8,07 - 8,00 (m, 1 H), 8,00 - 7,90 (m, 1 H), 7,64 (dd, J = 2,3, 9.0 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,1 , 158,7 (d, J = 216,2 Hz), 153,8, 149,7 (d, J = 8,9 Hz), 145,2 (d, J = 1 1 ,4 Hz), 132,0 (d, J = 6,5 Hz), 131 ,3, 129,6 (d, J = 15,2 Hz), 127,7, 1 19,8 (d, J = 3,8 Hz), 115,5, 112,3 (d, J = 27,2 Hz), 107,9 (d, J = 26,1 Hz).

1.2. Procedimiento general para la síntesis de las diaminas 5b— I

El SnCl2.2H ₂ O (10 eq.) fue agregado a una mezcla de la dinitrobenzamida en EtOAc (20 mL) y una cantidad catalítica de HCI concentrado (20 gotas). La mezcla de reacción se agita toda la noche a 50 °C, logrando una disolución completa de la nitrobenzamida. El crudo de reacción se filtra sobre una capa de Celite, que se lava con una mezcla de CH ₂ CI ₂ :MeOH (1 :1 ) (250 mL). El filtrado se evapora con alto vacío y el sólido obtenido se diluye en EtOAC, se basifica (pH = 8) añadiendo una disolución acuosa de NaHCO ₃ 10%. El compuesto se extrae con EtOAc varias veces. Una extracción completa de la fase acuosa se verifica por CCF revelada con ninhidrina. La fase orgánica se lava con una solución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre MgSÜ4, y el disolvente fue eliminado con alto vacío.

5-amino-N-(5-aminopiridin-2-il)picolinamida (5b). El compuesto 4b (1 ,5 g; 5,3 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% (300 mg; 20% w/w) con un hidrogenador Parr, obteniéndose 5b como polvo marrón por rechstalización en EtOAc (1 ,2 g; 99,8%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,80 (s, 1 H), 7,96 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,82 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,70 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 7,03 (dd, J = 8,7, 2,7 Hz, 2H), 6,12 (s, 2H), 5,13 (s, 2H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 161 ,5, 148,0, 141 ,7, 141 ,3, 136,4, 134,4, 133,7, 123,1 , 122,7, 119,4, 1 13,3. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+): m/z 229,1 [M+H],

4-amino-N-(4-amino-2-clorofen¡l)-3-clorobenzam¡da (5c). El compuesto 4c (5,5 g; 15,4 mmol) y SnCI ₂ .2H ₂ O (35 g; 154 mmol) reaccionaron siguiendo el método general, obteniéndose 5c como polvo marrón por rechstalización en EtOAc (4,1 g; 90%); ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,40 (s, 1 H), 7,86 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 7,67 (dd, J = 8,5, 2,0 Hz, 1 H), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 6,68 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,51 (dd, J = 8,5, 2,5 Hz, 1 H), 5,95 (br s, 2H), 5,33 (br s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,3, 148,3, 147,7, 130,7, 129,8, 128,8, 127,7, 123,0, 122,1 , 116,1 , 114,1 , 1 13,4, 1 12,6.

HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ): m/z 296,1 [M+H].

4-amino-N-(4-amino-3-clorofenil)-3-clorobenzamida (5d). El compuesto 4d (2 g; 5,6 mmol) y SnCl2.2H ₂ O (12,6 g; 562 mmol) reaccionaron siguiendo el método general, obteniéndose 5d como polvo amarillento por recristalización en EtOAc (4.1 g; 90%). ¹ H NMR (400 MHz, Methanol-d ₄ ) 5 7,84 (d, J = 2,1 Hz, 1 H), 7,64 (dd, J = 8,5, 2,1 Hz, 1 H), 7,60 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,27 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1 H), 6,84 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 6,83 (d, J = 8,6 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (101 MHz, Methanol-d ₄ ) 5 167,4, 149,2, 142,0, 131 ,1 , 130,1 , 128,5, 124,3, 123,8, 122,7, 119,8, 1 18,7, 1 17,1 , 115,5. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+): m/z 296,1 [M+H],

4-amino-N-(4-amino-2-clorofen¡l)-2-clorobenzam¡da (5e). El compuesto 4e (1 ,4 g; 4,0 mmol) y SnCI ₂ .2H ₂ O (9 g; 40 mmol) reaccionaron siguiendo el método general, obteniéndose 5e como polvo marrón por recristalización en EtOAc (693 mg; 59%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,25 (s, 1 H), 7,33 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,16 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 6,66 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 6,62 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 6,56 - 6,47 (m, 2H), 5,75 (s, 2H), 5,32 (s, 2H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 165,3, 151 ,5, 148,0, 131 ,5, 130,8, 129,7, 128,8, 122,9, 122,2, 113,8, 1 13,4, 112,6, 1 11 ,6. HPLC (UV) > 95%. LRMS ( ES l ⁺ ) : m/z 296,1 [M+H],

4-amino-N-(4-amino-3-clorofen¡l)-2-clorobenzam¡da (5f). El compuesto 4f (1 g; 2,5 mmol) y SnCI ₂ .2H ₂ O (4,75 g; 25 mmol) reaccionaron siguiendo el método general, obteniéndose 5f como polvo amarillento por recristalización en CHCI3 (520 mg; 71%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,83 (s, 1 H), 7,68 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,28 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1 H), 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 6,75 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 6,63 (d, J = 2,1 Hz, 1 H), 6,53 (dd, J = 8,4, 2,1 Hz, 1 H), 5,74 (s, 2H), 5,12 (s, 2H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+) : m/z 296,1 [M+H],

4-amino-N-(4-amino-3-isopropoxifenil)-2-isopropoxibenzami da (5g). El compuesto 4g (324 mg: 0,8 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% (65 mg) con un hidrogenador Parr, obteniéndose 5g como sólido marrón (253 mg, 92,4%) por recristalización en EtOAc/Hexano. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 59,51 (s, 1 H), 7,87 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,72 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 6,32 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 6,30 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 6,23 (dd, J = 8,5, 2,0 Hz, 1 H), 6,12 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1 H), 5,72 (s, 2H), 4,86 (s, 2H), 4,65 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 4,49 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 1 ,39 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 1 ,30 (d, J = 6,0 Hz, 6H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,3, 157,1 , 153,3, 148,0, 145,2, 132,8, 122,6, 118,4, 110,3, 106,8, 105,6, 100,1 , 98,4, 71 ,6, 70,6, 22,2, 22,0.

4-amino-N-(4-amino-2-fluorofenil)-3-fluorobenzamida (5i). El compuesto 4i (476 mg, 1 ,47 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% (86 mg) con un hidrogenador Parr, obteniéndose 5i como sólido grisáceo (230 mg, 59,4%) por recristalización en EtOAc/MeOH (98/2). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,32 (s, 1 H), 7,59 (m, 2H), 7,01 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 6,77 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 6,38 (m, 2H), 5,76 (s, 2H), 5,30 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,3, 157,4 (d, J = 243,1 Hz), 149,4 (d, J = 236,9 Hz), 148,5 (d, J = 1 1 ,0 Hz), 139,9 (d, J = 13,0 Hz), 128,8 (d, J = 3,5 Hz), 124,7, 121 ,1 (d, J = 5,5 Hz),

114.7 (d, J = 4,9 Hz), 1 14,3 (d, J = 19,6 Hz), 1 13,4 (d, J = 13,5 Hz), 109,3, 100,4 (d, J = 23,0 Hz).

4-amino-N-(4-amino-3-fluorofen¡l)-3-fluorobenzam¡da (5j). El compuesto 4j (177 mg, 0,55 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% con un hidrogenador Parr (H ₂ , 24 Psi) durante 2,5 h, obteniéndose 5j como sólido grisáceo por recristalización en EtOAc. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,67 (s, 1 H), 7,74 - 7,42 (m, 3H), 7,21 - 7,16 (m, 1 H), 6,88 - 6,65 (m, 2H), 5,78 (s, 2H), 4,90 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,7, 149,7 (d, J = 235,8 Hz), 148,9 (d, J = 236,1 Hz), 139,9 (d, J = 13,1 Hz), 132,1 (d, J = 13,0 Hz), 128,9 (d, J = 9,5 Hz), 124,7, 121 ,6 (d, J = 5,5 Hz), 1 16,8 (d, J = 3,1 Hz),

115.8 (d, J = 5,4 Hz), 1 14,7 (d, J = 5,0 Hz), 1 14,2 (d, J = 19,3 Hz), 108,2 (d, J = 23,0 Hz).

4-amino-N-(4-amino-2-fluorofen¡l)-2-fluorobenzam¡da (5k). El compuesto 4k (200 mg, 0,62 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% (60 mg) con un hidrogenador Parr (H ₂ , 28 Psi) durante 2 h, obteniéndose 5k como sólido grisáceo por recristalización en EtOAc. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 8,82 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,49 (t, J = 8,8 Hz, 1 H), 7,26 (t, J = 8,8 Hz, 1 H), 6,46 - 6,27 (m, 4H), 6,00 (s, 2H), 5,28 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,3, 161 .5 (d, J = 245,5 Hz), 156,2 (d, J = 241 ,9 Hz), 153,7 (d, J = 12,7 Hz), 147,9 (d, J = 10,8 Hz), 131 ,9 (d, J = 4,8 Hz), 127,1 , 113,9 (d, J = 12,7 Hz), 109,5, 109,2 (d, J = 2,1 Hz), 108,7 (d, J = 12,8 Hz), 100,3 (d, J = 22,8 Hz), 99,2 (d, J = 26,6 Hz). 4-amino-N-(4-amino-3-fluorofenil)-2-fluorobenzamida (5I). El compuesto 4I (155 mg, 0,48 mmol) fue hidrogenado en presencia de Pd-C 5% (50 mg) con un hidrogenador Parr (H2, 23 Psi) durante 2 h, obteniéndose 5I como sólido grisáceo (20 mg, 16%) por recristalización en EtOAc. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,77 - 9,27 (m, 1 H), 7,60 - 7,32 (m, 2H), 7,22 - 7,04 (m, 1 H), 6,70 (t, J = 9,6 Hz, 1 H), 6,48 - 6,24 (m, 2H), 5,95 (s, 2H), 4,89 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,2, 161 ,0 (d, J = 246,6 Hz), 153,4 (d, J = 12,5 Hz), 149,7 (d, J = 235,7 Hz), 132,1 (d, J = 13,1 Hz), 131 ,4 (d, J = 4,9 Hz), 128,8 (d, J = 9,6 Hz), 116,4 (d, J = 2,9 Hz), 115,8 (d, J = 5,4 Hz), 1 10,2 (d, J = 12,6 Hz), 109,4, 107,8 (d, J = 23,2 Hz), 99,3 (d, J = 26,0 Hz).

1 ,3-bis(4-aminofenil)urea (10). La 1 ,3-bis(4-nitrofenil)urea (2,4 g; 8,0 mmol) fue hidrogenada en presencia de Pd-C 5% (213 mg) con un hidrogenador Parr, obteniéndose 10 como polvo ligeramente violeta por recristalización en MeOH/DMF (520 mg; 27%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 7,91 (s, 2H), 7,04 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 6,49 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 4,71 (s, 4H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES l ⁺ ) : m/z 243,3 [M+H],

1.3. Procedimiento general para la síntesis de isotiocianatos (6a-g, 11 , 12)

La reacción se realiza en tubos KIMAX. Una solución de la diamina (1 eq.) y tiofósgeno (2,5 eq) en una mezcla Et2O:H ₂ O (3:1 ) (2 mL) se agita a temperatura ambiente toda la noche. Después de la agitación un sólido aparece en el fondo del tubo. El sólido precipitado se filtra sobre placa y se lava con H ₂ O destilada (100 mL). La purificación se hace en columna con Et ₂ O:EtOAc. El producto se seca a 40 ^e C, obteniéndose un sólido.

4-isotiocianato-N-(4-isotiocianatofenil)benzamida (6a). La 4-amino-N-(4- aminofenil)benzam¡da 5a (3,4 g, 15 mmol), disponible comercialmente, reaccionó con tiofosgeno (2,5 mL, 33 mmol) siguiendo el método general, obteniéndose 6a como sólido grisáceo (92%). ¹ H NMR (300 MHz, Chloroform-d) 5 7,88 (s 1 H, NH), 7,85 (d, J = 8,7, 2H), 7,63 (d, J = 8,8, 2H), 7,31 (d, J = 8,7, 2H), 7,22 (d, J = 8,8, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCI ₃ ) 5 164,7, 138,6, 137,1 , 135,9, 135,5, 133,2, 129,0, 127,8, 127,0, 126,5, 121 ,5. Mp. 199-200 °C. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+) m/z = 312,3 (M+H).

5-isotiocianato-N-(5-isotiocianatopiridin-2-il)picolinami da (6b). 5b (74,5 mg, 0,32 eq.) reaccionó con tiofosgeno (62 pL, 0,81 eq.) siguiendo el método general, obteniéndose 6b como sólido marrón. El compuesto se purificó por cromatografía sobre sílice eluyendo con éter de petróleo: EtOAc (100:0 -^50:50). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 10,43 (s, 1 H), 8,81 (s, 1 H), 8,63 - 8,43 (m, 1 H), 8,37 - 8,12 (m, 3H), 8,00 (m, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 181 ,4, 172,1 , 165,0, 162,2, 153,8, 146,3, 139,9, 136,2, 129,7, 126,3, 124,6, 123,6. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z = 314,3 (M+H).

3-cloro-N-(2-cloro-4-isotiocianatofenil)-4-isotiocianatob enzamida (6c). 5c (100 mg, 0,34 mmol) reaccionó con tiofosgeno (65 pL, 0,85 mmol) siguiendo el método general, obteniéndose 6c como sólido marrón (44%). ¹ H NMR (300 MHz, Chloroform-d) 5 8,53 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 8,31 (s, 1 H), 7,98 (s, 1 H), 7,74 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,36 (dd, J = 8,3, 1 ,1 Hz, 1 H), 7,21 (dd, J = 8,9, 1 ,3 Hz, 1 H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z = 377,8 (M-H).

3-cloro-N-(3-cloro-4-isotiocianatofenil)-4-isotiocianatob enzamida (6d). 5d (150 mg, 0,51 mmol) reaccionó con tiofosgeno (147 mg, 0,1 mL, 1 ,28 mmol) siguiendo el método general, obteniéndose 6d como sólido blanquecino (160 mg, 83%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,63 (s, 1 H), 8,15 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 8,08 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,94 (dd, J = 8,4, 2,0 Hz, 1 H), 7,73 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1 H), 7,67 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,51 (d, J = 8,8 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,2, 139,1 , 138,7, 136,7, 134,0, 131 ,4, 130,5, 130,4, 129,2, 128,0, 127,5, 127,3, 123,3, 120,7, 119,7. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESj m/z = 377,7 (M-H).

2-cloro-N-(2-cloro-4-isotiocianatofenil)-4-isotiocianatob enzamida (6e). 5e (100 mg, 0,34 mmol) reaccionó con tiofosgeno (98 mg, 65 pL, 0.85 mmol) siguiendo el método general. El producto se purificó en cromatografía de sílice eluyendo con éter de petróleo: EtOAc (100:0 — > 25:75), obteniéndose 6e como sólido blanquecino (85 mg, 66%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,41 (s, 1 H), 7,79 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,75 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 7,74 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,68 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,54 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1 H), 7,49 (dd, J = 9,0, 2,4 Hz, 1 H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ) m/z = 377,8 (M-H).

2-cloro-N-(3-cloro-4-isotiocianatofenil)-4-isotiocianatob enzamida (6f). 5f (310 mg, 1 ,05 mmol) reaccionó con tiofosgeno (303 mg, 0.2 mL, 2.63 mmol) siguiendo el método general, obteniéndose 6f como sólido blanquecino (94 mg, 24%). ¹ H NMR (300 MHz, Chloroform-d) 5 8,15 (s, 1 H), 7,86 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 7,74 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,45 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1 H), 7,28 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 7,22 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,20 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (75 MHz, Chloroform-d) 5 163,3, 140,1 , 139,1 , 136,8, 135,4, 132,6, 132,6, 132,0, 131 ,8, 127,4, 127,1 , 126,3, 124,8, 121 ,5, 1 19,1. HPLC (UV) > 95%.

LRMS (ESI ) m/z = 377,8 (M-H)

1.2-bis(4-isotiocianatofenil)etano (11). 4,4’-diaminobibencilo 9 (1 ,28 g, 6 mmol) reaccionó con tiofosgeno (1 ,73 g: 1 ,15 mL, 15 mmol) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía sobre sílice eluyendo con n-hexano: EtOAc (100^0 to 80^20), obteniéndose 11 como sólido blanquecino (1 ,4 g, 79%). ¹ H NMR (400 MHz, Chloroform-d) 5 7,12 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 7,07 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 2,89 (s, 4H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+) m/z = 297,3 (M+H).

1.3-bis(4-isot¡oc¡anatofen¡l)urea (12). 10 (201 mg, 0,83 mmol) reaccionó con tiofosgeno (0,16 mL, 2,08 mmol) siguiendo el método general, obteniéndose 12 como sólido blanquecino (174 mg: 64%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 9,03 (s, 2H), 7,52 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 7,37 (d, J = 8,9 Hz, 4H).

¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 152,1 , 139,2, 132,2, 126,7, 123,2, 1 19,0. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES ⁺ ) m/z = 314,3 (M+H).

1.4. Procedimiento general para la síntesis de bisbenzimidazoles (1a-f, 13,14)

En un tubo KIMAX se prepara una disolución del isotiocianato (1 eq.) y o-fenilendiamina (2,2 eq.) en DMF anhidra (4 mL) y se agita a 0 ^e C (baño de hielo) hasta la completa formación del intermedio tiourea (verificado por CCF y HPLC-MS). Luego se añade el EDC hidrocloruro (2,5 eq.) en un solo paso y la mezcla de reacción se agita a 60 ^e C por 24 horas. Transcurrido ese tiempo, se añaden trozos de hielo al crudo de reacción y se agita el tubo vigorosamente. El sólido precipitado se purifica por cromatografía circular (Chromatotron) empleando CH ₂ Cl2:MeOH (9:1 ; 8:2; 7:3; 6:4; 1 :1 ) como sistema de elución.

4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)amino)-N-(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- il¡deno)am¡no)fen¡l)benzamida (1a). Una disolución de 6a (200 mg, 0,64 mmol) y o- fenilenodiamina (151 mg, 1 ,4 mmol) en DMF anhidra (10 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 2 h hasta desaparición de los reactivos. Yodo (405 mg, 1 ,6 mmol) fue añadido a la mezcla de reacción, seguido de carbonato potásico (221 mg, 1 ,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y la reacción se paró añadiendo una disolución acuosa al 5% Na2S2Ü3 (3,5 mL). Se añadió salmuera (50 mL) y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 30 mL). La fase orgánica se secó y el disolvente se evaporó, obteniéndose un aceite amarillento. El producto se purificó por cromatografía sobre sílice (Hexano:EtOAc, 100:0^40:60), obteniéndose un sólido marrón. ¹ H NMR (300 MHz, Methanol-d ₄ ) 5 8,20 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,64 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,58 - 7,43 (m, 6H), 7,40 - 7,28 (m, 4H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES l ⁺ ) m/z = 459,2 [M+H],

5-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)amino)-N-(5-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- ¡lideno)amino)piridin-2-il)picolinamida (1 b). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 6b (20 mg, 64 pmol), o-fenilenodiamina (15 mg, 140 pmol), DMF (4 mL) y EDC hidrocloruro (30,6 mg, 160 pmol) con 12 h de agitación a 60 ^e C. Transcurrido este tiempo, se añadió hielo a la mezcla de reacción para precipitar el producto. El sólido se aisló por filtración, lavó con agua fría y se secó, obteniéndose un sólido marrón. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 1 1 ,32 (s, 1 H), 11 ,07 (s, 1 H), 10,26 (s, 1 H), 10,19 (s, 1 H), 9,60 (s, 1 H), 8,96 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 8,77 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 8,66 (dd, J = 8,5, 2,2 Hz, 1 H), 8,33 (dd, J = 9,0, 2,6 Hz, 1 H), 8,26 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 8,19 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,52 - 7,23 (m, 4H), 7,11 - 6,93 (m, 4H). ¹³ C NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 161 ,5, 150,3, 149,2, 144,5, 142,9, 142,5, 140,8, 140,4, 137,5, 137,4, 134,4, 132,9, 132,7, 126,7, 123,7, 123,0, 120,9, 120,6, 119,9, 116,5, 116,0, 1 13,0, 1 10,0, 109,5. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z = 462,2 [M+H],

4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-¡l¡deno)am¡no)-N-(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- ilideno)am¡no)-2-clorofen¡l)-3-clorobenzam¡da (1 c). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 6c (125 mg, 0,33 mmol), o-fenilenodiamina (78 mg, 0,72 mmol), DMF (4 mL) y EDC hidrocloruro (157 mg, 0,82 mmol) con 12 h de agitación a 60 ^e C. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CH2Cl2:MeOH, 100:0^70:30), obteniéndose un sólido amarillento (75 mg, 43%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10.04 (s, 1 H), 9.04 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 8.86 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 8.17 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 8.12 (d, J = 2.5 Hz, 1 H), 8.05 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1 H), 7.61 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.45 (dd, J = 5.9, 3.2 Hz, 1 H), 7.38 (td, J = 6.2, 3.2 Hz, 3H), 7.21 (dd, J = 5.9, 3.2 Hz, 1 H), 7.09 (td, J = 6.2, 3.2 Hz, 4H), 3.46 - 3.40 (m, 2H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163.9, 150.0, 149.5, 149.3, 139.6, 139.1 , 130.4, 129.9, 129.4, 128.8, 128.5, 127.7, 127.4, 123.0, 121.0, 120.7, 118.6, 118.4, 1 17.2, 11 1 .2. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES l ⁺ ) m/z = 528,2 [M+H], 4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)amino)-N-(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- ilideno)amino)-3-clorofenil)-3-clorobenzamida (1d). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 6d (102 mg, 0,27 mmol), o-fenilenodiamina (64 mg, 0,60 mmol), DMF (4 mL) y EDC hidrocloruro (131 mg, 0,68 mmol) con 48 h de agitación a 60 ^e C. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CH ₂ CI ₂ :MeOH, 100:0^70:30), obteniéndose un sólido amarillento (21 mg; 15%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,93 (br s, 3H), 9,50 (br s, 2H), 9,23 (br s, 2H), 8,85 (d, J = 9,8 Hz, 2H), 8,72 (d, J = 9,8 Hz, 2H), 8,59 - 8,30 (m, 6H), 3,16 (br s, 2H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 161 ,1 , 154,2, 152,1 , 146,1 , 144,6, 143,8, 140,7, 134,4, 133,6, 123,4, 112,9. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES ⁺ ) m/z 528,1 [M+H],

4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-¡l¡deno)am¡no)-N-(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- ilideno)am¡no)-2-clorofen¡l)-2-clorobenzam¡da (1e). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 6e (50 mg, 0,13 mmol), o-fenilenodiamina (31 mg, 0,29 mmol), DMF (4 mL) y EDC hidrocloruro (63 mg, 0,33 mmol) con 48 h de agitación a 60 ^e C. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CH ₂ Cl2:MeOH-NH ₃ ( _S aturado), 100:0^80:20), obteniéndose un sólido amarillento (20 mg; 17%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 11 ,17 (s, 1 H), 1 1 ,06 (s, 1 H), 9,92 (s, 1 H), 9,84 (s, 1 H), 9,70 (s, 1 H), 8,23 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 8,21 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,69 (dd, J = 2,2,

8.1 Hz, 1 H), 7,59 - 7,53 (m, 3H), 7,43 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7,40 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7,32 (t, J = 8,7 Hz, 2H), 7,04 (m, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 165,2, 150,0, 149,5, 143,2, 142,8, 142,6, 139,9, 132,6, 132,6, 131 ,0, 130,1 , 129,2, 128,2, 127,5, 127,2, 120,7, 120,6, 120,3, 120,0, 1 17,0, 117,0, 116,3, 1 16,1 , 1 15,9, 115,0, 109,8, 109,6. HPLC (UV)

> 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z = 528,2 [M+H],

4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-¡l¡deno)am¡no)-N-(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)- ilideno)am¡no)-3-clorofen¡l)-2-clorobenzam¡da (1f). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 6f (83 mg, 0,22 mmol), o-fenilenodiamina (52 mg, 0,48 mmol), DMF (4 mL) y EDC hidrocloruro (106 mg, 0,55 mmol) con 72 h de agitación a 60 ^e C. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CH ₂ CI ₂ : MeOH- NH3( _Sa turado), 100:0^90:10), obteniéndose un sólido amarillento (68 mg; 59%). ¹ H NMR (500 MHz, Methanol-d ₄ ) 5 8,07 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 8,02 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,85 (d, J =

2.1 Hz, 1 H), 7,57 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1 H), 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 7,53 (dd, J = 8,5, 2,1 Hz, 1 H), 7,43 - 7,29 (m, 4H), 7,12 (m, 2H), 7,07 (m, 2H). ¹³ C NMR (126 MHz, Methanol- d ₄ ) 5 168,0, 152,4, 151 ,1 , 144,9, 135,9, 134,5, 133,2, 131 ,0, 129,9, 125,5, 123,0, 122,5,

122,4, 122,2, 120,8, 119,1 , 116,7. HPLC (UV) 94.2%. HRMS (ESI ⁺ ) m/z = 528,2 [M+H],

4,4'-(etano-1 ,2-diil)bis(N-(1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)anilina) (13). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 11 (225 mg; 0,76 mmol), o-fenilenodiamina (180 mg; 1 ,67 mmol), DMF (3 mL) y EDC hidrocloruro. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CFhCh eOH, 100:0 — > 92:8), obteniéndose un sólido blanquecino (182 mg, 54%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-de) 5 9,29 (s, 2H), 7,63 (d, J = 8,5 Hz, 4H), 7,29 (dd, J = 5,8, 3,2 Hz, 4H), 7,16 (d, J = 8,5 Hz, 4H), 6,97 (dd, J = 5,8, 3,2 Hz, 4H), 2,83 (s, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,4, 150,8, 138,7, 133,8, 128,7, 120,0, 1 17,2, 36,7. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI+) m/z = 445,3 [M+H],

1 ,3-bis(4-((1 H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ilideno)amino)fenil)urea (14). La reacción se llevó a cabo siguiendo el método general utilizando 12 (103 mg, 0,32 mmol), o- fenilenodiamina (756 mg, 0,7 mmol), DMF (1 mL) y EDC hidrocloruro (154 mg, 0,8 mmol) con 48 h de agitación a 60 ^e C. El producto se purificó por cromatografía circular sobre sílice (CH2CI2: MeOH-NH3(saturado) 98.75:1.25 — > 80:20), obteniéndose un sólido amarillento (38 mg: 25%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,86 (br s, 2H), 9,25 (br s, 2H), 8,47 (s, 2H), 7,65 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 7,39 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 7,28 (dd, J = 5,8, 3,3 Hz, 4H), 6,97 (dd, J = 5,8, 3,3 Hz, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 171 ,4, 152,9, 152,9, 151 ,0, 135,3, 133,3, 119,8, 1 19,1 , 117,9. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z 475,5 [M+H],

1.7. Preparación del (Z)-metil N-terc-butoxicarbonilpiridin-2-carbimidotioato (7)

Síntesis del (Z)-metil N-tert-butoxicarbonilpiñdin-2-carbimidotioato (7).

Reactivos y condiciones: (i) NaH, DMF, di-terc-butildicarbonato, 0 °C — > 25 °C; (¡i) NaH, DMF, CH ₃ I, 0 °C — > 25 °C.

Una disolución de NaH (2,2 eq) en DMF anhidro, se agita a 0 ^e C (baño de hielo). Luego, se añade la piñdin-2-carbotioamida (1 eq) y se deja agitar por 5 minutos, seguido por la adición lenta de di-terc-butil dicarbonato (2,2 eq) dejando agitar a temperatura ambiente por 2 horas. El crudo de reacción se neutraliza con una solución saturada de NaHCO ₃ . La fase orgánica se extrae con EtOAc, se lava con una solución saturada de NaCI, se seca sobre MgSC . La fase orgánica se concentra a vacío para obtener el intermedio protegido con Boc como un aceite amarillo.

El intermedio protegido con Boc (19 g, 79,7 mmol, 1 eq), se añade a una disolución de NaH (4,0 g, 167,4 mmol, 2.1 eq) en DMF anhidro (300 mL) agitada a 0 ^e C (baño de hielo), luego de 15 minutos de agitación, se añade el yoduro de metilo (22.6 g, 159,5 mmol, 2 eq) agitando a temperatura ambiente. El crudo de reacción se neutraliza con una solución saturada de NaHCO ₃ (200 mL). La fase orgánica se extrae con EtOAc (3 x 200 mL), se lava con salmuera, se seca sobre MgSO4. La fase orgánica se concentra a vacío. El producto se purifica por cromatografía en columna de sílice eluyendo con una mezcla de hexano: EtOAC (100:0 — > 90:10), obteniéndose un sólido amarillento. El producto disuelto en CH ₃ CN/H ₂ O fue liofilizado, obteniéndose un sólido blanquecino (10,9 g, 54,3%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 8,64 (dd, J = 4,7, 1 ,6 Hz, 1 H), 7,97 (td, J = 7,7, 1 ,6 Hz, 1 H), 7,73 (dd, J = 7,7, 1 ,1 Hz, 1 H), 7,56 (ddd, J = 7,7, 4,7, 1 ,1 Hz, 1 H), 2,43 (s, 3H), 1 ,38 (s, 9H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 169,4, 159,3, 150,9, 149,1 ,

137.8, 126,3, 121 ,9, 80,9, 27,5, 13,6.

1.8. Procedimiento general para la síntesis de 2-arilimidamidas protegidas con Boc (2a-l)

Un tubo de microondas fue cargado con (Z)-metil N-terc-butoxicarbonilpiñdin-2- carbimidotioato 7 (4 eq.), diamina 5a-l (1 eq.) y cloruro de mercurio (II) (4 eq.). Se sella el tubo y se añade CH2CI2 anhidro (5 mL), seguido por la adición de tñetilamina anhidra (7 eq.). La mezcla de reacción se irradia 1 h a 50 ^e C. La mezcla de reacción se diluye en CH2CI2 y se filtra sobre Celite, usando una mezcla de CH ₂ Cl2:MeOH (50 mL). Se remueve el disolvente bajo vacío. El compuesto puro se obtiene por cromatografía. terc-butil ((E)-((6-((5-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)p iridin-2- il)carbamoil)piridin-3-il)amino)(piridin-2-il)metileno)carba mato (2b). La reacción se llevó a cabo con 5b (99 mg; 0,43 mmol), 7 (436 mg; 1 ,73 mmol), HgCI ₂ (469 mg; 1 ,73 mmol), Et ₃ N (1 ,75 mL; 1 ,73 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía flash sobre sílice eluyendo con Hexano:EtOAc (100:0 — > 80:20), obteniéndose un sólido amarillento (97 mg; 36%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,49 (br s, 8H), 9,78 (s, 1 H), 8,97 (br s, 2H), 8,03 - 7,88 (m, 2H), 7,81 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 7,70 (d, J = 2,8 Hz, 1 H), 7,03 (dd, J = 8,7, 2,5 Hz, 2H), 6,16 (s, 1 H), 5,14 (s, 1 H), 1 ,20 (s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 161 ,5, 148,1 , 141 ,7, 141 ,3, 136,3, 134,4, 133,7, 123,1 , 122,6, 119,3, 113,3, 8,4. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ): m/z = 638,4 [M+H]. terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 2- clorofenil)carbamoil)-2-clorofenil)amino)(piridin-2-il)metil eno)carbamato (2c). La reacción se llevó a cabo con 5c (150 mg, 0,5 mmol), 7 (515 mg, 2 mmol), HgCl2 (554 mg, 2 mmol), EtsN (0,3 mL, 2 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa (C18) con un cartucho de 12 g usando H2O:CH3CN (100:0 — > 0:100), obteniéndose un sólido amarillento (159 mg, 44%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,04 (s, 1 H), 9,99 (br s, 2H), 8,70 (ddd, J = 4,8, 1 ,7, 1 ,0 Hz, 2H), 8,62 (ddd, J = 3,6, 1 ,7, 1 ,0 Hz, 1 H), 8,08 - 7,98 (m, 3H), 7,96 - 7,83 (m, 1 H), 7,74 - 7,67 (m, 3H), 7,59 (ddd, J = 7,7, 4,8, 1 ,0 Hz, 2H), 7,50 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 1 ,23 (br s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,9, 160,1 , 156,3, 151 ,4, 151 ,1 , 149,3, 149,1 , 148,5, 138,5, 137,2, 130,2, 129,6, 128,9, 128,8, 127,0,

125.6, 125,0, 123,2, 123,1 , 120,8, 1 19,5, 80,4, 79,0, 27,6, 27,5. HPLC (UV) > 92%. LRMS (ESI ⁺ ): m/z 704,3 [M+H], terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 3- clorofenil)carbamoil)-2-clorofenil)amino)(piridin-2-il)metil eno)carbamato (2d). La reacción se llevó a cabo con 5d (79 mg, 0,3 mmol), 7 (273 mg, 1 ,1 mmol), HgCh (293 mg, 1 ,1 mmol), EtsN (0,2 mL, 1 ,1 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa (C18) con un cartucho de 12 g usando H2O:CH3CN (100:0 — > 0:100), obteniéndose un sólido amarillento (61 mg, 32%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,28 (s, 1 H), 9,38 (s, 1 H), 8,86 - 8,57 (m, 3H), 8,55 - 8,39 (m, 1 H), 8,19 - 7,79 (m, 4H), 7,76 - 7,46 (m, 4H), 7,37 - 7,21 (m, 1 H), 7,18 - 6,92 (m, 2H), 1 ,22 (br s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 163,6, 151 ,1 , 148,5, 148,3, 141 ,6, 137,1 , 128,6, 127,0, 125,5, 124,9, 123,1 , 121 ,2,

120.7, 119,2, 80,4, 80,1 , 27,6, 27,5. HPLC (UV) > 95%. LRMS ( ES l ⁺ ) : m/z 704,32 [M+H], terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 2- clorofenil)carbamoil)-3-clorofenil)amino)(piridin-2-il)metil eno)carbamato (2e). La reacción se llevó a cabo con 5e (112 mg, 0,38 mmol), 7 (240 mg, 0,95 mmol), HgCl2 (248 mg, 0,91 mmol), EtsN (154 mg, 1 ,5 mmol) y diclorometano anhidro (3 mL) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía circular con placa de sílice (2 mm) previamente neutralizadas con n-hexano (235 mL) y Et ₃ N (15 mL); eluyente: hexano:EtOAC (6:4 — > 4:6). El producto se obtuvo como sólido amarillento (181 mg, 67%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,17 (s, 1 H), 9,26 (s, 1 H), 8,85 - 8,54 (m, 2H), 8,25 - 7,97 (m, 3H), 7,72 (ddd, J = 6,8, 4,8, 1 ,9 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,17 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 6,66 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,62 (d, J = 1 ,7 Hz, 1 H), 6,52 (m, 2H), 5,76 (s, 1 H), 5,34 (s, 1 H), 1 ,48 (s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,0, 151 ,4, 149,8, 149,0, 148,6, 148,1 , 148,0, 138,5, 131 ,5, 130,8, 129,6, 128,7, 128,0, 127,4, 122,9, 122,6,

122.2, 113,7, 113,4, 1 12,6, 1 11 ,6, 81 ,5, 81 ,0, 28,2, 27,6. terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 3- clorofenil)carbamoil)-3-clorofenil)amino)(piridin-2-il)metil eno)carbamato (2f). La reacción se llevó a cabo con 5f (109 mg, 0,37 mmol), 7 (235 mg, 0,93 mmol), HgCI ₂ (242 mg, 0,89 mmol), Et ₃ N (150 mg, 1 ,5 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. El producto se purificó por cromatografía circular con placa de sílice (2 mm) previamente neutralizadas con n-hexano (235 mL) y Et ₃ N (15 mL); eluyente: CH ₂ Cl ₂ :EtOAC (95:5 — > 90:10). El producto se obtuvo como sólido amarillento (32 mg, 12%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10.53 (s, 1 H), 10,10 (br s, 2H), 9,58 (m, 1 H), 9,37 (m, 1 H), 8,75 - 8,66 (m, 2H), 8,67 - 8,57 (m, 1 H), 8,15 - 7,93 (m, 3H), 7,85 - 7,76 (m, 1 H), 7,73 - 7,66 (m, 1 H), 7,65 - 7,52 (m, 3H), 7,06 - 6,92 (m, 1 H), 1 ,24 (s, 9H), 1 ,22 (s, 9H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 165,7, 160,8, 160,0, 156,3, 153,2, 151 ,1 , 144,8, 141 ,7, 138,5, 137,3, 133,6, 129,5, 125,7, 123,1 , 120,6, 119,9, 118,8, 113,6, 113,1 , 80,1 ,

79.2, 27,5. terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 2- isopropoxifenil)carbamoil)-3-isopropoxifenil)amino)(piridin- 2- yl)metileno)carbamato (2g). La reacción se llevó a cabo con 5g (50 mg, 0,15 mmol), 7 (96 mg, 0,38 mmol), HgCI ₂ (98 mg, 0,36 mmol), Et ₃ N (61 mg, 0,6 mmol) y diclorometano anhidro (3 mL) siguiendo el método general. La mezcla de reacción se filtró sobre f lorisil lavando el precipitado con CH2CI2 y MeOH. La fase orgánica se lavó sucesivamente con H ₂ O y salmuera, se secó sobre Na ₂ SO ₄ y el disolvente se eliminó a vacío. El producto se purificó por cromatografía circular con placa de sílice (2 mm) previamente neutralizadas con n-hexano (235 mL) y Et ₃ N (15 mL); eluyente: hexane:EtOAC (2:3). El producto se obtuvo como sólido amarillento (56 mg, 50%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 10,06 (s, 1 H), 9,91 (s, 1 H), 9,80 (s, 1 H), 8,70 (dd, J = 9,9, 4,8 Hz, 2H), 8,33 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 8,10 - 7,95 (m, 3H), 7 ,77 - 7,65 (m, 3H), 7,59 (ddd, J = 12,4, 7,9, 5,1 Hz, 3H), 7,48 (s, 1 H), 7,37 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 4,72 (hept, J = 6,0 Hz, 1 H), 4,59 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 1 ,47 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 1 ,39 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 1 ,25 (s, 9H), 1 ,22 (s, 9H). terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 2- fluorofenil)carbamoil)-2-fluorofenil)amino)(piridin-2-il)met ileno)carbamato (2i). La reacción se llevó a cabo con 5i (51 mg, 0,19 mmol), 7 (195 mg, 0,77 mmol), HgCh (211 mg, 0,78 mmol), EtsN (107 pL, 0,77 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. La mezcla de reacción se filtró sobre Celite y florisil lavando el precipitado con CH2CI2 y MeOH. El disolvente se eliminó a vacío y el producto se purificó por cromatografía en fase reversa (12g, C-18). Los reactivos y los productos secundarios eluyen con H2O/CH3CN: 90/10^40/60 mientras que el producto deseado 2i eluye con 100% DMSO. El producto se obtuvo como sólido amarillento (23 mg, 18%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,09 - 9,92 (m, 2H), 8,70 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 8,59 - 8,47 (m, 1 H), 8,31 (s, 1 H), 8,14 - 8,06 (m, 1 H), 8,00 (dd, J = 7,8, 1 ,8 Hz, 1 H), 7,92 - 7,66 (m, 5H), 7,63 - 7,47 (m, 4H), 7,24-7,05 (m, 1 H), 1 ,24 (s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 160,6, 156,8, 154,9, 152,2, 151 ,9, 149,6, 138,6, 137,6, 127,9, 127,8, 126,1 , 126,0, 123,6, 123,5, 116,6, 115,6, 108,4, 108,2, 106,5, 79,6, 79,4, 28,0, 27,9. LRMS (ESI ⁺ ) m/z 672 [M+H] ⁺ . terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 3- fluorofenil)carbamoil)-2-fluorofenil)amino)(piridin-2-il)met ileno)carbamato (2j). La reacción se llevó a cabo con 5j (51 mg, 0,19 mmol), 7 (197 mg, 0,78 mmol), HgCl2 (217 mg, 0,80 mmol), EtsN (109 pL, 0,77 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. La mezcla de reacción se filtró sobre Celite y florisil lavando el precipitado con CH2CI2 y MeOH. El disolvente se eliminó a vacío y el producto se purificó por cromatografía en fase reversa (12g, C-18). Los reactivos y los productos secundarios eluyen con H2O/CH3CN: 90/10— >40/60 mientras que el producto deseado 2i eluye con 100% DMSO. El producto se obtuvo como sólido amarillento (28.2 mg, 22%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10.09 - 9.92 (m, 3H), 8.82 - 8.44 (m, 2H), 8.14 - 6.95 (m, 12H), 1.22 (s, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164.4, 164.2, 162.5, 153.5, 152.0, 151.9, 151.6, 151.3, 149.4, 149.3, 149.1 , 149.0, 148.8, 138.9, 137.6, 128.5, 126.0, 124.5, 123.7, 123.4, 123.1 , 116.4, 116.2, 1 16.2, 108.4, 108.2, 108.0, 80.9, 80.6, 28.0, 27.9. HPLC-MS (UV): > 95%. LRMS (ESI ⁺ ) m/z 672 [M+H] ⁺ . terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 2- fluorofenil)carbamoil)-3-fluorofenil)amino)(piridin-2-il)met ileno)carbamato (2k).

La reacción se llevó a cabo con 5k (50 mg, 0,19 mmol), 7 (194 mg, 0,77 mmol), HgCl2 (208 mg, 0,77 mmol), EtsN (110 pL, 0,79 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. La mezcla de reacción se filtró sobre Celite y florisil lavando el precipitado con CH2CI2 y MeOH. El disolvente se eliminó a vacío y el producto se purificó por cromatografía en fase reversa (12g, C-18). Los reactivos y los productos secundarios eluyen con H2O/CH3CN: 90/10 40/60 mientras que el producto deseado 2k eluye con 100% DMSO. El producto se obtuvo como sólido amarillento (48,4 mg, 38%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,19 (s, 1 H), 9,99 (s, 1 H), 9,88 (d, J = 3,3 Hz, 1 H), 8.70 (tt, J = 5.5, 1.1 Hz, 2H), 8,21 - 7,96 (m, 3H), 7,83 (t, J = 13,6 Hz, 2H), 7,76 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,73 - 7,66 (m, 2H), 7,63 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,61 - 7.53 (m, 2H), 7,52 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 1 .25 - 1 .22 (m, 18H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,6, 160,6,

160.4, 156,8, 156,7, 151 ,9, 151 ,5, 149,6, 149,5, 149,1 , 149,0, 148,9, 137,7, 137,6, 131 ,3, 126,2, 126,0, 123,6, 123,5, 121 ,4, 121 ,3, 1 16,6, 116,4, 108,3, 108,1 , 107,7, 107,5, 79,8,

79.4, 28,01 , 27,99. HPLC (UV): > 95 %. LRMS ( ES l ⁺ ) : m/z 672 [M+H], terc-butil ((E)-((4-((4-((E)-N'-(terc-butoxicarbonil)picolinimidamido)- 3- fluorofenil)carbamoil)-3-fluorofenil)amino)(piridin-2-il)met ileno)carbamato (2I). La reacción se llevó a cabo con 5I (50 mg, 0,19 mmol), 7 (194 mg, 0,77 mmol), HgCh (214 mg, 0,79 mmol), EtsN (106 pL, 0,76 mmol) y diclorometano anhidro (2 mL) siguiendo el método general. La mezcla de reacción se filtró sobre Celite y florisil lavando el precipitado con CH2CI2 y MeOH. El disolvente se eliminó a vacío y el producto se purificó por cromatografía en fase reversa (C-18). Los reactivos y los productos secundarios eluyen con H2O/CH3CN: 90/10— >40/60 mientras que el producto deseado 2k eluye con 100% DMSO. El producto se obtuvo como polvo amarillento (27,8 mg, 22%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,56 - 10.33 (m, 1 H), 10,31 -10,12 (m, 1 H), 9,61 - 9,39 (m, 1 H), 8,72 - 8,63 (m, 2H), 8,13 - 7,36 (m, 10H), 7,35 - 6,45 (m, 1 H), 1 ,26 (s, 9H), 1 ,22 (d, J = 5,7 Hz, 9H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 162,7, 160,5, 160,4, 158,5, 156,7, 153,5, 152,0, 151 ,6, 151 ,52, 151 ,46, 151 ,1 , 149,6, 149,3, 148,7, 137,7, 137,6, 130,9, 126,2, 125,9, 123,6, 123,4, 123,2, 116,4, 1 15,9, 1 15,8, 107,8, 107,6, 80,6, 79,8, 28,03, 27,99, 27,92. HPLC (UV): > 95 %. LRMS (ESI+): m/z 672 [M+H],

1.9. Procedimiento general para la hidrólisis del grupo Boc empleando ácido trifluoroacético (3b-g; 3i— I) A una solución en CH2CI2 (2 mL) del compuesto protegido con Boc agitada en frío (baño de hielo) se añade lentamente el ácido trifluoroacético (2 mL). La mezcla resultante se agita 2 horas a 0 ^º C. El exceso de ácido tñfluoroacético y diclorometano se evaporan a vacío. El proceso se repite, añadiendo CH ₂ CI ₂ al crudo y evaporando el disolvente a alto vacío. El sólido pegajoso se tritura con dietil éter para precipitar el producto como un sólido en polvo. di-trifluoroacetato de 5-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)piridin-2- il)picolinamida (3b). Siguiendo el método general con 5b (80 mg; 0,13 mmol) se obtuvo 3b como sólido marrón (78 mg; 90%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 11 ,68 (br s, 1 H), 10,55 (s, 1 H), 9,44 (br s, 1 H), 8,95 - 8,87 (m, 2H), 8,85 - 8,79 (m, 2H), 8,48 - 8,40 (m, 5H)), 8,27 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 8,22 (d, J = 9,9 Hz, 1 H), 7,98 - 7,80 (m, 4H). HPLC (UV): > 95 %. LRMS (ESI ⁺ ): m/z 438,3 [M+H], di-trifluoroacetato de 3-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidarnido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3c). Siguiendo el método general con 5c (50 mg; 70 pmol) se obtuvo 3c como sólido amarillento (45 mg, 88%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 10,41 (s, 1 H), 10,09 (br s, 1 H), 9,56 (br s, 1 H), 8,91 (d, J = 4,4 Hz, 1 H), 8,84 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 8,42 - 8,32 (m, 2H), 8,32 - 8,20 (m, 2H), 8,17 (t, J = 7,8, 7,8 Hz, 1 H), 8,09 (dd, J = 8,3, 2,0 Hz, 1 H), 7,87 (dd, J = 8,3, 4,7 Hz, 1 H), 7,82 - 7,73 (m, 3H), 7,61 - 7,46 (m, 2H), 3,63 (br s, 2H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,8, 159,6, 149,9, 149,4, 144,6, 138,5, 138,2, 134,9, 130,1 , 129,6, 129,3, 128,7, 128,1 , 127,2, 125,2, 123,9, 123,1. HPLC (UV) > 95%. LRMS (ESI ⁺ ): m/z 504,3 [M+H], di-trifluoroacetato de 3-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidarnido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3d). Siguiendo el método general con 5d (25 mg; 36 pmol) se obtuvo 3d como sólido amarillento (20 mg, 76%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 10,49 (br s, 3H), 9,14 - 8,78 (m, 3H), 8,61 - 8,28 (m, 3H), 8,25 - 8,04 (m, 3H), 8,03 - 7,68 (m, 3H), 7,36 - 7,17 (m, 3H). HPLC (UV) > 95%. LRMS (ES l ⁺ ) : m/z 504,3 [M+H], di-trifluoroacetato de 2-cloro-N-(2-cloro-4-(picolinimidarnido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3e). Siguiendo el método general con 5e (57 mg; 80 pmol) se obtuvo 3e como sólido marrón (31 mg, 67%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-de) 5 10,16 (br s, 1 H), 9,94 (s, 1 H), 9,85 (s, 2H), 9,49 (br s, 1 H), 7,72 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,53 - 7,40 (m, 5H), 7,33 - 7,24 (m, 2H), 7,13 (s, 1 H), 6,85 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 6,76 - 6,72 (m, 2H). di-trifluoroacetato de 2-cloro-N-(3-cloro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3f). Siguiendo el método general con 5f (30 mg; 40 pmol) se obtuvo 3f como sólido blanquecino (24 mg, 82%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 11 ,01 (s, 1 H), 8,92 - 8,90 (m, 1 H), 8,89 - 8,87 (m, 1 H), 8,46 - 8,31 (m, 2H), 8,29 - 8,15 (m, 3H), 7,90 - 7,81 (m, 2H), 7,81 - 7,75 (m, 2H), 7,69 (br s, 1 H), 7,58 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,50 (br s, 1 H), 3,52 (br s, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,9, 159,8, 150,0, 149,9, 149,7, 149,5, 144,3, 140,3, 138,5, 138,3, 131 ,0, 130,9, 130,2, 129,6, 128,7, 128,3, 124,5, 123,6, 120,6, 1 19,5. LRMS (ESI+): m/z 405,4 [M+H], di-hidrocloruro de 2-isopropoxi-N-(2-isopropoxi-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3g). Una disolución de HCI (4M en dioxano) fue añadida gota a gota a una disolución del compuesto 5g en CH ₂ CI ₂ (3 mL) enfriada con un baño de hielo. La mezcla resultante se agitó durante 2 horas a 0 ^° C. El exceso de HCI y diclorometano se evaporan a vacío. El sólido pegajoso se tritura con Et ₂ O para precipitar el producto como un sólido marrón (24 mg, 65%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 9,83 (s, 1 H), 9,21 (s, 1 H), 8,89 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 8,74 - 8,61 (m, 1 H), 8,40 (dd, J = 8,5, 4,6 Hz, 1 H), 8,22 (ddd, J = 1 1 ,2, 6,4, 2,5 Hz, 1 H), 8,17 - 7,97 (m, 1 H), 7,85 (dd, J = 7,7, 4,8 Hz, 1 H), 7,77 (dd, J = 9,9, 8,5 Hz, 2H), 7,14 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 6,93 (dd, J = 8,5, 2,3 Hz, 1 H), 6,45 - 6,41 (m, 1 H), 6,36 - 6,32 (m, 1 H), 4,75 - 4,58 (m, 4H), 3,73 - 3,64 (m, 1 H), 3,52 - 3,43 (m, 1 H), 1 ,44 - 1 ,36 (m, 12H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 163,2, 159,5, 157,3, 149,8, 149,0, 148,6, 148,3, 147,4, 147,1 , 144,5, 138,5, 138,4, 137,9, 133,1 , 129,1 , 128,6, 128,0, 126,5, 123,8, 122,6, 122,0, 121 ,4, 114,9, 108,6, 107,8, 72,2, 71 ,9, 22,0, 21 ,9. di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidarnido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3i). Siguiendo el método general con 5i (6.5 mg; 0,01 mmol) se obtuvo 3i como sólido amarillento (5.5 mg, 97%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆ ) 5 10,24 (s, 1 H), 9,44 (br s, 1 H), 8,89 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 8,76 (d, J = 3,5 Hz, 1 H), 8,37 (d, J = 7,9 Hz, 3H), 8,23 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 8,1 1 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 8,02 - 7,67 (m, 7H), 7,46 (d, J = 10,8 Hz, 1 H), 7,40 - 7,24 (m, 2H). HPLC-MS (UV) > 95%; LRMS ( ES l ⁺ ) m/z 472 [M+H]. di-trifluoroacetato de 3-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3j). Siguiendo el método general con 5j (10,7 mg; 0,016 mmol) se obtuvo 3j como sólido amarillento (7.5 mg, 80%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 10,24 (s, 1 H), 9,44 (br s, 1 H), 8,89 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 8,76 (d, J = 3,5 Hz, 1 H), 8,37 (d, J = 7,9 Hz, 3H), 8,23 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 8,1 1 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 8,02 - 7.67 (m, 7H), 7,46 (d, J = 10,8 Hz, 1 H), 7,40 - 7,24 (m, 2H), ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 165,2, 158,8, 157,9, 155,9, 151 ,0, 150,2, 146,1 , 139,9, 139,5, 129,8, 129,0, 128,3,

126.1 , 125,0, 124.0, 123,0, 117,4, 1 17,2, 115,1. HPLC (UV); > 95%. LRMS (ESI+) m/z 472 [M+H]+. di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(2-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3k). Siguiendo el método general con 5k (15,3 mg; 0,023 mmol) se obtuvo 3k como sólido amarillento (12,6 mg, 94%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 10,25 (br s, 1 H), 8,83 (s, 2H), 8,47 (s, 1 H), 8,30 (s, 4H), 7,89 (s, 5H), 7,13 (s, 6H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 164,9, 163,6, 161 ,6, 160,9, 160,7, 160,5,

160.2, 152,3, 152,1 , 134,4, 131 ,4, 131 ,0, 128,6, 126,6, 123,5, 116,5, 105,4. HPLC-MS (UV) > 95%; LRMS (ESI ⁺ ) m/z 472 [M+H], di-trifluoroacetato de 2-fluoro-N-(3-fluoro-4-(picolinimidamido)fenil)-4- (picolinimidamido)benzamida (3I). Siguiendo el método general con 5I (12,7 mg; 0,019 mmol) se obtuvo 3I como sólido amarillento (10,3 mg, 93%). ¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 11 ,72 (br s, 1 H), 10,90 (s, 1 H), 10,06 (br s, 1 H), 9,30 (br s, 2H), 8,89 (t, J =

5.8 Hz, 2H) , 8,38 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 8.30 - 8.17 (m, 2H), 7,97 (d, J = 12,8 Hz, 1 H), 7,86 (dt, J = 13,9, 7,7 Hz, 3H), 7,65 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 7,53 (t, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,45 (d, J =

9.8 Hz, 1 H), 7,34 (d, J = 8,5 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 165,4, 163,1 , 161 ,1 , 152,6, 152,2, 146,8, 141 ,3, 133,9, 133,8, 131 ,6, 131 ,4, 131 ,0, 126,4, 126,3, 124.0, 119,0, 119,0, 110,6, 1 10,4. HPLC-MS (UV) = 95%; LRMS (ESI ⁺ ) m/z 472 [M+H],

1.10. Procedimiento para la síntesis de 2-arilimidamidas 3a, 3h, 17, 18 di-trifluoroacetato de 4-(picolinimidamido)-N-(4-

(picolinimidamido)fenil)benzamida (3a). Una disolución de la diamina comercial 5a (0,5 g; 2,2 mmol) en EtOH/CH ₃ CN (3:1 , 6 mL) fue agitada a 0 ^° C. A continuación, se añadió lentamente una disolución de 8 (2 g, 5,5 mmol) en EtOH/CH ₃ CN (3:1 , 6 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. Los disolventes se evaporaron a vacío y el producto se purificó por cromatografía en columna de sílice eluyendo con hexano:EtOAc (20:80 — > 0:100), obteniéndose un sólido amarillento (220 mg; 23%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 10,05 (s, 1 H), 8,65 (ddt, J = 6,7, 4,9, 1 ,4, 1 ,4 Hz, 2H), 8,33 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 8,07 - 7,88 (m, 4H), 7,79 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,56 (dddd, J = 9,0, 7,5, 4,8, 1 ,3 Hz, 2H), 7,05 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,90 - 6,00 (m, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 164,8, 153,7, 151 ,8, 151 ,6, 151 ,2, 148,1 , 148,0, 145,6, 137,2, 137,1 , 134,2, 129,0, 128,6, 125,6, 125,4, 121 ,6, 121 ,5, 121 ,4, 121 ,2, 113,7, 112,5. HPLC (UV): > 95 %. LRMS (ESI+): m/z 436,4 [M+H], di-hidrocloruro de 4-(picolinimidamido)-N-(5-(picolinimidamido)pyridin-2- yl)benzamide (3h). Una disolución de 5h (86 mg; 0,38 mmol) en EtOH/CH ₃ CN (3:1 , 8 mL) fue agitada a 0 ^° C. A continuación, se añadió el sólido 8 (284 mg, 0,79 mmol) de una vez. La mezcla de reacción se agitó a 0 ^° C y luego se dejó volver a temperatura ambiente, continuando la agitación durante 5 días. Se añadió Et ₂ O a la mezcla de reacción y el precipitado se colectó en una placa filtrante. El precipitado se lavó con Et ₂ O, y luego se disolvió en EtOH (20 mL). La disolución se enfrió con un baño de hielo y se basificó (pH = 10) con NaOH 1 N. A continuación, el etanol se evaporó a vacío y se añadió agua (25 mL) al crudo. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3x40 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera y se secó sobre Na ₂ SÜ4. El disolvente fue evaporado, obteniéndose un residuo amarillento. Una primera purificación por cromatografía en sílice (cartucho SI de 5 g) con CHCI ₃ / NH ₃ ( _Sa t.)-MeOH: 0->5% dio lugar a una mezcla (=75/25, 38 mg) del producto esperado 3h (M = 436) junto con el producto mono- sustituido (M = 332). La mezcla se disolvió en CH ₂ CI ₂ /MeOH (2 mL), se enfrió con un baño de hielo, y se trató con una disolución saturada de HCI _g en dioxano. La reacción se agitó suavemente a 0 ^° C durante 1 h. El precipitado (i.e. hidrocloruro del producto mono-sustituido, sólido blanco, 20 mg) fue colectado por filtración. El filtrado fue evaporado y el sólido obtenido se recristalizó con CH ₂ CI ₂ /MeOH at -20 ^° C. El producto se lavó con Et ₂ O, obteniéndose un sólido blanquecino (10 mg). HPLC = 91 %. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 11 ,99 (brs, 1 H), 11 ,84 (brs, 1 H), 11 ,27 (s, 1 H), 10,22 (brs, 1 H), 10,20 (brs, 1 H), 9,50 (brs, 2H), 8,92 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 8,55 (d, J = 2,7 Hz, 1 H), 8,50 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 8,47 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 8,41 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 8,31 -8,20 (m, 4H), 8,01 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1 H), 7,92 - 7,84 (m, 2H), 7,65 (d, J = 8,1 Hz, 2H). LRMS (ES l ⁺ ) m/z 437 [M+H] ⁺ . r,N"-(etano-1 ,2-diilbis(4,1-fenileno))dipicolinimidamida (17). Una suspensión de 4,4'-diaminobibencilo 16 (106 mg, 0,5 mmol) y naftalen-2-ilmetil piridino-2- carbimidotioato 8 (449 mg, 1 ,25 mmol) en EtOH/CH ₃ CN (3:1 , 16 mL) fue agitada durante una noche. El disolvente se evaporó a vacío y el producto se purificó por cromatografía en columna de sílice eluyendo con hexano:EtOAc (100:0 — > 10:90). El producto 17 se obtuvo como sólido amarillento (51 mg, 24%). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-de) 5 8,63 (ddd, J = 4,8, 1 ,8, 1 ,1 Hz, 2H), 8,31 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,95 (td, J = 7,8, 7,8, 1 ,8 Hz, 2H), 7,55 (ddd, J = 7,8, 4,8, 1 ,1 Hz, 2H), 7,33 - 7,17 (m, 4H), 6,88 (d, J = 7,8 Hz, 4H), 2,87 (s, 4H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO-d ₆ ) 5 151 ,8, 151 ,4, 148,0, 147,5, 137,1 , 135,6, 129,2, 125,4, 121 ,4, 121 ,3, 36,9. HRMS: 95%. Anal. Calc.: C, 74,26; H, 5,75; N, 19,99. Encontrado: C, 73,59; H, 5,74; N, 19,36.

N,N'-((carbonilbis(azanediil))bis(4,1-fenileno))dipicolin imidamida (18). Una suspensión de 1 ,3-bis(4-aminophenyl)urea 10 (300 mg, 1 ,2 mmol) e hidrobromuro de naftalen-2-ilmetil piridino-2-carbimidotioato 8 (1 ,1 g, 3,1 mmol) en EtOH/CH ₃ CN (3:1 , 24 mL) fue agitada durante una noche. El sólido obtenido se lavó con MeOH y se secó. A continuación, el sólido fue disuelto en CH2CI2 y MeOH fue añadido para precipitar el producto como sólido blanquecino (220 mg, 39,4%). ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-de) 5 7,90 - 7,88 (m, 4H), 7,88 - 7,86 (m, 4H), 7,86 - 7,84 (m, 2H), 7,83 - 7,81 (m, 4H), 7,80 - 7,77 (m, 2H), 7,66 - 7,64 (m, 2H), 7,53 - 7,48 (m, 4H). ¹³ C NMR (101 MHz, DMSO) δ 150,9, 139,7, 133,0, 128,0, 127,5, 127,5, 127,4, 126,9, 126,2, 126,0, 125,7.

Ejemplo 2. Ensayos in vitro de la actividad leishmanicida de los compuestos de la invención

Los compuestos se evaluaron in vitro frente a formas promastigotas de L. donovani (cepa MHOM/ET/67/HU3) siguiendo el método colorimétrico de MTT descrito previamente (Kennedy ML, et al. J Med Chem 2001 , 44, 4668-4676) y amastigotas intracelulares del parásito L. donovani (cepa MHOM/ET/67/HU3) infectando macrófagos derivados de células THP-1 y aplicando el método colohméthco de resazurina descrito previamente (Koutsoni OS, et al. Bio-protocol 2019;9:e3410). Además, se evaluó su citotoxicidad sobre células humanas THP-1 y se calculó el índice de selectividad (IS) de cada compuesto (Tabla 1 ). Todas estas líneas celulares se cultivaron a 28 '’C en medio modificado RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con hiFBS al 10 % (Invitrogen), tal como descrito previamente (Jackson, PR, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1984, 33, 808- 819).

Los compuestos objetos de esta patente muestran actividades sobre formas promastigotas y amastigotas intracelulares de L. donovani en el rango micromolar a submicromolar (3a, 3b, 3c, 3d, 3f, 3g, 3h, 17), siendo de potencia parecida al fármaco de referencia miltefosina usado en este ensayo. Destacan los compuestos (3b, 3c, 3d) por ser más efectivos sobre las formas amastigotas intracelulares con respecto a las formas promastigotas.

Además, los compuestos muestran selectividad hacia Leishmania con índices de selectividad (IS) > 19 frente a las células humanas THP-1 para los más activos

(3a, 3b, 3c, 3d, 17). Destaca el compuesto 3a por su actividad submicromolar frente a formas promastigotas y amastigotas intracelulares de L. donovani, así como su índice de selectividad >76. Tabla 1. ^a Actividad leishmanicida de los compuestos de la invención (EC ₅ o representa la concentración del compuesto para producir 50% del efecto máximo de ese compuesto) a Parásitos y células THP-1 se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de los compuestos. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. ^b IS= índice de selectividad (EC50 THP-1 / EC50 parásito (forma amastigota)). ^c no ensayado. ^d Anfotericina B. ^e Miltefosina.

Ejemplo 3. Ensayos in vitro de la actividad tripanocida de los compuestos de la invención.

Los compuestos se evaluaron in vitro frente a formas tripomastigotas sanguíneos de T. b. brucei (cepa silvestre s427 y cepa fármaco-resistente B48) siguiendo el método colorimétrico del Alamar blue descrito previamente (Ebiloma GU, et al. Eur. J. Med. Chem. 2018, 150, 385-402). Por otra parte, los compuestos se evaluaron in vitro frente a epimastigotas y amastigotas intracelulares de T. cruzi (cepa CL lacZ) siguiendo un protocolo descrito previamente (Fonseca-Berzal C, et al. Eur. J. Med. Chem. 2016, 115, 295-310).

Los compuestos de la invención de las series bis(2-aminoimidazolinas) muestran actividades en el rango micromolar contra la cepa sensible (s427) y la cepa fármaco- resistente B48 del párasito Trypanosoma brucei (Tabla 2). Los compuestos de la serie bisarilimidamida muestran actividades en el rango submicromolar contra la cepa sensible (s427) y la cepa fármaco-resistente B48. Cabe destacar que los compuestos son equipolentes contra las cepas sensible y fármaco-resistente B48 (Factor de resistencia ~1). Los compuestos 3a, 3b, y 3d en particular son los más potentes de la serie con actividad submicromolar y un índice de selectividad > 118.

En cuanto a la actividad sobre el parásito Trypanosoma cruzi (Tabla 3), destacan los compuestos de la serie bisarimidamida con actividades sobre epimastigotas en el rango nanomolar (3c, 3d, 3f), submicromolar (3a, 3b, 3i, 3j, 3k, 3I) y micromolar bajo (3e, 3g, 17). Estos compuestos son también activos sobre la forma amastigota intracelular de T. cruzi, con actividades en el rango submicromolar (3c, 3d, 3f) a micromolar bajo (3a, 3g, 17). Cabe destacar el compuesto 3f que es dos veces más potente que el fármaco de referencia beznidazol, y el compuesto 3c que tiene la misma potencia que el benznidazol. Todos los compuestos son selectivos hacia el parásito con índices de selectividad comprendidos entre 24 y 399 frente a amastigotas intracelulares.

Tabla 2. ^a Actividad sobre T. brucei (EC50) de los compuestos de la invención y citotoxicidad (CC50: es la concentración citotóxica: la concentración que causa el 50% de muerte celular) sobre células HEK. a Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. ^b Cepa s427 de T. b. brucei. ^c Cepa B48 de T. b. brucei resistente a pentamidina y diminaceno. ^d FR = factor de resistencia (EC50 T. b. B48 / EC50T. b. s427). e Pentamidina. ^f Diminaceno.

Tabla 3. ^a Actividad sobre T. cruzi (EC50, pM) de los compuestos de la invención

a Parásitos (cepa CL lacZ) y células L929 se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de los compuestos. Los datos representan la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. ^b IS= índice de selectividad (EC50 L929 / EC50 parásito). c Fármaco de referencia: benznidazol.

Ejemplo 4. Estabilidad del compuesto JN-ll-40 frente a metabolismo hepático y en suero.

Se estudió la estabilidad microsomal del compuesto 3a hacia el metabolismo por el citocromo P450 (metabolismo de Fase I) y la uridina glucuronosil transferasa (UGT) (metabolismo de Fase II) en presencia de NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) y UDPGA (Tabla 4). Para ello, se siguió el protocolo descrito previamente (Manzano JI, et al. J. Med. Chem. 2019, 62, 10664-10675).

El Compuesto 3a no fue metabolizado por microsomas de hígado humano y de hígado de ratón (CD-1 ). Tampoco fue metabolizado por enzimas usando el cofactor UDPGA (ácido Uridina 5'-difosfoglucurónico) (enzimas de fase 2) de microsomas de hígado de ratón y de hígado humano. No encontramos ningún metabolito significativo en el tiempo de reacción de hasta 120 min. Por te tanto, el compuesto 3a es estable. Su tiempo de vida media fue de más de 2 h. En comparación, los microsomas de hígado humano metabolizaron rápidamente (alto aclaramiento intrínseco) el diclofenaco en las mismas condiciones con un tiempo de vida media de menos de 30 min. Comparativamente, los microsomas de hígado de ratón (CD-1 ) metabolizaron lentamente el fármaco diclofenaco. El compuesto 3a no se modificó en suero humano y fue estable durante 1 h de incubación. Luego, se concluye que, en las condiciones experimentales utilizadas, el compuesto es metabólicamente estable frente a fracciones microsomales de humanos y ratones, y en suero humano.

Tabla 4. Metabolismo hepático y en suero