LANAS ARBELOA ÁNGEL (ES)
CASADO APASTEGUI JAVIER (ES)
CHUECA LAPUENTE EDUARDO (ES)
PIAZUELO ORTEGA ELENA (ES)
SALILLAS BERGES SANDRA (ES)
SANCHO SANZ JAVIER (ES)
CONSORCIO CENTRO DE INVESTIG BIOMEDICA EN RED (ES)
INST ARAGONES DE CIENCIAS DE LA SALUD (ES)
UNIV ZARAGOZA (ES)
| WO2020079307A1 | 2020-04-23 |
| US20090247478A1 | 2009-10-01 |
DATABASE REGISTRY ANONYMOUS : "- 3-Thiophenecarboximidamide, N-[[[(4-chlorophenyl)amino]carbonyl]oxy]-5- nitro- (9CI) (CA INDEX NAME)", XP093085932, retrieved from STN
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GONZÁLEZ ANDRÉS, CASADO JAVIER, CHUECA EDUARDO, SALILLAS SANDRA, VELÁZQUEZ-CAMPOY ADRIÁN, ESPINOSA ANGARICA VLADIMIR, BÉNEJAT LUCI: "Repurposing Dihydropyridines for Treatment of Helicobacter pylori Infection", PHARMACEUTICS, vol. 11, no. 12, pages 681, XP093085936, DOI: 10.3390/pharmaceutics11120681
GONZÁLEZ ANDRÉS, SALILLAS SANDRA, VELÁZQUEZ-CAMPOY ADRIÁN, ESPINOSA ANGARICA VLADIMIR, FILLAT MARÍA F., SANCHO JAVIER, LANAS ÁNGEL: "Identifying potential novel drugs against Helicobacter pylori by targeting the essential response regulator HsrA", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 9, no. 1, XP093085937, DOI: 10.1038/s41598-019-47746-9
| REIVINDICACIONES Un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por la infección por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter: I donde: R1 es un grupo H o halógeno; R2 es un grupo H o halógeno; R3 es un grupo H, halógeno, C1-4 alquilo, -COC1-4 alquilo; -COOH, -COOC1-4 alquilo, -OH, -NH2, -SH o -NO2, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más grupos R9; R4 es un grupo H o C1-4 alquilo; R5 es un grupo H, -COOH o -COOC1-4 alquilo; Cy es un grupo de fórmula la, Ib, le o Id: R6 es un grupo H, halógeno, C1-4 alquilo, -COOH o -COOC1-4 alquilo; R7 es un grupo H, halógeno, C1-4 alquilo, -COOH, -COC1-4 alquilo o -NO2, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más grupos R10; R8 es H o halógeno; R9 es un grupo halógeno; y R10 es un grupo halógeno. El compuesto de fórmula I para el uso según la reivindicación 1 , donde R1 es un grupo H, Cl o Br. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R2 es un grupo H, Cl o Br. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC2H5, -COCH3; -COOH, -COOCH3, -OH, -NH2, -SH o -NO2. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R4 es un grupo H o CH3. 6. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R5es un grupo H o -COOH. 7. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Cy es un grupo la. 8. El compuesto de fórmula I para el uso esgún cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R6 es un grupo H, Cl, Br, CH3 o -COOH. 9. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde R7 es un grupo H, CH3, Cl, Br, -COOH, -COC2H5, -COCH3 o -NO2. 10. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde R8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br. 11 . El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R9 es un grupo Cl o Br. 12. El compuesto de fórmula I para el uso según la reivindicación 1 , seleccionado de: A1 5 13. El compuesto de fórmula I para el uso según la reivindicación 12, seleccionado de A1 a A30. 14. El compuesto de fórmula I para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori y donde la bacteria del género Campylobacter es de especie Campylobacter jejuni. 15. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula I según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter. 16. El compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal. El compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica del mismo para el uso según la reivindicación 16, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal, y preferiblemente donde la patología gastrointestinal se selecciona de gastritis aguda, gastritis crónica, duodenitis, dispepsia funcional, úlcera gástrica, úlcera duodenal, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT). |
Compuestos para el tratamiento v/o prevención de una infección o enfermedad causada por Helicobacter o Campylobacter
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección o enfermedad causada por la infección de una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
H. pylori está considerado como el patógeno bacteriano de mayor prevalencia en humanos. Un estudio reciente sugiere que más de la mitad de la población mundial se encuentra infectada (Hooi J.K.Y., et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and metaanalysis. Gastroenterology 2017; 153: 420-429). El microorganismo atraviesa la capa mucosa que protege al estómago y se adhiere y coloniza las células epiteliales gástricas. A menos que la infección sea tratada adecuadamente, la bacteria puede persistir en el estómago durante toda la vida del paciente, constituyendo la causa más común de gastritis crónica y contribuyendo a la patogénesis de manifestaciones clínicas más graves como úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT) (Kusters J.G., et al. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 449-490; y Moss S.F. The clinical evidence linking Helicobacter pylori to gastric cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 2017; 3: 183-191 ). En 1994, H. pylori fue clasificado como carcinógeno de tipo I (carcinógeno humano definitivo) para el cáncer gástrico por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer. Cerca del 60% de los adenocarcinomas gástricos de tipo intestinal y el 98% de los linfomas MALT de estómago están asociados a la infección por H. pylori. Asimismo, la infección crónica con este microorganismo incrementa significativamente el riesgo del paciente de desarrollar otros linfomas no gástricos, como el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de anexos oculares. La bacteria ha sido implicada además eenn vahos desordenes extra-gastrointestinales, como enfermedades isquémicas cardiacas y cerebrovasculares, aterosclerosis, entre otras.
H. pylori eess una bacteria Gram-negativa microaerofílica de la clase
Epsilonproteobacteria, a la cual pertenecen otros patógenos de relevancia clínica como C. jejuni. Campylobacter es una de las cuatro principales causas de enfermedad diarreica y está considerada como la causa bacteriana más frecuente de gastroenteritis en el mundo (Kaakoush N.O., et al. Epidemiology of Campylobacter infection. Clin Microbiol Rev 2015; 28: 687-720). Las infecciones por Campylobacter suelen ser leves, pero pueden ser mortales en niños muy pequeños, personas de edad avanzada e individuos inmunodeprimidos. La bacteria coloniza el epitelio intestinal ocasionando gastroenteritis aguda, diarreas acuosas, fiebre, náuseas y vómitos. Ocasionalmente, la infección puede desencadenar eventos extraintestinales graves como bacteriemia, meningitis y síndrome de Guillain-Barré o patologías gastrointestinales severas como colitis pseudomembranosa, apendicitis y hemorragia gastrointestinal masiva. Dentro del género Campylobacter, la especie C. jejuni está asociada con la mayor parte de las infecciones reportadas en el hombre (Igwaran A., et al. Human campylobacteriosis: A public health concern of global importance. Heliyon 2019; 5: e02814).
Dado el alarmante desarrollo y acumulación de mecanismos de resistencias antimicrobianas por cepas de H. pylori y C. jejuni en todo el mundo, con la consecuente disminución de la eficacia de los tratamientos antimicrobianos considerados de primera línea, la QMS clasificó en 2017 a estos dos patógenos como “altamente prioritarios” para la búsqueda y desarrollo de nuevos antibióticos (Tacconelli E., et al. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. Lancet Infect Dis 2018; 18: 318-327).
Así pues, sería deseable disponer de fármacos seguros, altamente eficaces como bactericidas frente a epsilonproteobacterias patógenas como las especies Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni y selectivos frente a miembros relevantes de la microbiota humana.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por la infección por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter, y preferiblemente donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori y donde la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni: donde:
R 1 es un grupo H o halógeno;
R 2 es un grupo H o halógeno;
R 3 es un grupo H, halógeno, C 1-4 alquilo, -COC 1-4 alquilo; -COOH, -COOC 1-4 alquilo, -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 , donde C 1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más grupos R 9 ;
R 4 es un grupo H o C 1-4 alquilo;
R 5 es un grupo H, -COOH o -COOC 1-4 alquilo;
Cy es un grupo de fórmula la, Ib, le o Id:
R 6 es un grupo H, halógeno, C 1-4 alquilo, -COOH o -COOC 1-4 alquilo;
R 7 es un grupo H, halógeno, C 1-4 alquilo, -COOH, -COC 1-4 alquilo o -NO 2 , donde C 1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más grupos R 10 ; R 8 es H o halógeno;
R 9 es un grupo halógeno; y
R 10 es un grupo halógeno.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H o halógeno;
R 2 es un grupo H o halógeno;
R 3 es un grupo H, halógeno, C 1-4 alquilo, -COC 1-4 alquilo; -COOH, -COOC 1-4 alquilo, -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 , donde C 1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o más grupos R 9 ;
R 4 es un grupo H o C 1-4 alquilo;
R 5 es un grupo H, -COOH o -COOC 1-4 alquilo;
Cy es un grupo de fórmula la, Ib, le o Id:
R 6 es un grupo H, halógeno, C 1-4 alquilo, -COOH o -COOC 1-4 alquilo;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ;
R 8 es H o halógeno;
R 9 es un grupo halógeno; y
R10 es un grupo halógeno.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 4 es un grupo H o CH 3 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente, donde Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl,
Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl,
Br, -COOH, -COCH 3 O -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 9 es un grupo Cl o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde R 10 es un grupo Cl o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
R 4 es un grupo H o CH 3 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br. En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
Cy es un grupo la. En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y
Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y
Cy es un grupo la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y
R 4 es un grupo H o CH 3 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
Cy es un grupo la; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 4 es un grupo H o CH 3 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 5 es un grupo H o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 . En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 4 es un grupo H o CH 3 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 5 es un grupo H o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br. En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 5 es un grupo H o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; R 5 es un grupo H o -COOH; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 O -NO 2 ; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H,
CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 .
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COCH 3 o -NO 2 ; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ; R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; y R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde: R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; Y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y
Cy es un grupo de fórmula la.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R1 es H o Br, y más preferiblemente donde R1 es H; R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br; R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula Ib.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H, R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula le.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente donde:
R 1 es un grupo H, Cl o Br, preferiblemente donde R 1 es H o Br, y más preferiblemente donde R 1 es H;
R 2 es un grupo H, Cl o Br, y preferiblemente donde R 2 es H o Br;
R 3 es un grupo H, Br, Cl, metilo, etilo, -COC 2 H 5 , -COCH 3 ; -COOH, -COOCH 3 , -OH, -NH 2 , -SH o -NO 2 ;
R 4 es un grupo H o CH 3 ;
R 5 es un grupo H o -COOH;
R 6 es un grupo H, Cl, Br, CH 3 o -COOH, y preferiblemente H, Br, CH 3 o -COOH;
R 7 es un grupo H, CH 3 , Cl, Br, -COOH, -COC 2 H 5 , -COCH 3 o -NO 2 , y preferiblemente H; R 8 es un grupo H, Br o Cl, y preferiblemente H o Br; y Cy es un grupo de fórmula Id.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente seleccionado de:
A10
5 A15
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente seleccionado de A1 a A30.
En otra realización la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para el uso definido anteriormente seleccionado de A1 , A2, A4 a A6, A8 a A10, A12 a A17, A19 a A22, A26 a A28, A31 y A32.
En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal, y preferiblemente donde la patología gastrointestinal se selecciona de gastritis aguda, gastritis crónica, duodenitis, dispepsia funcional, úlcera gástrica, úlcera duodenal, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT).
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y de no ser perjudiciales para quién tome dicha composición.
Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula I definido anteriormente, para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter, y preferiblemente donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori y donde la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni.
En otra realización la invención se refiere a la composición farmacéutica definida anteriormente, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal, y preferiblemente donde la patología gastrointestinal se selecciona de gastritis aguda, gastritis crónica, duodenitis, dispepsia funcional, úlcera gástrica, úlcera duodenal, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I o de una composición farmacéutica del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por la infección por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter, y preferiblemente donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori y donde la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por la infección por una bacteria del género Helicobacter o Campylobacter, y preferiblemente donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori y donde la bacteria del género Campylobacter es de la especie Campylobacter jejuni, para un sujeto que lo necesite, especialmente un ser humano, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente o una composición farmacéutica del mismo.
En las definiciones anteriores, el término C1-4 alquilo, como grupo o parte de un grupo, significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de C e incluye los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, ¡sobutilo, sec-butilo y tert-butilo.
Un radical halógeno o su abreviatura halo significa fluoro, cloro, bromo o yodo.
La expresión "opcionalmente sustituido por uno o más" significa la posibilidad de un grupo de estar sustituido por uno o más, preferiblemente por 1 , 2, 3 ó 4 sustituyentes, más preferiblemente por 1 , 2 ó 3 sustituyentes y aún más preferiblemente por 1 ó 2 sustituyentes, siempre que dicho grupo disponga de suficientes posiciones disponibles susceptibles de ser sustituidas. Si están presentes, dichos sustituyentes pueden ser ¡guales o diferentes y pueden estar situados sobre cualquier posición disponible.
A lo largo de la presente descripción, el término “tratamiento” se refiere a eliminar, erradicar, erradicar totalmente, reducir o disminuir la causa o efectos de una enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir del grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial). Ejemplos incluyen entre otros, “erradicar la infección”, “erradicación total del microorganismo” y “disminución de la colonización del microorganismo”.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término “prevención” se refiere a prevenir la aparición de la enfermedad que se presente en un paciente que está predispuesto o tiene factores de riesgo, pero que todavía no presenta síntomas de la enfermedad. Prevención también incluye prevenir la reaparición de una enfermedad en un sujeto que previamente ha padecido dicha enfermedad.
Los compuestos de la presente invención contienen uno o más nitrógenos básicos y podrían por tanto formar sales con ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos. Algunos compuestos de la presente invención podrían contener uno o más protones ácidos y por tanto podrían formar también sales con bases.
No hay limitación en el tipo de sal que se puede utilizar, con la condición de que cuando se usen con fines terapéuticos sean farmacéuticamente aceptables. Se entiende por sales farmacéuticamente aceptables aquellas sales que, a criterio médico, son adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos u otros mamíferos sin provocar una toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica o similar. Las sales farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por cualquier experto en la materia.
Los compuestos de fórmula I y sus sales pueden diferir en ciertas propiedades físicas, pero son equivalentes a efectos de la invención. Todas las sales de los compuestos de fórmula I quedan incluidas dentro del ámbito de la invención.
Los compuestos de la presente invención pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o desde los que se hacen precipitar o cristalizar. Estos complejos se conocen como solvatos. Tal como se utiliza aquí, el término solvato se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (un compuesto de fórmula I o una sal del mismo) y un disolvente. Ejemplos de disolventes incluyen los disolventes farmacéuticamente aceptables como agua, etanol y similares. Un complejo con agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los compuestos de la invención (o sus sales), incluyendo hidratos, quedan incluidos dentro del ámbito de la invención.
Los compuestos de fórmula I pueden existir en diferentes formas físicas, es decir en forma amorfa y formas cristalinas. Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden tener la capacidad de cristalizar de más de una forma, una característica que se conoce como polimorfismo. Los polimorfos se pueden diferenciar por vahas propiedades físicas bien conocidas por los entendidos en la materia como por ejemplo sus difractogramas de rayos X, puntos de fusión o solubilidad. Todas las formas físicas de los compuestos de fórmula I, incluyendo todas sus formas polimórficas (“polimorfos”), quedan incluidas dentro del ámbito de la presente invención.
Algunos compuestos de la presente invención podrían existir en forma de vahos diastereoisómeros y/o varios isómeros ópticos. Los diastereoisómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales como la cromatografía o la cristalización fraccionada. Los isómeros ópticos pueden ser resueltos mediante el uso de técnicas convencionales de resolución óptica, para dar los isómeros ópticamente puros. Esta resolución puede realizarse sobre los intermedios de síntesis que sean quirales o bien sobre los productos de fórmula I. Los isómeros ópticamente puros también pueden ser obtenidos individualmente empleando síntesis enantioespecíficas. La presente invención cubre tanto los isómeros individuales como sus mezclas (por ejemplo mezclas racémicas o mezclas de diastereoisómeros), tanto si se obtienen por síntesis como mezclándolos físicamente.
Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del principio activo y de su vía de administración. En principio se puede utilizar cualquier vía de administración, por ejemplo oral, parenteral, nasal, ocular, rectal, y tópica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vahantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 Muestra la inhibición in vitro de la actividad biológica del regulador transcripcional HsrA. (A) Bajo condiciones in vitro optimizadas, la proteína HsrA recombinante reconoce y se une específicamente a secuencias de ADN de sus promotores diana. La unión de la proteína al ADN diana determina la formación de un complejo ADN-proteína estable, con un tamaño molecular superior al del ADN libre, experimentando un retardo en la movilidad electroforética. La unión específica de HsrA a su promotor diana PporGDAB y la formación de un complejo HsrA-ADN detectable por la técnica de EMSA es directamente proporcional a la concentración de la proteína recombinante y no logra ser inhibido por la presencia de un fragmento de ADN competidor inespecífico. La concentración óptima de proteína para los ensayos de inhibición del compuesto de interés es aquella mínima concentración de HsrA que logra acomplejar completamente al promotor diana, en este caso 6 μM. (B) El compuesto de interés inhibe la unión de la proteína HsrA a su promotor diana, evitando la formación de complejos HsrA-ADN. La capacidad de inhibición del compuesto de interés sobre la actividad in vitro de HsrA es directamente proporcional a la concentración del inhibidor, logrando inhibir totalmente la actividad de la proteína con algunas de las concentraciones de inhibidor testadas en el ensayo.
Fig. 2 Muestra el modelo de interacción entre la proteína HsrA de Helicobacter pylori y el ligando ensayado expehmentalmente. (A) El ligando (compuesto A0) se une al dominio C-terminal de la proteína e interacciona directamente con residuos aminoacídicos implicados en el reconocimiento y unión al DNA que conforman un motivo hélice-giro-hélice (HTH). El motivo hélice-giro-hélice (HTH) de unión al DNA en el regulador HsrA comprende los aminoácidos 165 a 199 dentro del dominio C- terminal y está formado por dos hélices a separadas por un pequeño giro sin estructura secundaria. Este motivo ha sido resaltado en color oscuro en las figuras 2A y 2B e indicado además con una flecha. (B) Modelo de superficie de la proteína HsrA donde se aprecia el sitio de unión del ligando, ubicado en un bolsillo o pequeña cavidad en el dominio C-terminal. La superficie correspondiente al motivo HTH se ha resaltado en color oscuro e indicado con una flecha (C) La unión del ligando A0 a la proteína se encuentra estabilizada por interacciones no covalentes con los residuos Leu126, lleul 35, Leu152, Lys194, Metí 95, Pro198, Leu199 y Thr203, los cuales se indican en la figura. Las imágenes has sido obtenidas mediante el programa PyMoL
Fig. 3. Muestra la inhibición in vitro de la actividad biológica esencial del regulador transcripcional CosR. El compuesto de interés inhibe totalmente la unión de la proteína CosR a su promotor diana en algunas de las concentraciones testadas, evitando la formación de complejos CosR-ADN.
EJEMPLOS
A continuación, se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Procedimientos generales
1. Clónaje de los genes del gen hsrA y cosR
El ADN genómico de Helicobacter pylori cepa 26695 (ATCC 700392) se purificó mediante el método de fenol-cloroformo. La biomasa obtenida a partir de 100 mL de cultivo de Helicobacter pylori 26695 en caldo infusión cerebro corazón (BHI) suplementado con 4% de suero fetal bovino (SFB) durante 48 h en condiciones microaeróbicas fue resuspendida en 400 μL de tampón 10 mM Tris-CI (pH 8) y 1 mM EDTA. A esta suspensión celular se adicionó 1% SDS y 10 μL de proteinasa K (10 mg/mL) y se incubó durante 1 h a 55ºC. Al cabo de este tiempo, la muestra se lavó con 1 volumen (mismo volumen de la muestra) de fenol, luego con 1 volumen de fenol- cloroformo (1 :1) y finalmente se realizaron dos lavados con 1 volumen de cloroformo. El DNA genómico se precipitó toda la noche a -20ºC con 2 volúmenes de etanol absoluto frío y 0,1 volumen de 3M acetato de sodio (pH 5,2), el precipitado se lavó con etanol 70% y finalmente se resuspendió en tampón 10 mM Tris-CI (pH 8) y 1 mM EDTA. La secuencia completa del gen hsrA (hp1043) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico purificado de la cepa 26695 (ATCC 700392) de Helicobacter pylori empleando los cebadores 5'-GGAATTCCATATGCGCGTTCTACTGATTG-3' (SEQ ID NO: 1 ) y 5'-CCCAAGCTTTTACTCTTCACACGCCGG-3' (SEQ ID NO: 2) y la enzima Pfu DNA polimerasa de alta fidelidad (Agilent). El producto de PCR resultante fue digerido con las enzimas de restricción Ndel y Hindi II y clonado entre los mismos sitios de restricción del vector de expresión pET-28a (Novagen). El vector final fue parcialmente secuenciado para comprobar la integridad del gen.
Asimismo, se clonó el gen de la proteína CosR de Campylobacter, siguiendo la misma metodología anterior. La secuencia completa del gen cosR se amplificó por PCR a partir del ADN genómico purificado de la cepa NCTC 11351 de Campylobacter jejuni, empleando los cebadores 5’-GGAATTCCATATGAGAATTTTAGTTATAGAAG-3’ (SEQ ID NO: 3) y 5’-CGGGATCCTTAAGATTTTTTAGGGAAGCAGAAACGG-3’ (SEQ ID NO: 4) y la enzima Pfu DNA polimerasa de alta fidelidad. El producto de PCR resultante fue digerido con las enzimas de restricción Ndel y BamHI y clonado entre los mismos sitios de restricción del vector de expresión pET-28a. El vector final fue parcialmente secuenciado para comprobar la integridad del gen.
2. Expresión recombinante v purificación de las proteínas HsrA y CosR
Se transformaron células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) con el vector pET-28a conteniendo el gen hsrA de Helicobacter pylori ATCC 700392 o el gen cosR de Campylobacter jejuni NCTC 11351.. Este vector permite expresar la proteína recombinante como una proteína de fusión a un péptido de 6 residuos de histidinas en su extremo N-terminaL Las células de Escherichia coli transformadas fueron cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/mL de kanamicina bajo condiciones de agitación vigorosa y 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,8 medida a una longitud de onda de 600 nm. La expresión de la proteína HsrA recombinante se indujo mediante la adición al medio de cultivo de 1 mM de IPTG, tras lo cual las células se dejaron crecer bajo las mismas condiciones de temperatura y agitación durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, el cultivo se centrifugó a 8,000 rpm durante 10 min a 4ºC y la biomasa celular obtenida fue lavada con PBS pH 7,4 frió.
Las proteínas HsrA y CosR recombinantes fueron expresadas en forma soluble en el citoplasma de Escherichia coli BL21 (DE3). Para la purificación proteica, las células fueron resuspendidas en tampón 50 mM Tris-CI (pH 8), con 500 mM NaCI, 10 mM imidazol y 1 mM PMSF. La ruptura celular se realizó mediante 10 ciclos ultrasónicos de 45 segundos en baño de hielo, con descansos de 30 segundos entre cada ciclo. Los detritos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 18,000 rpm durante 20 min a 4ºC. Las proteínas recombinantes con cola de histidinas contenidas en el sobrenadante fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) empleando la matriz Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) cargada con iones Ni 2+ , previamente equilibrada con el tampón empleado en la lisis celular. Ambas proteínas recombinantes fueron eluidas de la matriz empleando un gradiente de imidazol (0,01 a 1 M) y dializadas frente al tampón 50 mM Tris-HCI (pH 8), 300 mM NaCI y 10% glicerol. La concentración de proteína fue determinada en ambos casos mediante el kit comercial BCA™ Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). La cola de poli-histidinas fue eliminada del extremo N-terminal de ambas proteínas mediante tratamiento con trombina (GE Healthcare), empleando 10 U de enzima por cada miligramo de proteína recombinante. Tras la restricción enzimática, las proteínas HsrA y CosR recombinantes fueron obtenidas en el volumen muerto de un segundo paso de purificación mediante IMAC-N¡ 2+ . Las proteínas así purificadas fueron conservadas a -20ºC.
3. Actividad biológica in vitro de HsrA y CosR v ensayos de inhibición
Las proteínas HsrA y CosR son reguladores de respuesta con actividad de unión al ADN, que actúan como reguladores transcripcionales. La actividad biológica de ambas proteínas se determina mediante el ensayo del cambio de movilidad electroforética (EMSA). En este ensayo, el regulador transcripcional se pone en contacto con un fragmento de ADN correspondiente a la región promotora de sus genes diana. Si la proteína es activa, se unirá de forma específica a sus promotores diana y formará un complejo proteína-ADN que experimentará un retardo en la movilidad electroforética respecto al DNA libre, dado el mayor tamaño molecular del complejo. Como región promotora diana de HsrA se amplificó por PCR una secuencia de 288 pb correspondiente al promotor del operón porGDAB a partir del ADN genómico de Helicobacter pylori ATCC 700392 empleando como cebadores 5'- CCCCACACTTGCCCCATACAGAC-3' (SEQ ID NO: 5) y 5'-
GCATGCCATCTAATTTGAAACATGG-3' (SEQ ID NO: 6 ). Como región promotora diana de CosR se amplificó por PCR una secuencia de 420 pb correspondiente al promotor del gen sodB a partir del ADN genómico de Campylobacter jejuni NCTC 11351 empleando como cebadores 5’-CTGCGAAAGCACCTAGTAATGC-3’ (SEQ ID NO: 7) y 5’-GTAACATAAGTATTGTGATGTTTTCCATG- 3’ (SEQ ID NO: 8). Los promotores así sintetizados fueron purificados mediante el kit comercial ¡Ilustra™ GFX POR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) y su concentración fue cuantificada mediante espectrofotómetro NanoVue Plus (GE Healthcare). Para los ensayos de actividad biológica de la proteína HsrA recombinante recién purificada, se mezclaron concentraciones crecientes de la proteína, desde 2 hasta 7 pM, con 120 ng de ADN en tampón 10 mM bis-Tris (pH 7,5), 40 mM KOI, 100 pg/mL BSA, 1 mM DTT y 5% (v/v) de glicerol, en un volumen final de mezcla de reacción de 20 μL. Como ADN competidor inespecífico se adicionó a todas las mezclas 120 ng de un fragmento de 121 pb correspondiente a una porción de la secuencia codificadora del gen pkn22 (alr2502) de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120. Para los ensayos de actividad biológica de la proteína CosR recombinante recién purificada, se mezclaron concentraciones crecientes de la proteína de 20 a 700 nM, con 120 ng de ADN en tampón 10 mM bis-Tris (pH 7,5), 40 mM KOI, 100 pg/mL BSA, 1 mM DTT y 5% (v/v) de glicerol, en un volumen final de mezcla de reacción de 20 μL. Como ADN competidor inespecífico se adicionó a todas las mezclas 120 ng de un fragmento de 121 pb correspondiente a una porción de la secuencia codificadora del gen pkn22 (alr2502) de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120. Las mezclas de proteína (HsrA o CosR) y ADN se incubaron a 25ºC durante 30 minutos y posteriormente se separaron mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida 6% empleando el tampón 25 mM Tris y 190 mM glicina para la cámara electroforética. Los geles de poliacrilamida fueron teñidos con el colorante SYBR® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen) y procesados con Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad).
Para los ensayos de inhibición de la actividad biológica, 6 pM de la proteína HsrA o 600 nM de la proteína CosR se mezclaron con 2; 1 ; 0,5; 0,1 y 0,05 mM del compuesto A0 descrito en la presente invención. Dado que el compuesto de interés se encontraba disuelto en DMSO al 100%, se incluyó como control negativo a la proteína en presencia de la misma cantidad de DMSO, en sustitución del inhibidor. La mezcla de proteína e inhibidor en tampón 10 mM bis-Tris (pH 7,5), 40 mM KCI, 100 pg/mL BSA, 1 mM DTT y 5% (v/v) de glicerol se incubó durante 10 min a 25ºC. Transcurrido este tiempo se adicionó a cada mezcla 120 ng de promotor diana (porGDAB para HsrA y sodB para CosR) y 120 ng de ADN competidor (pkn22). El resto del procedimiento se llevó a cabo en las mismas condiciones del ensayo de actividad anteriormente descrito. Cada ensayo se realizó por triplicado. 4. Actividad antimicrobiana frente a Helicobacter pylori del inhibidor de HsrA
La actividad antimicrobiana del compuesto A0 fue testada frente a dos cepas diferentes de Helicobacter pylori, la cepa ATCC 700392 y la cepa resistente a claritromicina ATCC 700684. Ambas cepas fueron cultivadas en agar sangre (base) Nº 2 (OXOID) suplementado con 8% de sangre de caballo desfibrinada (OXOID) en atmósfera microaeróbica húmeda (85% N 2 , 10% CO 2 , 5% O 2 ) a 37ºC. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (MIC) de cada compuesto mediante el método de microdilución empleando placas de poliestireno de 96 pocilios con fondo plano. Para los ensayos, las bacterias fueron subcultivadas en caldo infusión cerebro corazón (BHI) suplementado con 4% de suero fetal bovino (SFB) durante 48 h en condiciones microaeróbicas. Al cabo de este tiempo, los cultivos fueron diluidos con caldo BHI + 4% SFB hasta una densidad óptica de 0,01 medida a una longitud de onda de 600 nm. Para el ensayo de microdilución en placas, 100 μL de los cultivos bacterianos así ajustados fueron dispensados en cada uno de los pocilios de la placa, excepto la primera columna de la placa, que recibió 200 μL de suspensión bacteriana con 5 μL del compuesto inhibitorio de A0, a una concentración de 10,24 mg/mL en 100% DMSO. Se realizaron diluciones dobles seriadas del compuesto, evaluando la actividad antibacteriana de un rango de concentraciones entre 256 y 0,125 mg/L. En todas las placas se incorporaron controles de crecimiento positivo y negativo con caldo BHI + 4% SFB sin la presencia de inhibidores, inoculado y no inoculado con las bacterias. Se incorporaron además controles con DMSO y claritromicina. Todas las placas fueron incubadas bajo condiciones microaeróbicas a 37ºC y examinadas visualmente tras 48 h de incubación. Se definió como concentración mínima inhibitoria (CMI) a la mínima concentración del compuesto que inhibió completamente el crecimiento visible de la bacteria tras 48 h.
Se determinó además la concentración mínima bactericida (CMB) del compuesto A0. Una vez culminado el ensayo de CMI, se extrajeron alícuotas de 10 μL de dos diluciones anteriores y dos posteriores al valor CMI y se sembraron en agar sangre (base) Nº 2 (OXOID) suplementado con 8% de sangre de caballo desfibrinada (OXOID) en atmósfera microaeróbica húmeda (85% N 2 , 10% CO 2 , 5% O 2 ). Las placas de agar se incubaron a 37ºC durante 48 h. El valor CMB se definió como la mínima concentración del compuesto que impidió el crecimiento de >99,9% de las células de Helicobacter pylori subcultivadas sobre este medio libre de inhibidores. Cada experimento se realizó por triplicado, dos veces, para confirmar los resultados.
5. Actividad antimicrobiana frente a Campylobacter jejuni, Escherichia coli v Staphylococcus epidermidis del inhibidor de HsrA
La actividad antibacteriana del compuesto A0 fue testada frente Campylobacter jejuni ATCC 33560. Tanto Helicobacter pylori como Campylobacter jejuni son especies patógenas de la familia Epsilonproteobacteria, ambos microorganismos presentan requerimientos nutricionales muy similares y crecen óptimamente bajo las mismas condiciones de cultivo in vitro. De esta forma, para la determinación de la CMI y la CMB frente a Campylobacter jejuni se emplearon el mismo protocolo, medios y condiciones de cultivo descritos anteriormente para las cepas de Helicobacter pylori.
Se determinó además la actividad antimicrobiana del compuesto A0 frente a cepas de dos especies representativas de la microbiota normal humana: Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis. El cálculo de la CMI y CMB de ambas cepas se realizó mediante la técnica de microdilución en caldo, siguiendo las recomendaciones del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST, siglas en inglés).
Para el cálculo de la CMI, las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 fueron crecidas en medio agar Mueller-Hilton durante toda la noche a 37ºC. Partiendo de este cultivo, varias colonias representativas de cada cepa se resuspendieron en solución salina estéril hasta ajustar la suspensión bacteriana a una turbidez similar al estándar 0,5 de la escala de McFarland (~1 ,5 x 10 8 UFC/mL). A partir de esta suspensión estandarizada, se preparó el inoculo en caldo Mueller-Hinton a 1 x10 6 UFC/mL. Se emplearon en el ensayo placas de microtitulación estériles de 96 pocilios con fondo plano. A cada placa se adicionó 75 μL de medio líquido Mueller- Hinton en todos los pocilios a excepción de la primera columna, donde se dispensaron 120 μL. En los pocilios correspondientes de la primera columna se añadieron 30 μL de los diferentes compuestos, preparados previamente en soluciones de trabajo a 0,64 mg/mL en DMSO. En cada placa se incluyeron además dos controles, un control de viabilidad en el que se sustituyó el antimicrobiano por la misma cantidad de su solvente (30 μL de DMSO) y un control se sensibilidad en el que se incorporó kanamicina, de un stock a 0,64 mg/mL. A continuación se realizaron diluciones dobles seriadas desde la columna 1 hasta el final (eliminando los 75 μL correspondientes de la última columna) y posteriormente se añadieron 75 μL de inoculo recién preparado a cada pocilio de la placa, alcanzando en todos los casos una concentración final de 5x10 5 UFC/mL. El ensayo permitió evaluar la actividad antimicrobiana de los compuestos de interés en un rango de concentraciones de 64 pg/mL hasta 0,5 pg/mL Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche y la lectura del valor CIM se realizó de manera visual por ausencia de turbidez. Cada determinación se realizó al menos dos veces, por duplicado.
Para la determinación de la CMB se sembraron por duplicado alícuotas de 10 μL de cada uno de los pocilios correspondientes a al menos una o dos diluciones a cada lado del valor CMI de cada compuesto en agar Mueller-Hilton. Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Se consideró como valor de CMB a la menor concentración del compuesto que previno el crecimiento del 99,9% de la población bacteriana inicial tras el subcultivo en medio libre de antimicrobiano.
6. Estudio de la citotoxicidad en células HeLa
Se estudió la capacidad citotóxica sobre células humanas del compuesto A0 empleando el ensayo de reducción de la resazurina en células HeLa, para este ensayo se empleó el compuesto PrestoBlue™ de la casa comercial ThermoFisher. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocilios estériles, a razón de 10,000 células/pocillo, empleando medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 1% de GlutaMAX™ (ThermoFisher) y 1% de solución antibiótica penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich). Las placas así sembradas se incubaron durante 24 h a 37ºC bajo atmósfera saturada de humedad con 5% de CO 2 . Al cabo de este tiempo, las células fueron expuestas por triplicado a diluciones dobles seriadas del compuesto de interés, a fin de evaluar la capacidad citotóxica del mismo en un rango de concentraciones de 0,125 a 128 mg/L. La cantidad de DMSO (vehículo) total incorporada en todos los casos fue de 1 ,2% v/v, incluyendo controles de citotoxicidad del DMSO en todos los ensayos. Tras 24 h de exposición a cada tratamiento, se adicionó PrestoBlue 10% v/v y se incubó durante 2 horas a 37ºC. La fluorescencia emitida por la resofurina en células HeLa viables fue registrada con un lector Synergy HT (Biotek).
El principio activo del PrestoBlue es la resazurina, un compuesto de color azul, no fluorescente y no tóxico para las células. La resazurina atraviesa la membrana de las células vivas y en el interior de estas se reduce irreversiblemente a resorufina, un compuesto de color rosa que emite fluorescencia. La cantidad de resorufina producida en cada pocilio de la placa será proporcional al número de células viables y podrá cuantificarse mediante un lector de absorbancia (longitud de onda de absorción: 570 nm) o fluorescencia (se excita a 530 nm y emite a 590 nm). Una vez recogida la emisión de fluorescencia de las células HeLa tras la exposición a cada concentración del compuesto de interés, se construye una curva de porciento de viabilidad celular frente a concentración del compuesto, tomando como el 100% de viabilidad la fluorescencia emitida por los pocilios de células no tratadas. A partir de esta curva se determina el valor de concentración citotóxica media (CC 50 ), es decir, la concentración del compuesto que produce la muerte del 50% de las células del cultivo.
7. Cálculo del índice terapéutico (IT)
Teniendo en cuenta la CC 5 o del compuesto de interés calculada en los estudios de citotoxicidad en células HeLa y la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida a partir de estudios previos de actividad antimicrobiana, se puede calcular el índice terapéutico (IT) del compuesto de interés frente a cada microorganismo, como un valor numérico adimensional resultado del cociente CC 50 /CMI. Este valor proporciona una ¡dea acerca de la eficacia y seguridad de un fármaco dado que constituye la ratio entre la concentración a la que causa el efecto terapéutico frente a aquella que causa toxicidad y efectos adversos en el paciente. Mientras mayor es el valor de IT, mayor es la seguridad del fármaco. Un valor de IT > 10 implica una ventana de seguridad alta del compuesto o fármaco.
8. Toxicidad aguda en ratones
Se evaluó la toxicidad aguda por ingestión oral en ratones siguiendo el método de las clases según la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OECD), con ligeras modificaciones. El ensayo fue desarrollado en la Unidad de Nanotoxicología e Inmunotoxicología (UNATI) del I IS Aragón con la aprobación previa de la Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza (Ref. PI58/20). Ratones hembras SWISS de 25-30 g de peso, libres de patógenos específicos (SPF), fueron suministrados por Janvier Labs (Francia). Los animales fueron marcados para permitir la identificación individual y mantenidos en sus jaulas durante 7 días antes de la dosificación para permitir la aclimatación a las condiciones del laboratorio. La sustancia de ensayo se administró en una sola dosis mediante sonda intragástrica. La concentración de cada dosis fue ajustada para no administrar más de 1 mL/100 g de peso del animal. Dos grupos de 3 animales se mantuvieron en ayunas durante 4 horas (agua ad libitum), se pesaron individualmente y recibieron una dosis del compuesto A0 disuelto en el momento en aceite de maíz. Un grupo de animales recibió una dosis de 50 mg/kg de peso corporal y otro una dosis de 300 mg/kg de peso. Tras los tratamientos, los animales fueron observados individualmente durante los primeros 30 min y luego cada 1 h durante las primeras 4 h. Luego se realizaron dos observaciones diarias durante los primeros 5 días, y diariamente a partir de entonces, durante un total de 14 días. Los animales se pesaron diariamente y se realizaron sistemáticamente registros individuales para cada animal en cuanto a la apariencia de la piel, pelaje, membranas mucosas, frecuencia respiratoria, patrón de actividad y comportamiento somatomotor. Al final del ensayo, todos los animales se sacrificaron compasivamente y se sometieron a una necropsia macroscópica. Se extrajeron muestras a todos los animales de bazo, hígado, riñones, corazón y cerebro, las cuales se fijaron en formol para su posterior análisis anatomopatológico mediante tinción con hematoxilina-eosina. Los estudios histopatológicos fueron realizados en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa por personal especializado.
9. Análisis de la interacción proteína-ligando mediante acoplamiento molecular (Docking)
Se estimó la afinidad de unión a la proteína diana de diferentes ligandos de bajo peso molecular con una estructura química similar mediante acoplamiento molecular. La estructura tridimensional de la proteína HsrA de Helicobacter pylori (2HQR, modelo 1 , cadena A) fue extraída de la base de datos Protein Data Bank. Las estructuras 3D de todos los ligandos fueron construidas mediante el programa Corina Classic y minimizadas mediante AMMOS (https://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/). La proteína y los ligandos fueron preparados empleando AutoDockTools 1.5.6 (https://autodock.schipps.edu/). La estructura molecular de la proteína se consideró rígida, se permitió la libre torsión de los enlaces rotables en las moléculas de ligando. El análisis de acoplamiento molecular se realizó empleando el programa AutoDock Vina 1.2. Para cada uno de los ligandos se analizaron las energías libres de interacción (AG) de las 20 conformaciones proteína-ligando más favorecidas termodinámicamente tras un docking ciego. Se consideró como modelo de interacción la conformación con menor energía de unión entre el ligando y el dominio C-terminal (dominio de unión al DNA) de la proteína diana. La interacción molecular entre ambas moléculas se visualizó mediante el programa PyMol 2.5.2 (https://pymol.org). Resultados
1. Inhibición de la actividad de los reguladores de respuesta HsrA y CosR
2. El compuesto A0 inhibe la función biológica de la proteína esencial HsrA de Helicobacter pylori. La proteína HsrA es un regulador de respuesta con actividad de unión al ADN. Esta proteína actúa en la célula como regulador transcripcional, se une específicamente a la región promotora de genes diana y regula la transcripción de estos genes. Estudios previos han demostrado que HsrA constituye una diana terapéutica eficaz frente a Helicobacter pylori, dado que la inhibición de su actividad biológica conlleva a la muerte del microorganismo. Mediante ensayos de retardo en gel se demuestra que el compuesto de interés en la presente invención inhibe la unión de HsrA a su promotor diana porGDAB , según se observa en la Figura 1. El compuesto A0 inhibe además la actividad biológica de la proteína esencial CosR de Campylobacter jejuni. Mediante ensayos de retardo en gel se demuestra que el compuesto de interés en la presente invención inhibe la unión de CosR a su promotor diana sodB, según se observa en la Figura 3.Actividad antimicrobiana frente a Helicobacter pylori
El compuesto A0 muestra una potente actividad bactericida frente a cepas de Helicobacter pylori. El rango de concentración mínima inhibitoria observado (CMI = 0,031 - 0,063 mg/L, Tabla 1 ) evidencia una actividad antimicrobiana de 16 a 32 veces superior al metronidazol (CMI = 1 mg/L) frente a las cepas de Helicobacter pylori empleadas en el estudio.
3. Actividad antimicrobiana frente a Campylobacter jejuni
El compuesto A0 demuestra además una fuerte actividad bactericida frente a otra epsilonproteobacteria de interés clínico, Campylobacter jejuni, con un valor de CMI para la cepa control ATCC 33560 de 0,25 mg/L (Tabla 1 ). Esta actividad antimicrobiana frente a Campylobacter es similar a la evidenciada por ciprofloxacino (CMI = 0,5 mg/L) y superior a la obtenida con doxiciclina (CMI = 1 mg/L), eritromicina (CMI = 2 mg/L) y gentamicina (CMI = 1 mg/L), empleando la misma cepa de estudio.
Tabla 1. Actividad antimicrobiana del compuesto A0 frente a cepas de Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni y representantes de la microbiota normal humana.
CMI: Concentración mínima inhibitoria, CMB: Concentración mínima bactericida, ambas expresadas en mg/L.
4. Actividad antimicrobiana representantes de la microbiota normal humana
La actividad antimicrobiana del compuesto A0 frente a especies bacterianas representativas de la microbiota normal humana como Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis es muy baja, con valores de CMI > 64 mg/L (Tabla 1). Este resultado sugiere una actividad antimicrobiana selectiva del compuesto de interés frente a epsilonproteobacterias y una baja tasa de efectos colaterales adversos sobre la microbiota normal, de ser administrado en humanos como nuevo agente antimicrobiano.
5. Toxicidad e índice terapéutico
El compuesto A0 muestra una baja toxicidad tanto in vitro como in vivo y un elevado índice terapéutico frente a Helicobacter pylori y C. jejuni (Tabla 2). De esta forma, la dosis media necesaria del compuesto para causar citotoxicidad en una línea de células humanas (HeLa) es > 2000 veces superior a la dosis media necesaria para inhibir el crecimiento in vitro de Helicobacter pylori y >500 veces superior a la dosis requerida para inhibir el crecimiento in vitro de Campylobacter jejuni, lo cual garantiza un amplio margen terapéutico en el tratamiento de infecciones producidas por ambos microorganismos.
La toxicidad aguda en ratones tras ingestión oral es baja, con un valor del DL 50 > 300 mg/kg (Tabla 2). Este valor supone una toxicidad inferior a medicamentos ampliamente prescritos como aspirina (DL 50 = 250 mg/kg), voltaren (DL 50 = 95 mg/kg) o diazepam (DL 50 = 48 mg/kg) y antibióticos como isoniacida (DL 50 = 133 mg/kg). Todos los animales expuestos a dosis de 50 mg/kg y 300 mg/kg de peso corporal sobrevivieron. No se apreciaron signos de toxicidad macroscópicos como pérdida de peso, alteración de la piel, pelaje, mucosas, frecuencia respiratoria, patrón de actividad y comportamiento somato motor durante los 14 días de estudio. No se apreciaron alteraciones histológicas específicas de toxicidad en ninguno de los órganos estudiados (bazo, hígado, riñones, corazón y cerebro). En dos de los tres ratones expuestos a la dosis de 300 mg/kg se apreciaron leves infiltrados inflamatorios con presencia de eosinófilos en áreas lobulillares y sinusoides del hígado. Aunque estos hallazgos histológicos inespecíficos pudieran indicar una reacción de hipersensibilidad al compuesto de interés, estos no se acompañaron de otras alteraciones típicas (eosinófilos en espacios porta, colestasis centrolobulillar, apoptosis) que pudieran confirmar un diagnóstico definitivo de toxicidad hepática.
Tabla 2. Citotoxicidad en células HeLa, dosis letal media en ratones e índices terapéuticos del compuesto A0 frente a Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni.
CC 50 : Concentración citotóxica media, DL50: Dosis letal media.
El índice terapéutico (IT) es la relación entre la CC 50 y la CMI. Un valor IT > 10 implica un alto perfil de seguridad del compuesto o medicamento.
6. Análisis de la interacción proteína-ligando mediante acoplamiento molecular. Estudio de la afinidad de unión a la proteína diana de diferentes ligandos de bajo peso molecular con estructura química similar
Se realizó una predicción bioinformática del mejor modelo de interacción entre varios ligandos de estructura química similar y la proteína diana HsrA. El ligando cuya actividad antimicrobiana fue demostrada experimentalmente (A0) fue empleado inicialmente para definir el sitio de unión más probable con la proteína mediante un docking ciego. Mediante este procedimiento se analizan todas las conformaciones posibles de interacción proteína-ligando y finalmente se organizan o clasifican según el valor de la energía libre de interacción (AG), la cual es una medida de la afinidad del complejo. Mientras menor sea la energía libre de interacción, mayor es la afinidad de unión entre ambas moléculas. Dada la independencia funcional de los dos dominios de HsrA, solo los ligandos que interaccionaron con el dominio C-terminal de unión al DNA fueron considerados como posibles inhibidores de la actividad biológica de la proteína diana, siendo definido como modelo de interacción la conformación con menor energía de unión para cada ligando. Los resultados del análisis se muestran en la Figura 2 y Tabla 3.
Como se aprecia en la Figura 2C, en el sitio de unión con la proteína, dentro del dominio C-terminal, el ligando establece las siguientes interacciones no covalentes con los aminoácidos más cercanos: (1 ) el grupo fenilo del ligando establece interacciones hidrofóbicas con cadena lateral alifática del residuo Leu 126, (2) el Cl establece puente de hidrógeno con el grupo OH de la cadena lateral de Thr203, (3) el anillo de tiofeno establece interacciones hidrofóbicas con la cadena lateral alifática de los aminoácidos Lys194 y Leu152, (4) el grupo NO 2 establece interacciones electrostáticas con el grupo NH 3 + de Lys 194, mientras (5) el grupo carbonilo del ligando establece puente de hidrógeno con el grupo OH de la cadena lateral de Thr203. Los residuos Lys194, Metí 95, Pro198, Leu199 y Thr203 forman parte del motivo HTH. Según este modelo de interacción, la inhibición de la actividad biológica de HsrA como regulador transcripcional tras la unión del ligando se produce por impedimento esférico y bloqueo de la movilidad conformacional del motivo HTH, que impide el reconocimiento de secuencias de DNA específicas y la unión a las regiones promotoras de sus genes diana. La unión del ligando puede ocasionar además una desestabilización de la estructura del dominio C-terminal.
Una vez definido el sitio de interacción más probable del ligando evaluado experimentalmente (A0), se diseñaron ¡n silico pequeñas modificaciones racionales a la estructura química de este ligando, principalmente mediante cambios o adiciones de nuevos radicales, tanto polares como apolares, a sus anillos fenilo y tiofeno, y modificaciones en la posición y naturaleza química del anillo aromático de tiofeno (Tabla 3). Seguidamente, se analizó por acoplamiento molecular la energía libre de interacción entre cada una de las estructuras químicas diseñadas y el sitio de unión más probable del ligando experimental en la proteína HsrA, previamente definido y visualizado en la Figura 2.
Como se aprecia en la Tabla 3, pequeñas modificaciones incorporadas ¡n silico a la estructura química del ligando experimental (A0) permitieron obtener una serie de análogos de bajo peso molecular, que mantuvieron el mismo modelo de interacción del ligando experimental en los ensayos de acoplamiento molecular. Notablemente, algunas de las modificaciones químicas realizadas en la simulación bioinformática incrementaron la afinidad del ligando por la proteína, lo cual se refleja en una menor energía de interacción (ΔG, kcal/mol). Sin embargo, otras modificaciones parecieron disminuir ligeramente la afinidad de unión respecto al ligando experimental.
Tabla 3. Energía libre de interacción entre el regulador transcripcional HsrA de Helicobacter pylori y diferentes ligandos de bajo peso molecular que comparten una estructura química similar, según análisis de acoplamiento molecular (Docking).
El acoplamiento molecular y el cálculo de las energías de interacción se realizó empleando el software AutoDock Vina.
Los grupos Cy y R 1 a R 8 corresponden a los grupos de la fórmula I de los compuestos de la invención.