REPLICONES DE ARN DE CORONAVIRUS Y SU USO COMO VACUNAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca dentro del campo de la ingeniería genética recombinante. Se describe un replicón de ARN obtenido a partir de un coronavirus, así como su método de obtención, siendo este replicón deficiente en propagación. Dicho método comprende la deleción total o parcial de al menos 5 genes del coronavirus: gen que codifica la proteína E y al menos 4 genes que codifican proteínas accesorias específicas de género. Los replicones de ARN se han diseñado a partir del MERS-CoV. Se describe una composición que comprende dicho replicón de ARN para usar como vacuna, para generar inmunidad contra la infección por coronavirus.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los coronavirus (CoV) son una familia de virus con ARN monocatenario de polaridad positiva (ssARN+) que presentan el genoma más grande conocido para un virus ARN, con una longitud comprendida entre aproximadamente 25 y 33 kilobases (kb). Durante la infección por coronavirus se produce la replicación del ARN genómico (gARN) y la síntesis de un conjunto de ARNs subgenómicos (sgARN) de polaridad positiva y negativa sin retrotranscripción.

Los coronavirus causan principalmente infecciones en aves y mamíferos, incluyendo humanos. El brote del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en 2002 y, más recientemente, el síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS) en 2012 han demostrado la letalidad de los CoV cuando cruzan la barrera de las especies e infectan a los humanos. Por este motivo son necesarias vacunas frente a estos patógenos y una opción son las vacunas basadas en replicones de ARN.

Los replicones de ARN deficientes en propagación son unas excelentes plataformas para la generación de vacunas, dado que son un subtipo de vacunas derivadas de virus, con un solo ciclo infectivo al no poder diseminarse de célula a célula. La deficiencia de estos replicones en una o más funciones esenciales para la síntesis, el ensamblaje de partículas virales o la diseminación, hacen que sean unas vacunas muy seguras y de gran utilidad como vectores para la inmunización frente a agentes infecciosos (Lundstrom, 2018). Para amplificar estos replicones es conveniente complementar en trans los genes virales necesarios para su propagación, que les han sido delecionados. Para ello, los replicones se pueden crecer en líneas celulares que complementen y expresen las proteínas requeridas para su diseminación, de las que carecen (Almazán et al., 2013; Ortego et al., 2002). Cuando los replicones crecen en células que no complementan sus carencias, por ejemplo, dentro del sujeto al que se ha vacunado con dicho replicón de ARN, éstos expresan sus genomas deficientes y los antígenos que codifican, sin que se puedan producir viriones infectivos que se diseminen de célula a célula.

Los replicones de ARN se pueden clasificar en dos grandes grupos: (i) los defectivos en replicación y (ii) los competentes en replicación, pero defectivos en propagación. La presente invención describe replicones de ARN competentes en replicación, pero defectivos en propagación. Algunas de las ventajas de la utilización de los replicones ARN como plataformas para la generación de vacunas son: (i) su fácil administración, (ii) que solamente tienen un ciclo de infección debido a los genes delecionados, (iii) que no se integran en el genoma dado que son ARNs, y (iv) que son muy bioseguros.

La disposición de los genes en el genoma de un coronavirus es: extremo 5'-UTR ( untranslated región) - replicasa/transcriptasa- proteína S de las espículas - proteína E de la envuelta - proteína M de la membrana- proteína N de la nucleocápsida - extremo 3' UTR y cola poli (A). Las cuatro proteínas estructurales (S, E, M y N) contribuyen a la formación eficaz de partículas virales estructuralmente estables.

Aparte de los genes estructurales, el genoma de los coronavirus también contiene genes que codifican proteínas con funciones no estructurales, por ejemplo, la ARN replicasa/transcriptasa. Otros genes que no codifican proteínas estructurales están en el genoma después del gen de la replicasa/transcriptasa. Se denominan genes accesorios o específicos de género. Algunas de estas proteínas de coronavirus están implicadas en contrarrestar las defensas del hospedador. Los genes de los coronavirus se denominan ORF ( Open Reading Frame) seguido de un número. En las siguientes tablas se describe la distribución de los genes en el genoma del MERS-CoV (Tabla 1).

Tabla 1. Genes presentes y su distribución en el genoma de MERS-CoV.

ORF PROTEÍNA INICIO (nt) FINAL (nt)

1ab pplab 279 21514

2 S 21456 25517

3 3 25532 25843

4a 4a 25852 26181

4b 4b 26093 26833

5 5 26840 27514

6 E 27590 27838

7 M 27853 28512

8 N 28566 29807

8b 8b 28762 29100 El documento WO2018160977 divulga un coronavirus atenuado mediante una alteración en el gen de la replicasa. La presente invención supone una mejora ya que, al mantener ese gen intacto, se logra que se produzcan numerosos antígenos aumentando así la eficacia de la vacuna.

En el artículo científico de Almazán et al 2013 se divulga un replicón de ARN obtenido a partir del coronavirus MERS-CoV en el que se ha delecionado el gen que codifica la proteína E. La presente invención supone una mejora respecto a dicho artículo ya que la deleción del gen que codifica la proteína E junto a la de otros genes accesorios específicos de género del MERS-CoV logra una atenuación del virus mucho mayor, y una mayor seguridad dependiente de la deleción de varios genes, que la lograda exclusivamente con la deleción del gen que codifica la proteína E.

La presente invención describe unos replicones de ARN de coronavirus, así como su método de obtención y su uso como vacunas. Los inventores han demostrado la atenuación y la eficacia de varios replicones de coronavirus basados en MERS-CoV en la protección frente a la infección por coronavirus patogénicos para humanos. Estos replicones son competentes en replicación, pero defectivos en propagación y confieren inmunidad frente a los coronavirus de los que se derivan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un ARN auto-replicativo pero defectivo en propagación, esto es, un replicón de ARN. Dicho replicón se puede emplear como composición vacunal para coronavirus, preferentemente para el MERS-CoV.

Para lograr un replicón de ARN es necesario delecionar genes que estén involucrados en propagación, pero no en replicación. De los genes estructurales de los coronavirus, el más relevante que hay que eliminar para obtener replicones deficientes en propagación es el gen que codifica la proteína E. La presente invención combina la deleción de dicho gen con la de otros genes, denominados genes accesorios específicos de género (genes no necesarios para la replicación del ARN). Dentro de esta categoría están aquellos que codifican proteínas accesorias específicas de género, y que además pueden estar implicados en la virulencia del virus. La principal ventaja de escindir el gen que codifica la proteína E y al menos 4 genes (3, 4a, 4b, y 5) es que se logra un incremento en la seguridad del replicón de ARN ya que la probabilidad de que revierta las cinco modificaciones y recupere la virulencia es muy baja.

Una ventaja adicional de estos replicones de ARN es que al mantener la capacidad de replicación intacta, cuando la vacuna se inocula a un sujeto, el replicón comenzará a replicarse dentro de la célula, pero los nuevos ARNs y proteínas codificadas por los genes que no han sido delecionados podrán formar Virus-like partióles (VLPs) que protegerán al ARN que forma el genoma del replicón frente a la degradación, aunque no se podrá transmitir a otras células. De esta forma, las proteínas virales sintetizadas por la célula infectada por el replicón de ARN formarán VLPs con estructuras poliméricas altamente inmunogénicas que serán reconocidas como antígenos por el sistema inmune, dando lugar a respuestas inmunes elevadas y de larga duración, es decir, inducirán una larga memoria inmunológica.

Estos replicones de ARN se pueden emplear como composiciones vacunales para inmunizar a sujetos, para prevenir el desarrollo de la enfermedad causada por el coronavirus del cual se ha obtenido el replicón. Dado que los genes que codifican las proteínas estructurales habitualmente reconocidas por el sistema inmune no se han delecionado, la capacidad inmunogénica de las VLPs formadas por estos replicones es muy elevada. Sin embargo, las VLPs producidas por los replicones son defectivas en propagación y no salen de la célula salvo rotura de la membrana celular.

Las principales ventajas y novedades de la presente invención se enumeran a continuación:

- Es la primera vez que se consigue una vacuna a partir de un replicón ARN de un coronavirus en el que se han delecionado al menos cinco genes en un mismo coronavirus, tres de los cuales, como mínimo, lo transforman en un ARN atenuado, competente en replicación, pero defectivo en propagación, por lo que ya no se considera un virus.

- La estrategia seguida para obtener dichos replicones deja la maquinaria de replicación intacta, lo que permite aumentar la cantidad de moléculas de antígeno que pueden ser codificadas y reconocidas por el sistema inmune.

- Los replicones de ARN se pueden obtener a partir de varios vectores de expresión que contienen los genes no delecionados. Esto aporta mayor bioseguridad durante la producción.

- Las VLPs en las que se envuelven los replicones ARN son indistinguibles al microscopio electrónico de las partículas de un coronavirus completo, y la administración de estas vacunas a un sujeto por vía nasal permite imitar la ruta de infección del virus nativo.

- Adicionalmente, los replicones ARN se pueden administrar mediante la combinación con un polímero, por ejemplo, un polímero catiónico.

- Así mismo, estas vacunas son seguras, sin producir efectos secundarios no deseados.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES

En esta memoria cuando se indica “deleción de un gen” ésta puede ser total o parcial, cuando no se indique la alteración exacta.

Según la presente invención, un "cromosoma artificial de bacterias" (BAC) es una secuencia de ADN que comprende la secuencia del factor F. Los plásmidos que contienen esta secuencia, denominados plásmidos F, pueden mantener, de manera estable, secuencias heterólogas de una longitud mayor de 300 kb con un máximo de una o dos copias por célula. Los BAC correspondientes pueden ser cualquiera conocido en el estado de la técnica.

El término "coronavirus" se utiliza según la presente invención para hacer referencia a un grupo ( Familia ) de virus que presenta una única molécula de single stranded RNA ssARN lineal, sentido positivo, de 25 a 33 kb. Estos virus normalmente contienen de 4 a 10 genes estructurales. El término coronavirus incluye cualquier miembro de la familia Coronaviridae, preferentemente Orthocoronaviridae, y más preferentemente del género Betacoronavirus y aún más preferentemente el MERS-CoV.

En la presente memoria “genes que codifican proteínas accesorias específicas de género” son aquellos genes del genoma del coronavirus que codifican la síntesis de proteínas que no se incorporan a la estructura del virus.

En la presente invención la expresión “genes de virulencia” son todos aquellos genes comprendidos en el genoma del coronavirus cuya deleción atenúa al virus y que, generalmente, no tienen una función estructural.

En la presente memoria “vector de expresión” puede ser un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cósmido y/o un cromosoma artificial derivado P1.

La expresión "ácido nucleico" tal como se utiliza en esta descripción incluye genes o fragmentos de genes, así como, en general, cualquier molécula de ADN o ARN.

En la presente memoria, el término “replicón” es sinónimo a “replicón de ARN” y “replicón ARN” y se refiere a un ARN que es auto-amplificable (dado que puede hacer muchas copias de sí mismo), pero defectivo en propagación. Este replicón incluso puede formar partículas análogas a virus (VLPs) formadas a partir de ARNs subgenómicos que actúan como ARNs mensajeros y se traducen en proteínas que se ensamblan en estructuras dando lugar a las VLPs que contienen en su interior el ARN del replicón.

En la presente memoria, la expresión “VLP-E+” (funcional, en el sentido que da lugar a un replicón que es infectivo al llevar la proteína E) se refiere a la VLP generada por un replicón de ARN al que se le ha aportado en trans al menos una de las proteínas delecionadas. En la presente memoria, la expresión "inducir protección", debe entenderse como inducir una respuesta inmune en el organismo receptor, mediada por antígeno, que genera un efecto memoria a largo plazo en el mismo, estando dicho antígeno codificado por el replicón ARN de la invención. Esta respuesta inmune puede estar aumentada por mecanismos que impliquen la inducción de sustancias potenciadoras de la respuesta humoral mediada por anticuerpos, o celular, mediada por interleuquinas, citoquinas, interferones, o similares, y sustancias que median procesos intracelulares que hacen que el sujeto quede protegido frente a infecciones causadas por agentes infecciosos.

En la presente solicitud las expresiones MERS-MA30-A[3-E] y MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5, E] son sinónimas y se usan de forma intercambiable.

En la presente solicitud las expresiones MERS-CoV-A[3-E] y MERS-CoV -D[3, 4a, 4b, 5, E] son sinónimas y se usan de forma intercambiable.

El término “vacuna” y “composición vacunal” son sinónimos tienen el significado habitual en el campo.

En la presente memoria el número “4” dentro del nombre de un replicón de ARN o un virus atenuado comprende los genes 4a y 4b.

La presente invención se refiere a un replicón de ARN de un coronavirus en el que se han delecionado:

- parcialmente el gen que codifica la proteína E y

- total o parcialmente al menos 4 genes que codifican proteínas accesorias de género seleccionados entre 3, 4a, 4b y 5 de MERS-CoV.

El replicón de ARN procedente del MERS-CoV puede presentar una identidad de por lo menos 55 %, preferentemente 65 %, más preferentemente 75 %, aún más preferentemente 85 %, al menos 90 % de identidad y aún más preferentemente 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta 99 % respecto a la secuencia del replicón SEQJD 1 , concretamente respecto al fragmento de la secuencia adjunta comprendido entre los nucleótidos 7890 a 35838.

En una realización preferido, la secuencia de polinucleótidos del replicón MERS-CoV- D[3-E] de la invención se describe en la SEQJD 1 concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de la lista de secuencias adjunta. Para estudiar el uso como vacunas de replicones de ARN derivados de coronavirus es necesario el empleo de modelos animales. El modelo animal más empleado en investigación clínica, el ratón (Mus musculus) no es susceptible a la infección por MERS- CoV, dado que la proteína S del MERS-CoV no reconoce la proteína homologa murina del receptor humano. Se ha empleado un derivado del MERS-CoV que es patógeno en estos animales humanizados. A partir de la secuencia de virus MERS-CoV patogénico para humanos Genbank JX869059 se generó una cepa infectiva que causase la muerte de todos los ratones infectados, mediante el pase de dicho virus MERS-CoV durante 30 veces consecutivas en ratones (Li et al., 2017). Esta secuencia se ha depositado en GeneBank con el número de acceso MT576585.

En una realización particular, a un MERS-CoV adaptado a ratón (MERS-MA30) (Li et al, 2017) se le han delecionado total o parcialmente el gen que codifica la proteína E y los genes que codifican proteínas accesorias de género 3, 4a, 4b y 5, obteniéndose un replicón de ARN. Este replicón de ARN procedente de MERS-MA30-A[3-E] puede presentar una identidad de por lo menos 55 %, preferentemente 65 %, más preferentemente 75 %, aún más preferentemente 85 %, al menos 90 % de identidad y aún más preferentemente 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o incluso hasta 99 % respecto a la secuencia del replicón SEQJD 2, concretamente respecto del fragmento de la secuencia comprendido entre los nucleótidos 7890 a 35838.

En una realización preferida, la secuencia de polinucleótidos del replicón MERS- MA30- D[3-E] de la invención se describe en la SEQJD 2 concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de la lista de secuencias adjunta.

La SEQJD 1 tiene un porcentaje de identidad con la SEQJD 2, concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838 de ambas secuencias de un 99,96%. Por lo tanto, se puede concluir que los resultados en modelos de ratón obtenidos con el replicón de MERS-CoV adaptado a ratón son extrapolares a los que serían obtenibles con el replicón de MERS-CoV en humanos.

El replicón de ARN derivado del MERS-CoV comprende al menos los genes que codifican las proteínas 1a,1ab, S, M y N. En otra realización particular en el replicón de ARN se ha realizado al menos una deleción en fase del gen que codifica la proteína nsp1. Preferentemente, se eliminan los nucleótidos 792 a 827 del gen ORF1a (nsp1-AD), y/o se pueden eliminar los nucleótidos 708 a 734 (nsp1-AC), y/o se puede hacer al menos una pequeña deleción de entre 27 y 36 nt entre las posiciones 528 y 848 del genoma del coronavirus.

La proteína nsp1 es un modulador de la respuesta antiviral y se ha demostrado que pequeñas deleciones dentro de la misma atenúan completamente los coronavirus

(Jimenez-Guardeño et al, 2015).

Estas modificaciones actuarán como sistema de seguridad en el caso de que consiguieran revertir las deleciones génicas, ya que el virus resultante no es virulento como el MERS-CoV silvestre.

El replicón de ARN se puede modificar mediante la sustitución de al menos un nucleótido por un nucleótido modificado seleccionado entre pseudouridina y metilpseudouridina o alternativas similares con el fin de aumentar la estabilidad, su traducibilidad, y reducir la activación de la respuesta inmune innata.

La secuencia de nucleótidos del ácido nucleico del replicón de ARN puede optimizarse, en al menos en uno de los codones de los genes que comprende. La optimización de codones comprende la introducción de mutaciones silenciosas puntuales en los codones de la secuencia de polinucleótidos para facilitar su expresión y traducción en proteínas en un huésped determinado. Preferentemente el huésped es un mamífero, más preferentemente el huésped es un humano. Un experto en la materia sabría que el número de codones optimizados depende tanto de la secuencia de polinucleótidos como del organismo donde se va a expresar.

En una realización particular se ha optimizado la secuencia de nucleótidos del gen que la proteína S, concretamente se han optimizado el 50% de los codones de dicho gen.

Asimismo, la secuencia de nucleótidos o codones de cualquier gen, o de una región concreta de un gen, se podrá optimizar para la expresión en células de un huésped en al menos un 10% de los codones, preferentemente un 20%, más preferentemente un 30%, aún más preferentemente un 40%, aún más preferentemente un 50% de los codones, aún más preferentemente un 60%, aún más preferentemente un 70%, aún más preferentemente un 80%, aún más preferentemente un 90%. La secuencia de polinucleótidos es preferentemente al menos un gen del replicón, por ejemplo, el gen S, M, N y ORF1 ab.

La optimización de codones se puede realizar siguiendo un protocolo habitual en el área. Para determinar cuáles son los codones optimizados se puede emplear cualquier herramienta informática como por ejemplo Design Vector y a continuación obtener el fragmento de polinucleótidos con los codones optimizados por síntesis química sintética. Un experto en la materia sabría cómo optimizar la secuencia de nucleótidos o codones de cualquier gen, o de una región concreta de un gen.

En una realización particular del replicón, la secuencia del gen que codifica la proteína S del coronavirus MERS-MA30-CoV es SEQJD 3, la secuencia del gen que codifica la proteína S sin los codones optimizados es la SEQJD 4.

En otra realización particular del replicón, la secuencia del gen que codifica la proteína S del coronavirus MERS-CoV es SEQJD 5, la secuencia del gen que codifica la proteína S sin los codones optimizados es la SEQJD 6.

La proteína S del MERS-CoV es una proteína trimérica que existe en una conformación de prefusión, metaestable, que sufre una reordenación estructural para fusionarse con la membrana plasmática de la célula huésped. Se ha demostrado que la conformación prefusión presenta mayor antigenicidad. El estado de prefusión se estabiliza mediante las mutaciones puntuales: V1060P y L1061P en la secuencia de aminoácidos de la proteína S. (Pallesen et al, 2017). Estas posiciones son comunes independientemente de que el virus sea el MERS-CoV o el MERS-MA30.

El replicón de ARN de la invención puede tener un tamaño entre 18 y 29 kb, preferentemente entre 20 y 27 kb, más preferentemente entre 22 y 26 kb y aún más preferentemente entre 22 y 24 kb.

En otra realización particular, la secuencia del gen que codifica la proteína S presenta al menos una de las siguientes modificaciones: V1060P y L1061 P, en la secuencia de polinucleótidos estas modificaciones son 24633_24634 delins CC y 24637_24638 delins CC. Respectivamente, en ambos casos se han modificado 2 nucleótidos consecutivos.

En otra realización particular la secuencia del gen que codifica la proteína S de MERS- MA30-CoV tiene los codones optimizados para su expresión en células de mamífero y las modificaciones 24633_24634 delins CC y 24637_24638 delins CC siendo la secuencia resultante del gen S SEQJD 7.

En otra realización particular la secuencia del gen que codifica la proteína S de MERS- CoV tiene los codones optimizados para su expresión en células de mamífero y las modificaciones 24633_24634 delins CC y 24637_24638 delins CC siendo la secuencia resultante del gen S SEQJD 8.

En una realización particular el replicón de ARN de la invención se han delecionado:

- parcialmente el gen que codifica la proteína E y

- total o parcialmente al menos 4 genes que codifican proteínas accesorias de género seleccionados entre 3, 4a, 4b y 5 de MERS-CoV, además, la secuencia de nucleótidos de la proteína S de dicho replicón tiene los codones optimizados para la expresión en mamíferos, la secuencia del gen que codifica la proteína S presenta al menos las siguientes modificaciones: V1060P y L1061 P, y presenta una deleción de 35 nucleótidos en el gen que codifica la proteína nsp1 (nsp1-AD).

Este replicón se denomina V1-CD y la secuencia de polinucleótidos de este replicón adaptado a ratón se describe en la SEQJD 9 (MERS-MA30-V1-CD). La secuencia de polinucleótidos de este replicón adaptado a humano se describe en la SEQJD 10 (MERS-CoV-V1-CD)

La SEQJD 9 tiene un % de identidad con la SEQJD 2, concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de esta última de un 96,12%. SEQJD 2 es la secuencia del replicón MERS-MA30-A[3-E] adaptado a ratón. La SEQJD 10 tiene un % de identidad con la SEQJD 1, concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de esta última de un 96,03%. La SEQJD 1 es la secuencia del replicón MERS-CoV-A[3,4a,4b,5,E]

En otra realización particular, en el replicón de ARN de la invención se han delecionado:

- parcialmente el gen que codifica la proteína E y - total o parcialmente al menos 4 genes que codifican proteínas accesorias de género seleccionados entre 3, 4a, 4b y 5, en el caso de MERS-CoV, además, la secuencia de nucleótidos de la proteína S de dicho replicón tiene los codones optimizados para la expresión en mamíferos, y presenta una deleción de 35 nucleótidos en el gen que codifica la proteína nsp1 (nsp1-AD).

Este replicón se denomina V1-VLP y la secuencia de polinucleótidos de este replicón adaptado a ratón es la SEQJD 11 (MERS-MA30-V1-VLP). La secuencia de polinucleótidos de este replicón adaptado a humano es la SEQJD 12 (MERS-CoV-V1- VLP)

La SEQJD 11 tiene un % de identidad con la SEQJD 2 concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de esta última de un 96,11%. SEQJD 2 es la secuencia del replicón MERS-MA30-A[3-E] adaptado a ratón.

La SEQJD 12 tiene un % de identidad con la SEQJD 1 , concretamente entre los nucleótidos 7890 a 35838, de esta última de un 96,04%. La SEQJD 1 es la secuencia del replicón MERS-CoV-A[3,4a,4b,5,E]

El porcentaje de identidad entre SEQJD 9 y SEQJD 11 es de un 99, 8%.

El porcentaje de identidad entre SEQJD 10 y SEQJD 12 es de un 99, 98%.

Debe entenderse que los ácidos nucleicos de la invención pueden ser monocatenarios o bicatenarios, y además contener una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la invención. El término "complementario" se refiere a la capacidad de dos fragmentos de polinucleótidos monocatenarios para formar pares de bases entre sí. Los fragmentos de polinucleótidos sustancialmente complementarios pueden incluir al menos un emparejamiento incorrecto de pares de bases, de modo que al menos un nucleótido presente en un primer fragmento de polinucleótido no se emparejará con al menos un nucleótido presente en un segundo fragmento de polinucleótido, sin embargo, los dos fragmentos de polinucleótidos seguirán teniendo capacidad de hibridación. Por lo tanto, la presente invención abarca fragmentos de polinucleótidos que son sustancialmente complementarios. Dos fragmentos de polinucleótidos son sustancialmente complementarios si se hibridan en condiciones de hibridación ejemplificadas por2x SSC (SSC: NaCI 150 mM, citrato trisódico 15 mM, pH 7,6) a 55 °C. Los fragmentos de polinucleótidos sustancialmente complementarios para los fines de la presente invención comparten preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 90 % o 95 % o 99 % de identidad de nucleótidos.

Las ubicaciones y los niveles de identidad de la secuencia de nucleótidos entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar por medio del software "Clustal" disponible en el Instituto Bioinformático Europeo (EBI) o “BLAST” disponible en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI).

Para su administración, el replicón de ARN puede estar envuelto mediante una de las siguientes opciones: combinación con un polímero seleccionado que lo recubra, a modo de ejemplo, entre: quitosano, poliplex, polietilenimina (PEI), poli(ácido láctico- co-glicólico) (PLGA), ciclodextrina (CD), dendrímeros (poli-amidoamina) PAMAM, poli-propilenimina (PPI) y derivados de estos, la combinación con al menos una nanopartícula lipídica, seleccionada a modo de ejemplo entre: lípidos catiónicos permanentemente cargados, lípidos catiónicos ionizables y combinaciones de ellos: 1,2-di-O-octadecenil- 3-trimetilamoniopropano (DOTMA), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleil-3-dimetilamoniopropano (DLinDAP), 1 ,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) y 0-(Z,Z,Z,Z- heptatriaconta-6,9,26,29-tetraen-19-yl)-4-(N,N-dimetilamino) (DLin-MC3- DMA) y 1 ,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano (DODAP), o similares a estos. Otros sistemas basados en péptidos o hidratos de carbono, por ejemplo: péptidos en conformación de a-Hélice o b-Lámina, péptidos lineales como el homodipéptido (phe-phe) o Ab-amieloide, péptidos cíclicos, como el ciclo-(L- Gln-D-Ala-L-Glu-D-Ala)2, péptidos anfifílicos, o péptidos con secuencias específicas de aminoácidos que facilitan la penetración celular, como el TAT dodecapéptido GRKKRRQRRRPQ, o péptidos capaces de interaccionar con receptores de membrana sobreexpresados, por ejemplo para el receptor DPP4. En el caso de hidratos de carbono se pueden emplear derivados de la glucosa, mañosa y galactosa como por ejemplo, N-(D-glucos-1-il)-L- asparagina, N-( D-fructos-2-il)-L-asparagina, N-(D-glucos-1-il)-L-glutamina, N-(D-glucos-1-yl)-L-metionina.

En una realización particular, el replicón de ARN de la invención puede estar envuelto para su administración en una VLP-E+, que incluye la proteína E proporcionada en trans y confiere al virus su transmisibilidad, pero el replicón de ARN no incluye el gen que codifica la proteína E; este tipo de VLPs se diferencia de las VLP-E-, es decir, que no incluyen la proteína E. Esta realización particular no es posible para el replicón de ARN que presenta mutaciones puntuales en el gen de la proteína S para estabilizar el estado prefusión.

Los replicones de ARN proporcionados por la invención son competentes en replicación, pero deficientes en propagación, lo que les impide transmitirse de célula a célula. Al infectar una célula, el replicón de ARN de la invención se amplifica y consecuentemente aumenta su capacidad para expresar diversas proteínas del virus. Sin embargo, estas proteínas forman una VLP-E que puede envolver al replicón de ARN, aunque este no se puede propagar a otras células del organismo; dichas VLPs-E son reconocidas por el sistema inmune del huésped. Entre las proteínas de la VLP producidas por el replicón de la invención está la proteína S de las espículas de los coronavirus, que es el mayor antígeno viral inductor de anticuerpos protectores neutralizantes así como un activador de células T.

Otro aspecto de esta invención se refiere a una VLP-E+ funcional que comprende un replicón de ARN como el que se ha definido anteriormente. Dicha VLP-E+ funcional contiene al menos una de las proteínas codificadas por uno de los genes delecionados en el replicón ARN, preferentemente la proteína E.

El replicón de ARN dentro de una VLP-E+ no puede codificar la proteína S en el estado prefusión, estabilizado mediante las mutaciones puntuales: V1060P y L1061P. Este sería incapaz de entrar en la célula, dado que el mecanismo de entrada a la célula de las VLP-E+ de la invención imita el de una infección natural. Por tanto, la entrada de la VLP a la célula está mediada por la proteína S, y requiere cambios conformacionales que llevan a la fusión de membranas y que son incompatibles con el estado prefusión de la proteína S. Tanto el replicón V1-CD como el replicón V1-VLP pueden administrarse mediante una formulación químicamente definida, preferentemente se empleará el replicón V1-CD ya que al tener la proteína S bloqueada en una conformación que bloquea la entrada natural del virus en las células se aumenta la seguridad.

El replicón V1 CD descrito anteriormente no es apto para ser administrado mediante una VLP-E+.

Otro aspecto de esta invención se refiere a una formulación químicamente definida (CD, de sus siglas en inglés) que comprende un replicón de ARN como el que se ha definido anteriormente y al menos uno de los siguientes tipos de compuestos:

Un polímero seleccionado entre quitosano, poliplex, polietilenimina (PEI), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), ciclodextrina (CD), dendrímeros (poli- amidoamina) PAMAM, poli-propilenimina (PPI) y derivados de estos una nanopartícula lipídica, seleccionada a modo de ejemplo entre: lípidos catiónicos permanentemente cargados, lípidos catiónicos ionizables y combinaciones de ellos: 1,2-di-0-octadecenil-3-trimetilamoniopropano (DOTMA), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1 ,2-dilinoleil- 3-dimetilamoniopropano (DLinDAP), 1 ,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA) y 0-(Z,Z,Z,Z-heptatriaconta-6,9,26,29-tetraen-19-yl)-4-(N,N-di metilamino) (DLin-MC3-DMA) y 1 ,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano (DODAP), o similares a estos

Otros sistemas basados en péptidos o hidratos de carbono por ejemplo: péptidos en conformación de a-Hélice o b-Lámina, péptidos lineales como el homodipéptido (phe-phe) o Ab-amieloide, péptidos cíclicos, como el ciclo-(L- Gln-D-Ala-L-Glu-D-Ala)2, péptidos anfifílicos, o péptidos con secuencias específicas de aminoácidos que facilitan la penetración celular, como el TAT dodecapéptido GRKKRRGRRRPG, o péptidos capaces de interaccionar con receptores de membrana sobreexpresados, por ejemplo para el recpetor DPP4. En el caso de hidratos de carbono se pueden emplear derivados de la glucosa, mañosa y galactosa como por ejemplo, N-(D-glucos-1-il)-L- asparagina, N-( D-fructos-2-il)-L-asparagina, N-(D-glucos-1-il)-L-glutamina, N-(D-glucos-1-yl)-L-metionina. El replicón de ARN dentro de una formulación químicamente definida puede codificar una proteína S, que incluye en su secuencia las mutaciones puntuales: V1060P y L1061 P, que fijan la estructura molecular de esta proteína en una conformación que bloquea la entrada natural del virus en las células, lo que incrementa la seguridad del replicón ARN. Esto es posible en la variante de la vacuna basada en el replicón químicamente definido, porque su entrada no depende de la proteína S sino que está mediada por uno de los sistemas mencionados anteriormente (por ejemplo, un polímero) que protege al RNA y facilita su entrada en la célula.

La invención adicionalmente proporciona un método de diseño y construcción por genética reversa (ingeniería genética) de replicones de ARN derivados de los genomas de coronavirus para la construcción de vacunas que proporcionen protección frente a la infección por los coronavirus de los que se derivan y también de otros coronavirus relacionados (Almazán et al., 2013; Almazán et al., 2015; Sambrook and Russell, 2001).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar un replicón de ARN de un coronavirus que comprende: i. la construcción del cADN de longitud completa a partir del gARN de un coronavirus y su inserción en un vector de expresión obteniendo un clon infectivo ii. la deleción:

- parcial del gen que codifica la proteína E y

- total o parcial al menos 4 genes que codifican proteínas accesorias de género seleccionados entre 3, 4a, 4b y 5, en el caso de MERS-CoV.

MI. transfectar el vector de expresión de la etapa anterior en una célula hospedadora en condiciones adecuadas para su expresión.

La secuencia de nucleótidos del cADN de longitud completa puede presentar una identidad de al menos un 50 %, preferentemente un 60 %, más preferentemente un 70 %, aún más preferentemente un 80%, aún más preferentemente un 90 %, y aún más preferentemente un 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o el 99 % de identidad respecto a la secuencia de polinucleótidos del gARN de un coronavirus. La secuencia de nucleótidos del cADN de longitud completa puede presentar una identidad de al menos un 50 %, preferentemente un 60 %, más preferentemente un 70 %, aún más preferentemente un 80 %, aún más preferentemente un 90 % y aún más preferentemente el 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o el 99 % de identidad respecto a la secuencia de polinucleótidos correspondiente al MERS- CoV (Genbank: JX869059).

El método de la invención puede comprender la deleción parcial del gen que codifica la proteína E y la deleción total o parcial los genes que codifican proteínas accesorias de género 3, 4a, 4b y 5, en el caso el MERS-CoV.

El método puede comprender la modificación de la secuencia del cADN mediante sustituciones, deleciones, adiciones o cualquier otra modificación en la secuencia del ácido nucleico, previa a la deleción total o parcial de genes para obtener el replicón de ARN de la invención.

El método también puede comprender la sustitución de al menos un nucleótido por otro nucleótido que está químicamente modificado o enzimáticamente modificado.

El cADN de longitud completa se puede obtener mediante cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica. Debido a la longitud del cADN es posible la obtención de varios fragmentos del mismo, por ejemplo, mediante síntesis química e introducir cada uno de estos fragmentos en un vector. Se puede modificar la secuencia de polinucleótidos de dichos fragmentos, preferentemente la de los extremos, con el objetivo de introducir dianas de restricción que faciliten su combinación posterior para obtener el clon infectivo de longitud completa en un solo vector de expresión. Estos vectores de expresión pueden ser cualquiera en el que quepa el cADN de longitud completa, como por ejemplo un cromosoma artificial bacteriano.

Previamente a la deleción total o parcial de los genes para obtener el replicón de ARN de la invención, el vector de expresión que comprende el cADN de longitud completa del gARN del coronavirus se puede transfectar en células apropiadas. Dichas células producirán viriones recombinantes de ese coronavirus. Estos viriones recombinantes tienen la misma capacidad de replicación y propagación que el virus completo. Dichas células pueden ser células de riñón de hámster (BHK21) o de mono verde africano (Vero-81), o células humanas derivadas de riñón (HEK293), de hígado (Huh-7), o de pulmón (Calu3, Calu3 2B4, MRC-5). Las condiciones de cultivo, así como la recuperación de los viriones infectivos se pueden realizar por cualquier método conocido en el estado de la técnica (Almazán et al., 2013).

Las estrategias para delecionar total o parcialmente los genes del genoma del coronavirus pueden ser cualquiera del estado de la técnica, por ejemplo, empleo de enzimas de restricción, recombinación entre vectores y tecnología CRISPR (Almazán et al., 2015; Sambrook and Russell, 2001).

El vector de expresión con el cADN de longitud completa puede poseer todos los elementos reguladores que permitan la expresión del ARN de longitud completa en una célula adecuada obteniendo un coronavirus recombinante. El vector de expresión del método debe tener los elementos adecuados para su replicación y expresión. Se prefiere la utilización del promotor inmediato temprano (IE) del citomegalovirus (CMV) para su expresión en células de mamífero o el promotor T7.

Otros promotores que se pueden emplear para su expresión en células de mamífero son por ejemplo el promotor humano de la Ubiquitina C (UBC) y el promotor de la PGK. La ventaja de estos promotores es que se facilita la posterior aprobación para uso terapéutico ya que estas secuencias están de manera natural en los seres humanos. También se pueden emplear, por ejemplo, los promotores descritos en los artículos científicos: How to Choose the Right Inducible Gene Expression System for Mammalian Studies? Kallunki T, et al Cells. 2019 Jul 30;8(8):796 y/o Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production. Zhu J. Biotechnol Adv. 2012 Sep- Oct;30(5): 1158-70.

El vector de expresión del método también puede tener los elementos adecuados para su expresión in vitro, es decir, en ausencia de células. En este caso, los plásmidos de replicación y expresión pueden comprender las secuencias necesarias para la amplificación y transcripción in vitro bajo el control de promotor de T7.

Los vectores de expresión que contienen los replicones de la invención pueden llevar, a modo de ejemplo, el promotor de CMV o el de T7. Si se utiliza el primero, la transcripción se realiza dentro de la célula, por la polimerasa poli I celular. El RNA viral resultante se replicará en la célula, expresará las proteínas virales y formará VLPs. Si se utiliza T7, el cDNA se transcribirá in vitro y para introducirlo en las células se necesita un vehículo como los mencionados anteriormente. El promotor T7 es apropiado para el replicón V1-CD.

El extremo 5’ del vector de expresión, puede contener las secuencias que se indican a continuación, o variantes de las mismas:

T7P - 5’UTR - MISC-DLP - P2A -3’ UTR dónde UTR son las siglas en inglés de región no traducida ( untranslated región),

MISC es una secuencia que proviene del replicón del virus de Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV),

DLP es una secuencia que proviene del virus Sindbis (parte de la RdRp del virus Sindbis),

P2A es la proteasa 2a del Porcine Teschovirus-1 , siendo las correspondientes secuencias de polinucleótidos de estos elementos, las siguientes:

T7P (SEQJD 13):

TAATACGACTCACTATAG 5'UTR (SEQJD 14):

ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAA MISC (SEQ D 15):

TAGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGC AGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCA TGCT AATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACT GATCGAAACGGAGGT G GACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGA DLP (SEQJD 16):

AT AGTCAGCATAGTACATTT CAT CT GACT AAT ACT ACAACACCACCACCAT G AAT A GAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGT GGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCG P2A (SEQJD 17):

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAG

AACCCTGGACCT El extremo 3’ del vector de expresión, puede contener las secuencias o variantes de las mismas:

3’ UTR- Poly A - terminador T7 3'UTR (SEQJD 18): ATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCG CTTT AAAATTTTT ATTTT ATTTTT CTTTT CTTTTCCG AATCGG ATTTTGTTTTT AAT AT TTC

PoIyA (SEQJD 19):

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA terminador T7(SEQ_ID 20):

CCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión en el que se ha insertado la secuencia de cADN complementario al replicón de ARN derivado de un coronavirus, preferentemente del MERS-CoV.

En una realización particular la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN insertada en el vector de expresión presenta una identidad de por lo menos 55 %, preferentemente 65 %, más preferentemente 75 %, aún más preferentemente 85 %, aún más preferentemente 90 %, y aún más preferentemente el 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o el 99 % de identidad respecto a la secuencia SEQJD

1, concretamente respecto al fragmento de dicha secuencia comprendido entre los nucleótidos 7890 a 35838.

En otra realización particular la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN insertada en el vector de expresión presenta una identidad de por lo menos 55 %, preferentemente 65 %, más preferentemente 75 %, aún más preferentemente 85 %, aún más preferentemente 90 %, y aún más preferentemente el 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o el 99 % de identidad respecto a la secuencia SEQJD

2, concretamente respecto al fragmento de dicha secuencia comprendido entre los nucleótidos 7890 a 35838. En otra realización particular la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN insertada en el vector de expresión presenta una identidad de por lo menos 55 %, preferentemente 65 %, más preferentemente 75 %, aún más preferentemente 85 %, aún más preferentemente 90 %, y aún más preferentemente el 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o el 99 % de identidad respecto a la secuencia SEQJD 9, SEQJD 10, SEQJD 11 , o SEQJD 12.

Este vector de expresión se puede seleccionar entre un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cósmido y un cromosoma artificial derivado P1.

El vector de expresión de la invención codifica proteínas que se pueden expresar en cultivos celulares o en células de mamífero, incluyendo un modelo animal experimental, como son ratones transgénicos humanizados para el receptor DPP4 del virus. El organismo o célula puede ser eucariota o procariota, y puede ser, una bacteria, una levadura, un protozoo o animales como un insecto, un humano, un ave, o un mamífero no humano, como un gato.

El vector de expresión que comprende la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN es una molécula de ADN que posee un origen de replicación y es, por tanto, capaz de replicarse en una célula adecuada. El vector utilizado es adecuado para mantener y amplificar el replicón de ARN de la invención en una célula hospedadora adecuada, tal como, una bacteria, por ejemplo, Escheríchia coli. El vector de expresión, generalmente, comprende un sistema de selección de células que portan dicho vector, por ejemplo:

- un gen de resistencia a antibióticos que permite la selección de las células que lo llevan: por ejemplo, genes de resistencia a cloranfenicol (cloranfenicol acetil transferasa, cat), kanamicina o neomicina,

- un sistema de selección basado en la complementación de marcadores auxotróficos, siempre que se emplee una cepa bacteriana deficiente para una ruta metabólica, por ejemplo, una alteración en la vía del DAP (ácido diaminopimélico) debido a una mutación o supresión en el gen DapD o el empleo de una cepa cepa DTrίA, que presenta una baja tasa de crecimiento con la glucosa como fuente de carbono y ningún crecimiento con el glicerol. Sólo la cepa que lleva el plásmido que expresa el gen tpiA puede restaurar el crecimiento normal.

- un mecanismo toxina/antitoxina, por ejemplo, el sistema hok/soko el ccdB/ccdA

- un mecanismo de represión basado en ColE1 (Mairhofer and Grabherr, 2008; Mairhofer et al., 2008) -un mecanismo basado en el marcador de contraselección sacB

(WO2010/135742).

La introducción del vector de expresión que contiene la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención en la célula hospedadora puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica para transfectar plásmidos, preferentemente mediante lipofectación, fosfato cálcico, o electroporación.

El cADN del replicón de la invención está insertado entre los elementos 5 ^' y 3 ^' del vector de expresión.

El requerimiento mínimo necesario para la transcripción del cADN del replicón de la invención es el promotor T7 (T7P), cuando se realiza la transcripción in vitro en la forma químicamente definida, o el promotor de citomegalovirus cuando se expresa el replicón dentro de las células.

En una realización particular, la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención que se ha insertado en el vector de expresión está flanqueada en el extremo 3' por los siguientes elementos y en este orden: una cola poli (A) de, al menos, 24 residuos de adenina, la secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV), y las secuencias de terminación y poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH) (Almazán 2013).

El plásmido se debe poder linearizar (cortar el ADN del plásmido circular que codifica el replicón de ARN replicón por ejemplo mediante enzimas de restricción) antes de la síntesis de ARN, por lo que se debe introducir un sitio único de corte por un enzima de restricción, después de la secuencia de terminación del fago T7.

Se deben evitar secuencias de terminación para la polimerasa del fago T7 a lo largo de la secuencia del replicón de la invención, tales como la secuencia ATCTGTT, por lo que las secuencias de este tipo a lo largo del replicón se deben mutar sin afectar a la funcionalidad del replicón.

El replicón de ARN resultante de la deleción de al menos cinco genes del coronavirus del que procede, preferentemente MERS-CoV, se puede expresar en una célula adecuada, por ejemplo, una célula que proporcione en trans una de las proteínas delecionadas que permita al replicón de ARN envolverse en una VLP funcional., preferentemente el replicón V1-VLP. Las células adecuadas para expresar el replicón de ARN envuelto en una VLP-E+ funcional son, por ejemplo, BHK21 , Huh-7, HEK293, Calu3, Calu3 2B4, MRC-5 y Vero-81. El replicón de ARN se puede combinar con un polímero o una nanopartícula lipídica o de otra naturaleza, preferentemente el replicón V1-CD.

Las líneas celulares adecuadas para la expresión de la invención han de modificarse previamente para poder proporcionar en trans al menos uno de los genes delecionados en el replicón de la invención, preferentemente el gen que codifica la proteína E.

En una realización adicional, a partir del vector de expresión en el que se ha insertado la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención, se puede generar un replicón ARN repartido en al menos dos fragmentos (es decir, dos componentes que codifican distintas proteínas virales y por tanto son dos vectores de expresión). Cada uno de estos vectores incluyen un fragmento parcial de la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención. Los fragmentos de la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención, que se han insertado en al menos dos vectores de expresión pueden ser solapantes. Uno de los fragmentos, el que incluye el gen de la replicasa, es autónomo para su replicación, mientras que el otro, u otros fragmentos, dependen del primero (autónomo para su replicación), porque este es el único que incluye el gen de la replicasa.

El conjunto de al menos 2 vectores de expresión según se ha explicado en el párrafo anterior, comprende: El gen de la replicasa y el de la proteína N incluidos en la secuencia SEQJD 2 o SEQJD 1 , SEQJD 9, SEQJD 10, SEQJD 11 , SEQJD 12, y un segundo vector de expresión que incluye secuencias del resto de genes estructurales y/o secuencias de genes no esenciales comprendidos en la SEQJD 2 o SEQJD 1 : el fragmento de la secuencia entre los nucleótidos 7890 a 35668 o SEQJD 9, SEQJD 10, SEQJD 11 , o SEQJD 12, respectivamente.

En cada uno de los vectores de expresión que comprenda un fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención, dicho fragmento está flanqueado en sus extremos por las secuencias no traducidas ( Untranslated Regions, o UTRs) de los extremos 5’ (5 ^' -UTR) y 3’ (3 ^' -UTR) del coronavirus del cual se haya obtenido el ácido nucleico del replicón de la invención, preferentemente MERS-CoV. Los genes de cada fragmento van precedidos por las secuencias reguladoras de la transcripción de cada uno de ellos ( transcription regulatory sequences, o TRSs) que controlan la expresión de los ARNs mensajeros correspondientes.

Las estrategias para obtener vectores de expresión con un fragmento parcial de la secuencia de cADN complementaria al replicón de ARN de la invención se pueden realizar por cualquier método conocido del estado de la técnica, preferentemente mediante una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos obtenidos por síntesis química y uso de enzimas de restricción.

Para obtener el replicón de ARN resultante, se pueden expresaren una célula adecuada los vectores de expresión que contengan los fragmentos parciales de secuencias de cADN que codifican todos los genes que no se han delecionado. La célula adecuada es aquella que proporcione en trans una de las proteínas delecionadas que permita al replicón de ARN envolverse en una VLP-E+ funcional para su uso posterior. Las células adecuadas pueden ser BHK21 , Huh-7, HEK293, Calu3, Calu3 2B4, MRC-5 y Vero-81. El replicón de ARN se puede combinar con un polímero o una nanopartícula lipídica.

Para obtener el replicón V1-CD, se transcribe in vitro el RNA a partir del pBAC que contiene el replicón en condiciones libres de RNasas, este pBAC puede ser cualquier vector conocido en el área, por ejemplo, es un plásmido pBeloBACH modificado para incluir el promotor de T7, necesario para la transcripción in vitro. Para ello se utiliza el protocolo anteriormente descrito por Eriksson K.K. et al, 208, Methods in Mol. Biol. 454:237-254, con algunas modificaciones. En resumen, como molde se utiliza el pBAC altamente purificado, linearizado o no. La transcripción in vitro se realiza con kits comerciales que contienen la polimerasa T7, como por ejemplo el RiboMAX Large Scale RNA production system de Promega, añadiendo análogo de cap (Ribo m ⁷ G cap analog, Promega). La reacción se desarrolla durante 2 horas a 30°C. Posteriormente el DNA molde se elimina mediante digestión con DNasa RNasa-free. El RNA transcrito in vitro se purifica mediante precipitación con LiCI, se cuantifica utilizando un nanodrop, y su calidad se analiza en un gel de agarosa.

En una realización particular, un vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica las ORF 1a, ORF 1ab y el gen N y un segundo vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica los genes S, M y genes que codifican proteínas accesorias de género que no se hubieran delecionado del replicón de ARN de la invención.

En otra realización particular, un vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica las ORF 1a, ORF 1ab y un segundo vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica los genes N, S, M y genes que codifican proteínas accesorias de género que no se hubieran delecionado del replicón de ARN de la invención.

En otra realización particular, un vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica las ORF 1a, ORF 1ab y el gen S, y un segundo vector de expresión comprende el fragmento de cADN complementario al replicón de ARN de la invención que codifica para los genes N, M y genes que codifican para proteínas accesorias de género que no se hubieran delecionado del replicón de ARN de la invención.

El replicón de la invención puede incluir uno o varios ácidos nucleicos heterólogos de interés. Dicho ácido nucleico heterólogo se selecciona entre un gen y/o un fragmento de un gen que codifica un producto génico de interés.

Cualquier gen heterólogo de interés puede ser insertado en los ácidos nucleicos según la presente invención. Se prefiere en particular la inserción de genes que codifican péptidos o proteínas que sean reconocidos como un antígeno de un agente infeccioso o extraño (no propio) por el sistema inmunitario de un mamífero. El gen heterólogo puede por lo tanto codificar por lo menos un antígeno apropiado para inducir una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso, y/o por lo menos codificar una molécula que interfiere con la replicación de un agente infeccioso, y/o un anticuerpo que proporcione una protección contra el agente infeccioso. De modo alternativo o adicionalmente, el gen heterólogo puede codificar un modulador inmunitario, una citoquina, un intensificador de la respuesta inmunitaria y/o una proteína antiinflamatoria.

El ácido nucleico heterólogo que puede estar insertado el replicón de la invención puede ser un gen o fragmento de gen que codifica una proteína, un micro-ARN, un péptido, un epítopo o cualquier producto génico de interés (tales como enzimas, citoquinas, interleuquinas, etc.). El ácido nucleico heterólogo se puede insertar en el clon infectivo de la invención mediante técnicas de ingeniería genética convencionales en cualquier región apropiada del cADN, por ejemplo, después de la ORFlab o entre dos genes, siguiendo el codón iniciador (AUG) y en fase de lectura con ese gen; o, alternativamente, en las zonas correspondientes a otras ORFs. En la construcción del replicón de ARN de la invención es esencial que la inserción del ácido nucleico heterólogo no interfiera ninguna de las funciones virales básicas necesarias para la autoamplificación y envuelta del replicón en una VLP, cuando estas sean necesarias.

Otro aspecto adicional de esta invención es una composición vacunal que induzca protección en un sujeto frente a la infección causada por el coronavirus MERS-CoV, tal que dicha composición vacunal comprende un replicón de ARN derivado de MERS-CoV los descritos anteriormente, junto con, opcionalmente: al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o al menos un adyuvante o inmunoestimulador químico o biológico.

Como excipiente puede utilizarse un diluyente tal como suero salino fisiológico y otras soluciones salinas similares, o también polímeros de distinta naturaleza que se han desarrollado con este fin y son comercialmente accesibles.

Los adyuvantes químicos preferidos comprenden AS03 o Matrix - M, hidróxido de aluminio, Quil A, suspensiones de geles de alúmina y similares, como oleoso, a base de aceites minerales, glicéridos y derivados de ácido graso, y sus mezclas.

Los adyuvantes biológicos pueden amplificar la respuesta inmune inducida por la vacuna de la invención. Los adyuvantes biológicos se seleccionan entre sustancias potenciadoras de la respuesta celular (PRC), sustancias potenciadoras de subpoblaciones de células T helper (JM yTh2) tales como interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, interferón gamma (IFN-gamma), factor de necrosis tumoral (TNF) y sustancias similares, que pueden potenciar la respuesta inmune en los sujetos vacunados. Estos reguladores de la respuesta inmune podrían utilizarse en formulaciones vacunales con adyuvantes acuosos u oleosos. También se puede utilizar otro tipo de adyuvantes que modulan e inmunoestimulan la respuesta inmune tales como el MDP (muramil dipéptido), ISCOM ( Immuno Stimulant Complex) o liposomas.

La composición vacunal de la invención se puede administrar a un sujeto por vía tópica, vía intranasal, oral, subcutánea o intramuscular, preferentemente por vía intranasal. El sujeto es preferentemente un mamífero, más preferentemente un humano o un animal doméstico, a modo de ejemplo un perro o un gato, aunque se puede tratar otros sujetos alternativos, en el curso de la investigación sobre vacunas o enfermedades. La dosis de vacuna que se administrará a un sujeto depende de la especie y el tamaño del sujeto, la naturaleza de la afección que se está previniendo y puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia.

A fecha 1 de mayo de 2021 , había depositadas en GenBank 610 secuencias completas del genoma de MERS-CoV tanto de Camelus spp como de Homo sapiens, la identidad de estas 610 secuencias está en un intervalo comprendido entre 74 y el 100%. Por lo tanto, es de esperar que el replicón y la composición vacunal de la presente invención puedan proteger no sólo humanos sino otros animales contra la infección de este coronavirus.

Otro objeto adicional de esta invención comprende el replicón de ARN definido anteriormente para su uso en una composición vacunal.

Dicho replicón de ARN atenuado que expresa uno o más genes estructurales de un coronavirus se puede usar como parte de una composición vacunal. También se proporciona el uso de un replicón de ARN atenuado que expresa uno o más genes estructurales de coronavirus en la fabricación de una vacuna. La composición vacunal está diseñada para su uso en la protección de un sujeto contra la infección por un coronavirus, preferentemente MERS-CoV.

En una realización particular, la composición vacunal de la invención se administra al sujeto simultáneamente junto con un adyuvante o inmunoestimulador químico o biológico.

En otra realización particular, la composición vacunal de la invención se administra antes o después que el adyuvante o inmunoestimulador químico o biológico.

Las vacunas de esta invención pueden presentarse en forma líquida o liofilizada y pueden prepararse suspendiendo los componentes de la composición vacunal en el excipiente. Estos sistemas pueden estar en forma liofilizada, el excipiente puede ser el propio reconstituyente.

Alternativamente, las composiciones vacunales divulgadas en esta invención se pueden combinar con otras vacunas convencionales. Una sola administración de la composición vacunal puede ser suficiente para proporcionar una inmunización adecuada, pero en realizaciones alternativas, se pueden administrar más de una dosis de vacuna. Por ejemplo, una primera dosis puede ser seguida por una dosis de refuerzo después de una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o intervalos más largos.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que describen de forma detallada los objetos de la invención. Estos ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención sino como ilustrativos de la misma.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Esquema del genoma del coronavirus MERS-CoV. Se representa el genoma del MERS-CoV (cepa EMC/2012, GenBank JX869059). Las letras sobre las cajas representan los genes virales: L, secuencia líder; S, gen de la proteína de la espícula; E, gen de la proteína de la envuelta; M, gen de la proteína de membrana; N, gen de la proteína de la nucleocápsida. Los números o letras sobre las cajas indican los genes específicos de género. ORF, fase de lectura abierta; An, cola de poli-A. En el caso del MERS-CoV, se consideran proteínas específicas de género las codificadas por los genes 3, 4a, 4b, y 5.

Figura 2. Construcción de un clon infectivo de MERS-MA30 adaptado a crecer en ratones. (A) La figura muestra la estructura genética del MERS-CoV indicando mediante letras y números los nombres de los genes [ORF1a, ORF1b, S, 3, 4a, 4b, 5, E, M, y N], donde ORF significa marco abierto de lectura. En los recuadros de la parte inferior de la barra se indican las posiciones de las mutaciones introducidas en el genoma del virus MERS-MA30 SEQJD 21 adaptado a crecer en ratones a lo largo de 30 pases, que no estaban presentes en el MERS-CoV no adaptado a crecer en ratón. El genoma del cADN del MERS-CoV se ha descrito en GenBank JX869059.

Las bandas verticales dentro de las cajas representan las mutaciones puntuales que se han introducido en cADN a lo largo del genoma. Es importante resaltar que en el MERS- MA30 se han introducido durante la adaptación una deleción dentro del gen 5 (en blanco) y un codón de parada (asterisco), lo que impide la expresión de la proteína 5 en el MERS-MA30. Las líneas verticales negras dentro de las cajas indican mutaciones silenciosas. (B) La imagen superior representa el cADN del genoma del MERS-CoV adaptado al ratón (MERS-MA30), número de acceso en GenBank MT576585, como se muestra en el panel A, flanqueado por el promotor del citomegalovirus (CMV) y la ribozima del virus de la hepatitis delta (Rz) y la secuencia de terminación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). pA, cola de poli(A). La imagen inferior representa los seis fragmentos (F1 a F6, en gris oscuro) diseñados originalmente para ensamblar el cADN infeccioso del MERS-CoV (Almazan, et al, 2013), flanqueados por los sitios de restricción indicados (las posiciones en el genoma viral se indican con números entre paréntesis). Sobre ellos aparecen situados los recuadros en gris claro que indican los fragmentos sintéticos adaptados al ratón con las mutaciones mencionadas en la Figura 2A (rayas negras verticales) sintetizados químicamente (FS 1-9, Tabla 3). Las rayas verticales de puntos indican la localización de cada uno de estos fragmentos sintéticos en el cADN infeccioso del MERS-CoV y en cada uno de los fragmentos diseñados (pBAC-SA-F1-6) para ensamblarlo.

Figura 3. Esquema de los mutantes de deleción diseñados a partir del clon infectivo del MERS-MA30. En recuadros blancos con borde discontinuo se indican los genes delecionados. Hay una deleción dentro (banda en blanco y borde discontinuo) del gen 5 y un codón de parada (asterisco, *), lo que impide la expresión de la proteína 5 completa en el MERS-MA30. Las puntas de flecha a la izquierda del nombre de los mutantes indican aquellos que, por contener la deleción del gen que codifica la proteína E, son replicones. Figura 4. Esquema de los replicones de ARN de MERS-CoV V1-CD y V1-VLP: Se muestran los esquemas de las versiones V-1., tanto químicamente definida (CD), como para su empaquetamiento en VLPs (VLP). En recuadros blancos con borde discontinuo se indican los genes delecionados, así como la pequeña deleción en el gen nsp1, se muestra como ejemplo la deleción nsp1-AD. También se muestra la identidad entre ambas secuencias y las modificaciones en el gen S de cada replicón: S* opt: secuencia del gen S con codones optimizados. Figura 5. Virulencia del virus obtenido a partir del cADN infectivo del MERS-MA30.

Se inocularon intranasalmente ratones Kl con 10 ⁴ UFP/ratón de este virus aislado de ratón (círculos) o del virus MERS-MA30 recombinante obtenido a partir del cADN infectivo (cuadros negros). En la figura de la izquierda se muestran las pérdidas de peso de los ratones infectados, y en la gráfica de la derecha la supervivencia. Las diferencias en pérdida de peso están representadas como la media ± el error estándar de la media.

Figura 6. Cinética de crecimiento de los virus y replicones derivados del MERS- MA30. Crecimiento en ausencia (E ) o en presencia (E ⁺ ) de la proteína E proporcionada en trans. Se infectaron células Huh-7 a una MDI de 0,001 y se siguió la infección durante 72 horas. Los resultados están expresados como la media ± la desviación estándar.

Figura 7. Microscopía electrónica de transmisión de células Huh-7 infectadas con el virus MERS-CoV WT o con el replicón MERS-CoV-DE, en ausencia de proteína E proporcionada en trans. Las infecciones se hicieron con dos multiplicidades de infección diferentes (MDI) 0.1 y 1.0, obteniéndose el mismo resultado en todos los casos y se ilustra el de MDI 1.0 solamente. Las muestras se tomaron a las 17 horas después de la infección. En el panel de la izquierda (MERS-CoV WT) se pueden apreciar las vesículas grandes con alta concentración de viriones esféricos, con un mayor efecto citopático en las células infectadas con la MDI 1 (menor integridad celular). Las vesículas con viriones son alargadas en el panel de la derecha (MERS-CoV-DE) para ambas MDIs, y se aprecia un menor efecto citopático.

Figura 8. Evaluación de la atenuación de los mutantes y replicones derivados del MERS-MA30 en ratones Kl. En la figura de la izquierda se muestran las pérdidas de peso de los ratones infectados, y en la gráfica de la derecha la supervivencia. Las diferencias en pérdida de peso están representadas como la media ± el error estándar de la media.

Figura 9. Título del virus MERS-MA30 y del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] en el pulmón de los ratones infectados. Se muestran los títulos del MERS-CoV-MA y del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] en los pulmones de los ratones. Se observa que los títulos del virus en los ratones infectados con MERS-CoV-MA (columnas negras) fueron al menos cuatro unidades logarítmicas superiores que en los ratones infectados con el replicón (columnas claras). Es más, no se detectó virus infectivo en los ratones inoculados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E], confirmando que este es deficiente en propagación.

Figura 10. Niveles de replicación y transcripción del virus MERS-MA30 y del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] en el pulmón de los ratones infectados. En la figura de la izquierda se muestran los niveles de replicación del virus MERS-MA30 (columnas negras) y del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] (columnas claras) en los ratones infectados a los tiempos indicados. En la figura de la derecha se muestra el nivel de transcripción del virus MERS-MA30 (columnas negras) y del replicón MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E] (columnas claras) en los pulmones de los ratones. **: prueba t-Student (nivel de significación menor de 0,01); los resultados están expresados como la media ± la desviación estándar.

Figura 11. Evaluación de la protección conferida por los mutantes y replicones derivados del MERS-MA30 en ratones Kl. En la figura de la izquierda se muestran las pérdidas de peso de los ratones infectados, es decir inmunizados y desafiados después con el virus virulento, y en la gráfica de la derecha la supervivencia. Las diferencias en pérdida de peso están representadas como la media ± el error estándar de la media.

Figura 12. Niveles de replicación y transcripción del virus MERS-MA30 utilizado en el desafío, en el pulmón de ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E] En la figura de la izquierda se muestra el nivel de replicación del virus MERS-MA30 utilizado en el desafío, en los ratones no inmunizados (columnas negras) y en los inmunizados con el replicón (columnas claras). La evaluación se hizo en los pulmones de los ratones desafiados. En la figura de la derecha se muestra el nivel de transcripción del virus del desafío en los pulmones de los ratones desafiados (los códigos de colores son análogos a los del panel de la izquierda). Prueba t-Student: (*) nivel de significación menor de 0,05 (**) nivel de significación menor de 0,01 ; los resultados están expresados como la media ± la desviación estándar.

Figura 13. Replicación del virus del desafío en los pulmones de los ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E]. Las columnas negras muestran el crecimiento del virus en los ratones no inmunizados y las claras en los ratones inmunizados con el replicón. Se observa claramente que en los ratones inmunizados el virus no creció en absoluto a cualquier tiempo después de la inmunización, indicando que ésta había sido esterilizante, es decir que el virus del desafío no pudo replicarse en ningún momento.

Figura 14. Cantidad de anticuerpos neutralizantes en el suero de ratones inmunizados con el replicón. Las muestras de sangre se obtuvieron de ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] y ratones control (no inmunizados) a 0 y 21 días después de la infección. El título de anticuerpos neutralizantes se muestra como la dilución de suero más elevada que muestra una completa neutralización del efecto citopático en un 50% de los pocilios (TCID50). Prueba t-Student: (*) p valor: 0,0102919. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS

A continuación, se describen los materiales y protocolos comunes a los distintos ejemplos de realización, serán los empleados salvo que explícitamente se indique lo contrario. Líneas Celulares eucariotas

Se han utilizado células Huh-7 derivadas de hepatocarcinoma humano ( Homo sapiens), células BHK21 derivadas de riñón de hámster dorado recién nacido ( Mesocricetus auratus ), células Vero-81 y Vero E6 derivadas de riñón de cercopiteco verde ( Chlorocebus aethiops ), las HEK293, embrionarias de riñón humano, las Calu3 y Calu3 2B4 derivadas de adenocarcinoma de pulmón humano, y células MRC-5, derivadas de fibroblastos de pulmón humano.

Las líneas celulares se crecieron en un incubador a 37 °C con una presión parcial de CO2 del 5 % y una humedad del 97 %, en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 25 mM de tampón HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-iletanosulfónico] y 4,5 g/L de glucosa (BioWhittaker, Lonza). Para las evaluaciones y los ensayos en cultivos celulares, el medio se suplemento con 2 mM de glutamina (Sigma-Aldrich), 1 %p/v de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) y 10 %v/v de FBS. Se añadieron 100 UI/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich) al medio para el mantenimiento de la línea entre ensayos. Todas las líneas celulares se congelaron en nitrógeno líquido a una densidad de 1 x 10 ⁶ células/mL en FBS con 10 %v/v de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich) para su conservación.

Bacterias

Para el clonaje de los distintos plásmidos se utilizó la cepa DH10B de Escheríchia coli (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), que presenta un fenotipo

[F mcckk{mrr-hsdRMS-ma C)0QOúlacZk^bNacXlAdeoRrecMendM araD139 (. ara,leu)7697gal\JgalKXrpsLnupG ]

Las bacterias se crecieron a 30 o 37 °C en medio líquido Luria-Bertani (LB) (Sambrook and Russell, 2001), o en medio sólido LB-agar (15 g/L) para el aislamiento de colonias. Cuando fue necesario, el medio se suplemento con antibióticos para la selección y crecimiento de colonias individuales (100 pg/mL de ampicilina o 12,5 pg/mL de cloranfenicol; Sigma-Aldrich).

Generación de bacterias competentes

Para la preparación de bacterias DH10B competentes para electroporación, se creció a 37 °C durante la noche un pre-inóculo, a partir de una colonia individual aislada en medio sólido LB-agar, en 50mL de medio Super Optima I Broth (SOB) [20 g/L de triptona (Becton, Dickinson and Company), 5 g/L de extracto de levaduras (Becton, Dickinson and Company), 0,5 g/L de NaCI (Sigma-Aldrich), 0,18 g/L de KCI (Sigma-Aldrich)]. Al día siguiente, se inocularon dos litros de medio SOB con 1 mL del pre-inóculo y se amplificaron hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nm (DOssonm) de 0,7. Seguidamente, se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 xg durante 10 minutos a 4 °C y se lavaron tres veces con una solución de glicerol al 10 %v/v. En cada lavado las bacterias se resuspendieron en un volumen equivalente al del cultivo inicial, que se fue reduciendo a la mitad en los sucesivos lavados (2 L, 1 L, 0,5 L y 0,25 L, respectivamente). Después de la sedimentación inicial y entre los lavados, las bacterias se mantuvieron en hielo en todo momento. El sedimento final se resuspendió en un volumen de 6 mL de glicerol al 10 %v/v a 4 °C, se repartieron las bacterias en alícuotas y se congelaron a -80 °C hasta su utilización. Transformación de bacterias mediante electroporación

Las bacterias DH10B competentes para electroporación se transformaron con un ADN libre de sales. Ese ADN se dializó durante 20 minutos frente a H2O destilada utilizando unas membranas hidrófilas de ásteres de celulosa con un tamaño de poro de 0,025 pm (Merck- Millipore). El ADN dializado se mezcló con 50 pL de bacterias competentes y se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm (Bio-Rad). Para la electroporación, se aplicó un pulso eléctrico a la cubeta con la mezcla ADN-bacterias de 25 pF, 2,5 KV y 200 W con un electroporador MicroPulser Electroporator (Bio-Rad). A continuación, se resuspendieron las células electroporadas en 1 mL de LB y se crecieron durante 45 minutos a 37 °C en agitación. Después de la incubación, las bacterias electroporadas se sembraron en una placa de medio LB-agar con el antibiótico de selección correspondiente.

MANIPULACION Y ANALISIS DEL ADN Plásmidos

El plásmido TRE-Auto-rtTA-V10-2T se emplea para la expresión de la proteína de la envuelta (E) del MERS-CoV y sus variantes. La secuencia de la construcción resultante se comprobó mediante la secuenciación Sanger (Macrogen) de los plásmidos purificados. El gen de interés se encuentra bajo la influencia de un promotor inducible en el plásmido TRE-Auto-rtTA-V10-2T (Das et al., 2016b). Este vector se basa en el sistema de expresión inducible controlado por tetraciclina Tet-On (Das et al., 2016a). A partir de la secuencia codificante de la proteína E o sus variantes, se introdujeron mediante PCR dos dianas de restricción EcoRI para clonar el gen que codifica la proteína en el plásmido. Los oligonucleótidos utilizados fueron: VS-EcoRI-E-MERS-rtTA-V10-2T (5’- CCGGAATTCGAGCTCGGT

ACCCGGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTTACCCTTTGTCCAAGA-3’) SEQJD 22 y RS-EcoRI-EMERS-rtTA-V10-2T, SEQJD 23. El producto de PCR resultante se clonó en el vector utilizando los sitios de restricción EcoRI. Se comprobó la correcta orientación del inserto en el vector mediante PCR utilizando un oligonucleótido interno (RS-E-MERS: 5’-TTAAACCCACTCGTCAGG-3’) SEQJD 24 y otro externo (VS-TRE- Auto-2380: 5’- ATCCACGCTGTTTTGACCTC-3’) SEQJD 25 respecto al fragmento insertado. El plásmido TRE-Auto-rtTA-V10-2T contiene un gen que codifica un transactivador (rtTA) a continuación del gen que codifica la proteína E. En presencia de un inductor (doxiciclina, un antibiótico derivado de la tetraciclina), este transactivador es capaz de unirse al promotor inducible e iniciar la transcripción del gen de interés. Entre ambos genes existe un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), lo que genera un bucle de retroalimentación positivo que aumenta los niveles de expresión tanto de la proteína E como del transactivador.

El plásmido pUC57 (GenScript) de alto número de copia se utilizó para el clonaje y modificación de algunos ADNs complementarios al ARN viral (cADN). Para clonar el cADN del MERS-CoV cepa EMC/2012, el MERS-MA30, y sus correspondientes variantes, se utilizó el plásmido pBeloBAC11 (pBAC) (Wang et al., 1997). Este plásmido de 7507 bp contiene el origen de replicación del factor F de E.coli ( oirS ), el gen de resistencia a cloranfenicol (cat) y los genes necesarios para mantener una copia única del plásmido por célula ( parA , parB, parC y repE). Este vector también se utilizó para el clonaje y modificación de cADNs virales de gran tamaño o aquellos que contuviesen secuencias tóxicas para su crecimiento en bacterias, según lo descrito anteriormente (Almazán et al., 2000; González et al., 2002).

Purificación de plásmidos y fragmentos de ADN

Para la extracción y purificación de plásmidos a partir de cultivos de bacterias de pequeña o mediana escala, se utilizaron los reactivos Plasmid Mini Kit y Plasmid Midi Kit (Qiagen), respectivamente.

Para la purificación a gran escala de plásmidos basados en pBAC, se partió de un cultivo de bacterias de 400 ml_ crecido durante 18 horas a 30 °C en agitación en medio LB suplementado con 15 pg/mL de cloranfenicol (Sigma-Aldrich). Para su purificación se empleó el reactivo Large Construct Kit (Qiagen). Este reactivo permite la purificación de grandes fragmentos de ADN libres de ADN cromosómico bacteriano gracias a un tratamiento con exonucleasa.

Los productos de PCR y los fragmentos de ADN extraídos de geles de agarosa se purificaron con el reactivo QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Cuando el fragmento fue mayor de 10 kb, se utilizó el reactivo QIAEX II (Qiagen). En todos los casos se siguieron las instrucciones del fabricante y el ADN se eluyó en H2O destilada ultrapura MiliQ (Merck-Millipore) o en tampón de elución EB (10 mM Tris- Cl, pH 8,5; Qiagen).

Enzimas de restricción, modificación y ligación del ADN

Todas las enzimas de restricción utilizadas en los clonajes y la realización de patrones de restricción se obtuvieron de Roche, New England Biolabs y Thermo Fisher Scientific. Para las reacciones de ligación de ADN se utilizó la enzima ADN ligasa del fago T4 (Roche). La desfosforilación de extremos de moléculas de ADN se realizó con la fosfatasa alcalina de gamba (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Los tratamientos enzimáticos de restricción, desfosforilación y ligación del ADN se llevaron a cabo siguiendo las indicaciones de cada fabricante y protocolos estándar descritos anteriormente (Sambrook and Russell, 2001). La secuencia de las construcciones resultantes se analizó y comprobó mediante secuenciación Sanger (Macrogen).

Reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación de fragmentos de ADN

Las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador 2720 Thermal cycler o en un termociclador SimpliAMP (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). El volumen final de las reacciones fue de 25 pL. En aquellas reacciones preparativas en las que fue necesario obtener una mayor cantidad de producto de PCR, el volumen final se incrementó hasta 50 pL. Se utilizaron entre 50 y 150 ng de ADN molde por reacción. La temperatura de fusión de los oligonucleótidos (Tm) y la longitud del fragmento a amplificar determinaron la temperatura de hibridación (de 4 a 5 °C menos que la Tm del oligonucleótido con menor Tm) y el tiempo de elongación (en torno a 1 minuto por cada 1 kb de ADN amplificado), respectivamente. Las condiciones de la reacción se ajustaron de la siguiente forma: (a) desnaturalización inicial de 5 minutos a 95 °C; (b) 25-35 ciclos de: i) desnaturalización, 30 segundos a 95 °C; ii) hibridación, 30 segundos a la temperatura calculada; iii) elongación, 1 minuto/kb a 72 °C; (c) elongación final, 10 minutos a 72 °C.

Las reacciones con fines analíticos, incluidas las de genotipado, se llevaron a cabo con la enzima AmpliTaq ADN polymerase (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Se utilizaron 0,025 U/pL de polimerasa en su correspondiente tampón de reacción ( GeneAmp 10X PCR Buffer II, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) en presencia de MgCL 2,5 mM, 0,3 pM de cada oligonucleótido y una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) (Roche) a una concentración final de 0,2 mM de cada uno.

Para las reacciones preparativas y de secuenciación, se utilizó la enzima Vent polymerase (New England Biolabs), que presenta mayor fidelidad debido a su actividad exonucleasa 3’-5’ correctora de errores. Se utilizaron 0,016 U/pL de polimerasa en su correspondiente tampón de reacción (ThermoPol Reaction Buffer, New England Biolabs; composición final 1X: Tris-HCI 20 mM, (NH^SCL 10 mM, KCI 10 mM, Tritón ^® X-1000,1 %, pH 8.8) en presencia de MgSCL 2 mM, 0,2 mM de cada oligonucleótido y una mezcla dNTPs a una concentración final de 0,3 mM de cada uno.

Electroforesis de ADN en geles de agarosa

La separación de fragmentos de ADN para estudios analíticos o purificación se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa de bajo punto de electroendoosmosis (Pronadisa, Laboratorios CONDA) al 0,7-1, 5 %p/v en tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, ácido etilendiaminotetraacético - EDTA - 1 mM). Para la visualización de las bandas de ADN en un captador de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad) se incorporó SYBR Safe ADN ge I stain 1X (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a la disolución de agarosa.

VIRUS

Aislados virales

Los virus recombinantes rescatados a partir de la transfección del clon infectivo del MERS-CoV (MERS-CoV) (Almazán et al., 2013) tienen el fondo genético del aislado MERS-CoV EMC/2012 (GenBank: JX869059) (van Boheemen et al., 2012). Los virus recombinantes rescatados a partir de la transfección del clon infectivo del MERS-CoV adaptado a ratón (MERS-MA30) presentan el fondo genético del MERS-CoV-6-1-2 aislado después de 30 pases en ratones Y\DPPA-knockin (Li et al., 2017).

Manipulación de virus en cultivos celulares

Los virus se crecieron en células siguiendo protocolos estándar. Para ello, las células se amplificaron hasta un 100 % de confluencia en frascos de cultivo con tapón de rosca preferentemente o en placas de cultivo. Después, se llevaron al laboratorio NCB3 y se infectaron con la cantidad deseada de virus. En el caso de las placas de cultivo, se introdujeron en bolsas de plástico termosellables. Tanto los frascos como las placas se dispusieron en cajas de metacrilato para la contención de posibles vertidos, y se incubaron a 37 °C durante el periodo de tiempo indicado.

Los lotes de virus se generaron en frascos de cultivo con tapón de rosca del volumen final de lote deseado. A las 24 horas después de sembrar las células y comprobar que habían alcanzado un 100 % de confluencia, se infectaron a una multiplicidad de infección (MDI) de 0,001 unidades formadoras de placa (UFP) por célula (UFP/célula). El sobrenadante se recogió 72 horas después de la infección (hdi) y se distribuyó en alícuotas que se almacenaron a -80 °C hasta su utilización. La secuencia de los lotes de virus se analizó mediante secuenciación Sanger (Macrogen) para comprobar que no se habían producido cambios.

Titulación viral mediante el ensayo de formación de placas

Las titulaciones por ensayo de formación de placas se llevaron a cabo siguiendo protocolos estándar adaptados a las cepas de virus utilizadas en el laboratorio (Coleman & Frieman, 2015). Se sembraron placas de 12 pocilios con células Huh-7 o Vero 81 , se crecieron hasta el 100 % de confluencia y se infectaron por triplicado con diluciones seriadas de factor 10 del sobrenadante de virus. Después de 45 minutos de adsorción a 37 °C, se retiró el medio y se añadió DMEM suplementado con 4 mM de glutamina, 1 %v/v de aminoácidos no esenciales, 2 %v/v de FBS, 0,16 mg/mL de DEAE-Dextrano y 0,6 %p/v de agarosa de bajo punto de electroendoosmosis (Pronadisa, Laboratorios CONDA), formándose una capa de agarosa. Las células Huh-7 o Vero E6 y Vero81 se infectaron con MERS-CoV y se incubaron durante 72-96 horas. Finalizada la incubación, las células se fijaron e inactivaron con formaldehído (Sigma-Aldrich) al 10 %v/v en tampón fosfato salino (PBS) durante, al menos, 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se retiró el formaldehído y el tapón de agarosa para teñir las células con una solución de cristal violeta (1 mg/mL de cristal violeta en metanol al 20 % en H2O destilada) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se determinó el número de placas de lisis formadas en cada una de las diluciones. El título se expresó como el número UFPs multiplicado por el factor de dilución en un volumen de 1 mL (UFP/mL).

Titulación viral mediante el ensayo de detección de formación de focos por inmunofluorescencia El ensayo de detección de formación de focos por inmunofluorescencia es especialmente útil para la detección y titulación de aquellos virus deficientes en propagación incapaces de formar placas visibles. Para ello, se sembraron 5 x 10 ⁴ células por pocilio en una placa de 96 pocilios en un volumen final de 50 pl_ de medio. Al día siguiente, las células se infectaron con 20 mI_ de diluciones seriadas de factor 10 del sobrenadante con virus. A las 16 horas de infección (hdi), las células se fijaron e inactivaron con paraformaldehído (Merck-Millipore) al 4 %p/v en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se permeabilizaron con metanol frío durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon con FBS al 10 %v/v en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo policlonal de conejo frente a la proteína de la nucleocápsida (N) (BioGenes) a una dilución 1 :500 en FBS al 5 % en PBS. Al día siguiente, se retiró el anticuerpo, se lavaron las células con PBS y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de cabra frente a conejo conjugado con el fluorocromo Alexa Fluor ^® 488 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a una dilución 1 :500 en FBS al 5 % en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se contaron los focos de infección formados en las diferentes diluciones utilizando un microscopio de fluorescencia Axio Vert.AI (Zeiss). El título se expresó como el número de unidades formadoras de focos (UFF) multiplicado por el factor de dilución en un volumen de 1 mL (UFF/mL), equivalente a UFP/mL.

Titulación viral mediante el método de dosis infectiva del 50% en cultivos celulares

La dosis infectiva del 50 % en cultivos celulares (50 % tissue culture infective dose, TCID50) es la dilución a la cual el virus produce un efecto citopático en el 50 % de los pocilios con células inoculadas. Para llevar a cabo la titulación por este método, se sembraron 5 x 10 ⁴ células por pocilio en una placa de 96 pocilios en un volumen final de 50 pL de medio. Al día siguiente, se retiró el medio de las células, se infectaron con 100 pL de diluciones seriadas de factor 10 del sobrenadante de virus (desde la 1:10 hasta la 1 : 10 ⁸ ) y se incubaron durante 72 horas a 37 °C. Para cada una de las diluciones de cada virus se inocularon 10 pocilios. A las 72 hdi, se retiró el medio de las células y se fijaron e inactivaron con formaldehído (Sigma- Aldrich) al 10 %v/v en PBS durante, al menos, 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se retiró el formaldehído para teñir las células con una solución de cristal violeta (1 mg/mL de cristal violeta en metanol al 20 % en H2O destilada) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la obtención del título se calculó la dilución de virus en la cual el 50 % de los pocilios con células presentaban efecto citopático (TCID50) siguiendo el método descrito por Reed- Muench (Reed and Muench, 1938), se multiplicó por el factor de dilución y se expresó como TCID50 por mililitro de virus (TCIDso _/mi. ).

Transfección de los cADNs infectivos y rescate de los virus MERS-CoV, MERS- MA30

Las células BHK21 crecidas hasta un 95 % de confluencia en frascos de cultivo de 12,5 cm ² se transfectaron con 6 pg del cADN infectivo de uno de los virus y 18 pL del reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A las 5-6 horas después de la transfección (hdt), las células BHK21 transfectadas se desprendieron de la placa con 500 pL de tripsina- EDTA (25 %), se añadieron sobre una monocapa de células Huh-7 o Vero 81 confluentes crecidas en frascos de cultivo de 12,5 cm ² y se incubaron a 37 °C. A las 72 horas, se recogieron los sobrenadantes (pase 0) y se guardaron a -80 °C. Un tercio del sobrenadante se reservó para hacer un pase a un nuevo frasco de células Huh-7 o Vero 81 confluentes que se incubó, nuevamente, a 37 °C durante 72 horas. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes (pase 1) y se guardaron a -80 °C. Los virus rescatados se amplificaron directamente del pase 1. Sólo algunos virus seleccionados se clonaron previamente a ser amplificados mediante tres pasos de purificación de placas de lisis en medio DMEM semi-sólido al 0,6 %p/v de agarosa de bajo punto de electroendoosmosis (Pronadisa, Laboratorios CONDA). Los pases 0 y 1, así como los lotes de amplificación de cada virus, se titularon y secuenciaron para comprobar que el rescate se había producido correctamente.

Rescate de los replicones de MERS-CoV

Para el rescate de los replicones de MERS-CoV con el gen que codifica la proteína E delecionado, las células Huh-7 se transfectaron con el plásmido pcADN3.1-E-MERS- CoV. Este plásmido se utilizó para proporcionar en trans la proteína E con el fin de que el replicón forme VLPs que lleven la proteína E en su superficie. De esta manera el replicón generado es autosuficiente para infectar por sí mismo. Alternativamente, para hacer el rescate del replicón dentro de las VLPs, las células Huh-7 se cotransfectaron con los replicones de MERS-CoV y el plásmido TRE-Auto-rtTA-V10-2T-E-MERS-CoV que proporciona la proteína E en trans. A las 5-6 hdt, se retiró el medio con los complejos plásmido -Lipofectamine de las células Huh-7 transfectadas, se lavaron y se les añadió medio fresco. En el caso de las células transfectadas con el plásmido TRE-Auto-rtTA- V10-2T-EMERS-CoV, el medio estaba suplementado con doxiciclina a una concentración de 1 pg/mL para inducir la expresión de la proteína E. En un proceso alternativo, los mismos plásmidos descritos se transfectaron primero sobre células BHK21, y a las 6 horas se incubaron con 500 pL de tripsina-EDTA (25 %), se desprendieron de la placa y se añadieron sobre las células Huh-7 transfectadas con los plásmidos de expresión de la proteína E y se incubaron a 37 °C durante 72 horas. El utilizar primero una transfección de los plásmidos sobre las células BHK21 se hizo para aumentar el alto porcentaje de transfección de estas células. Tanto para el rescate como para los sucesivos pases de amplificación y la generación de lotes de los virus, las células Huh-7 se transfectaron con los plásmidos de expresión de la proteína E en una proporción ADN-.Lipofectamine 2000 de 1 :3 (microgramos:microlitros).

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Se sembraron células Huh-7 en placas de 24 pocilios. Al día siguiente, se comprobó que el nivel de confluencia fuera casi del 100 %. En ese momento, las células se infectaron con MDIs de 0.1 y de 1.0 de los virus y MERS-CoV y MERS-CoV-DE, obteniéndose resultados similares en ambos casos. A las 17 hdi se retiró el medio, se hicieron varios lavados con tampón PBS y se fijaron in situ durante 2 horas a temperatura ambiente con una solución de PFA al 4% p/v y glutaraldehído al 2% p/v en tampón fosfato Sórensen 0,1 M a pH 7,4. Se conservaron a 4 °C. durante 24 horas para la fijación. La inclusión de las células se hizo en plano directamente en la placa sin levantar las células. Para ello se retiró el fijador y se embebieron las células en resina epoxi TAAB 812 (TAAB Laboratories). Los bloques de resina se extrajeron de la placa para realizar cortes ultrafinos (70-80 nm) con un ultramicrotomo Ultracut E (Leica) que se contrastaron con una solución de acetato de uranilo al 2 % en agua y citrato de plomo de Reynolds. Las rejillas con los cortes se examinaron a 80 kV en un microscopio electrónico de transmisión JEM1010 (Jeol) y se tomaron fotos con una cámara digital CMOS TemCam F416 (TVIPS).

MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DEL ARN Extracción y purificación del ARN total intracelular

El ARN total de las células o de los pulmones de ratones infectados se extrajo y purificó con el reactivo RNeasy Mini Kit (Qiagen) para la verificación de la secuencia y el análisis de la estabilidad de los virus rescatados, así como para la cuantificación de la expresión de los genes virales y celulares. El rendimiento de la purificación se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). Todos los ARNs purificados se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Síntesis de cADNs a partir de ARN por RT-PCR

Los cADNs de los ARNs purificados se sintetizaron por PCR de transcripción reversa (RT) con el reactivo High Capacity ADN RT kit (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) en un volumen final de 30pL, con 150ng de ARN como molde y hexanucleótidos al azar, proporcionados en el kit, como cebadores. Las condiciones de la RT-PCR fueron: 10 minutos a 25 °C, 120 minutos a 37 °C y 5 minutos a 85 °C para la inactivación de la enzima. Los cADNs generados se utilizaron inmediatamente y el resto se conservó a -20 °C. Una fracción de los cADNs (2 pL) se utilizó como molde para su amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos específicos. Los productos de esta PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y secuenciación Sanger (Macrogen) para estudiar la estabilidad y la secuencia de los mutantes generados.

Cuantificación de ARNs por RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) Utilizando la tecnología TaqMan, el ARN genómico (gARN) y subgenómico (sgmARN) viral presente en muestras de pulmones de ratón se transcribió a cADN mediante transcripción reversa y se analizó por PCR cuantitativa (RT-qPCR). En el caso del gARN y del sgmARN del gen N (sgmARN-N), los ensayos TaqMan se componían de dos oligonucleótidos (Sigma-Aldrich) y una sonda conjugada con un fluoróforo y con un desactivador de la fluorescencia (Eurofins Genomics). Tanto los oligonucleótidos como la sonda son específicos de los virus MERS-CoV y MERS-MA30 (Tabla 2).

Tabla 2. Ensayos TaqMan.

Para normalizar y relativizar las cuantificaciones de los ARNs virales, se utilizó como control un ensayo TaqMan comercial del ARN ribosomal 18-S (rARN-18S) de ratón (referencia: Mm03928990-g1; Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Se tomaron 2 pL de una dilución 1/10 del cADN sintetizado por transcripción reversa para la cuantificación de los ARNs virales, y 2 pL de una dilución 1/100 para la cuantificación del ARN ribosómico 18S (rARN-18S). La qPCR se realizó en un equipo 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific), utilizando las siguientes condiciones: (a) 2 minutos a 50° C; 10 minutos a 95 °C; (b) 40 ciclos de: (i) 15 segundos a 95 °C; (ii) 1 minuto a 60 °C. En todos los casos la reacción se llevó a cabo con el reactivo GoTaq qPCR Master Mix (Promega) y se analizaron tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas de las anteriores para asegurar la precisión del análisis. Los valores correspondientes a las medias de los valores de los ciclos de corte (Ct) se analizaron con el programa 7500 software v2.0.6. (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) y se usaron para calcular los valores de expresión relativos utilizando el método 2- ^AACt (Livak and Schmittgen, 2001).

ENSAYOS EN RATÓN

Modelos experimentales de ratón y protocolos de inoculación Para la evaluación de la patogénesis del MERS-MA30 y los candidatos a vacuna basados en replicones del MERS-MA30, se utilizaron ratones knockin-in C57BL/6NTac- Dpp4 ^{tm3600(DPP4)Arte} (Li et al., 2017) (ratones Kl), en los que se han sustituido los exones 10-12 del gen de la Dipeptidil peptidasa 4 murina ( Dpp4 , Cd26 o mDpp4 ) por los correspondientes del gen homólogo humano, DPP4, generándose así una proteína quimérica humanizada ( huDpp4 ). Los exones sustituidos codifican la región reconocida por el RBD de la proteína S del MERS-CoV. Estos ratones son muy útiles para el estudio de la patología producida por MERS-CoV, dado que reproducen muy bien los signos clínicos y el daño pulmonar observado en la infección del MERS-CoV en el ser humano, (Li et al., 2017). También se utilizaron los ratones transgénicos SJL-Tg(K18-DPP4) (K18) (Li et al., 2016), en las evaluaciones de protección con resultados similares a los experimentos mostrados realizados en los ratones Kl descritos anteriormente para las inmunizaciones.

Los experimentos en ratones se llevaron a cabo con hembras de 16 a 30 semanas de edad libres de patógenos específicos. En todos procedimientos experimentales realizados, los ratones se anestesiaron con una mezcla de isoflurano y oxígeno. Todos los virus se inocularon por vía intranasal en un volumen final máximo de 50 pL de DMEM, depositando pequeñas gotas de la suspensión de virus en las fosas nasales que el ratón inhalaba de forma natural en 2 ó 3 segundos. Dependiendo de cada experimento, la dosis empleada varió entre, 1 x 10 ⁴ UFP para las inmunizaciones o estudios de atenuación y 1 x 10 ⁵ UFP/ratón para el desafío.

Seguimiento de la enfermedad, análisis de la virulencia y toma de muestras

Se monitorizaron el peso, los signos clínicos de la enfermedad y la supervivencia de los ratones infectados durante un periodo de 14 días. Aquellos animales que durante el desarrollo del experimento sufrieron pérdidas de peso superiores al 25 % respecto al peso inicial, se sacrificaron de acuerdo con los criterios establecidos de punto final.

A los días indicados, tres ratones de cada grupo experimental se sacrificaron por dislocación cervical para la toma de muestras de pulmón. Para el recuento de la carga viral en los pulmones de los ratones infectados, se tomó la mitad del pulmón derecho y se guardó a -80 °C hasta su utilización. El resto se embebió en la solución de conservación RNAIater (Sigma-Aldrich) durante 48 horas a 4 °C y se guardaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento para garantizar la integridad de las moléculas de ARN. El pulmón izquierdo se fijó en una solución de formalina de zinc al 10 % (Sigma- Aldrich) durante 24-48 horas a 4 °C para la inactivación del virus y el posterior análisis histopatológico.

Procesamiento de muestras para la cuantificación de virus en pulmón

Las muestras de pulmón se descongelaron y se homogeneizaron en 2 mL de PBS suplementado con 50 pg/mL de gentamicina (Sigma-Aldrich), 0,25 pg/mL de anfotericina B (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 100 UI/mL de penicilina (Sigma-Aldrich) y 100 pg/mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich) en un homogeneizador gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec) con sus correspondientes tubos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se centrifugaron a 3000 xg durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se dividieron en alícuotas y guardaron a -80 °C hasta el momento de la titulación del virus por los métodos antes descritos. Los títulos se expresaron en unidades formadoras de placa por gramo de pulmón (UFP/g).

Extracción de ARN de pulmón

Se retiró la solución de conservación de ARN de las muestras de pulmón y se homogenizaron en 2 mL de tampón RLT lysis buffer (Qiagen) con b-mercaptoetanol al 1 %v/v en un homogeneizador gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec), utilizando los tubos correspondientes y siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras homogenizadas se centrifugaron a 3000 xg durante 10 minutos a 4 °C. El ARN total se purificó del sobrenadante utilizando el reactivo RNeasy Mini Kit (Qiagen). Con el ARN total purificado se cuantificaron los ARNs virales y celulares.

Evaluación de la virulencia de los candidatos a vacuna

Para la evaluación de la atenuación de los candidatos a vacuna, se infectaron 11 ratones con cada virus generado: cinco para el seguimiento de la enfermedad, tres para tomar muestras de pulmón a los 3 días después de la infección (ddi), y tres para tomar muestras de pulmón a los 6 ddi. Se inocularon 1 x 10 ⁴ UFP/ratón de los candidatos basados en virus replicativos no propagativos en ratones Kl. Como control durante el seguimiento de la enfermedad, se inocularon cinco ratones K18 con 5 x 10 ³ UFP/ratón de MERS-CoV y cinco ratones Kl con 1 x 10 ⁴ UFP/ratón de MERS-MA30.

Evaluación de la protección de los candidatos a vacuna

A los 21 días después de la inmunización (ddin) se sometió a los cinco ratones inmunizados con cada candidato a vacuna a un desafío frente a una dosis alta (1 x 10 ⁵ UFP/ratón) de MERS-CoV o MERS-MA30, dependiendo de si se trataba de ratones K18 o Kl, respectivamente. Después de la evaluación del grado de protección, se seleccionó un candidato de cada tipo de vacuna para inmunizar 12 ratones y tomar muestras a los días 2, 4, 6, 8 y 12 días después del desafío (ddd). Las muestras tomadas se utilizaron para medir los niveles de ARN viral, la carga viral y evaluar la capacidad de los candidatos seleccionados para inducir inmunidad esterilizante. Ensayo de neutralización de virus

Las muestras de sangre se obtuvieron de la vena submandibular a los 0 y 21 días después de la inmunización. Las muestras de sangre se incubaron a 37°C durante 1 hr en un baño de agua y luego a 4°C durante la noche para facilitar la coagulación y separación del suero. El suero se clarificó mediante centrifugación y se almacenó a -80 °C. Un día antes del ensayo, se sembraron en placas de 96 pocilios 5 x 10 ⁴ células Huh- 7 por pocilio. El día del ensayo, las muestras de suero se descongelaron e incubaron a 56 °C durante 30 min para inactivar el sistema complemento. Se prepararon diluciones dobles de cada suero en DMEM completo suplementado con 2% de FBS en un volumen final de 60 pL. Las diluciones del suero se incubaron durante 1 hra 37 °C con 100 TCID50 de MERS-MA 30 en una proporción 1:1. Se eliminó el medio de las células Huh-7 y se incubaron con 60 pL de la mezcla suero:virus durante 1 hr a 37 °C. Después de la incubación, se sustituyó la mezcla suero:virus por medio fresco, DMEM completo y las células se incubaron a 37°C durante 72 hr. Finalmente, se fijaron las células con formaldehído 10% v/v en PBS y se tiñeron con cristal violeta. El título de anticuerpos neutralizantes en el suero de los ratones se determinó como la dilución más elevada que mostrara una completa neutralización del efecto citopático en un 50% de los pocilios (TCID50) ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para analizar las diferencias entre las medias de dos grupos, se utilizó la prueba t de Student, de dos colas, y para muestras desapareadas. Para la comparación de medias de tres o más grupos, se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) unifactorial. Se consideraron diferencias significativas aquellas pruebas en las que el valor de P fuese <0,05. Las diferencias en pérdida de peso se representaron como la media ± el error estándar de la media (SEM). El resto de los resultados se expresaron como la media ± la desviación estándar (SD).

Ejemplos de realización Como se ha comentado anteriormente, uno de los coronavirus más letales para el hombre es el MERS-CoV, en la Figura 1 se representa de forma esquemática su genoma completo.

A continuación, se describen una serie de ejemplos del método de la invención por el que se obtienen replicones de ARN a partir del MERS-CoV, así como su uso como vacunas para la generación de inmunidad en modelos animales.

1. Construcción de los clones infectivos del MERS-CoV adaptado a ratón, aislado después de 30 pases en ratones hDPP4- rnoc r/>j (MERS-MA30)

Para estudiar el uso como vacunas de replicones de ARN derivados de coronavirus es necesario el empleo de modelos animales. En este primer ejemplo, los ratones (Mus musculus) no son susceptibles a la infección por MERS-CoV, dado que la proteína S del MERS-CoV no reconoce la proteína homologa murina del receptor humano. Por esta razón, se han utilizado dos modelos de ratón modificados genéticamente para ser susceptibles a la infección por este virus y se ha empleado un derivado del MERS-CoV que es patogénico en estos animales.

A partir de la secuencia de virus MERS-CoV Genbank JX869059 se generó una cepa infectiva que causase la muerte de todos los ratones infectados, mediante el pase de dicho virus MERS-CoV durante 30 veces consecutivas en ratones (Li et al., 2017). A dicho virus se le denominó MERS-MA30-6-1-2 (SEQJD 21). En la presente invención se ha generado el cADN de longitud completa del genoma del coronavirus descrito en la SEQJD 21 adjuntada y depositada en GenBank con número de acceso MT576585. Mediante la generación de nueve fragmentos por síntesis química (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) que contenían las mutaciones presentes en el virus MERS-MA30-6-1- 2 (Figura 2A), aislado después de 30 pases en ratones Y\OPPA-knockin (MERS-MA30). Se seleccionó este modelo animal y este virus porque, en conjunto, los ratones Kl y el MERS-MA30-6-1-2 reproducen mejor en el ratón los signos clínicos observados en el ser humano.

El cADN se clonó en un BAC (Almazán et al., 2013) bajo el promotor de expresión inmediatamente temprano de citomegalovirus (CMV) y una región no traducida (UTR), y está flanqueado en el extremo 3' por las secuencias de terminación y poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) separadas de la cola poli A (con 24 residuos de adenina) por la secuencia de la ribozima del HDV (Rz).

Cada uno de estos fragmentos se clonó en un plásmido intermedio pBAC (Almazán et al., 2013) utilizando las enzimas de restricción seleccionadas (Figura 2B, Tabla 3). A continuación, se ensamblaron los diferentes fragmentos del MERS-MA30 a partir de los plásmidos intermedios pBAC, tal como se ha descrito previamente (Almazán et al., 2013), para generar el correspondiente pBAC con el genoma completo del MERS-MA30 (pBAC-MERS-MA-FL).

Además del genoma del clon MERS-MA30-6.1.2, en el que el gen ORF5 se encuentra mutado y no se expresa (Li et al., 2017), se generaron otros cADNs infectivos: uno con el gen ORF5 completo (pBAC-MERS-MA30-5FL) y otro con el gen ORF5 delecionado (pBAC-MERS-MA30-A5) (no mostrados).

2. Evaluación de la virulencia del MERS-MA30 in vivo

El MERS-CoV, que infectaba a ratones Kl sin causarles la muerte, se adaptó a crecer en estos ratones mediante 30 pases secuenciales del virus, dando lugar al virus denominado MERS-MA30 (derivado de MERS-CoV adaptado al ratón ( mouse adapted, MA). Después de este proceso, el virus causaba la muerte de los ratones Kl infectados. Posteriormente, se clonó tres veces por aislamiento de placas de lisis, y se seleccionó un clon para posteriores trabajos, que se denominó: MERS-MA30-6-1-2.

Con el objetivo de comprobar posibles cambios en la virulencia del MERS-MA30 es decir, el virus recombinante obtenido en la presente invención por síntesis química, incorporando las mutaciones adquiridas por un MERS-CoV al ser pasado 30 veces en ratones knockin (Kl), se realizó una inoculación en ratones Kl humanizados con el virus derivado por pases (MERS-MA30-6-1-2), que reproducen mejor en el ratón los signos clínicos observados en el ser humano (Li et al., 2017), y con el obtenido por síntesis química e ingeniería genética (MERS-MA30). Los ratones se inocularon intranasalmente con 1 x 10 ⁵ UFP/ratón. Se observó que las pérdidas de peso y la supervivencia fueron similares con los dos virus, indicando que el cADN infectivo que se había generado (MERS-MA30) se comportaba prácticamente igual que el virus aislado (MERS-MA30-6- 1-2), con una ligera, pero no significativa, mayor virulencia (Figura 5). 3. Construcción de los replicones ARN a partir del clon infectivo de MERS-MA30 recombinante Los datos concretos de cada uno de los genes, presentes en el pBAC, que codifica el MERS-CoV se muestran en la Tabla 1.

El pBAC-MERS-MA30-FL se utilizó como base para la obtención de los diferentes replicones y virus mutantes de MERS-MA30 (Figura 3):

MERS-MA30 (cADN completo de partida),

Replicón ARN MERS-MA30-AE (deleción del gen que codifica la proteína E),

Replicón ARN MERS-MA30-A5-AE (deleción de los genes ORFs 5 y E),

Virus muíante MERS-MA30-A [3-5] (deleción de los genes ORFs 3, 4a, 4b y 5), y Replicón ARN MERS-MA30-A[3-E] (deleción de los genes ORFs 3, 4a, 4b, 5 y E).

Para la generación del cADN infectivo del MERS-MA30-AE y del MERS-MA30-A5-AE, se encargó un fragmento de síntesis química (GeneArt, Thermo FisherScientific) de 502 bp flanqueado por los sitios de restricción /7l/SanD1 y P/723II. Este fragmento incluía las mutaciones del MERS-MA30 entre los nucleótidos 27535 y 28236 del genoma viral, la deleción de la CS de la TRS del gen que codifica la proteína E, y la deleción de los 197 primeros nucleótidos de la secuencia del gen que codifica la proteína E. Este fragmento tiene una menor longitud ya que no comprende la secuencia total del gen E. Este fragmento se insertaría en la posición 27535 y 28236 ya que hay un sitio de restricción para /7l/SandD1 (ver Figura 2B) y el otro sitio de restricción P/723II está originalmente localizado en el FS-9, que se introdujo en el pBAC-SA-F6.

Se mantuvieron los 52 últimos nucleótidos de la secuencia del gen que codifica la proteína E por incluir éstos parte de la secuencia que regula la transcripción ( transcription regulatory sequence o TRS) del gen M. El fragmento de síntesis se clonó en el plásmido intermedio pBAC-SA-F6 (posiciones 25841 a 30162 del genoma viral) para generar un pBAC-SA-F6-MA30-AE, y en el pBAC-SA-F6-MA30-A5 para generar un pBAC-SA-F6-MA30-A5-AE. El fragmento Pac\-Rsñ\ del pBAC-SA-F6-MA30-AE y del pBAC-SA-F6-MA30-A5-AE, que incluye la región /7I-P/723II, se clonó en el pBAC- MERS-MA30-FL para obtener los correspondientes pBAC-MERS-MA30-AE y pBAC- MERS-MA30-A5-AE. Las digestiones de los vectores con enzimas de restricción se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la construcción del cADN infectivo del MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5] y del MERS- MA30-D[3, 4a, 4b, 5, E] se generó, previamente, un plásmido intermedio pUC57-F5-A3- MERS-MA30 a partir de un pUC57-F5-A3-MERS (Almazan et al., 2013). El pUC57-F5- A3-MERS-MA30 incluye las mutaciones adquiridas por el MERS-MA30-6-1-2 en la región del genoma viral comprendida entre los nucleótidos 20902 y 25840, así como la deleción del gen ORF3. Esta región, flanqueada por sitios de restricción Swal y Pací, se clonó en el pBAC-MERS-MA30-FL y en el pBAC-MERS-MA30-AE para obtener un pBAC-MERS-MA30-A3 y un pBAC-MERS-MA30-A3-AE, respectivamente. Finalmente, se realizó una digestión con Pací y Kfl\/SanD1 para delecionar los genes 4a, 4b y 5, se separaron los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron los vectores digeridos. Dado que los extremos resultantes de la digestión no son cohesivos entre sí, se generaron extremos romos con la ADN polimerasa del fago T4 (New England Biolabs). Para ello, se incubaron 300 ng de cada plásmido digerido con 1 U de enzima por cada 1 pg de ADN durante 30 minutos a 37 °C en presencia de un exceso de dNTPs. Después, se inactivó la enzima con un tratamiento a 75 °C durante 20 minutos y se añadió ADN ligasa del fago T4 (Roche) para ligar los extremos, generándose los plásmidos pBAC-MERS-MA30-A[3-5] y pBAC-MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5, E]

Opcionalmente este replicón puede comprender la secuencia de polinucleótidos del gen que codifica la proteína S optimizada para su expresión en células de mamífero mediante el procedimiento que se describe en la siguiente sección.

4. Obtención de los replicones de ARN V1-CD y V1-VLP

Para generar los replicones V1-CD y V1-VLP, se generaron por síntesis química (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) dos fragmentos de 4945 bp, flanqueados por los sitios de restricción Swal y Pací (Figura 2B). Estos fragmentos, denominados Sopt-CD y Sopt-VLP contenían los nucleótidos del 20898 al 25844 del genoma del MERS-MA30, en los que la secuencia del gen que codifica la proteína S (Tabla 1, SEQJD 4) se optimizó para su expresión en humanos, usando una herramienta on-line para optimización de codones (https://en.vectort>uilder.com/tooí/codon-optimization.h tmi). En este proceso, se evitó crear nuevos sitios de restricción de entre los que se usan para el ensamblaje del cDNA del MERS-CoV (Figura 2B) (Almazan et al, 2013). De este modo, el fragmento Sopt-VLP contenía la SEQJD 3. En el caso del fragmento Sopt-CD, al optimizar la secuencia se tuvo en cuenta además que no se generasen sitios de terminación de la T7 polimerasa, tales como ATCTGTT, y se incluyeron los cambios de nucleótido que dan lugar a las sustituciones de aminoácido V1060P y L1061P. De este modo, el fragmento Sopt-CD contenía la secuencia SEQJD 7. Los fragmentos Sopt-CD y Sopt-VLP se digirieron con Swal y Pací y se clonaron en los mismos sitios del plásmido pBAC-MERS-MA30-A3-AE. Finalmente, se realizó una digestión con Pací y Kfl\/SanD\ para delecionar los genes 4a, 4b y 5, se separaron los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron los vectores digeridos. Dado que los extremos resultantes de la digestión no son cohesivos entre sí, se generaron extremos romos con la ADN polimerasa del fago T4 (New England Biolabs). Para ello, se incubaron 300 ng de cada plásmido digerido con 1 U de enzima por cada 1 pg de ADN durante 30 minutos a 37 °C en presencia de un exceso de dNTPs. Después, se inactivó la enzima con un tratamiento a 75 °C durante 20 minutos y se añadió ADN ligasa del fago T4 (Roche) para ligar los extremos, generándose los plásmidos pBAC-MERS- MA30-Sopt-CD-A[3, 4a, 4b, 5, E] y pBAC-MERS-MA30-Sopt-VLP-A[3, 4a, 4b, 5, E], que son la base para los replicones V1-CD y V1-VLP, respectivamente.

Para incluir la deleción nsp1-AD, se generaron por síntesis química (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) dos fragmentos flanqueados por los sitios de restricción Ascl y BbvCI: T7-nsp1-AD y nsp1-AD. Estos fragmentos contenían el promotor de T7 (T7P) o de CMV, respectivamente, y los nucleótidos del 1 al 3123 del genoma del MERS-MA30, además de la deleción de los nucleótidos 792 a 827 del genoma del MERS-MA30. Estos fragmentos se digirieron con las enzimas Ascl y BbvCI y se clonaron en los mismos sitios de los plásmidos pBAC-MERS-MA30-Sopt-CD-A[3, 4a, 4b, 5, E], el T7-nsp1-AD, y pBAC-MERS-MA30-Sopt-VLP-A[3, 4a, 4b, 5, E], el nsp1-AD, obteniéndose los plásmidos pBAC-MERS-MA-V1-CD y pBAC-MERS-MA-V1-VLP, respectivamente. Estos plásmidos contenían las secuencias de los replicones V1-CD y V1-VLP (Figura 4, SEQJD 9 y SEQJD 11).

Para incluir la deleción nsp1-AC, se generaron por síntesis química (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) dos fragmentos flanqueado por los sitios de restricción Ascl y BbvCI: T7-nsp1-AC y nsp1-AC. Estos fragmentos contenían el promotor de T7 (T7P) o de CMV, respectivamente, y los nucleótidos del 1 al 3123 del genoma del MERS-MA30, además de la deleción de los nucleótidos 708 a 734 del genoma del MERS-MA30

Para incluir una deleción en el gen nsp1, se generaron por síntesis química (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) dos fragmentos flanqueado por los sitios de restricción Ascl y BbvCI: T7-nsp1-A y nspl-D. Estos fragmentos contenían el promotor de T7 (T7P) o de CMV, respectivamente, y los nucleótidos del 1 al 3123 del genoma del MERS-MA30, además de una deleción de entre 27 y 36 nucleótidos entre las posiciones 528 y 848 del genoma del MERS-MA30

Las deleciones mencionadas en el gen que codifica la proteína nsp1 se pueden combinar de cualquier forma y se incluyen en el mismo fragmento que contiene el promotor T7 o CMV.

5. Transcripción in vitro del RNA del replicón V1-CD

Se siguió un protocolo previamente descrito para la transcripción in vitro de ARNs de coronavirus (Eriksson K.K. et al, 2008, Methods in Mol. Biol. 454:237-254), con pequeñas modificaciones. Todos los procesos se realizaron en condiciones y con reactivos libres de RNasas. En la reacción de transcripción se utilizó como molde 1 pg del plásmido pBAC-MERS-MA-V1-CD sin digerir, un análogo de cap Ribo m ⁷ G (Promega) y el kit RiboMAX Large Scale RNA production system (Promega). El volumen final de cada reacción fue de 50 mI, que se incubaron 2h a 30°C. Posteriormente, el DNA molde se eliminó añadiendo 2 mI de DNasa libre de RNasas e incubando la mezcla a 37°C durante 20 min. Finalmente, el RNA se precipitó con LiCI, se resuspendió en 30 mI de agua libre de RNasas y se almacenó a -80°C hasta su uso.

Para su administración en cultivos celulares, se utilizó Lipofectamina 2000 (Life Technologies) utilizando las mismas condiciones que se utilizan para transfectar DNA. Para su administración a ratones, se utilizó el reactivo in vivo-jetRNA (Polyplus transfection), siguiendo las recomendaciones del fabricante.

6. Capacidad replicativa o amplificación de los replicones derivados del MERS- MA30 en presencia o ausencia de la proteína E. La capacidad replicativa de los mutantes construidos se evaluó en células Huh-7. Estas células han sido previamente transfectadas transitoriamente con el plásmido inducible TRE-Auto-rtTA-V10-2T-E- MERS-CoV que expresa la proteína E. El medio de crecimiento contenía doxiciclina a una concentración de 1000 ng/mL para la inducción de la expresión de la proteína E. A las 5 hdt, las células se infectaron con el virus a una MDI (multiplicidad de infección) de 0,001 y se monitorizó la infección durante las 72 horas.

Se han desarrollado otros procedimientos para la generación de líneas celulares empaquetadoras, basadas en mutantes de la proteína E que inactivan la toxicidad de esta proteína y proporcionan replicones ARN derivados del MERS-CoV empaquetados con alta eficacia.

En células crecidas en medio sin doxiciclina, es decir, en ausencia de la proteína E añadida externamente, los virus MERS-MA30, y MERS-MA30-A [3, 4a, 4b, 5] siguieron cinéticas de crecimiento muy similares, sin diferencias significativas (Figura 6). En el crecimiento del muíante MERS-MA30-A [3, 4a, 4b, 5], se observó una reducción del título desde las 24 horas post infección (hpi) comparado con el del virus MERS-MA30, posiblemente como consecuencia de la ausencia de los genes accesorios. Los replicones MERS-MA30-AE y MERS-MA30-A [5, E] se comportaron de manera similar al replicón MERS-CoV-DE, que no se propaga en ausencia del gen que codifica la proteína E, datos no mostrados. Por último, en el crecimiento del replicón MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E] se observó una disminución significativa a las 24 y 48 hpi respecto al crecimiento de los otros replicones (MERS-MA30-AE y MERS-MA30-A[5,E]), lo que sugiere que la deleción conjunta de los genes 3, 4a, 4b, 5 y E tuvo un mayor efecto que la deleción del gen que codifica la proteína E únicamente, o que la deleción conjunta de los genes 5 y E (Figura 6).

No se observaron grandes diferencias en los títulos del muíante MERS-MA30- A[3,4a,4b,5], que solamente aumentaron de 2 a 4 veces en presencia de la proteína E, y se mantuvieron por debajo de los títulos del virus MERS-MA30 (Figura 6). Sin embargo, los títulos de los replicones MERS-MA30-AE y MERS-MA30-A[5, E] se incrementaron en presencia de la proteína E, hasta alcanzar niveles similares al del virus MERS-MA30 a las 72 hdi. Pese a disponer de la proteína E, el replicón MERS-MA30- D[3, 4a, 4b, 5, E] mostró un crecimiento más lento que los replicones MERS-MA30-AE y MERS-MA30-A[5,E] No obstante, a tiempos tardíos en la infección, alcanzó títulos similares a los de los virus MERS-MA30, en presencia de la proteína E. La complementación con la proteína E en trans permite a los replicones con el gen que codifica la proteína E delecionado alcanzar a tiempos tardíos en la infección títulos similares a los de los virus de los cuales derivan. Por otra parte, la deleción de los genes accesorios 3, 4a, 4b, y 5 dio lugar a una atenuación en el crecimiento del muíante MERS- MA30-A[3,4a,4b,5] y del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E], en comparación con el virus MERS-MA30 y el replicón MERS-MA30-AE, respectivamente, que incluyen estos genes. La ausencia del gen 5 no pareció afectar al crecimiento del MERS-CoV en cultivos celulares, en el caso del replicón MERS-MA30-A[5,E]

7. Análisis de la producción de viriones por el replicón MERS-CoV-DE y en comparación con el virus MERS-CoV WT.

Se llevó a cabo un estudio comparativo de la morfogénesis del virus MERS-CoV WT y los replicones MERS-CoV-DE. Para ello, se infectaron células Huh-7, y a las 17 hdi se incluyeron en resina y se realizaron cortes de las preparaciones para su observación por microscopía electrónica de transmisión (MET) (Figura 7).

El MERS-CoV-DE y el MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] formaron viriones dentro de la célula que, aparentemente, eran similares a los que forma el MERS-CoV WT, aunque solo se muestran las VLPs formadas por el MERS-CoV-DE. En las células infectadas con una MDI 1 , el MERS-CoV WT mostró un alto efecto citopático, observándose vesículas de virus llenas de viriones con forma esférica, mientras que las vesículas del replicón MERS-CoV-DE fueron menos frecuentes, con formas alargadas y con un menor número de viriones inmaduros. En las células infectadas con una MDI de 0,1 se observó algo similar (resultados no mostrados), aunque el efecto citopático en la infección por el MERS-CoV WT fue menor comparado con la infección a una MDI 1. Estos resultados demostraron que el replicón MERS-CoV-DE formó estructuras poliméricas con elevado potencial inmunogénico.

8. Efecto de la atenuación de los mutantes del MERS-MA30 en ratones Kl.

La patogenicidad del virus MERS-MA30-A[3,4a,4b,5] y de los replicones MERS-MA30- DE, MERS-MA30-A[5,E] y MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] se evaluó en ratones Kl (Li et al., 2017) de 16 semanas de edad. Como virus virulento de referencia se utilizó el MERS-MA30. De cada virus o replicón, se inocularon 1 x 10 ⁴ UFP intranasalmente, y la pérdida de peso y la supervivencia se monitorizaron durante los siguientes 13 días (Figura 8).

Todos los ratones inoculados con el virus MERS-MA30 perdieron peso y murieron entre los 6 y 8 ddi. Por el contrario, los ratones infectados con el virus MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5] o con los replicones MERS-MA30-AE, MERS-MA30-A[5,E] o MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E], no perdieron peso, y todos ellos sobrevivieron, indicado que todos los mutantes de deleción generados estaban atenuados. Se tomaron muestras de los pulmones de los ratones inoculados con el MERS-MA30 y el MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5, E] a los 3 y 6 dpi. A partir de esas muestras se analizó el título (Figura 9), la replicación y la transcripción viral en pulmón del MERS-MA30, como un control, y del MERS-MA30-A[3, 4a, 4b, 5, E] (Figura 10). Mientras que en los pulmones de los ratones infectados con el virus MERS-MA30 se detectaron altos títulos a 3 dpi que disminuyeron a los 6 dpi, en los pulmones de los ratones infectados con el replicón MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E] no se observó virus mediante el ensayo de detección de formación de focos por inmunofluorescencia (Figura 9). Este resultado fue consistente con los resultados previos in vitro en los que demostró que en ausencia del gen que codifica la proteína E el MERS-CoV no se propaga. Así mismo, los niveles de replicación y transcripción del replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] fueron significativamente inferiores a los del virus MERS-MA30 (Figura 10), dado que el replicón MERS-MA30- A[3,4a,4b,5,E] no se propaga a otras células in vivo y solamente se replica en aquellas células infectadas inicialmente.

9. Protección proporcionada por los mutantes de deleción del MERS-MA30 en ratones Kl.

Los ratones inmunizados con los distintos mutantes de deleción se desafiaron a los 21 días después de la inmunización (ddin) con una dosis letal del MERS-MA30 (1 x 10 ⁵ UFP por ratón) (Figura 11). Los ratones control no inmunizados perdieron peso y murieron entre los 6 y 7 ddi. Sin embargo, todos los ratones inmunizados con alguno de los mutantes de deleción sobrevivieron al desafío, y ninguno de ellos sufrió pérdidas de peso significativas.

Durante el desafío se tomaron muestras a 2, 4 y 6 ddd (días después del desafío) del pulmón de los ratones desafiados para analizar la protección conferida por el MERS- MA30-A[3,4a,4b,5,E], y se utilizaron para medir la replicación y la transcripción viral, y el título de los virus. En los pulmones de los ratones no inmunizados se detectaron niveles de replicación y transcripción elevados que se reducían algo más de diez veces a los días 4 y 6, pero que eran considerablemente altos (Figura 12). Por el contrario, los niveles de replicación y transcripción en los pulmones de los ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] fueron significativamente menores a todos los tiempos después del desafío que se analizaron (Figura 12). Interesantemente, no se detectó crecimiento del virus del desafío en los pulmones de los ratones inmunizados en ningunos de los tiempos después del desafío (2, 4 y 6 días después del desafío) (Figura 13), por lo que se puede afirmar que el MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] confiere una inmunidad esterilizante, es decir, que no permite crecer al virus después de la inmunización.

Los niveles de anticuerpos neutralizantes se determinaron en el suero de ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] y en ratones control (sin el replicón) a 0 y 21 ddin mediante un ensayo de neutralización. Los títulos de anticuerpos aparecen expresados como la dilución más elevada que muestra una completa neutralización del efecto citopático en un 50% de los pocilios (TCID50) (Figura 14). No se detectaron anticuerpos neutralizantes en el suero de ratones no inmunizados o ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] a 0 ddin. Sin embargo, a 21 ddin, los ratones inmunizados con el replicón MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] mostraron niveles detectables de anticuerpos neutralizantes en comparación con los ratones no inmunizados tras una sola inmunización.

En conjunto, estos resultados demostraron que el virus MERS-MA30-A[3,4a,4b,5] y los replicones MERS-MA30-AE, MERS-MA30-A[5,E] y MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] indujeron protección en el modelo experimental de ratón Kl frente a una dosis letal del virus MERS-MA30, y que el replicón ARN derivado del MERS-MA30-A[3,4a,4b,5,E] es un candidato a vacuna seguro, eficaz y muy prometedor. Resultados similares se obtuvieron con el modelo de ratón transgénico humanizado (K18) y el replicón con la secuencia del virus humano, no adaptado a ratón.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente memoria comprende las siguientes secuencias:

SEQJD 1: Secuencia de nucleótidos del vector que contiene el replicón pBAC-MERS- CoV-A[3,4a,4b,5,E] completo. Incluye la secuencia del pBAC (nucleótidos 1 a 7889), replicón de ARN (nucleótidos 7890 a 35838) y secuencia del pBAC (nucleótidos 35839 a 36179)

SEQJD 2: Secuencia de nucleótidos del vector que contiene el replicón pBAC-MERS- MA30-A[3,4a,4b,5,E] completo. Incluye la secuencia del pBAC (nucleótidos 1 a 7889), replicón de ARN (nucleótidos 7890 a 35838) y secuencia del pBAC (nucleótidos 35832 a 36173). SEQJD 3: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-MA30- CoV con los codones optimizados para su expresión en células de mamífero.

SEQJD 4: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-MA30- CoV con los codones no optimizados para su expresión en células de mamífero.

SEQJD 5: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-CoV con los codones optimizados para su expresión en células de mamífero.

SEQJD 6: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-CoV con los codones no optimizados para su expresión en células de mamífero.

SEQJD 7: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-MA30- CoV con los codones optimizados para su expresión en células de mamífero y las modificaciones 24633_24634 delins CC y 24637_24638 delins CC.

SEQJD 8: Secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína S de MERS-CoV con los codones optimizados para su expresión en células de mamífero y las modificaciones 24633_24634 delins CC y 24637_24638 delins CC.

SEQJD 9: Secuencia de nucleótidos del replicón MERS-MA30-V1-CD, definido químicamente.

SEQJD 10: Secuencia de nucleótidos del replicón MERS-CoV-V1-CD, definido químicamente.

SEQJD 11: Secuencia de nucleótidos del replicón MERS-MA30-V1-VLP.

SEQJD 12: Secuencia de nucleótidos del replicón MERS-CoV-V1-VLP. SEQJD 13: Secuencia de nucleótidos del promotor T7P

SEQJD 14: Secuencia de nucleótidos del 5 ^' UTR

SEQJD 15: Secuencia de nucleótidos del MISC

SEQJD 16: Secuencia de nucleótidos de DLP SEQJD 17: Secuencia de nucleótidos de P2A

SEQJD 18: Secuencia de nucleótidos de 3 ^' UTR

SEQJD 19: Secuencia de nucleótidos de la cola PoIyA

SEQJD 20: Secuencia de nucleótidos del terminador T7

SEQJD 21: Secuencia de nucleótidos del virus MERS-MA30. SEQJD 22: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) VS-EcoRI-E-MERS- rtTA-V10-2T

SEQJD 23: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) RS-EcoRI-EMERS- rtTA-V10-2T

SEQJD 24: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) RS-E-MERS SEQJD 25: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) VS-TRE-Auto-2380 SEQJD 26: Secuencia de nucleótidos del cebador (sondas Taqman) gARN-MERS SEQJD 27: Secuencia de nucleótidos del cebador (sondas Taqman) sgmARN-N-MERS SEQJD 28: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) VS MERS gARN SEQJD 29: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) RS MERS gARN SEQJD 30: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) Leader sgARN SEQJD 31: Secuencia de nucleótidos del cebador (primer PCR) sgARN-N

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