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Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der deutschen Patentanmeldung 102022 107247.9 eingereicht am 28 März 2022. Der Inhalt dieser deutschen Prioritätsanmeldung wird durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen.

Technischer Hintergrund

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Partikeln und eine Partikeldispersion.

Stand der Technik

[001] Innerhalb der letzten drei Dekaden, sind signifikante Forschungsanstrengungen auf polymere Biomaterialien gerichtet worden, insbesondere auf Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA). PLGA ist ein biokompatibles, biologisch abbaubares Polymer, das schon seit Dekaden von der FDA für medizinische Anwendungen zugelassen ist. Eine Auswahl von ungefähr 20 Depotformulierungen wie das mikropartikuläre Lupron Depot®, das feste Implantat Propel und das in situ gel Perseris ^tm sind verfügbar ¹ . PLGA ist auch das meistgenutzte Polymer für nanopartikuläre Drug Delivery Vehikel und eine Vielzahl von Small Molecules ² und Makromolekülen wie Peptiden ³ , Proteinen ⁴ und DNA/RNA ⁵ wurden erfolgreich formuliert. Nanopartikuläre Formulierungen können sowohl erhöhte Löslichkeit und Bioverfügbarkeit von schwer löslichen Substanzen durch Vergrößerung der Oberfläche ermöglichen als auch die modifizierte Freisetzung von Substanzen durch Abbau des Polymers und Modifikation der Partikeloberfläche.

[002] Allerdings gibt es derzeit keine Therapeutika auf dem Markt, die PLGA in nanopartikulären Formulierungen verwenden. Das könnte darin begründet sein, dass bisher keine kosten- und zeiteffiziente Massenproduktion existiert, so dass deren mögliche klinische Anwendung limitiert war. Derzeit gibt es einige wenige Zugänge für die Massenproduktion von PLGA- Nanopartikeln in großem Maßstab, zum Beispiel die semi-automatische Nanoprezipitationssystem entwickelt von Rietscher et al. ⁶ , das Nanoprezipitationssystem basierend auf MicroJetReactor Technologie ⁷ oder die Emulsion Lösungsmittel- Verdampfungstechnik modifiziert von Schiller ⁸ , die fokussierten Ultraschall verwendet oder im Allgemeinen mikrofluidische Ansätze ^9,10 . Da Partikel anschließend vor Verwendung von Lösungsmitteln oder Stabilisatoren gereinigt werden müssen, bedeutet dieses einen weiteren kosten- und zeitintensiven Faktor in der kommerziellen Produktion. [003] Eine sich drehende Scheibe ist eine multifunktionale Vorrichtung, die eine automatische Massenproduktion zu vernünftigen Kosten für den Hersteller verspricht. Diese Systeme ermöglichen einen kontinuierlichen Flow-Prozess in welchem hohe zentrifugale Kräfte verwendet werden, um die Flüssigkeit auf der rotierenden Scheibe in einen dünnen Film zu dispergieren und dadurch ein großes Oberfläche zu Volumen Verhältnis der Flüssigkeit zu erzeugen. Diese Technologie ist seit Dekaden in Gebrauch, zum Beispiel um verschiedene schnelle chemische Reaktionen in sogenannten Spinning Disc Reaktoren (SDR), einschließlich Polymerisation ¹¹ , Neutralisation ¹² , Rekristallisation ¹³ zu realisieren. Außerdem wurde eine große Anzahl von chemischen Verbindungen in Nanogröße durch reaktive Präzipitation produziert, z.B. Hydroxyapatit ¹⁴ , TiO ₂ ¹⁵ , ZnO ¹⁶ und magnetisches Fe ₃ O ₄ ^{17, 18} . Wie in der Literatur beschrieben, wurde die Spinning Disc Technologie erfolgreich für die ionische Gelierung von Chitosan Nanopartikel verwendet ¹⁹ und für die Lösungsmittel-Antilösungsmittel Präzipitation von Nanopartikeln bestehend aus Betacarotin ²⁰ , Stärke ²¹ , oder Curcumin. ²² Was diese gemeinsam haben ist eine Zweiphasenzufuhr der Reaktionsflüssigkeiten. Daher wird die schnelle und homogene Mikrovermischungsfähigkeit der rotierenden Scheibe ausgenutzt ²³ ’ ¹⁴ . Zusätzlich ermöglicht diese Technolgie einen erhöhten und kontrollierbaren Wärme- und Massetransfer welcher viele Synthesen und Prozesse unterstützt, die sonst in dieser Hinsicht limitiert sind. ²⁴ Das trifft auch auf konzentrierte Flüssigkeiten, wie durch Akhtar et al. ²⁵ beschrieben zu, wo eine milde Methode beschrieben wird, aufgrund der kurzen Kontaktzeit mit der Heizplatte.

[004] Neben Methoden wie Emulsions-Lösungsmittelverdampfung, Aussalzen und Elektrospraytrocknung, ist die Solvent-Antisolventpräzipitation eine allgemein verwendete Technik zur Herstellung von PLGA - Nanopartikeln. ^{26, 27, 28} Der Prezipitationsmechanismus ist in der Literatur als vierstufiger Prozess beschrieben: Übersättigung, Keimbildung und Wachstum durch Kondensation und Koagulation. Die Zugabe von gelöstem Polymer zum Antisolvent mit dem das Lösungsmittel komplett mischbar ist, resultiert in verringerter Löslichkeit und führt zur Übersättigung, wenn die Gleichgewichtssättigungskonzentration überschritten wird. Über der kritischen Übersättigungskonzentration wird die Keimbildung induziert. ²⁹ Die Reproduzierbarkeit der Partikeleingeschaften ist bei vielen Verfahren allerdings auf kleine Volumina beschränkt.

Es besteht daher Bedarf an weiteren Verfahren zur Herstellung von Partikeln.

Zusammenfassung der Erfindung

[005] Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Partikeln umfassend Aufträgen einer Lösung auf eine sich drehenden Oberfläche; wobei die Lösung umfasst: a) mindestens ein polar-aprotisches organisches Lösungsmittel; b) ein protisches Lösungsmittel; c) mindestens ein Polymer; und d) mindestens eine einzukapselnde Verbindung.

[006] Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Partikeldispersion, umfassend a) Partikel umfassend i) mindestens ein Polymer; ii) mindestens eine eingekapselte Verbindung und b) Wasser, wobei die Dispersion kein organisches Lösungsmittel enthält oder die Menge des vorhandenen organischen Lösungsmittel unter 1 Gew.-% basierend auf der Gesamtmenge der Dispersion beträgt.

[007] Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Herstellung von Partikeln, vorzugsweise Nanopartikel, umfassend a) eine sich drehende Oberfläche; b) ein über der sich drehenden Oberfläche angebrachtes Mittel zur Abgabe von Flüssigkeiten auf die sich drehende Oberfläche; c) eine physische Abschirmung, die Substanzen zurückhält, die auf die sich drehende Oberfläche mittels b) aufgebracht wurden.

[008] Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in einer Ausführungsform die Herstellung von Partikeln, insbesondere Nanopartikeln, in einem kontinuierlichen Prozess. Aufgrund der angewandten einfachen Verfahrensschritte ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch eine Herstellung der Partikel in kommerziell relevanten Größenordnungen, die über den Labormaßstab hinausgehen zu geringen Kosten. Durch das Aufbringen der Lösung auf eine relativ große Oberfläche und den dadurch erzeugten dünnen Film, wird das organische Lösungsmittel leicht und ohne weitere separate Reinigungsschritte entfernt. Kurze Beschreibung der Figuren

[009] Fig. 1 : Nanopräzipitation durch Lösungsmittel-Evaporation in einem SDS. A: Schematische Darstellung eines SDS. Blaue Pfeile zeigen die Bewegungen der Platten und der Probeflüssigkeit. B: Petrischale nach Nanopräzipitation mit zentraler Auftropfposition. Ab einem bestimmten Abstand zum Plattenzentrum treten strahlenförmig getrocknete Polymerreste auf (roter Pfeil). Die Nanopartikeldispersion sammelt sich im Rand der Schale.

[0010] Fig. 2: Effekt der Polymerkonzentration auf die Größe der Nanopartikel. A: Ergebnisse der DLS Messungen zur Größenformation von PLGA Nanopartikeln in Abhängigkeit der verwendeten Polymerkonzentration im SDS. Die dargestellte Trendlinie (R2=0.99216) weist auf eine nahezu lineare Beziehung innerhalb Polymerkonzentrationen von bis zu 18 mg/ml und der Partikelgröße. B: Ergebnisse der DLS Messungen zur Größenformation von PLGA Nanopartikeln in Abhängigkeit der verwendeten Polymerkonzentration im BT Verfahren.

[0011] Fig. 3: Einfluss des Polymertyps auf die Größe der Nanopartikel im SDS und im BT Verfahren. A: PLGA Typen mit unterschiedlichen MS Anteilen. B: PLGA Typen mit unterschiedlichen Molekulargewichten.

[0012] Fig. 4: SEM Aufnahmen von PLGA Nanopartikeln. A-E: Unterschiedliche PLGA Typen in ACE und H2O präzipitiert im SDS. A: Resomer RG 502H (50% MS Anteil, 7 17000 g/mol), 241±34 nm. B: Resomer RG 503H (50% MS Anteil, 24 38000 g/mol), 127±2 nm. C: Resomer RG 504H (50% MS Anteil, 38 54000 g/mol), 84±20 nm. D: Resomer RG 653H (65% MS Anteil, 24 38000 g/mol), 198±38 nm. E: Resomer RG 753H (75% MS Anteil, 24 38000 g/mol), 227±45 nm. F-H: Resomer RG 503H in unterschiedlichen Lösungsmittel/Nicht-Lösungsmittel Mischungen durch direkte Trocknung auf Siliziumdioxid-Plättchen präzipitiert. F: ACE und H2O, 183±65 nm. G: ACN und H2O, 386±115 nm. H: ACE und Ethanol, 348±86 nm. In jeder Abbildung wurden die Durchmesser von 30 Partikel vermessen.

[0013] Fig. 5: Einfluss von Lösungsmittel und Nicht-Lösungsmittel auf die Größe der Nanopartikel. Resomer RG 503H gelöst in unterschiedlichen Zusammensetzungen an Lösungsmitteln und Nicht-Lösungsmitteln im SDS.

[0014] Fig. 6: CUR Beladung im SDS und im BT Verfahren. A: Ergebnisse der DLS Messungen von 1% (m/m) CUR beladener Nanopartikel unterschiedlichen Polymerkonzentration. B: EE, DL und Ausbeuten von 1% (m/m) CUR beladener Nanopartikel unterschiedlichen Polymerkonzentration. C: Ergebnisse der DLS Messungen unterschiedlicher CUR Beladungen im SDS und BT Verfahren. D: EE und DL unterschiedlicher CUR Beladungen im SD und im BT Verfahren.

[0015] Fig. 7: Frisch hergestellte Nanopartikeldispersionen. Links: Im SDS hergestellte Dispersion (gesamtes Probevolumen). Rechts: Im BT Verfahren hergestellte Dispersion (Aliquot: 0.5 ml; Gesamtvolumen: 11.5 ml).

[0016] Fig. 8: Acetongehalt in Abhängigkeit von der Zeit.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

*■*■*■*

[0017] Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Partikeln und/oder einer Partikeldispersion umfassend Aufträgen einer Lösung auf einer sich drehenden Oberfläche.

[0018] Die Partikel sind vorzugsweise Nanopartikel, mehr bevorzugt weisen die Partikel eine intensitätsgewichtete Durchschnittspartikelgröße (Z-Durchschnittsgröße) von 20 bis 1000 nm, noch mehr bevorzugt 100 bis 600 nm, besonders bevorzugt 120 bis 200 nm auf.

[0019] Die Partikel weisen insgesamt vorzugsweise einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,016 bis 0,2, vorzugsweise 0,016 bis 0,1 auf.

Wobei sd = Standardabweichung zur hypothetischen Gaußverteilung z _ave = intensitätsgewichtete Durchschnittspartikelgröße

[0020] Die Partikel haben vorzugsweise ein ^-Potential von -20 bis -50 mV, mehr bevorzugt -25 bis -40 mV.

[0021] Das Aufträgen wird vorzugsweise ausgeführt mittels Auftropfen, oder Sprühen, mehr bevorzugt Auftropfen.

[0022] Die Lösung umfasst: a) mindestens ein polar-aprotisches organisches Lösungsmittel; b) ein protisches Lösungsmittel; c) mindestens ein Polymer; und d) mindestens eine einzukapselnde Verbindung.

[0023] Das mindestens eine polar-aprotische Lösungsmittel vorzugsweise i) eine Flüchtigkeit von größer als 3 aufweist und/oder ii) ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Aceton, Acetonitrile und THF, vorzugsweise Aceton. t90 (ßutylacetat)

[0024] Die Flüchtigkeit wird wie folgt definiert: Flüchtigkeit = t90 (Probe) t ₉₀ = Zeit bis zu der 90% der Probe verdunstet ist.

[0025] Vorzugsweise beträgt die Menge des einen polar-aprotischen organischen Lösungsmittels in der Lösung oder der Dispersion basierend auf dem Gesamtgewicht der Lösungsmittel in der Lösung oder der Dispersion 95 bis 70 Gew.-%, mehr bevorzugt 92 bis 75 Gew.-%, noch mehr bevorzugt 91 bis 80 Gew., am meisten bevorzugt 90 Gew-% beträgt.

[0026] Das mindestens eine protische Lösungsmittel ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Wasser, Ethanol, Methanol und Isopropanol, vorzugsweise Wasser.

[0027] Vorzugsweise beträgt die Menge des mindestens einen protischen Lösungsmittels in der Lösung oder der Dispersion basierend auf dem Gesamtgewicht der Lösungsmittel in der Dispersion 5 bis 30 Gew.-%, mehr bevorzugt 8 bis 25 Gew.-%, noch mehr bevorzugt 9 bis 20 Gew.-%, am meisten bevorzugt 10 Gew.-%.

[0028] Das mindestens ein Polymer ist vorzugsweise Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA). Vorzugsweise ist in dem Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) i) das Verhältnis von Milchsäure: Glykolsäure ist 20:80 bis 80:20, vorzugsweise 50:50, 65:35, oder 70:25 und/oder ii) das Molekulargewicht ist 6000 bis 60000 g/mol, vorzugsweise 6500 bis 55000 g/mol.

[0029] Die Konzentration des Polymers in der Lösung beträgt vorzugsweise 0,1 bis 25 mg/ml, mehr bevorzugt 5 bis 13 mg/ml.

[0030] In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration des Polymers in der Lösung 1 ,5 bis 3 mg/ml, vorzugsweise 2 mg/ml.

[0031] In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration des Polymers in der Lösung 5 bis 7 mg/ml, vorzugsweise 6 mg/ml.

[0032] In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration des Polymers in der Lösung 10 bis 14 mg/ml, vorzugsweise 12 mg/ml. [0033] Vorzugsweise ist die mindestens eine einzukapselnde Verbindung oder die mindestens eine eingekapselte Verbindung i) eine pharmazeutisch aktive Verbindung aus der Klasse „small molecule“ und/oder ii) eine niedermolekulare Verbindung mit einem Molekulargewicht von <900 g/mol und/oder iii) eine niedermolekulare Verbindung mit einem logP-Wert >0 ist.

[0034] Die Menge der mindestens einen einzukapselnden Verbindung in der Lösung beträgt vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew-%, mehr bevorzugt 1 bis 8 Gew.-% noch mehr bevorzugt 1 bis 5 Gew-% in Bezug auf Menge des Polymers (m/m).

[0035] In einer Ausführungsform beträgt die Menge der mindestens einen einzukapselnden Verbindung in der Lösung 0,5 bis 1 ,5 Gew-%, vorzugsweise 1 Gew.-% in Bezug auf Menge des Polymers (m/m).

[0036] In einer Ausführungsform beträgt die Menge der mindestens einen einzukapselnden Verbindung in der Lösung 1 ,8 bis 2,5 Gew-%, vorzugsweise 2 Gew.-% in Bezug auf Menge des Polymers (m/m).

[0037] In einer Ausführungsform beträgt die Menge der mindestens einen einzukapselnden Verbindung in der Lösung 3,5 bis 6,5 Gew-%, vorzugsweise 5 Gew.-% in Bezug auf Menge des Polymers (m/m).

[0038] Die Definition des logP-Wertes ist dem Fachmann bekannt. P ist der n-Octanol-Wasser- cO

Verteilungskoeffizient. LogP kann wie folgt definiert werden: logP = log—. c ₀ ist die Konzentration der betrachteten Substanz in der n-Octanolphase.

Cw ist die Konzentration der betrachteten Substanz in der Wasserphase.

[0039] Vorzugsweise ist die sich drehende Oberfläche i) eine Scheibe, vorzugsweise eine Glasscheibe oder ein Wafer und/oder ii) mit Polyvinylalkohol beschichtet und/oder iii) eine Scheibe und die Scheibe dreht sich um eine gedachte Achse die 90° zur Oberfläche der Scheibe, und exakt im Zentrum der Scheibe steht und/oder iv) die sich drehende Oberfläche sich mit 700 rpm bis 3000 rpm dreht und/oder v) die sich drehende Oberfläche glatt ist oder eine Strukturierung aufweisen kann, vorzugsweise ist die sich drehende Oberfläche glatt und/oder vi) die sich drehende Oberfläche kreisförmig ist.

[0040] rpm = rounds per minute = Umdrehungen pro Minute.

[0041] Vorzugsweise liegen die Partikel nach dem Aufbringen der Lösung auf die sich drehende Oberfläche in Form einer Dispersion vor.

[0042] Das Verfahren kann einen weiteren Trocknungsschritt umfassen in dem die zunächst nach dem Aufbringen der Lösung auf die sich drehende Oberfläche erhaltene Partikeldispersion getrocknet wird. Vorzugsweise erfolgt die Trocknung mittels Gefriertrocknung. Die Gefriertrocknung erfolgt vorzugsweise nach Verfahren, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik für Gefriertrocknungsprozesse allgemein bekannt sind.

[0043] Einer Ausführungsform umfasst die Lösung: a) mindestens ein polar-aprotisches organisches Lösungsmittel; wobei die Menge des einen polar-aprotischen organischen Lösungsmittels in der Lösung oder der Dispersion basierend auf dem Gesamtgewicht der Lösungsmittel in der Lösung oder der Dispersion 95 bis 70 Gew.-%, vorzugsweise 92 bis 75 Gew.-%, mehr bevorzugt 91 bis 80 Gew., noch mehr bevorzugt 90 Gew-% beträgt; b) ein protisches Lösungsmittel; wobei die Menge des mindestens einen protischen Lösungsmittels in der Lösung oder der Dispersion basierend auf dem Gesamtgewicht der Lösungsmittel in der Dispersion 5 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 25 Gew.-%, mehr bevorzugt 9 bis 20 Gew.-%, noch mehr bevorzugt 0 Gew.-% beträgt; c) mindestens ein Polymer; wobei die Konzentration des Polymers in der Lösung vorzugsweise 0,1 bis 25 mg/ml, mehr bevorzugt 5 bis 13 mg/ml beträgt und d) mindestens eine einzukapselnde Verbindung; wobei die Menge der mindestens einen einzukapselnden Verbindung in der Lösung 0,5 bis 10 Gew-%, vorzugsweise 1 bis 8 Gew.-% mehr bevorzugt 1 bis 5 Gew-% in Bezug auf Menge des Polymers (m/m) beträgt.

[0044] Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Partikeldispersion, herstellbar gemäß dem Verfahren wie oben beschreiben, wobei das mindestens eine protische Lösungsmittel Wasser ist. [0045] In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung, optional herstellbar nach dem Verfahren wie oben beschrieben, auf eine Partikeldispersion, umfassend a) Partikel umfassend i) mindestens ein Polymer; ii) mindestens eine eingekapselte Verbindung und b) Wasser,

[0046] wobei die Dispersion kein organisches Lösungsmittel enthält oder die Menge des vorhandenen organischem Lösungsmittel unter 1 Gew.-% basierend auf der Gesamtmenge der Dispersion beträgt. Die Definitionen für die Partikel, das Polymer und die eingekapselte Verbindung, wie oben für das Verfahren definiert, sind vorzugsweise auch auf diese Ausführungsform anwendbar. Weiterhin ist die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Herstellung von Partikeln gerichtet, umfassend a) eine sich drehende Oberfläche; b) ein über der sich drehenden Oberfläche angebrachtes Mittel zur Abgabe von Flüssigkeiten auf die sich drehende Oberfläche; c) eine physische Abschirmung, die Substanzen zurückhält, die auf die sich drehende Oberfläche mittels b) aufgebracht wurden.

[0047] Die physische Abschirmung kann direkt an die sich drehende Oberfläche angebracht sein und sich mit der Oberfläche mitdrehen.

[0048] Die physische Abschirmung kann so ausgestaltet sein, dass sich die drehende Oberfläche unabhängig von der physischen Abschirmung dreht. Die physische Abschirmung kann so ausgestaltet sein, dass die Substanzen auf der sich drehenden Oberfläche zurückgehalten werden oder so, dass das Zurückhalten außerhalb der sich drehenden Oberfläche geschieht. Beispiele für diese Ausführungsformen sind in Figur 1 dargestellt.

[0049] Das über der sich drehenden Oberfläche angebrachte Mittel b) kann so ausgestaltet sein, dass es geeignet ist, die Flüssigkeit tropfenweise auf die sich drehende Oberfläche abzugeben oder als Spray auf diese abzugeben, vorzugsweise tropfenweise abzugeben. Beispielsweise kann die Flüssigkeit mittels Spritze oder Kanüle aufgetragen werden.

Beispiele

1. Materialien [0050] PLGA [50:50 Milchsäure:Glycolsäure (MS:GS) mit M _w 7000-17000 g/mol (Resomer RG592H), M _w 24000-38000 g/mol (Resomer RG503H) und M _w 38000-54000 g/mol (Resomer RG504H); 65:35 MS:GS mit M _w 24000-38000 g/mol (Resomer RG653H); 75:25 MS:GS mit 22000-36000 g/mol (Resomer RG753H) wurden von Evonik Industries AG (Essen, Deutschland). CUR (Curcumin) wurde von Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland) beschafft. Polyvinylalkohol [PVA, Mw ~ 31000 (Mowiol® 4-88)] wurde durch Kuraray Europe (Hattersheim, Deutschland) zu Verfügung gestellt. Aceton (ACE, analytical grade), Acetonitril (ACN, HPLC gradient grade), Tetrahydrofuran (THF, analytical grade) und Ethanol (HPLC grade) wurden von Fisher Scientific UK Ltd (Loughborough, UK) erworben. Methanol and Isopropanol, beide HPLC grade, wurden von VWR International (Darmstadt, Deutschland) beschafft. Das verwendete Wasser war Millipore Q-Gard 2 durch das Wasserreinigungssystem von Merck Millipore (Billerica, USA).

2. Durchführung - Spinning Disk Systeme

2.7 Prototyp I

[0051] Der entwickelte einfache Prototyp I ist aus mehreren Modulen zusammengesetzt (Figur 1A, linkes Schema). Ein modifizierter, propellerfreier Computerlüfter (12x12 cm, AVC, Taipei, Taiwan) stellt den Kern des Systems dar. Der Deckel einer Glaspetrischale (Steriplan 15x100 mm, Brand GmbH Co KG, Weinheim, Deutschland) ist dauerhaft umgekehrt am Motor des Lüfters befestigt als Halter für die Petrischale, die in den Deckel eingeführt wird und mit Gummi befestigt wird. Die Petrischale dient als austauschbares Prezipitations- und Sammelgefäß. Ein Labornetzteil (EA-PS 2323A, EA Elektro-Automatik GmbH &Co.KG, Viersen GmbH, Deutschland) versorgt den Lüfter mit Energie, mit variabler Spannung, um die Rotationsgeschwindigkeit des Lüfters und der Petrischale anzupassen. Die Rotationsgeschwindigkeit der eingeführten Petrischale wurde mit einem Tachometer (Voltcraft ®, DT -10L, Conrad Electronic AG, Wollerau, Switzerland). Eine Spritzenpumpe (PHD 2000 programmable, Harvard Apparatus Inc., Holliston, USA) wurde benutzt um die Fliessgeschwindigkeit der Polymer-Solvent-Antisolvent Mischung in die eingefügte, rotierende Petrischale zu regeln. Die Spitze der Nadel (0.55x25 mm), befestigt auf einer Spritze (5 ml- 20 ml), alles gekauft von Braun Melsungen AG (Melsungen, Deutschland), wurde ungefähr 3 mm über der eingefügten Petrischale positioniert.

2.2 Prototyp II

[0052] Zur kontinuierlichen Probensammlung wurde ein zweiter Prototyp konstruiert unter Verwendung eines speziellen Glasgefäßes. Dieses beinhaltet eine runde Aussparung für den Motor des Lüfters und Vertiefungen als Schutz gegen Leckagen und einen Probenauslass am Boden (Figur 1A, rechtes Schema). Die Polymere-Solvent-Antisolvent Mischung wurde auf einen Glaspetrischalendeckel getropft welcher in einer geeigneten Weise an dem Motor des Lüfters befestigt wurde. Mit dem neuen Prototyp wurden größere Mengen Flüssigkeit zugetropft und daher war eine Nanopartikelproduktion in erhöhten Mengen möglich und das Entnehmen der Probe im Betrieb.

3. Partikelherstellung

3.1 Nanopräzipitation durch Verdampfungs-getriggerter SDS

[0053] Zur Herstellung von polymeren Nanopartikeln wurden 10 mg Resomer RG503H in ACE gelöst und 10 Min. kräftig gerührt bevor Wasser zugesetzt wurde in einem ACE:Wasser Verhältnis von 9:1 um eine polymeres Solvent-Antisolvent Mischung von 2 mg/ml zu erhalten. Der Motor des Lüfters wurde bei 5 V gestartet entsprechend einer Rotationsgeschwindigkeit von ungefähr 841 rpm. Die Lösung wurde auf das Zentrum der rotierenden Schale aufgetragen, bei einer Spritzenpumpenfließgeschwindigkeit von 0.5 ml/min. Eine 2%-ige PVA Lösung wurde eingesetzt, um die Petrischale zu beschichten durch Trocknung bei Umgebungsbedingungen, um die abgeschiedenen Nanopartikel in der Dispersion zu stabilisieren, welches als Standartherstellung benutzt wurde. Die resultierende Nanopartikeldispersion wurde vom Rand der eingefügten Petrischale (Prototyp I) entfernt. Die angegebenen Parameter wurden in den folgenden Untersuchungen (Standartprozeduren) verwendet, wenn nicht anders angegeben.

3.2 Einfluss von verschiedenen Parametern auf die NP Größe

[0054] Um den Einfluss von systemspezifischen Einstellungen auf die Partikelgröße zu untersuchen, Drehgeschwindigkeiten von 841 rpm (5 V), 2051 rpm (5.5 V) und 2727 rpm (7V) und Positionen der Nadel zum Aufträgen der Lösung von 0, 1 ,5 und 3 cm Abstand vom Zentrum der eingefügten Petrischale wurden getestet. Rpm = rounds per minute = Umdrehungen pro Minute.

[0055] Die Abhängigkeit von Polymertyp, Polymerkonzentration und Lösungsmittelzusammensetzung auf die Nanopartikelgröße wurde auch untersucht. Für Polymertypen, verschiedene Molekulargewichte von 50:50 MS:GS (Resomere RG 502H, 503H, 504H), verschiedene MS:GA Verhältnisse (Resomer RG 503H, 653H, 753H) und PLGA Konzentrationen von 0,5-22 mg/ml des Resomers RG 503H wurden präzipitiert. Der Einfluss von Lösungsmittel und Antisolvent auf die Partikelgröße wurde untersucht, wobei ACE, ACN und THF als Lösungsmittel und Wasser, Ethanol, Methanol, und Isopropanol als Antisolvents verglichen wurden. Um den Verdampfungseffekt auf die Partikelbildung zu zeigen, wurden Lösungsmittel-Antisolvent-Mischungen hergestellt, wie oben beschrieben und auf Silica-Wafern für SEM Abbildung getrocknet. Zur Größenauswertung wurden 30 zufällig ausgewählte Partikel mittels Fiji-Software vermessen. 3.3 Nanopräzipitation durch den Standard BT Prozess

[0056] Verschiedene Konzentrationen von Resomer RG 503H als auch von verschiedenen Typen von PLGA wurden bezüglich der Größen der resultierenden Nanopartikel, hergestellt durch allgemein verwendete Nanopräzipitation, verglichen. Resomer RG 503H in den Massen 10-40 mg und verschiedene PLGA Typen (Resomer 502H, 503H, 504H, 653H, und 753H) bei einer Masse von 25 mg wurden in 10 min, unter starkem Rühren in 1 ,5 ml ACE gelöst. Polymerlösungen wurden unter Rühren zu 10 ml einer wässrigen Lösung enthaltend 2% PVA mittels einer Spritzenpumpe gegeben, die auf eine Injektionsrate von 0,5 ml/min eingestellt wurde. Die resultierende Nanopartikeldispersion wurde durch Zentrifugation bei 10000 g für 20 min gereinigt und zweimal gewaschen, um überschüssigen Stabilisator zu entfernen. Es ist erwähnenswert, dass das SDS-Produkt aus einer kleinen Antisolvent Phase mit hoher Konzentration bestand, im Gegensatz zu dem bench top (BT) Produkt, das aus einer großen Antisolventphase und einer kleinen Lösungsmittelphase bestand.

3.4 CUR-Beladung von NP

[0057] Zur Herstellung von CUR-beladenen Nanopartikeln wurde CUR in ACE gelöst um eine 1%-ige Lösung zu erhalten. In SDS (Prototyp I), wurde Resomer RG 503H in ACE gelöst und die CUR-Lösung wurde hinzugefügt um Polymerkonzentrationen von 2, 6, und 12 mg/ml zu erhalten und einen anfänglichen Wirkstoffinhalt von 1% (m/m) zum Polymer. In einem Experiment wurde eine Polymerkonzentration von 6 mg/ml und anfängliche Wirkstoffinhalte von 1 , 2, 5% (m/m) in Bezug auf das Polymer eingestellt. Die resultierende Nanopartikeldispersionen wurde gesammelt und bei 10000 g für 20 Min. (Rotina 420 R, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany) zentrifugiert, um freien Wirkstoff zu eliminieren. In BT, wurden CUR-beladene Nanopartikel mit einer anfänglichen Polymerkonzentrationen von 12 mg/ml hergestellt und in derselben Weise gereinigt wie in Abschnitt 3.3 beschrieben. In der Nanopräzipitation im Standard BT Verfahren wurde ACE teilweise durch CUR Stammlösung (1% in ACE) ersetzt um anfängliche Konzentrationen von 1 , 2 und 5% (m/m) des Polymers zu erhalten. Quantifizierungen (DL und EE) wurden wie in Abschnitt 5 beschrieben durchgeführt.

3.5 Übertragbarkeit auf Prototyp II

[0058] Um die Übertragbarkeit auf Prototyp II zu testen, wurde eine Polymer-Lösungsmittel- Antisolvens Mischung hergestellt, in einer Menge von 20 ml und unter denselben Parametern präzipitiert wie für den Prototyp I. Die drehende Schale wurde nicht mit PVA beschichtet, weil die Menge an beschichtetem Material, das in Prototyp I verwendet wurde, nicht ausreichend ist für größere Mengen Polymer, die im Polymer II verwendet werden (3.1 Nanopräzipitation durch Verdampfungs-getriggerter SDS). Das Sammelgefäß wurde vorbefeuchtet, um das Flüssigkeitsvolumen zu erhöhen und erlaubt die produzierte Nanopartikeldispersion zu sammeln.

4. Bestimmung der Ausbeute und Evaluation von NP Stabilität

[0059] Die Ausbeute wurde durch Gefriertrocknung von gesammelten Nanopartikeldispersionen, hergestellt in Konzentrationen von 2, 6 und 12 mg/ml (alpha 3-4 LSCbasic, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Germany) über 24 Stunden bestimmt. Die Stabilität von Nanopartikeln (Resomer RG 503H in Prototyp I) hergestellt mit und ohne PVA Beschichtung der Schale wurde in Prototyp I untersucht. Daher wurde die resultierende Dispersion bei 4 °C gelagert und die Qualität bezüglich der kolloidalen Eigenschaften (Größe, PDI und ^-Potential) evaluiert auf Basis der frisch hergestellten Dispersion, nach 7,14, 21 und 28 Tagen durch Zetasizer Messungen. Für Prototyp II, wurde die Stabilität nur für PVA-freie Bedingungen untersucht.

5. Partikel Charakterisierung

5.1 Partikelgröße, Polydispersitätsindex und ^-Potential

[0060] Nanopartikelgröße und Polydispersitätsindex (PDI) wurden mittels Dynamic Light Scattering bestimmt, ^-Potential wurde mittels Electrophoretic

Light Scattering (Nano ZS, Malvern Panalytical GmbH, Malvern, UK and Almelo, the Netherlands). Die Analyse wurden bei einem Rückstreuungswinkel von 173° und bei 25 °C durchgeführt unter Verwendung von angemessen mit Wasser verdünnten Proben.

5.2 Partikelmorphologie

[0061] Die Oberflächenmorphologie von getrockneten Proben wurde durch Scannen mit einem Elektronenmikroskop (Zeiss EVO 15, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) nach Sputtern mit einer 10 nm Goldschicht unter Vakuumbedingungen (Q150R Rotary-Pumped Sputter Coater, Quorum Technologies Ltd., Laughton, UK) bei einem Arbeitsabstand von 16.5 mm und einer Beschleunigungsspannung von 5 kV.

5.3 CUR Quantifizierung

[0062] Proben zur Quantifizierung von CUR wurden für 24 h gefriergetrocknet und bezüglich DL und EE quantifiziert. Daher wurden die Partikel in ACN (1 mg/ml) gelöst, gefiltert (0,45 pm, RC membrane filter Titan 3, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) und mit Fluoreszenzspektroskopie (plate reader Infinite M200, Tecan Trading AG, Männedorf, Schweiz) analysiert. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden jeweils auf 415 nm und 515 nm eingestellt. Die Kalibrierungskurve, die für die Berechnung der CUR-Konzentration verwendet wurde, war linear im Bereich 0,1-1 pg/ml. Die Wirkstoffbeladung (DL%) und Einkapselungseffizienz (EE%) wurden gemäß den Gleichungen (1) und (2) berechnet.

6. Resultate und Diskussion

6. 1 Nanopräzipitation durch Verdampfungs-getriggerter SDS

[0063] Partikel konnten unter Verwendung von SDS produziert werden, basierend auf einer modifizierten Nanopräzipitationstechnik. Die große Oberfläche der rotierenden Platte löste extensive Verdampfung des aufgetragenen Lösungsmittels (ACE) aus. Daher produzierten die präzipitierten Nanopartikel eine milchige, hochkonzentrierte Nanopartikeldispersion in der kleinen Menge Antisolvenz (Figur 7). Allerdings war ein Verlust des Polymers auf der drehenden Schale sichtbar, der detailliert in Abschnitt 6.3 beschrieben wird. Ein Herstellungsvolumen von 5 ml resultierte in einem Dispersionsvolumen von 0.3-0.4 ml. Unter der Annahme, dass die Lösungsmittelkomponente (4,5 ml) komplett durch Verdampfung entfernt wurde, olfaktorisch bestimmt, bedeutet das, dass 60-80% der wässrigen Phase zurückgewonnen wurde.

Die Menge an Aceton in der erhaltenen Suspension ist nach einem Zeitraum >30 Minuten unter 0,5% gefallen (Figur 8).

6.2 Einfluss von verschiedenen Parametern auf die NP Größe

6.2.1 Effekt der PLGA Konzentration

[0064] Höhere PLGA Konzentrationen resultierten in größeren Partikeln, wie erwartet für die SDS und BT Methode (Figur 2). Im letzten Fall war der Effekt allerdings viel kleiner. Innerhalb des getesteten Konzentrationsbereichs wurden Größen von ungefähr 120-380 nm erzielt, unter Verwendung von SDS (Figur 2A). Bis zu einer Konzentration von 16 mg/ml konnte fast eine lineare Beziehung zwischen Polymerkonzentrationen und Partikelgröße beobachtet. Über einer Konzentration von 16 mg/ml, zeigen fluktuierende Größen von 335-380 nm begrenzte Reproduzierbarkeit, und das eine Plateau erreicht oder eine maximale kontrollierbare Partikelgröße erreicht überschritten war an. Die Partikelgrößenverteilung wurde mit steigender Polymerkonzentration weiter, was durch einen steigenden PDI von 0,016 bis 0,2 korrelierend mit der Partikelgröße angezeigt wird. In dem linearen Bereich überstieg der PDI allerdings nicht 0,2, was noch eine enge Verteilung anzeigt (Müller und Schuhmann, 1996). Bei Verwendung der BT Methode wurden Partikelgrößen von ungefähr 150-220 nm mit sehr engen Größenverteilungen (PDI<0, 1) erreicht (Figur 2B). Wenn höhere Konzentrationen von 50 mg und mehr in 1 ,5 ml ACE gelöst wurden, um größere Nanopartikel zu produzieren, konnte keine keine homogene Nanodispersion erreicht werden und sichtbare Niederschläge bildeten sich direkt an der Spitze der Kanüle.

6.2.2 Effekt von PLGA Typen

[0065] Wie in den Figuren 3A und B gezeigt, hat der Typ des PLGAs die Partikelgröße während der Nanopartikelproduktion unter Verwendung der BT Methode nicht beeinflusst. Partikelgrößen waren konstant um 180-195 nm und uniform, niedrige PDIs von <0,1 wurden erzielt. Die Verdampfungs-getriggerte Methode unter Verwendung von SDS hingegen führte zu signifikant größeren Partikeln mit steigendem MS-Gehalt im Polymer (Figur 3A), ungefähr 140 nm für MS:GS 50:50 verglichen mit 230 nm für MS:GS 75:25.

[0066] Mit steigender Viskosität oder steigendem Molekulargewicht wurden im SDS kleinere Partikel enthalten (Figur 3B). Das niedrigste Molekulargewicht (7000-17000 g/mol) produzierte Partikel die nahezu doppelt so groß wie das höchste Molekulargewicht (38000-54000 g/mol) (243,3±5,7 nm vs. 127,7±2,2 nm), wobei der Unterschied in der Größe zwischen dem mittleren Molekulargewicht PLGA (24000-38000 g/mol) und dem höchsten PLGA (10-15 nm) ziemlich klein war. Die Untersuchung von verschiedenen Molekulargewichten im BT Aufbau hatte nur einen geringen Einfluss (193.3±2,1 nm mit 7000-17000 g/mol vs. 181.7±0,5 nm mit 38000- 54000 g/mol). Der Einfluss von Diffusion ist nicht stark ausgeprägt. In Figur 4A-E SEM sind Bilder dargestellt, welche klar die Unterschiede in den erhaltenen Partikelgrößen zeigen, wenn verschiedene PLGAs verwendet werden.

6.2.3 Effekt der Drehgeschwindigkeit und der Tropfposition

[0067] Da die Drehgeschwindigkeit der rotierenden Schale nur indirekt über die Spannung der Energiequelle eingestellt werden konnte waren die Drehgeschwindigkeiten reproduzierbar aber konnten nicht frei eingestellt werden. Drei Geschwindigkeiten mit den größtmöglichen Unterschieden wurden getestet. Die produzierten Partikel hatten ähnliche Größen (841 rpm: 140,9±1,3 nm, 2051 rpm: 146, 5±11 ,2 nm und 2727 rpm: 139,2±9,4 nm) mit kleinen Verteilungen (PDI<0,05). Darüber hinaus führten verschiedene Tropfposition relativ zur Scheibenmitte zu keinen relevanten Änderungen oder korrelierenden Tendenzen in der Partikelgröße (0 cm: 140,9±1,3 nm, 1 ,5 cm: 126,4±2,0 nm und 3 cm: 134,0±2,4 nm). Alle PDIs zeigten kleine Verteilungen (PDI <0,05).

6.2.4 Effekt von Lösungsmittel und Antisolvenstyp [0068] Bei Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln wurde im SEM und DLS (Figure 4F-H, Figure 5) eine Änderung der Partikelgröße beobachtet. Mit ACN und THF wurden größere Partikel gebildet (ungefähr 230 nm) als mit ACE (ungefähr 140 nm; Figur 5).

[0069] Figur 4F-H zeigt SEM Aufnahmen von PLGA Nanopartikeln hergestellt nur durch Trocknen der Lösungsmittel-Antisolvens Mischungen auf Silica Wafern. Durch Austausch des Lösungsmittels von ACE durch ACN oder das Antisolvens von H ₂ O durch Ethanol kann eine sichtbare Erhöhung der Größe als Ergebnis des Trocknungsprozesses allein beobachtet werden. Ein Wechsel des Antisolvens von Wasser zu Alkoholen verursachte auch eine Änderung der Größe. Die Präzipitation in Methanol, Ethanol, und Isopropanol führte zu Partikelgrößen von ungefähr 210-220 nm (Figur 5).

6.3 Ausbeute von mit SDS produzierten Nanopartikeln

[0070] Die Bestimmung der Ausbeute zeigte geringere Partikelausbeuten mit höheren Polymerkonzentrationen. Daher wurden Ausbeuten von 88,8±2,1% bei 2 mg/ml, 72,8±4,8% bei 6 mg/ml und 40,6±2,7% bei 12 mg/ml der PLGA Menge gewonnen. Der Polymerverlust lässt sich auf die Trocknung der PLGA-Partikel auf der drehenden Schale zurückführen (Figur 1B). Desto höher die Konzentrationen, desto mehr Partikel trockneten auf der Schale bevor diese den Rand erreichten und gesammelten konnten. Bis zu einem Abstand zum Zentrum der Schale von 3 cm, schien kein oder eine ziemlich kleine Menge PLGA auf der Schale zu verbleiben. Hinter diesem Abstand floss die Partikelsuspension radial zum Rand. Die meisten Polymerverluste scheinen in den Strahlen vorzukommen.

6.4 Stabilität von SDS produzierten Nanopartikeln

[0071] Keine der untersuchten Partikel zeigten irgendwelche sichtbaren oder messbaren Änderungen in der Stabilität wie Zusammenbacken von Nanopartikeln, eine Verringerung des - Potentials und eine anschließende Vergrößerung der Partikelgröße und des PDI aufgrund von Agglomeration. Zum Beispiel war die maximale Größenabweichung nach 28 Tagen Lagerung bei 4 °C für alle untersuchten Partikel 2-6 nm. Dementsprechend blieb die Partikelgröße konstant über die gemessene Zeit. Die Größenverteilungen zeigten leichte Fluktuationen aber alle PDIs blieben unter 0,1. Die durchschnittliche maximale Senkung des ^-Potentials war 5.6 mV (PVA beschichtete Schalen) und 7,6 mV (nicht beschichtete Schalen). Insgesamt lagen alle gemessenen ^-Potentiale unter Werten von -30 mV (-39±2 mV) und zeigten daher eine gute Stabilität, sogar noch nach 28 Tagen. Daher, wenn man die Daten, die erhalten wurden bei Verwendung einer unbeschichteten rotierenden Scheibe, und die Daten, die bei Verwendung einer mit PVA beschichteten Schale erhalten wurden, vergleicht, kann geschlossen werden, dass die Beschichtung der Schale mit einem Stabilisator (z.B. PVA) nicht erforderlich ist, um die Qualität der Partikel zu erhalten, zumindest bei Lagerung für 28 Tage. Die in Prototyp II hergestellten Partikel erwiesen sich ebenfalls als stabil.

6.5 Beladungseigenschaften von CUR-beladenen NPs

[0072] Partikelgrößen der CUR-beladenen Nanopartikel (Figur 6A und C) produziert sowohl nach dem SDS- als auch nach dem BT-Verfahren waren ähnlich zu denen von unbeladenen Partikeln (Figur 2A und B). Demnach hatte die Beladung in diesen Konzentrationsbereichen keinen Einfluss auf die Partikelgröße.

[0073] Im SDS führte eine Erhöhung der Polymerkonzentration mit einer konstanten anfänglichen Beladung von 1% (m/m) CUR zu einem erhöhten DL (Figur 6B). Das resultierte auch in einer höheren EE bei einer Konzentration von 6 mg/ml verglichen mit 2 mg/ml. Im Gegensatz dazu, bei noch höheren Konzentrationen von 12 mg/ml, war die EE niedriger als bei 2 mg/ml. Da die Einkapselungseffizienz durch Multiplikation der Menge des zurückgewonnenen Wirkstoffs in 1 mg Formulierung mit der Ausbeute der Formulierung des Erhalts der Gesamtmenge des zurückgewonnenen Wirkstoffs in der hergestellten Probe berechnet wurde, korreliert die EE mit der Ausbeute. Das erhöhte DL konnte den viel höheren Partikelverlust nicht kompensieren (79,6% vs. 43,5% Ausbeute, Figur 6B).

[0074] Um die Beladungseigenschaften in den beiden Verfahren zu vergleichen, wurden Polymerkonzentrationen ausgewählt, mit denen ähnliche Partikelgrößen erhalten werden können. Figur 6D zeigt, dass mit SDS höhere DL und EE erreicht werden konnten. Das DL von SDS-Partikeln ist zweimal so hoch als das von BT-Partikeln (ungefähr 80-90% der anfänglich eingesetzten CUR pro Masse des Polymers, verglichen mit ungefähr 40-45%). Auch die EE von SDS-Partikeln (ungefähr 60-70%) war deutlich höher als die von BT-Partikeln, welche wiederholt bei 10 bis 25% war.

6.6 Partikelproduktion mit Aufbau für kontinuierliche Produktion (Prototyp II)

[0075] Die Partikel, die mit Prototyp II produziert wurden, wiesen eine Größe von 135,5±5,5 nm, einen PDI von 0,017±0,002 und ein Zetapotential von -29,2±3,2 mV. Somit haben die erhaltenen Partikel vergleichbare Eigenschaften zu den mit Prototyp I produzierten (140,9±1 ,3 nm, 0,016±0, 008, -28,3±2,7 mV). Die Stabilität der Partikel wurde auch erfolgreich getestet. Bei einem anfänglichen Testvolumen von 20 ml war es schwierig die produzierten Partikel aufgrund des niedrigen anfänglichen Volumens der Dispersion zu sammeln. Daher war es erforderlich das Sammelgefäß zusätzlich mit Wasser anzufeuchten. Das erhöhte das Endvolumen und verdünnte die finale Dispersion. Die Sammlung der Partikel ohne Störung der Produktion auf der sich drehenden Schale erlaubt die Verwendung von größeren Volumen (unbegrenzt) und daher die Partikel kontinuierlich zu ernten und größere Mengen der Partikeldispersion zu erhalten. Folglich wäre kein zusätzliches Wasser zur Anfeuchtung notwendig. Bestimmung der Ausbeuten zeigte eine durchschnittliche Reduktion von 9,4±5% verglichen mit Prototyp I.

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