Composition cosmétique à base de cellules de Rhodiola Rosea

La présente invention a pour objet une composition cosmétique à base de cellules de Rhodiola Rosea et de Xilytol, en particulier pour pour améliorer et/ou réguler l'équilibre microbiologique de la flore cutanée d'une zone de la zone de peau humaine.

Améliorer et contrôler la flore cutanée est un problème essentiel en cosmétique car il permet d'obtenir un rendu de la peau plus lisse et plus jeune.

Ainsi que stipulé dans WO2019/149754, paragraphes 0056 à 0058:

"La peau est un organe barrière complexe qui héberge à sa surface de nombreux microorganismes (bactéries, champignons, virus). Cette microflore colonisant le stratum corneum constitue le microbiote cutané. Il est acquis à la naissance et évolue pour atteindre un état d'équilibre à l'âge adulte. Sa composition et son abondance sont influencées par la génétique et le mode de vie. Ceci garantit le caractère unique du microbiote entre les individus qui peut ainsi être qualifié d'empreinte microbiologique. Les microorganismes et leur hôte vivent en parfaite harmonie. Un microbiote équilibré est sans danger et bénéfique pour son hôte. Parmi la diversité de la flore cutanée, quatre groupes principaux de bactéries (ou phyla) ont été caractérisés : Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes avec trois espèces prédominantes : Corynebacteria, Propionibacteria et Staphylococci.

Le microbiote participe au développement et au maintien de l'équilibre de son hôte. Les microorganismes et la barrière cutanée agissent en synergie pour protéger la peau des agressions extérieures. La flore cutanée joue un rôle fondamental puisqu'elle confère à la peau immunité et protection face aux colonisateurs pathogènes potentiels. Le microbiote cutané est aujourd'hui considéré comme une véritable unité fonctionnelle de la peau qui participe à sa santé et à sa beauté. Cependant, cet équilibre est constamment menacé par divers facteurs, intrinsèques et extrinsèques, pouvant altérer la composition du microbiote et la fonction barrière de la peau. Ce déséquilibre du microbiote, ou dysbiose, perturbe les coopérations microbe-microbe et microbe-hôte et peut conduire à des désordres cutanés. Il est donc primordial de maintenir l'équilibre de l’écosystème cutané pour arborer une peau de qualité exceptionnelle."

De nombreuses solutions ont déjà été proposées / suggérées pour assurer un certain contrôle de la flore cutanée, et ainsi contrôler d'une certaine manière les odeurs générées par l'homme.

L'utilisation d'extrait de Rhodiola en cosmétique a déjà été proposée.

Par exemple, le document JP2000/128729 décrit une composition cosmétique hydratante et donnant un effet "clair" à la peau comprend un extrait de plante de la famille Rhodiola, dont les espèces Kiringen Keikeiten (Rhodiola algida/Aomi, Haibei, Kaisei), Karako Redkeiten (Rhodiola algida var. Tangutica/ Aomi, Sichuan), Nishikawa Kokeiten (Rhodiola alsia/Sichuan), Koza Béni Kageten (RHODIOLA dumulosa/Sichuan, Gansu), Kageten (RHODIOLA euryphylla, Tibet), Nagachifukukeiten (RHODIOLA fastigitaa, Tibet), Chorinkokeiten (Rhodiola Gelida/Utenyama), Kageten (RHODIOLA henryi/Gansu, Henan, Hubei, Sichuan, Guizhou), RHODIOLA hetero donta/Xinjiang, Tibet, Kageten (RHODIOLA Kirirowii/Hebei, Shanxi, Yunnan, Sichuan, Tibet), RHODIOLA quadrifida/Gansu, Aomi, Xinjiang, Sichuan, Tibet; , Sekiji Bcnkcitcn (RHODIOLA sacra, Tibet), Zokukeiten (RHODIOLA scabrida/ Sichuan, Tibet), RHODIOLA wallichiana, Yunnan, Tibet, RHODIOLA wallichiana et Rhodiola cholaensis/Aoumi, Tibet, Sichuan, Yunnan.

Il n'est pas fait mention dans ce document à l'utilisation de cellules végétales de Rhodiola enrichies en Xylitol, en particulier pour contrôler le microbiote cutané. Des compositions anti-rides comprenant un extrait de Rhodiola Rosea en tant qu'un agent anti-ride à utiliser en combinaison avec d'autres sont par exemple enseignées dans CN103784376, CN103690406, CN105456114, etc. Ces documents montrent que les extraits de Rhodiola Rosea ne sont pas considérés en tant que tels comme suffisants pour traiter le problème de rides.

L'extrait de Rhodiola Rosea n'est donc considéré comme efficace qu'en combinaison avec un autre extrait pour le traitement anti-ride.

Diverses méthodes d'extractions existent, par exemple en utilisant des étapes de broyage, suivi d'étapes d'extraction en utilisant un ou des solvants.

Un procédé d'extraction particulier applicable à des végétaux est décrit dans le document EP2575993 (qui correspond à WO2011/155829; inventeurs Robert Verpoorte et al), ce procédé utilisant un solvant eutectique puissant un sucre ou un alcool choisi dans une famille comprenant le xylitol, un acide organique, et un composé inorganique. Cette étape d'extraction revient à faire éclater les cellules végétales pour en retirer l'un ou l'autre principe actif.

Dans ce procédé d'extraction de matières d'un matériel biologique, on traite le matériel biologique dans un solvant eutectique profond (DES). Le solvant eutectique est par exemple la combinaison d'un acide organique naturel (tel qu'acide citrique, acide lactique, etc.) et d'un sucre ou alcool de sucre (tel que sucrose, glucose, sorbitol, xylitol, etc.). Dans ce procédé, l'extraction de composés biologiques d'une matière biologique s'opèrent par leur dissolution dans le solvant eutectique. Dans le tableau 1 de ce document, la composition de solvants eutectiques profonds (DES) est donnée. Dans les compositions des deux solvants eutectiques comprenant du xylitol, les solvants comprennent au moins de la choline en excès molaire et en poids par- rapport au xylitol, et un large excès molaire d'eau par rapport à la quantité molaire de Xylitol.

Dans le document "Natural Deep Eutectic Solvent Extraction of Flavanoids of Scutellaria baicalensis as a Replacement for Conventional Organic Solvents", Robert Verpoorte et al, Molecules 2020, 25, 617, il est fait référence que pour assurer une extraction et solubilisation optimale de flavanoîdes avec les NADES (NAtural Deep Eutectic Solvents - Solvants Eutectiques Profonds NAturels), il y a lieu de réduire la viscosité des solvants NADES en ajoutant une quantité d'eau, mais ceci rend alors plus difficile l'étape de récupération des métabolotes présent dans le NADES.

Comme signalé dans l'article "Natural Deep Eutectic Solvents as a New Extraction Media for Phenolic Metabolites in Carthamus tinctorius L.", Robert Verpoorte et al, Analytical Chemistry 2013, 85, 13, 6272-6278, (accessible via le dossier EP2575993 du Registre de l'Office Européen des Brevets), les conditions d'extraction optimale pour les NADES sont 1 heure, rapport entre le poids de matière végétale et le solvant de 30mg/ml. Un très large excès de solvant est donc requis. La matière végétale est transformée en poudre dans un mélangeur à azote liquide.

Le processus d'extraction par solvant eutectique profond revient à dissoudre des métabolites peu ou pas solubles dans l'eau, cette étape d'extraction requérant alors un large excès de NADES par rapport à la quantité de métabolites à dissoudre. Une étape d'extraction va à l'encontre d'une étape d'enrichissement de cellules végétales en xylitol, qui permet une application contrôlée des métabolites et du xylitol présent dans les cellules de Rhodiola rosea.

Le document CN106520665 décrit la culture in- vitro de cellules de Rhodolia Rosea dans des milieux de culture enrichis d'hormones végétales. Ce milieu de culture est soumis ensuite à une étape d'extraction au moyen d'un solvant du type alcool. Le produit ainsi obtenu est également un extrait alcoolique.

Par le document CN101444456, l'utilisation cosmétique du xylitol en tant qu'agent hydratant est décrite, en combinaison avec un acide gras, un émulsifiant et de l'eau. Par le document "Plant cell culture as emerging technology for production of active cosmetic ingredients", Vasil Georgiev et al, Engineering in Life Sciences, Wiley, volume 18, no 11, pages 779 à 798, on connaît l'utilisation de cultures de cellules végétales pour la préparation d'agents cosmétiques actifs. Dans cet article, il est fait référence à la production d'extrait de cellules de Rhodiola rosea cultivées in-vitro, cet extrait revendiquant des propriétés anti-oxidantes.

Par le document CN110037980, on connaît une composition anti-ride comprenant un extrait de cellules souches humaines, enrichi d'un lysat de cellules de Rhodiola rosea et d'un lysat de cellules de fleur de prunier. Les lysats sont préparés par désintégration des membranes et par lyophilisation. La composition anti-ride ne contient pas de cellules de Rhodiola rosea non broyées. Les exemples comparatifs 1 à 6 de ce document montrent l'importance de la présence tous les ingrédients pour obtenir de bonnes propriétés anti-oxidantes et de bonnes propriétés anti-âges.

Le produit "Super Moisture Balm" commercialisé en 2011 les laboratoires Clarins a pour objet un baume super hydratant à base de hyaluronate de calcium et d'herbe de bison. La compostion aqueuse comprend de nombreux composés, dont du xylitol, du glycérol et des extraits de racines de Rhodiola rosea.

Le demandeur a maintetenant remarqué que l'utilisation de cellules dédifférentiées de Rhodiala Rosea non broyées contenant à l'intérieur de leur enveloppe ou paroi cellulaire du Xylitol permettait en tant que tel d'avoir un effet pour améliorer et /ou contrôler la flore cutanée sur une période de temps de plusieurs jours, tout en assurant un effet hydratant pour les cellules de la peau.

Cette solution n'est ni décrite, ni suggérée dans les solutions proposées dans l'état de la technique.

L'invention a pour objet une composition cosmétique au moins partiellement aqueuse contenant au moins (a) des cellules dédifférentiées de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en xylitol et présentant dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire du xylitol, et (b) un support pour application cosmétique. Cette composition est pour une application topique.

Selon des formes avantageuses de la composition suivant l'invention, la composition présente une ou plusieurs des caractéristiques suivantes:

~ la composition contient au moins (a) des cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en xylitol dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire, (b) du xylitol hors du volume interne des cellules, (c) de la glycérine et (d) un support pour application cosmétique.

- Avantageusement, le rapport en poids Xylitol / glycérine de la composition est de 1 :5 à 1 :25, de préférence de 1 :10 à 1 :20.

- la composition contient en outre (e) un broyât de cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea. Avantageusement, le broyat de cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea est un broyât de cellules de rhodiola Rosea effectué en présence de Xylitol et de glycérine, le rapport en poids Xylitol / glycérine étant avantageusement de 1 :5 à 1 :25, de préférence de 1 :10 à 1 :20.

- le rapport en poids entre les cellules non broyées, dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea enrichies au moins en xylitol dans leur volume interne, et le broyat de cellules dedifférentiées et élicitées de Rhodiola Rosea est compris entre 1:10 et 10:1.

- les cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en xylitol dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire présentent sur leur" paroi cellulaire au moins une ou des zones comprenant du xylitol et de la glycérine. - les cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en xylitol dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire comprennent au moins des phytoalexines et du xylitol, le rapport en poids xylitol ! phytoalexines dans le volume interne des cellules défini par leur paroi cellulaire étant supérieur à 0,3, avantageusement supérieur à 0,5, de préférence supérieur à 1.

- les cellules dédifférentiées, et avantageusement élicitées, de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en Xylitol et présentant dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire du Xylitol sont des cellules préparées en séparant de leur milieu de culture, un cal comprenant des cellules dédifférentiées, et avantageusement élicitées, et en mélangeant ce cal de cellules de Rhodiola Rosea avec du xylitol ou une composition liquide aqueuse contenant du xylitol, le rapport en poids cal aqueux ! Xylitol étant supérieur à 1 : 1 (avantageusement supérieur à 2 : 1 , de préférence compris entre 5:1 et 10:1) et étant adapté à la teneur en eau du cal pour éviter toute cristallisation du xylitol en mélange avec le cal à une température comprise entre 15 et 40°C.

- le cal est mélangé avec du xylitol en poudre, avec un rapport en poids cal aqueux / xylitol adapté pour assurer la dissolution totale du xylitol à une température comprise entre 15 et 40°C dans l'eau contenue dans le cal.

- le cal après mélange son mélange avec du xylitol, est mélangé à du glycérol, la rapport en poids glycérol / xylitol étant supérieur à 0,5 : 1, avantageusement supérieur à 1 : 1, de préférence supérieur à 10: 1; en particulier compris entre 10:1 et 50:1.

- le cal après mélange avec du xylitol et du glycérol est soumis à un broyage partiel, de manière à ce qu’au moins 50% en poids des cellules dédifférentiées de Rhodiola Rosea aient une paroi cellulaire dans un état non broyé. - le cal de cellules dédifférentiées, et avantageusement élicitées, éventuellement soumise à un broyage, avantageusement mélangé à du glycérol est soumis à une élicitation à pression atmosphérique, à une température de 20 à 40°C, et dans de l'air avec un taux d’humidité relative de plus de 50% , avantageusement de plus de 75% enrichi en CO2 pour que sa teneur en CO2 soit comprise entre 3 et 10% en volume, comprenant au moins deux étapes d'illumination dans la gamme de longueur d'ondes comprise entre 400 et 720nm avec chacune une durée de 20 à 120 minutes avec une intensité de plus de 1000 lux, avantageusement de plus de 10000 lux et séparée entre elles par- une période d'obscurité de moins de lOOlux de durée comprise entre 20 et 60minutes.

- le cal de cellules dédifférentiées et élicitées de Rhodiola Rosea, après séchage à - 40°C et sous une pression de 100 Pa ou inférieure à 100 Pa, pour obtenir un cal séché présentant une teneur en humidité inférieure à 0,5% en poids, contient plus de 0,5% en poids de mélange de tyrosol et de Salidroside par rapport au poids du cal après séchage. Avantageusement, le cal séché contient plus de 0,5% en poids de Salidroside, de préférence de 0,6% à 1,2% en poids, et plus de 0,1% en poids de tyrosol, de préférence de 0,2% à 0,6% en poids, par rapport au poids du cal après séchage ou cal séché.

- la composition contient un reste de milieu de culture comprenant des vitamines, avantageusement une vitamine B, en particulier de la vitamine B7 et/ou de la vitamine B1 et/ou de la vitamine B3 et/ou de la vitamine B4 et/ou de la vitamine B6 et / ou un mélange de telles vitamines.

- la composition contient de 0,1 à 10% en poids de cellules dédifférentiées de Rhodiola Rosea non broyées enrichies au moins en xylitol et présentant dans leur volume interne défini par leur paroi cellulaire du xylitol. - les cellules dédifférentiées de Rhodiola Rosea, avant mélange avec du xylitol, sont soumises à un cycle d’élicitation dans leur milieu de croissance, ledit cycle d'élicitation comprend , et avantageusement élicitées, éventuellement soumise à un broyage, avantageusement mélangé à du glycérol est soumis à une elicitation à pression atmosphérique, à une température de 20 à 40°C, et dans de l'air avec un taux d'humidité relative de plus de 50% , avantageusement de 75% ou de plus de 75% enrichi en CO2 pour que sa teneur en CO2 soit comprise entre 3 et 10% en volume, comprenant au moins deux étapes d'illumination dans la gamme de longueur d'ondes comprise entre 400 et 720nm avec chacune une durée de 20 à 120 minutes avec une intensité de plus de 1000 lux, avantageusement de plus de 10000 lux et séparée entre elles par une période d'obscurité de moins de lOOlux de durée comprise entre 20 et 60 minutes

- la composition est adaptée pour assurer une amélioration de l'équilibre microbiologique de la flore cutanée, tout en assurant avantageusement une action anti-age ou anti viellissement et/ou une action protectrice contre les UV et/ou une activité antioxydante et/ou antibactérienne.

- une combinaison de telles caractéristiques.

L'invention a encore pour objet un traitement cosmétique, non thérapeutique, d'une zone de la peau d'un être humain pour améliorer et/ou réguler l'équilibre microbiologique de la flore cutanée de cette zone, dans lequel on applique sur ladite zone une composition cosmétique selon l'invention telle que décrite ci- avant. Ce traitement cosmétique assure également avantageusement un traitement cosmétique anti-age ou anti viellissement et/ou une action cosniétque protectrice contre les UV et/ou une activité cosmétique antioxydante et/ou une activité cosmétique antibactérienne.

Les cellules végétales dédifférenciées de Rhodiola Rosea peuvent être obtenues à partir de matériel végétal issu de plante entière ou de partie de plante comme les feuilles, les tiges, les fleurs, les pétales, les racines, les fruits, leur peau, l’enveloppe les protégeant, les graines, les anthères, la sève, les épines, les bourgeons, l’écorce, les baies, et des mélanges de ceux-ci. Les celleules végétales dédifférenciées proviennent toutefois de préférence de racines de Rhodiola Rosea, en particulier de radicelles de Rhodiola Rosea.

Les cellules végétales dédifférenciées utilisables selon l'invention peuvent être obtenues à partir de végétaux obtenus par culture in vivo ou issu de culture in vitro.

Par culture in vivo on entend toute culture de type classique c'est à dire en sol à l'air libre ou en serre ou encore hors sol ou en milieu hydroponique.

Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permet de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. La pression de sélection imposée par les conditions physicochimiques lors de la croissance des cellules végétales in vitro permet d'obtenir un matériel végétal standardisé, exempt de contaminations et disponible tout au long de l'année contrairement aux plantes cultivées in vivo.

Préférentiellement selon l'invention on utilise des cellules végétales dédifférenciées issues de culture in vitro. L'élicitation des cellules est de préférence opérée avec les cellules dans un milieu de culture.

Les cellules végétales dédifférenciées utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode connue de l’art antérieur. A cet égard on peut citer les méthodes décrites par E.F. George et P.D. Sherrington dans Plant Propagation by tissue culture, handbook and directory of commercial laboratories (Exegetics Ltd 1984).

Les milieux de culture utilisables selon l'invention sont ceux généralement connus de l’homme du métier. On peut citer à titre d'exemples les milieux de Gamborg, Murashige et Skoog, Heller, White etc.... On trouvera dans "Plant Culture Média : formulations and uses" de E.F. George, DJM Puttock et H.J George (Exegetics Ltd 1987, tome 1 & 2) des descriptions complètes de ces milieux.

Préférentiellement selon l'invention on prépare les cellules végétales dédifférenciées cultivées sur milieu de Gamborg.

Des particularités et détails de compositions suivant l'invention ressortiront de la description suivante d'exemples de réalisation donnés à titre d’exemple uniquement,

Des tests démontrant l’efficacité de compositions cosmétiques selon l'invention seront décrits ci-après.

Dans ces exemples, on a utilisé des cellules de Rhodiola Rosea élicitées.

Ces cellules ont été préparées de la manière suivante :

Etape 1 : Préparation de cellules dédifférenciées de Rhodiola Rosea et cultivées dans un milieu de culture in vitro type Gamborg.

On a prélevé des cellules de radicelles de Rhodiola Rosea (radicelles avec un diamètre de moins de 2mm). Cette étape de préparation de cellules dédifférenciées de Rhodiola Rosea a été réalisée de manière classique, avec des étapes successives de repiquage, à partir de radicelles.

Le milieu de culture utilisé est un milieu Gamborg B5 complet (G5893) commercialisé par Sigma-Aldrich (Allemagne). D'autres milieux de culture sont possibles.

Etape 2 : repiquage des cellules dédifférenciées de l'étape 1 dans un milieu de culture in vitro pour le développement et félicitation des cellules. Le développement avec élicitation des cellules de l'étape 1 a été opéré dans un milieu in vitro (Gamborg B5) sous une atmosphère gazeuse contenant de l’oxygène et du CO ₂ (air enrichi en CO ₂ pour que sa teneur en CO ₂ soit de 8% en volume) selon un cycle comprenant 100 périodes de faible luminosité avec une luminosité de moins de 10 lux ( de 1 à 5 lux) pendant 30 minutes sous une atmosphère constituée d'air humide (humidité relative de 85%) enrichi de CO ₂ (pour que la teneur en CO? soit de 8% en volume) et présentant une température de 30°C, ces périodes de développement/élicitation sous faible (voire sans) luminosité étant séparées l’une de l’autre par une période de luminosité de plus de 100000 lux (gamme de longueur d'ondes comprises entre 400 et 720nm) pendant 1 heure sous une atmosphère constituée d'air humide (humidité relative de 85%) enrichi en CO ₂ (pour que la teneur en CO ₂ de l'atmosphère soit de 8% en volume) et présentant une température de 35°C. Le passage d’un état d'obscurité à un état éclairé et inversément est réalisé par le déplacement d'une paroi opaque. Cette culture in vitro sous élicitation est opérée en chambre blanche.

Etape 3 : Extraction du cal des cellules dédifférenciées et élicitées en milieu de culture in vitro, par- filtration du milieu de culture suivi de plusieurs étapes de lavage à l'eau, opérées pour ne pas détruire la structure des membranes des cellules. Le cal lavé a été égoutté pendant 45 minutes.

Ce cal (nommé CAL 1) sera utilisé en partie pour la préparation d'une composition comparative.

Une partie de ce cal a été soumise à séchage par lyophilisation à -4Û“C pour détermination de la teneur en Saliroside et tyrosol du cal après séchage par UPLC chromatographie (chromatographie liquide à haute performance). L'opération de séchage est opérée par liophilisation sous vide (lOOPa et moins si nécessaire, température de -40°C), pour obtenir un produit poudreux avec une teneur en eau de moins de 1,5% en poids. Au cas, où la texture du produit séché n'est pas optimale, il peut être soumis à un broyage. Pour cette chromatographie 0,3 g de poudre est dissous dans 25ml d'un solvant constitué d'eau 90% en poids et d'acétonitrile 10% en poids. Après dissolution, la solution est filtrée sur un filtre à 0,45 i.im.

La chromatographie UPLC de l'extrait de Rhodiola a été analysée en utilisant un système de chromatographie ACQUITY UPLC commercialisée par Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, MA 01757, Etats-Unis d'Amérique. Le chromato graphe comportait une colonne BEH C18, 100 mm de longueur, de diamètre intérieur de 2,1mm, particules de garnissage sphériques de 1,8μm de diamètre. Le volume de solution à analyser injecté dans la colonne était de 2 μl. on introduit ensuite dans la colonne un solvant constitué d’eau et d'acétonitrile à un débit de 0,6ml/minute à 75°C, pendant 14 minutes, tout en accroissant de manière graduelle la concentration en acétonitrile (concentration variant de manière graduelle de 2,5% en poids à 100% en poids sur 14 minutes).

Le tyrosol et le salidroside sont détectée par UV à 221nm au temps 30 secondes et 90 secondes. Sur base de cette chromatographie il a été possible de calculer une teneur de 0,8% en poids de salidroside et de 0,3% en poids de tyrosol, par rapport au poids sec du cal.

Etape 4 : Mélange au cal égoutté de cellules dédifférenciées et élicitées de Rhodiola Rosea d'une quantité de xylitol.

La quantité de xylitol ajoutée (en poudre) est telle que le rapport en poids Xylitol / poids du cal égoutté (toujours humide) est de 1 : 8. Le mélange est effectué de manière douce avec une spatule jusqu'à solubilisation complète du xylitol.

Etape 5 : repiquage et élicitation le cal de l'étape 4 est repiqué dans un milieu de culture Gamborg B 5 pour être soumis à une élicitation. Cette elicitation a été opérée dans un milieu in vitro (Gamborg B5) sous une atmosphère gazeuse contenant de l’oxygène et du CO ₂ (air enrichi en CO ₂ pour que sa teneur en CO ₂ soit de 8% en volume) comprenant un cycle constitué de deux étapes d'élicitation par rayonnement dans la gamme 400-720 nm sous une atmosphère constituée d'air humide (humidité relative de 85%) enrichi de CO ₂ (pour que la teneur en CO ₂ soit de 8% en volume) et présentant une température de 30°C, chaque étape d'élicitation ayant une durée de 90minutes avec une luminosité de 10000lux, lesdites deux étapes d'élicitation étant séparées l'une de l'autre par une étape de repos avec une luminosité de lOOlux (gamme d'ondes entre 400 et 720nm) pendant 45minutes sous une atmosphère constituée d'air humide (humidité relative de 85%) enrichi en CO ₂ (pour que la teneur en CO ₂ de l'atmosphère soit de 8% en volume) et présentant une température de 35°C. Le passage d'un état d'obscurité à un état éclairé et inversément est réalisé par le déplacement d'une paroi opaque. Cette culture in vitro sous élicitation est opérée en chambre blanche,

Etape 6 : Extraction du cal des cellules dédifférenciées et élicitées en présence de Xylitol en milieu de culture in vitro, par filtration du milieu de culture suivi de plusieurs étapes de lavage à l'eau, opérées pour ne pas détruire la structure des membranes des cellules élicitées en présence de xylitol. Le cal lavé a été égoutté pendant 45 minutes.

Etape 7 : ajout de glycérol et mélange du cal avec le glycérol

On ajoute une quantité de glycérol au cal à raison d'une quantité correspondant à 15 fois la quantité de xylitol ajoutée à l'étape 4 .

A l'issue de cete étape 7, on obtient des cellules de Rhodiola enrichies en xylitol protégées par du glycérol et/ou des amas de telles cellules protégées par du glycérol. Ce mélange est appelé ci-après "Rhodiola G". Etape 8 : broyage partiel du cal avec xylitol et glycérol.

Le broyage est partiel pour obtenir un mélange de cellules broyées et de cellules non broyées. Ce broyage partiel peut par exemple être opéré en divisant le cal en deux parties, une première partie représentant 20% en poids du cal étant soumise à broyage, tandis que la deuxième partie représentant 80% en poids du cal n'est pas soumise à broyage.

Les deux parties sont ensuite mélangées entre elles de manière douce, pour former un mélange de cellules non broyées et de cellules broyées, contenant du Xylitol et de la glycérine. Ce mélange est nommé ci-après "Rhodiola X-G" dans des exemples de réalisation.

Etape 9 : ajout d'un support pour application cosmétique pour obtenir une composition cosmétique pour application topique.

Si à l'étape 4 du procédé décrit ci-avant, on avait mélangé au préalable le Xylitol à du citrate de choline et de l'eau dans le rapport molaire 1:2:3 (composé XoCH du tableau 1 de EP 2575993), on aurait obtenu un mélange d'un solvant eutectique profond NADES avec un cal de cellules végétales. Par la présence de ce solvant NADES, on a observé une extraction en dehors des cellules, de composés présents dans les cellules. Les cellules se sont ainsi appauvries en principes actifs, tels que composés phénoliques et flavanoïdes. L'utilisation d'un solvant eutectique profond (du type xylitol, citrate de choline et eau) dans l'étape 4 ne permet pas d'obtenir des cellules dédifférenciées et élicitées enrichies en xylitol dans leur volume interne.)

La composition cosmétique de l'invention comprend par exemple de 0,5 à 15% en poids de mélange de cellules végétales, broyées et non broyées, de xylitol et de glycérine. On donnera ci-après quelques exemples, non limitatifs, de telles compositions cosmétiques à usage topique Exemples 1A et 1B : Dispersion de Rhodiola X-G ou de Rhodiola G dans une base cosmétique

Rhodiola X-G ou Rhodiola G est dispersé dans la base suivante :

- Eau déionisée 85, 0 %

Huile minérale 9, 00 % - Alcool cétylique 3, 00 % ceteareth - 20 0, 75 %

Rhodiola X-G ou Rhodiola G 2,00 % fragrance 0, 15 % carbomer 0, 10 TOTAL 100, 00 %

La composition obtenue montre une dispersion homogène des cellules dans la crème et une texture très fine. L’étude de propriété a montré l’absence de germes et champignons ainsi qu’une remarquable stabilité de la composition.

Exemples 2A et 2B : Dispersion de Rhodiola X-G ou de Rhodiola G dans une autre base cosmétique

Le Rhodiola X-G ou Rhodiola G est dispersé dans la base suivante : - eau 46,59 % laureth sulfate de sodium ( 25% ) 36, 40 %

- PEG-7 glyceryl cocoate 2, 00 % laureth-2 1, 50 % laureth- 11 carboxylate de sodium 4, 00 % - cocamidopropyl bétaine & acide benzoique 3, 48 % chlorure de sodium 1, 60 % - parfum 0, 13 %

PEG-40 huile hydrogénée de castor

& propylène glycol & eau 0, 50 % oleth-10 0, 50 % - phosphate de sodium 0, 30 % phosphate dissodique 0, 08 % acide citrique ( 50 % ) 0, 52 % benzoate de sodium 0, 50 % Rhodiola X-G ou Rhodiola G 0, 90 % TOTAL 100, 00 %

Les compositions obtenues montrent une dispersion homogène des cellules. L’étude de propriété a montré l’absence de germes et champignons ainsi qu’une remarquable stabilité des compositions.

Exemple 3 : Lotions

Lotions contenant seulement Rhodiola X-G ou Rhodiola G : eau déminéralisée, propylène glycol, conservateur, parfum ; et produit actif : Rhodiola X-G ou Rhodiola G.

Exemple 5 : Shampooings

Shampoings / gels / laits contenant seulement une phase aqueuse A à base d’eau déminéralisée, détergents, moussants, épaississants, parfum et produit actif :

Rhodiola X-G ou Rhodiola G, sous forme d’une suspension visqueuse ou d’un gel.

Concernant les lotions, solutions et shampooings, les compositions à usage topique contiennent les différents constituants, dont on peut varier les teneurs en fonction des applications, mélangés dans la seule phase aqueuse, comme le réalise habituellement l'homme de l’art dans ce domaine.

La proportion de Rhodiola X-G ou Rhodiola G est fonction de la nature de la composition à usage topique et de l’application souhaitée. Elle est avantageusement comprise entre 0,01 et 5 %, mais peut atteindre jusqu’à 25 %.

Evidemment, l’invention n’est pas limitée aux exemples de réalisation donnés ci- dessus et il est possible de réaliser la composition à usage topique sous d’autres formes, telles que huile, onguent, laques, fards (fond de teint, poudre, rouge à lèvres, crayon, mascara ou produit cosmétique permettant de surligner les yeux en colorant les cils et/ou leur donnant plus de longueur ou d'épaisseur apparente, ombre à paupières) qui entrent aussi dans le cadre de l’invention.

Tests d'efficacité

La flore microbienne de la peau humaine est très complexe, comprenant des germes aérobies, anaérobies, des germes gram positifs et gram négatifs, des levures. La flore cutanée comprend d'une part la flore naturelle, résidente et non pathogène, et d'autre part, une flore exogène qui se développe lors d'un affaiblissement des défenses naturelles, d'une plaie, d'une infection, etc.

La flore cutanée résidente ou naturelle est composée de plusieurs espèces, dont: Staphylocoques (S. epidermis, S.hominis, S.haemolyticus, S. aureus), Corynebacteries (C.lipophiles ; C.urealyticum ; C.minutissimum ; C.jeikeium), Propionibacterie (P. acnés; P.avidum ; P. granulosum, P.propionicum), Microcoques (M.luteus; M.varians), Streptocoques (groupes A, B et G), Brevibacteries.

Il est généralement admis que la flore résidente, naturelle, a un rôle protecteur dans la mesure où elle "occupe le terrain", où elle sécrète parfois des substances antimicrobiennes (antibiotiques) qui défendent la peau contre d'autres espèces et où elle maintient le système défensif de la peau (système immunitaire) en éveil.

Des désordres cutanés sont liés à la rupture de l'équilibre écologique de la flore résidente suite à la colonisation de la peau par des germes exogènes ou à la prolifération anormale d'une souche endogène, cette profilération anormale peut être la conséquence d'une utilisation trop fréquentes de compositions bactéricides, antimicrobiennes, anti virucides, anti fongiques, antibiotiques, etc. non sélectives, attaquant indifféremment la flore pathogène et la flore résidente. Une telle utilisation de compositions non sélectives est une source de développement de souches exogènes résistantes. La prolifération des souches exogènes se traduit pai- des phénomènes divers, dont: le développement d'odeurs corporelles, notamment les odeurs axillaires et des pieds (principalement C. Xerosis pour les odeurs axillaires et B. linens pour les odeurs des pieds); pour les personnes à peau sensible, dermatite atopique, eczéma (germe responsable : S. aureus); la production de pellicules (principalement M. furfur); pour les personnes avec une peau grasse ou hyperséborrhéique, de l’acné (P. acnés); etc.

L'utilisation des antibiotiques ou bactéricides non spécifiques pose le problème du risque d'apparition de résistances bactériennes, et des problèmes de tolérance cutanée (irritations, allergies, ...).

En particulier dans cette période de Coronavirus, le lavage et la désinfection répétée des mains avec des solutions hydro alcooliques se sont traduits dans des perturbations de la flore cutanée naturelle, favorisant ainsi l'apparition et le développement d'espèces microbiennes exogènes, voire pathogènes au détriment de la flore naturelle. Cette apparition et développement rapide d'espèces microbiennes exogènes et pathogènes sont une source de contamination importante entre personnes, et de propagations de maladies. La composition cosmétique selon l'invention a montré lors de tests sur des volontaires, qu'elle permet un maintien d'un équilibre microbien bénéfique sur la peau, même et surtout après des agressions répétées du type hydroalcoolique.

Pour des tests d'efficacité, une lotion pour visage a été utilisée. Le pH de cette lotion est de 7,5.

Cette lotion de visage a été utilisée pour préparer les lotions de tests suivantes:

Lotion de référence : lotion de base "LR"

Lotion comparative 1 : lotion de base additionnée de Xylitol pour obtenir une teneur en Xylitol de 1% en poids. "LCOMP1 ",

Dans une variante de la lotion comparative 1 ("LCOMPlbis"), le xylitol a été mélangé et broyé avec le CAL 1, avec un large excès de xylitol par rapport au poids de CALL Ce mélange a été filtré pour récupérer une phase liquide visqueuse contenant du xylitol. Cette phase liquide a été utilisée pour préparer la lotion de base additionnée de xylitol pour obtenir une teneur- de 1% en poids de xylitol dans la lotion.

Lotion comparative 2 : lotion de base additionnée de CAL Ipour obtenir une teneur- en CAL 1 dans la lotion de 8% en poids. "LCOMP2"

Lotion comparative 3 : lotion de base additionnée de CAL 1 pour obtenir une teneur en CAL 1 dans la lotion de 8% en poids, et additionnée de glycérine pour obtenir une teneur de 15% en poids. "LCOMP3"

Lotion selon l'invention 1 : lotion de base additionnée de "Rhodiola X-G" en quantité suffisante pour obtenir une lotion avec une teneur de 1% en poids de Xylitol. Lotion selon l'invention 2 : lotion de base additionnée de "Rhodiola G" en quantité suffisante pour obtenir une lotion avec une teneur de 0,5% en poids de Xylitol.

Quinze personnes volontaires ont participé au test en suivant le protocole ci- dessous:

Le visage est lavé avec un savon liquide de pH 7.5, puis rincé et séché.

Le pH cutané est déterminé à l'aide d'une électrode spécifique de surface. Un prélèvement de la flore microbienne au niveau du visage est effectué à l'aide de plaques de gélose pour chaque volontaire.

Les volontaires ont été répartis en cinq groupes, le groupe référence qui sera traité avec la lotion LR, le groupe comparatif 1 qui sera traité avec la lotion LCOMP1, le groupe comparatif 2 qui sera traité avec la lotion LCOMP2, le groupe invention 1 qui sera traité avec la lotion Rhodiola X-G, et le groupe invention 2 qui sera traité avec la lotion Rhodiola G. Après ce traitement avec une lotion, les zones traitées ont été mises en contact (1 heure après le traitement) avec des souches exogènes Corynebacterium xerosis pour déterminer leur prolifération. Ces souches exogènes après le test ont été tuées par une crème antibiotique. La zone traitée est limitée à 4cm ² , de manière à pouvoir observer les différences éventuelles avec la zone non traitée pour- un même volontaire.

On effectue des mesures du pH de la peau avant traitement, et ensuite de la zone traitée, à divers moments après traitement, à savoir 2heures, 4 heures, 8 heures et lôheures après traitement. De même, on opère à des prélèvements de microbes sur les zones traitées à divers moments, à savoir 2, 4, 8 et 16 heures après traitement.

16 heures après traitement, on opère un lavage avec le savon liquide de pH 7,5. On détermine alors le temps requis pour que la zone traitée retrouve son pH initial avant traitement. 1, 2 et 4 heures après le lavage, on examine la flore cutanée de la zone traitée lavée.

En cas de développement trop important de Corynebacterium xerosis sur la zone traitée, le test est arrêté et la zone est traitée rapidement avec une crème topique antibiotique.

Avant traitement, mais après lavage et séchage, la peau des volontaires avaient un pH de 4,9 à 5,3. La flore microbienne cutanée se composait essentiellement des espèces suivantes: Staphylocoques (S. epidermis, S.hominis, S.haemolyticus, S. aureus), Corynebacteries (C.lipophiles ; C.urealyticum ; C.minutissimum ;

C.jeikeium), Propionibacterie (P. acnés; P.avidum ; P. granulosum, P.propionicum), Microcoques (M.luteus; M.varians), Streptocoques (groupes A, B et G), Brevibacteries.

La flore bactérienne cutanée pour les zones qui vont être soumises à traitement ne comportait pas de Corynebacterium xerosis.

Pour les volontaires traités avec la lotion de référence LR, le pH de la zone traitée augmente rapidement d'une à deux unités, de plus une prolifération de la souche Corynebacterium xerosis est visible 4 heures après le début du traitement. La flore microbienne cutanée résidente était perturbée. Le test a été interrompu et la zone traitée a été soumise à une étape de lavage, rinçage et séchage. 3 heures après cette étape de lavage, le pH de la zone traitée revenait à une valeur de 5,2 - 5,5.

Pour éviter toute prolifération future de Corynebacterium xerosis, la zone traitée lavée et rincée a été traitée au moyen de la crème antibiotique.

Pour les volontaires traités avec la lotion comparative LC0MP1, le pH de la zone traitée augmente rapidement d'une à deux unités, de plus une prolifération de la souche Corynebacterium xerosis est visible 8 heures après le début du traitement. La flore microbienne cutanée résidente était perturbée. Le test a été interrompu après 8 heures et la zone traitée a été soumise à une étape de lavage, rinçage et séchage. 2 heures après cette étape de lavage, le pH de la zone traitée revenait à une valeur de 5,2 - 5,5.

Pour éviter toute prolifération future de Corynebacterium xerosis, la zone traitée et lavée a été traitée au moyen de la crème antibiotique.

Ces mêmes volontaires ont été traités avec la variante LCOMP1bis. Les résultats de ce test étaient identiques à ceux obtenus avec la composition comparative LCOMP1.

Pour les volontaires traités avec la lotion de référence LCOMP2, le pH de la zone traitée augmente rapidement d'une à deux unités, de plus une prolifération de la souche Corynebacterium xerosis est visible 8 heures après le début du traitement. La flore microbienne cutanée résidente était perturbée. Le test a été interrompu et la zone traitée a été soumise à une étape de lavage, rinçage et séchage. 2 heures après cette étape de lavage, le pH de la zone traitée revenait à une valeur de 5,2 - 5,5.

Pour éviter toute prolifération future de Corynebacterium xerosis, la zone traitée et lavée a été traitée au moyen de la crème antibiotique.

Pour les volontaires traités avec la lotion de l'invention 1 avec Rhodiola X-G, le pH de la zone traitée augmente d'une unité,. Après 16 heures, aucune prolifération de la souche Corynebacterium xerosis n'a été observée. La flore microbienne cutanée résidente restait proche de la flore originelle. Le test a été interrompu après 16 heures et la zone traitée a été soumise à une étape de lavage, rinçage et séchage.

1 heure après cette étape de lavage, le pH de la zone traitée et lavée revenait à une valeur de 5,2 - 5,5. La lotion selon l'invention 1 protège donc de manière efficace la flore cutanée résidente, tout en ayant une action protectrice contre des microorganismes exogènes. Pour les volontaires traités avec la lotion de l'invention 2 avec Rhodiola G, le pH de la zone traitée augmente de 0,5 unité. Après 12 heures, une légère prolifération de la souche Corynebacterium xerosis a été observée. La flore microbienne cutanée résidente restait proche de la flore originelle. Le test a été interrompu après 12 heures et la zone traitée a été soumise à une étape de lavage, rinçage et séchage.

1 heure après cette étape de lavage, le pH de la zone traitée et lavée revenait à une valeur de 5,2 - 5,5. La lotion selon l'invention 2 protège donc de manière efficace la flore cutanée résidente, tout en ayant une action protectrice confie des micro organismes exogènes. La durée d'action protectrice de la lotion selon l'invention 2 avec Rhodiola G était inférieure à celle de la lotion selon l'invention

1 avec Rlioliola X-G.

La peau traitée avec la lotion de l'invention 1 ou 2 avait un aspect plus souple, plus douce, plus hydratée que la peau non traitée, et le traitement n’a pas provoqué de rougeurs et d'irritations.

Test d'efficacité sur la croissance de germes Corynebacterium xerosis. Staphylococcus epidermidis, et Propionibacterium acnés

L'action inhibitrice ou non des lotions a été évaluée sur la croissance des germes Corynebacterium. xerosis (principal germe responsable des mauvaises odeurs corporelles), Staphylococcus epidermidis (bactérie bénéfique de la flore microbienne de la peau), et sur le germe Propionibacterium acnés (germes présents sur la peau hyperséborrhéique - responsables de poussée d'acné).

Les germes ont été mis chacun dans un milieu de culture gélose. On a opéré des puits pour chaque boite de culture, chaque puit étant destiné à recevoir une même quantité de lotion (LR ou LCOMP1 ou LCOMP2 ou Rhodiola X-G. Aucune action inhibitrice ou une faible action inhibitrice n’a été observée sur Corynebacterium. xerosis, Staphylococcus epidennidis, et sur le germe Propionibacterium acnés, pour la lotion LR.

Pour la lotion LCOMP1, pas d'effet inhibiteur pour Corynebacterium xerosis, mais bien une certaine inhibition pour Staphylococcus epidennidis, et pour le germe Propionibacterium acnesC

Pour la lotion LCOMP2, pas d'effet inhibiteur pour Corynebacterium xerosis, et Staphylococcus epidennidis, mais bien une certaine inhibition pour le germe Propionibacterium acnés (acné).

Pour la lotion Rhodiola G et la lotion Rhodiola X-G, on observe un effet inhibiteur respectivement marqué et très marqué pour Corynebacterium xerosis, et Propionibacterium acnés, et pas d'effet inhibiteur pour Staphylococcus epidermidis. Ceci permet de conserver la flore cutanée résidente, tout en ayant une action sur Corynebacterium xerosis, et Propionibacterium acnés.

Tests sur de de la peau reconstituée

Pour ces tests on a reconstitué une peau associée à un mélange de bactéries Staphyloccocus aureus, Staphyloccoccus epidennidis, Corynebacterium xerosis et Cutibacterium acnés.

On a appliqué sur cette peau reconstituée infectée de ce mélange de bactéries les mélanges à base de glycérol (97,5% en poids) et de cellules de Rhodiola Rosea enrichies en Xylitol (2,5% en poids). Par rapport à la peau reconstituée infectée de ce mélange de bactéries, mais non traitée, on a observé ainsi une réduction générale de l'adhésion des bactéries sur la peau reconstituée, mais surtout un accroissement de la proportion de Staphylococcus epidennidis sur la peau reconstituée (en particulier au détriment de Staphylococcus aureus et de Corynebacterium xerosis, sans modifier la proportion de Cutibacterium acnés), cet accroissement de la proportion de Staphylococcus epidermidis sur la peau assurant un effet de barrière améliorée.