Campo de la invención

La presente invención se encuadra en general en el campo de la biomedicina y en particular se refiere a nuevos compuestos para el tratamiento de enfermedades causadas por parásitos de! género Leishmania.

Estado de la técnica

La Leishmania es un flagelado tripanosomátido del orden de los cinetoplástidos responsable de la enfermedad leishmaniosis, cuyo vector principa! de infección son los mosquitos del género Phlebotomus y Llutzomya. La leishmaniosis afecta a distintas especies de mamíferos y al hombre. La Organización Mundial de la Saiud (OMS) estima que en todo el mundo están afectados por dicha enfermedad aproximadamente 12 millones de personas.

Los especímenes de Leishmania muestran dos morfologías durante su ciclo vital:

- Promastigote, con forma alargada con un cilio o flagelo anterior, en el intestino del invertebrado vector.

- Amastigote, con forma esférica y con un cilio muy corto, que no sobresale de la bolsa flagelar, de modo que sólo es apreciable en el microscopio eléctrónico, que se reproduce dentro de macrófagos y células del sistema retículoendotelial del huésped vertebrado. Las infecciones se producen en la piel (cutáneas), piel y mucosas (mucocutáneas) o en los órganos (viscerales).

Existen pocos medicamentos disponibles para el tratamiento de la enfermedad. Actualmente se han descrito inhibidores de la histona deacetilasa. La solicitud de patente WO2008/090585 describe procesos de preparación de formas solubles de compiejos inhibidores de la histona deacetiiasa con ciclodextrina y ei uso de los mismos para el tratamiento de tripanosomiasis causada por ieishmanía.

Vishal Patil, William Guerrant Po C. Chen, Berkiey Gryder, Derek B. Benicewicz, Shabana i. Khan, Babu L. Tekwani "Antimalarial and antileishmanial activities of histone deacetylase inhibitors with triazoie- linked cap group" Bioorganic & Medicinal Chemistry. Voiume 18, Issue 1 , 1 January 2010, Pages 415-425, describe la relación estructura/actividad de los compuestos inhibidores de la histona deacetilasa y con la actividad antimaiaria y antileishmania.

Sin embargo, estos compuestos presentan escasa solubilidad y necesitan ser administrados en altas dosis para ser efectivos, de tal forma que presentan una toxicidad relativamente alta.

Existe pues ía necesidad de encontrar un medicamento para el tratamiento y prevención de la infección por Leishmania, que solucione los problemas descritos en el estado de la técnica.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un compuesto antileishmania efectivo frente al parásito, que presenta una baja toxicidad incluso a dosis altas del compuesto. Así pues, la presente invención en un primer aspecto se refiere a un compuesto de fórmula general (I)

donde:

R1 es seleccionado de entre H ó Cl

R2 es seleccionado de entre H, Me ó OMe

R3 es seleccionado de entre H ó OMe

n = 0, 1 , 2 En una realización preferida, R1 = R2 = R3 = H y n es 1.

En otra realización preferida, R1 es Cí, R2 = R3' = H y n es 1

En otra realización preferida, R1 = R3 = H, R2 es Me y n es 1

En otra realización preferida, R1 es H, R2 = R3' = OMe y n es 1

En un segundo aspecto la presente invención se refiere al compuesto de fórmula general I según se ha descrito anteriormente, para uso como medicamento.

En un tercer aspecto, el compuesto de fórmula general (I) de la presente invención, según se ha descrito anteriormente, es para el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos del género Leishmania. Particularmente el parásito es L infantum.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula general I según se ha descrito anteriormente y excipientes farmacéuticamente aceptables. En un aspecto más en particular, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica descrita anteriormente para el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por parásitos del género Leishmania.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis del compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente que comprende hacer reaccionar en una disolución un ácido de fórmula general (III) o un derivado del mismo de fórmula general (il),

(III) 00

donde n = 0, 1 ó 2

con un cloruro de tritilo de fórmula genera! (V) o una hidroxilamína de fórmula general (IV)

(V) (IV)

donde

R1 es seleccionado de entre H o Cl

R2 es seleccionado de entre H, Me ó OMe

R3 es seleccionado de entre H ó OMe

En una realización particular de la presente invención, el procedimiento para la obtención del compuesto de fórmula general (I) comprende hacer reaccionar en una disolución un ácido de fórmula genera! (III),

donde n = 0, 1 ó 2

con un cloruro de tritilo de fórmula genera! (V),

donde

R1 es seleccionado de entre H o Cí

R2 es seleccionado de entre H, Me ó OMe

R3 es seieccionado de entre H ó OMe En otra realización particular de la presente invención, el procedimiento para la obtención del compuesto de fórmula general (I) comprende hacer reaccionar en una disolución un compuesto de fórmula general (II):

(li)

donde n= 0, 1 ó 2

con una hidroxilamina de fórmula general (IV)

donde

1 es seleccionado de entre H o CI

R2 es seleccionado de entre H, Me ó OMe

R3 es seleccionado de entre H ó OMe.

El compuesto de la invención soportado sobre nanopartículas poiimérícas o de oro ha demostrado tener unas características de solubilidad mucho mejores que el compuesto soio, sin que la efectividad de las nanoparticulas-compuesto de la invención disminuya.

Por lo tanto, el sexto aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula general (I) según ha sido descrito arriba soportado sobre nanopartículas de un polímero farmacéuticamente aceptable y biodegradable. El término "nanoapartículas" como se describe en la presente invención se refiere a partículas de menos de 1 micrómetro en alguna de sus dimensiones, preferentemente en un rango de 10 a 900 nanómetros.

En la presente invención "polímeros farmacéuticamente aceptables y biodegradables" se refiere a polímeros biodegradable conocidos en ei estado de la técnica que puedan ser utilizados para la formación de nanopartículas y que sean aceptables farmacéuticamente. Estos polímeros incluyen entre otros, ácidos polihidroxilados tal como ácidos polilácticos, y poliglicólicos y copolímeros de ellos como el PLGA (ácido poliláctico glícólico), polianidridas, poliesteres y polisacáridos, por ejemplo quitosanos.

El término "biodegradable" se refiere a polímeros que se disuelven o se degradan en un periodo el cual es aceptable para la aplicación deseada, en este caso terapias in vivo, una vez ha sido expuesto a una solución fisiológica a un pH entre 6-9 y a una temperatura comprendida entre 25 ^a C y 40°C.

En la presente invención "composiciones farmacéuticas" se refiere a composiciones aplicables tanto en humanos como en mamíferos, particularmente en perros.

.Preferentemente en ei sexto aspecto de la invención el polímero es PLGA (ácido poliláctico glícólico).

En un séptimo aspecto de la invención la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula general (i) según se ha definido arriba soportado sobre nanopartículas de oro.

Se ha demostrado en la presente invención que si las composiciones farmacéuticas presentan además un compuesto de Sb(V) el efecto con el compuesto (I) de la invención es sorprendente.

Por lo tanto, en un octavo aspecto de la invención las composiciones farmacéuticas según eí sexto y séptimo aspecto de la invención comprenden un compuesto de Sb(V). Particularmente el compuesto de Sb (V) es antimoniato de megiimina. Particularmente el compuesto de fómula general (I) es N- trifenilmetoxi-N'feniloctano diamida, el compuesto de Sb(iV) es antomoniato de megiimina y el polímero es PLGA. Por último la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas arriba referenciadas que comprenden excipientes farmacéuticamente aceptables.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la efectividad de los compuestos de la presente invención en base al % de infección.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1: Procedimiento general para la síntesis de compuestos de fórmula general (I)

El procedimiento general para la síntesis del compuesto de fórmula general (I) según se ha descrito en la presente invención, consistió en hacer reaccionar en una disolución un ácido hidroxámico de fórmula general (III) o un precursor del mismo de fórmula general (II)

(!!!) (II)

donde n = 0, 1 ó 2

con un cloruro de tritilo de fórmula general (V) o una hidroxilamina O-sustituida de fórmula general (IV)

(V) (IV)

donde

R1 es seleccionado de entre H o Cl R2 es seleccionado de entre H, Me ó OMe

R3 es seleccionado de entre H ó OMe

El Esquema 1 muestra la preparación del compuesto de fórmula general (I) a partir de una disolución con el derivado dei ácido carboxíiico de fórmula general (II) (1 equiv.), HOAt (1 equiv.), EDCI (1 equiv.), TEA (1 equiv.) y la correspondiente hidroxilamina de fórmula general (IV) (2 equiv.) en DMF. La solución obtenida se mantuvo en agitación durante 6 horas a temperatura ambiente. Transcurrido ei tiempo de reacción se diluyó con H ₂ 0 y se extrajo con acetato de etilo (AcOEt) (3 x 15 mL). Se secó sobre MgS0 _4> se filtró y se concentró a presión reducida. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía flash utilizando como eluyente hexano/acetato de etilo.

Esquema 1. Síntesis de nuevos fármacos para el tratamiento y/o prevención de la ¡eishmaniosis

El Esquema 2 muestra la preparación del compuesto de fórmula general (I) a partir de una solución con el ácido hidroxámico de fórmula general (ilí) (1 equivalente) y carbonato sódico (Na ₂ C0 ₃ ) (3 equivalentes) en DMF anhidra (1 mL), y posteriormente se adicionó el correspondiente cloruro de tritilo de fórmula general (V) bajo atmósfera de argón. La solución resultante se mantuvo en agitación durante 24 horas a 40 °C. A continuación se diluyó con 20 mL de H ₂ 0 y se extrajo con acetato de etilo (AcOEt) (3 x 15 mL). La fase orgánica se secó sobre MgS0 ₄ , se filtró y se concentró a presión reducida. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía flash utilizando como eluyente hexano/acetato de etilo. Compuesto de

fórmula general (i)

Esquema 2. Síntesis de nuevos fármacos para el tratamiento y/o prevención de la leishmaniosis

Los análisis de pureza se realizaron por HPLC: Flujo 0.8 mL/min.; detector λ = 254 nm. Disolvente A (agua:acetonitrilo 30:70 ó 40:60+ 0.1% fórmico). Disolvente B {acetonitriio 100% + 0.1 % fórmico). Procedimiento: ¡socrática disolvente A (2 min.); gradiente de A a B (10 min-20 min). Columna Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm.

Ejemplo 2: Síntesis de N-(trifenilmetoxi)-N'-feniloctanodiamida (COMPUESTO A)

Se siguió el procedimiento general según el Esquema 1 descrito anteriormente. Para eiio se utilizó eí derivado del ácido carboxilico de fórmula general (il) con n=1 (CAS 149648-52-2 AstaTech, Inc), la hidroxilamina de fórmula general (IV) con R1 = R2 = R3 = H) (CAS 31938-11-1 Aidrich), DMF 2 mL. El compuesto fue purificado por cromatografía flash utilizando como eluyente AcOE Hexano (1:2), obteniéndose un sólido blanco (Rendimiento = 50%). HPLC (método 1): t _R = 10,29 min (100%).

¹ H R N (DMSO-d ₆ ) δ 10.14 (sa, 1H, NH), 9.80 (sa, NH), 7.58 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Harom), 7.39 - 7.20 (m, 17H, H _{arom +} H^, 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1 H, H _arom ), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH ₂ ), 1.84 - 1.68 (m, 2H, CH ₂ ), 1.54 - 1.44 (m, 2H, CH ₂ ), 1.27 - 1.07 (m, 4H, CH ₂ ), 1.06 - 0.93 (m, 2H, CH ₂ ).

¹³ C RMN (DMSO-de) δ 171.14, 170.27, 142.43, 139.30, 128.92, 128.56, 127.45, 127.35, 122.84, 118.99, 91.70, 36.34, 31.93, 28.31 , 28.14, 24.90, 24.65.

HRMS ESI: Calculado para C ₃ 3H3 ₄ N ₂ 0 ₃ Na (M+Na) ⁺ m/z 529.2467 encontrado 529.2462 (desviación -0.9 ppm). Ejemplo 3: Síntesis de N-((2-clorofenil)difeniimetoxi)-N'~feniloctanodiamida. (COMPUESTO B)

Se siguió el procedimiento general según el Esquema 2 descrito anteriormente. Para ello se utilizó el compuesto de fórmula genera! (II!) con n = 1 (9,9 mg, 0,037 mmol), Na ₂ C0 ₃ (7,9 mg, 0,075 mmol), un cloruro de tritiio de fórmula general (V), en concreto el cloruro de 2-c!orotritilo con R1 = Cl, R2 = R3 = H (17,6 mg, 0,056 mmol, cloruro de 2-clorotritilo) y DMF anhidra (0,04 M). Se purificó por cromatografía flash utilizando como eluyente AcOEtHexano (1 ,5:1). Se obtuvo un sólido blanco (Rendimiento = 21%). Rf (TLC); 0,43 [AcOEt/Hex (2:1)]. HPLC (método 2): t _R = 9,25 min (100%).

H RMN (DMSO-de) δ 10.07 (sa, 1 H, NH), 9.80 (s, 1 H, NH), 7.95 (d, J = 7.7 Hz, 1 H, H _arom ), 7.58 (d, J = 7.7 Hz, 1 H, H _aram ), 7.48 - 7.45 (m, H, H _arom ), 7.40-7.26 (m, 14H, H _arom ) 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1 H, H _arom ), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH ₂ -CO), 1.81 - 1.69 (m, 2H, CH ₂ -CO), 1.52 - 1.46 (m, 2Hz, 2H, CH _Z ), 1.20 - 1.10 (m, 4H, CH ₂ ), 1.01 - 0.97 (m, 2H, CH ₂ ).

3C RMN (DMSO-d _e ) δ 168.96, 157.83, 138.19, 138.16, 129.28, 126.69, 125.48, 124.58, 38.81 , 32.08, 27.93, 27.61 , 25.68, 24.85.

HRMS ESI: Calculado para C ₃₃ H ₃₃ CI ₂ 0 ₃ Na (M+Na) ⁺ m/z 563,2077, encontrado 563,2070 (desviación 1 ,24 ppm).

Ejemplo 4: Síntesis de N-(difenil(p-metilfenil)metoxi)-N'-feniloctanodiamida (COMPUESTO C)

Se siguió el procedimiento general según el Esquema 2 descrito anteriormente. Para ello se utilizó el compuesto de fórmula general (Mí) con n = 1 (10 mg, 0,038mmol), Na ₂ C0 ₃ (8 mg, 0,077 mmol), un cloruro de trifilo de fórmula general (V), en concreto ef cloruro de 4-metiltritilo con R1 = R3 = H, R2 = Me (17 mg, 0,057 mmol) y DMF anhidra (0,04 M). Se purificó por cromatografía flash utilizando como eluyente AcOEtHexano (1 :1). Se obtuvo un sólido blanco (Rendimiento = 15%). Rf (TLC): 0,38 [AcOEt/Hex (1 :2)]. P. fusión: 133-136 °C. HPLC (método 2): í _R = 7.58 min (100%).

1H RMN (DMSO-d ₆ ) δ 10.09 (s, 1 H, NH), 9.79 (s, 1 H, NH), 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 2H, H _arom ), 7.32 - 7.26 (m, 12H, H _arorn ), 7.19 (d, J = 7.8 Hz, 2H, H _afom ), 7.12 (d, J = 7.9 Hz, 2H, H _arom ), 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1 H, H _arom ), 2.28 (s, 3H, Ph-CH ₃ ), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH ₂ -CO), 1.81 - 1.74 (m, 2H, CH CO), 1.52 - 1.46 (m, 2H, CH ₂ ), 1.20 - 1.11 (m, 4H, CH ₂ ), 1.04 - 0.96 (m, 2H, CH ₂ ).

¹³ C RMN (DMSO-de) δ 171.13, 170.22, 142.66, 139.37, 139.30, 136.54, 129.04, 128.82, 128.57, 128.01 , 127.41 , 127.25, 122.84, 1 18.98, 91.61 , 36.34, 31.97, 28.33, 28.12, 24.91 , 24.64, 20.55.

HRMS ESI: Calculado para C ₃₄ H ₃₆ N ₂ 0 ₃ Na (M+Na) ⁺ m/z 543,2624, encontrado 543,2617 (desviación 1 ,29 ppm).

Ejemplo 5: Síntesis de N-[bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxtj-N'-feniloctanodiamida (COMPUESTO D)

Se siguió el procedimiento general según el Esquema 2 descrito anteriormente. Para ello se utilizó el compuesto de fórmula general (llí) con n = 1 (20 mg, 0,076 mmol), Na ₂ C0 ₃ (48,4 mg, 0,456 mmol), un cloruro de tritilo de fórmula general (V), en concreto el 4,4 ^' -dimetoxi-trifenilclorometano con R1 = H, R2= R3 = OMe (77,3 mg, 0,228 mmol) y DMF anhidra (0,08 M). Se purificó por cromatografía flash utilizando como eiuyente AcOE Hexano (1 :1 ). Se obtuvo un sólido blanco (rendimiento = 64%). Rf (TLC): 0,22 [AcOEt/Hex (2:1)]. HPLC (método 2): t _R 5.52 min (96%).

¹ H RMN (DMSO-d ₆ ) Ó 10.07 (sa, 1 H, NH), 9.80 (sa, 1 H, NH), 7.58 (dd, J = 8.6, 1.1 Hz, 2H, H _arom ), 7.35 - 7.24 (m, 7H, H _aram ), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 4H, H _arom ), 7.03 - 6.99 (m, 1 H, H _arom ), 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 4H, H _arom ), 3.73 (s, 6H, CH ₃ ), 2.25 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH ₂ -CONH), 1.85 - 1.73 (m, 2H, CH ₂ -CONH), 1.55 - 1.45 (m, 2H, CH ₂ ), 1.26 - 1.12 (m, 4H, CH ₂ ), 1.08 - 0.94 (m, 2H, CH ₂ ).

¹³ C RMN (DMSO-d ₆ ) δ 171.13, 170.11 , 158.37, 139.31 , 134.46, 130.46, 128.56, 128.44, 127.45, 127.06, 122.84, 118.98, 112.69, 91.35, 54.99, 36.35, 32.00, 28.37, 28.18, 24.90, 24.66.

HRMS ESI: Calculado para C ₃₅ H ₃ 8 ₂ 0 ₅ a (M+Na) ⁺ m/z 589,2678, encontrado 589,2672 (desviación 1 ,02 ppm).

Ejemplo 6: Evaluación ín vitro: Ensayos in vitro en amastigotes intracelulares Para ensayar el porcentaje de infección por L. infantum se utilizaron macrófagos derivados de médula ósea (BMD ) de ratones tipo BALB/c. Estas células se extrajeron conforme a lo establecido por Zamboni, D. S.; Rabinovitch, . Nitric oxide partia!ly controls Coxiella burnetii phase II infection in mouse primary macrophages. Infecí Immun. 2003, 71 (3), 1225-1233. Los BMDM se cultivaron sobre cubreobjetos en pocilios de placas de microtitulación de 24 pocilios, a una concentración de 4x10 ⁵ BMDM en cada pocilio conteniendo medio RPMi-1640 con suero bovino fetal (FCS) a! 10% y 5% de medio de células L929. Las placas con BMDM se dejaron toda la noche a una temperatura de 37°C a 5% de C0 ₂ para que las células se adhieran.

Las infecciones se realizaron conforme a lo establecido por Zauli-Nascimento, R. C; Miguel, D. C; Yokoyama-Yasunaka, J. K.; Pereira, L. !.; Pelli de Oüveira, M. A.; Ribeiro-Dias, F.; Doria, M. L.; Uliana, S. R. in vitro sensitivity of Leishmania (Viannia) braziiiensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis Brazilian isolates to meglumine antimoniate and amphotericin B. Trop. Med. Int. Health 2010, 15(1), 68-76; ajustadas a la proporción de 5 promastigotes en fase estacionaria de L. infantum por cada macrófago. Los promastigotes se adicionaron a los pocilios manteniéndolos durante 2 horas a 37°C y 5% de C0 ₂ en RPMI-1640 con 10% de FCS. Pasado este tiempo el medio se retiró y los macrófagos se lavaron con medio RPMI-1640 para eliminar los promastigotes.

Se adicionó un nuevo medio RPMI-1640 enriquecido con 10% SBF y 5% de medio condicionado de células L929 y que contuviera el fármaco en sus distintas diluciones. Tras 48 h de incubación a 37°C, 5% C0 ₂ , los cubres se fijaron con metanol y tiñeron con Giemsa 20%. Se contaron 200 macrófagos distribuidos por todos los campos del cubre y se calculó el porcentaje de macrófagos infectados y no infectados. Se consideraron como infectados los macrófagos que contuvieran a! menos un amastigote. Cada experimento se realizó por triplicado.

Tras el tratamiento a diversas concentraciones de cada fármaco, la respuesta observada en forma de % de infección se convierte en % de reducción de infección y se realiza un análisis de regresión lineal múltiple (software SPSS 15.0). La ecuación matemática permite el cálculo de la CE ₅₀ y CE ₉₀ , los resultados se muestran en la Tabla 1. CE ₅₀ se refiere a la concentración de fármaco necesaria para reducir en un 50% el % de macrofagos infectados

CE ₉₀ se refiere a la concentración de fármaco necesaria para reducir en un 90% el % de macrofagos infectados.

ND = no determinada

Tabla 1: CE ₅₀ y CE ₉₀ de los compuestos de la presente invención

Los resultados obtenidos para el Compuesto A se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 1. Como control se utilizaron los fármacos vorinostat (SAHA) y pentamidina (20 μΜ). La concentración 20 μ para el vorinostat no aparece en la Tabla 2 debido a la toxicidad observada en los macrofagos tratados a dicha concentración.

Se observó una disminución de porcentaje de infección en los macrofagos tratados a dosis 1-20 μ y una concentración para disminución de la infección al 50% próxima a 5 μΜ. Sin embargo, la toxicidad sobre macrofagos a las dosis establecidas fue inferior en el caso del fármaco Compuesto A

Tabla 2: % de infección de los compuestos antileishmania Ejemplo 7: Síntesis partículas poliméricas PLGA (ácido poliláctico glicóíico)- fármaco Compuesto A

El proceso de síntesis de partículas poliméricas de PLGA consta de los siguientes pasos: a) Se preparó la fase orgánica dispersando en un volumen de 5 mL de acetona una cantidad correspondiente al 1.5% en volumen de PLGA, y una vez que se ha obtenido una dispersión homogénea, se añadió una cantidad comprendida entre (0.5-1) % en volumen de Span 60. b) Se preparó la fase acuosa dispersando (0.5-1) % en volumen de Pluronic F68 en un volumen de agua de 15 mL. c) Se mezclaron las fases oleosa y acuosa añadiendo !a fase orgánica sobre la fase acuosa gota a gota a razón de 5 mL por minuto con ayuda de un vortex o mediante agitación mecánica. d) Se dejó evaporar la muestra durante 24 horas bajo agitación mecánica. El sedimento color blanquecino resultante de la síntesis es centrifugado a 9000 rpm durante un tiempo de 20 minutos, resuspendiendo el sedimento obtenido en agua tantas veces como sea necesario hasta que se obtenga una conductividad del sobrenadante inferior a 2 μβ/αη.

Una vez obtenido dicho valor, la muestra se suspendió en medio acuoso con una concentración adiciona! de Pluronic F68 ai 1 %.

La concentración de nanopartículas para las distintas variantes que se pueden formular atendiendo a las distintas concentraciones de Span60 y Pluronic F68 viene a ser de 0.38 g/mL de suspensión.

Los tamaños de las nanopartículas obtenidas están dentro del intervalo comprendido entre (110-140)nm, siendo el índice de polidispersión inferior al 15 %.

La funcíonalización de las partículas de PLGA con el fármaco Compuesto A se obtiene dispersando la cantidad de fármaco determinada en una solución acuosa de DMSO al 5%, y añadiendo sobre la suspensión de fármaco gota a gota bajo agitación mecánica, ei mismo volumen de nanopartículas de PLGA en ei medio de dispersión. Tras la adición de nanopartículas de PLGA la turbidez observada de la suspensión de fármaco Compuesto A desaparece, y se transforma en una suspensión completamente homogénea de color blanquecino.

El recubrimiento con fármaco Compuesto A se siguió por métodos ópticos y midiendo la carga superficial de las nanopartículas de PLGA a distintos pHs. El tamaño de las partículas funcionalizadas con fármaco Compuesto A aumentó hasta alcanzar valores próximos a los 190 nm, y ei índice de polidispersión también aumentó hasta valores próximos a! 40 %.

La concentración de fármaco Compuesto A adsorbida por mililitro de nanopartículas de PLGA es 0.6 mM.

Ejemplo 8: Síntesis de partículas inorgánicas de oro-fármaco Compuesto A:

La preparación de las nanopartículas de oro se efectuó de acuerdo con el método de reducción térmica en presencia de iones citrato descrito por Turkevich y cois. [J. Turkevich, P.C. Stevenson, J. Hiiiier, Discuss. Trans. Faraday Soc. 11 (1951) 55.]

De acuerdo con el mismo, ia suspensión de partículas de oro se obtuvieron añadiendo 4.5 mg de tetracloruroaureato sódico en 25 mL de agua. La solución se calentó hasta alcanzar que se encuentra en estado de ebullición, y posteriormente se le añadió 1 mL de una solución de citrato sódico rápidamente. La suspensión se mantuvo bajo ebullición durante 40 minutos siempre bajo agitación mecánica.

El tamaño de las partículas obtenidas es de 18 nm y el índice de polidispersión es inferior al 10 %.

La funcionalización de las partículas de oro con el fármaco Compuesto A se obtiene dispersando ¡a cantidad de fármaco Compuesto A determinada en una solución acuosa de DIVISO al 5%, y añadiendo sobre la suspensión de fármaco fármaco Compuesto A gota a gota con la ayuda de un vortex, el mismo volumen de nanopartícuias de oro de la suspensión madre.

Los agregados de fármaco Compuesto A observados desaparecen, y se transforman en una suspensión homogénea de color rosa. El recubrimiento con fármaco Compuesto A se ha seguido por métodos ópticos y midiendo la carga superficial de las nanopartícuias de oro a distintos pHs. El tamaño de las partículas funcionalizadas con fármaco Compuesto A aumentó hasta alcanzar valores próximos a los 50 nm, y e! índice de polidispersión también aumentó hasta valores próximos ai 44 %. Ejemplo 9: Evaluación in vitro: Ensayos in vitro en amastigotes intracelulares utilizando el fármaco Compuesto A soportado sobre nanopartícuias de naturaleza diversa.

Se llevó a cabo un ensayo in vitro en las condiciones descritas en el Ejemplo 6, incubando los macrofagos infectados durante 48 h con: a) fármaco Compuesto A diluido en D SO; b) el fármaco Compuesto A unido a nanopartícuias de PLGA; o c) el fármaco Compuesto A unido a nanopartícuias de oro.

Resultados obtenidos:

Reducción observada tras el tratamiento con el fármaco Compuesto A a una dosis de 5μΜ = 64,7 ± 7 % Reducción observada tras el tratamiento con el fármaco Compuesto A unido a nanopartícuias de PLGA a una dosis de 5 μΜ = 54,3 ± 9 %

Reducción observada tras el tratamiento con el fármaco Compuesto A unido a nanopartícuias de oro a una dosis de 14,3 μΜ = 66,7 ± 7 %.

Ejemplo 10: Evaluación in vivo: Evaluación de la actividad in vivo del fármaco Compuesto A en un modelo animal infectado con Leishmania infantum.

Reactivos: a) El fármaco Compuesto A unido a nanopartícuias de PLGA se presentó con una concentración de 2 mg/mL. Se diluyó en agua para preparaciones inyectables en cantidad suficiente para una dosis de 0,5 mL con la cantidad deseada. b) El control con nanopartículas de PLGA se presentó a una concentración similar a la de la usada en a). c) El Giucantime® se presenta en una solución de 300 mg/mL (85mg Sb ^v /mL). Se procede a diluir en SSF para su administración in vivo.

Procedimiento de infección y tratamiento:

La infección se realiza por vía intraperitonea! en ratones Balb/c de 6 semanas de edad. Se utiliza una dosis infectiva de 10 ⁷ promastigotes en fase estacionaria a partir de cultivos de Leishmania infantum de 6 días desde el último pase. La dosis se ajusta a un inócuio de 0,2 mL.

Tras 4 semanas de infección, se inicia el tratamiento de 14 días con fármaco soportado sobre nanopartículas de PLGA. Este tratamiento se realiza con el producto diluido en un inoculo de 0,5 mL de agua para inyectables por vía intraperitoneal cada día.

Los tratamientos utilizados in vivo son ios siguientes:

Control: 0,5 mL de dilución de nanopartículas de PLGA equivalente a la cantidad de nanopartículas que recibe el grupo MTC-NP 50 mg/kg, diariamente durante 14 días. Fármaco compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA, dosis de 25 mg/kg: 0,5 mL de dilución de 0,5 mg de MTC unido a nanopartículas, diariamente durante 14 días.

Fármaco compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA, dosis de 50 mg/kg: 0,5 mL de dilución de 1 mg de MTC unido a nanopartículas, diariamente durante 14 días.

Giucantime: 0,5 mL de agua para inyectables con 104 mg/kg/d de antimonio (Sb ) durante 14 días con descanso cada cuatro días, siendo un total de 12 dosis (4+1+4+1 +4). Glucantime + fármaco Compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA: 0,5 mL de dilución de 0,125 mg de fármaco Compuesto A unido a nanopartículas de PLGA y 104 mg/kg de antimonio (Sb ^v ) durante 14 días con descanso cada cuatro días, siendo un tota! de 12 dosis (4+1+4+1+4). Para la cuantificación de la carga parasitaria en órgano de ratón sacrificado tras el tratamiento, se pesan 20mg de tejido, se homogeniza y se extrae el ADN con un kit comercial adecuado, quedando éste resuspendido en un volumen de 20 pL. A continuación se realiza una PCR cuantitativa (a tiempo real). Esta PCR utiliza sondas TaqMan y es específica de Leishmania infantum. Se calcula el número de parásitos presentes en cada muestra utilizando una curva patrón previamente ajustada basándose en el número de copias del ADN amplificado. A partir de! número de copias presentes en el pozo de reacción y conociendo el peso del órgano utilizado, se estima el número de parásitos/mg de órgano.

Resultados obtenidos in vivo: Las cargas parasitarias de ios ratones en hígado y bazo son las siguientes . Órgano estudiado: Bazo a) Parásitos/mg encontrados para fármaco compuesto A soportado en

nanopartículas de PLGA, dosis de 25 mg/kg = 14 b) Parásitos/mg encontrados para fármaco compuesto A soportado en

nanopartículas de PLGA, dosis de 50 mg/kg = 9 c) Parásitos/mg encontrados para Glucantime + fármaco Compuesto A

soportado en nanopartículas de PLGA - 3.5 d) Parásitos/mg encontrados para Glucantime = 45 e) Parásitos/mg encontrados para control = 40 2. Órgano estudiado: Hígado a) Parásitos/mg encontrados para fármaco compuesto A soportado en

nanopartículas de PLGA, dosis de 25 mg/kg = 9 b) Parásitos/mg encontrados para fármaco compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA, dosis de 50 mg/kg = 3 c) Parásitos/mg encontrados para Glucantime + fármaco Compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA = 0 d) Parásitos/mg encontrados para Glucantime = 1 e) Parásitos/mg encontrados para control = 5

Tras realizar un análisis no paramétrico (Test de Mann-Whitney) se concluye que existe diferencia estadísticamente significativa entre ia carga parasitaria de los bazos de los ratones tratados con fármaco Compuesto A a las distintas concentraciones y el control basado en nanopartículas de PLGA sin fármaco. También existe diferencia estadísticamente significativa entre los ratones tratados con la combinación de Glucantime y fármaco Compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA, frente al control con nanopartículas de PLGA y frente al control tratado con glucantime. Con respecto a la carga parasitaria de los hígados existe diferencia estadísticamente significativa entre la combinación de Glucantime y fármaco Compuesto A soportado en nanopartículas de PLGA, frente al control con nanopartículas de PLGA y frente al control tratado con Glucantime.