La présente invention a pour objet des compositions cosmétiques contenant comme ingrédient actif au moins un peptide pouvant être 5 obtenu par hydrolyse ou protéolyse de caséines du lait.

On sait que les caséines sont des protéines phosphorées qui précipitent à partir du lait écrémé à un pH de 4,6 à température ambiante.

On connaît, parmi les constituants des caséines, quatre 0 constituants majeurs : les caséines alpha ., alpha „, bêta et Kappa.

On sait que certains peptides pouvant être obtenus par hydrolyse de caséine ont une activité de type opioïde, cette activité pouvant être mise en évidence notamment par l'effet inhibiteur de la 5 contraction de l'iléon de cobaye stimulé électriquement. Cette inhibition est réversible sous l'action de la naloxone, qui est un antagoniste spécifique de la morphine. L'activité des peptides de caséine peut également être mise en évidence par l'inhibition des contractions induites par stimulation électrique du vas deferens de la 0 souris ou du rat, cette inhibition étant ici encore réversible sous l'action de la naloxone.

On a maintenant découvert que les peptides à activité opioïde pouvant être obtenus notamment par hydrolyse ou protéolyse de caséines du lait, ou des fractions peptidiques les contenant, ont des 5 propriétés cosmétiques intéressantes, qui permettent de les utiliser comme ingrédients actifs dans des compositions cosmétiques.

La présente invention a donc pour objet une composition cosmétique caractérisée par le fait qu'elle contient, comme ingrédient actif, au moins un peptide à activité opioïde pouvant être obtenu par 0 hydrolyse ou protéolyse de caséines du lait. La composition de l'invention est notamment une composition cosmétique pour la peau.

L'ingrédient actif peut être au moins un peptide purifié s activité opioïde, obtenu soit par synthèse peptidique, soit par purification d'un hydrolysat de caséines. L'ingrédient actif peut 5 également être constitué par une fraction peptidique contenant au moins un peptide à activité opioïde, cette fraction pouvant être

obtenue par purification partielle d'un hyαrolysat total de caséines, par exemple par les méthodes chromatographiques, par exemple par chromatographie d'adsorption, chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) ou chromatographie d'affinité, ou par les méthodes de fi tration sur membranes, notamment par ultrafiltration.

Les peptides ou fractions peptidiques utilisés comme ingrédients actifs dans les compositions de l'invention sont donc au moins partiellement purifiés, ce qui exclut l'incorporation comme ingrédient actif d'un hydrolysat total de caséine. Les peptides présents comme ingrédients actifs dans les compositions cosmétiques de l'invention sont choisis parmi :

- l'heptapeptide :

Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu ou l'hexapeptide correspondant : Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu.

Les deux peptides ci-dessus ont été isolés à partir d'hydrolysats d'alpha caséine ; voir par exemple C. ZI0UDR0U et al, J.BIOL CHEM 254, n°7, 2446-2449 (1979).

- L'undécapeptide : Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu,

- L' heptapeptide correspondant :

Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile (encore appelé bêta-casomorphine-7) ,

- et le pentapeptide correspondant : Tyr Pro Phe Pro Gly (encore appelé bêta-casomorphine-5).

On sait que l'undécapeptide, à activité opioïde modérée, lui-même précurseur de l'hepta et du pentapeptide à activité plus importante, provient de la bêta-caséine ; voir par exemples BFAKTL et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360, 1211-1216 (1979) et Life Sci. 28, 1903-1909 (1981).

Certains peptides à activité opioïde qui sont mentionnés ci-dessus peuvent également être préparés par hydrolyse ou protéolyse de gluten de blé ou de protéines de soja ; voir par exemple C. ZI0UDR0U et al., article déjà cité. En outre, la synthèse de certains de ces peptides a été décrite par Spyros Loukas et al., Biochemistry 22 (19), pp 4567-4573 (1983).

Céπéralement, l e ou les peptides £< activité opioïde sont présents, dans la composition de l'invention, à raison de 0,] à 5 % en poids.

On a en outre découvert un procédé particulièrement intéressant

5 pour préparer des peptides ou fractions peptidiques utilisables dans les compositions cosmétiques de l'invention.

Ce procédé est caractérisé par le fait que : a) soit l'on soumet une solution de caséine à une hydrolyse acide à un pH non supérieur à 4,0 et à une température de 20 à 100°C,

10 b) soit l'on soumet une solution de caséine à l'action d'une protéase de Staphylococcus aureus, puis que, dans les deux cas, on purifie selon les méthodes usuelles les fractions peptidiques obtenues et réunit les fractions peptidiques purifiées ayant une activité opioïde. ^5 Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut également présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison :

- on effectue par exemple l'hydrolyse acide à un pH de 3,5 environ ; la concentration de la caséine dans la solution de départ

2 est par exemple de 1 à 10 % en poids ; la caséine de départ est par exemple une caséine alcalisoluble, ou une caséine selon Hammarsten, ou encore une caséine précipitée au pH isoélectrique à partir d'un lait écrémé ; la durée de l'hydrolyse dépend de la température ; on peut déterminer facilement dans chaque cas la durée de la réaction

₂₅ d'hydrolyse (généralement entre 15 min et 70 heures environ), de préférence en déterminant par des expériences de routine le temps d'apparition d'une activité opioïde optimale dans les fractions peptidiques obtenues ;

- on effectue la réaction de protéolyse en utilisant de 25 à 50 unités d'enzyme par g de caséine de départ ; la caséine de départ est notamment une alpha-caséine ; le temps optimal de la réaction peut être déterminé par électrophorèse en gel de polyacrylamide 17,5 % (SDS-PAGE) : par dépôts successifs d'aliquotes du milieu réactionnel enrichi en SDS (0,5 %) et en glycérol (10 %) . L'hydrolyse s'accompagne c d'une disparition progressive de la bande correspondant à l'alpha-caséine et de l'apparition de fractions protéiques de poids moléculaire inférieur.

La protéase de S. aυreus est par exemple celle de S. aureus Strain Vδ type XVII-B cor*ιercialisée par SIGMA ;

- selon une variante, on peut faire précéder la protéolyse enzymatique d'un clivage de la caséine de départ avec du bromure de cyanogène, dont on sait qu'il coupe les liaisons peptidiques dans lesquelles une m.éthionïne est impliquée par son carboxyle ; on utilise le bromure de cyanogène généralement à raison de 2,5 g/g d'alpha _ς -caséine ; on opère par exemple en solution d'acide formique à 70 % ; voir OTANI et al. AGR.BIOL.CHEM. 50(3)-607-1986 ; - la purification des fractions peptidiques obtenues peut être faite selon les méthodes usuelles, notamment par chromatographie d'exclusion ou par échanges d'ions ou par interactions hydrophobes ; après mise au point du procédé de purification par des expériences de routine, on pourra opérer par exemple de façon à isoler et/ou à réunir les fractions peptidiques ayant une activté opioïde ; cette activité opioïde peut être déterminée selon les méthodes classiques telles que l'inhibition des contractions induites par stimulation électrique sur l'iléon de cobaye ou sur le vas deferens chez le rat ou la souris, cette inhibition étant levée par la présence d'un antagoniste de la morphine tel que la naloxone ; pour la description de ces tests classiques voir par exemple : Method used for the study of opioids receptors-LESLIE-Phaπnacological Revie s-Vol.39, n° 3-1987.

On peut également purifier partiellement les fractions peptidiques à l'aide de membranes ayant un seuil de coupure approprié (par exemple 5000) qui laissent passer les peptides de masse moléculaire inférieure au seuil de coupure, et qui retiennent les protéines ou fragments protéiques de masse moléculaire supérieure, y compris les protéases utilisées dans le procédé de protéolyse.

Les fractions peptidiques utilisables comme ingrédient actif dans les compositions de l'invention sont notamment les fractions exemptes de peptides de masse moléculaire supérieure à 5000, et en particulier de peptides de masse moléculaire supérieure à 3000.

Les peptides présents dans les compositions de l'invention peuvent également être obtenus selon des procédés analogues à partir de protéines du soja ou du gluten.

I.es compositions de l'invention présentent notamment, lorsqu'elles sont appliquées sur la peau, un effet calmant et/ou régénérant, permettant d'en améliorer l'aspect.

Ces propriétés peuvent être utilisées notamment pour réaliser des compositions destinées à atténuer ou à éliminer les effets de l'irritation de la peau provoquée notamment par l'action du rayonnement solaire ou par l'action d'autres agents irritants physiques, chimiques ou biologiques ; ou encore des compositions permettant de lutter contre les effets du vieillissement de la peau, afin d'en améliorer l'aspect.

Les compositions de l'invention contiennent les fractions peptidiques décrites ci-dessus en association avec un véhicule cosmétique approprié, c'est-à-dire un véhicule compatible avec l'application sur la peau et les muqueuses. Ledit véhicule cosmétique est un véhicule classique permettant de présenter la composition notamment sous la forme de solutions aqueuses ou hydroalcooliques, d'émulsions (laits ou crèmes), sous la forme de gels aqueux, sous la forme de solides comme les bâtons (colorés ou non) pour les lèvres, ou encore sous la forme d'aérosols. Les excipients permettant de préparer ces diverses formes de compositions cosmétiques sont connus et décrits notamment dans les ouvrages classiques de cosmétologie.

Les compositions de l'invention peuvent contenir en outre des adjuvants usuels tels que des parfums, des agents colorants, des agents épaississants, des agents séquestrants, des modificateurs de pH, des agents conservateurs, des filtres UV, des tensioactifs ou émulsifiants, des corps gras, des polymères, etc..

Les compositions de l'invention peuvent se présenter notamment sous la forme de gels, de laits, de crèmes, d'émulsions ou de pâtes constituant des compositions pour la toilette ou pour les soins de la peau, notamment après l'exposition au soleil, des compositions pour le bain, des compositions de protection contre le rayonnement solaire, des crèmes ou lotions pour les soins des mains, ou des bâtons pour les lèvres. Ces compositions cosmétiques sont préparées selon les méthodes usuelles.

I.'inventaci. a également pour objet 3 'utilisation comme ingrédient actif, dans la préparation d'une composition coMi-étique, d'au moins un peptide à activité opioïde tel que défini précédemment. L'invention concerne en outre un procédé de traitement cosmétique consistant à appliquer sur la peau une quantité efficace d'une composition cosmétique telle que définie précédemment.

On a également découvert que les peptides décrits ci-dessus présentent, chez l'homme, au contact de la peau et des muqueuses, des propriétés pharmacologiques intéressantes, notamment des propriétés cicatrisantes et apaisantes. Ces propriétés peuvent être mises à profit dans des compositions telles que des baumes gingivaux, des solutions constituant des bains de bouche, des comprimés sublinguaux, des pastilles à sucer, des pâtes à mâcher, ou des encore des films ou pansements imprégnés. Ces compositions, qui contiennent lesditε peptides généralement à raison de 0,05 à 5 % en poids, en combinaison avec des excipients et adjuvants classiques, sont préparées selon les méthodes usuelles. L'invention a donc également pour objet l'utilisation des peptides tels que définis ci-dessus, éventuellement sous la forme d'hydrolysats ou de fractions peptidiques d'hydrolysats au moins partiellement purifiés, comme principes actifs dans la préparation d'une composition cicatrisante et/ou apaisante pour la peau et les muqueuses. Les compositions buccales peuvent en outre servir notamment au traitement des aphtes. L'invention concerne également un procédé de traitement correspondant de la peau ou des muqueuses, dans lequel on applique sur la peau ou les muqueuses, une quantité efficace d'une composition telle qu'elle vient d'être définie.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

EXEMPLES DE PREPARATION DE FRACTIONS PEPTIDIQUES

EXEMPLE 1 : Hydrolyse de l'alpha-caséine par la protêase de Staphylococcus aureus. La caséine de départ est l'alpha-caséine commercialisée par

Sigma, qui contient 85 % d'alpha -caséine.

On solubilise l'alpha-caséine (5 g) dans 100 ml d'une solution tampon Tris HCl 125 mM, pH 6,8, en présence de 0,5 % de dodecylsulfate de sodium et de 10 % de glycérol. On ajoute la protéase de S.aureus Strain V8 Type XVII-B (commercialisée par Sigma) à raison de 50 unités/mg de caséine.

On laisse incuber à 37°C. L'hydrolyse de l'alpha-caséine peut être suivie par électrophorèse en gel de polyacryla ide, comme il a été indiqué précédemment.

En procédant à une étude systématique, et en fixant le temps d'hydrolyse à 3 heures, il est apparu que la concentration d'enzyme efficace pour hydrolyser la caséine est de l'ordre de 25 à 50 unités/mg de caséine.

On rappelle qu'une unité de protéase est la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 JJM d'alpha-phényl ester de l'acide N-t-butoxycarbonyl- L-glutamique par minute à pH 7,8 et à 37°C.

Par ailleurs, en fixant la concentration enzy atique à 50 unités/mg de caséine, le temps d'hydrolyse est compris entre 2 et 3 heures environ.

En variante, il est possible d'effectuer un traitement préliminaire de clivage de l'alpha-caséine par le bromure de cyanogène suivi d'une purification des peptides par tamisage moléculaire.

Par exemple, on solubilise 100 mg d'alpha-caséine (Sigma) dans une solution d'acide formique à 70 %. On ajoute, en deux fois, 250 mg de bromure de cyanogène. On laisse réagir pendant 24 heures sous agitation. Les peptides obtenus sont séparés par tamisage moléculaire sur une colonne de Sephadex G50, équilibrée avec un tampon TEMED HCl 20 mM, pH 5,5, en présence d'urée 4,5 M. Le pic d'exclusion contient notamment un mélange de peptides ayant 61 et 63 résidus d'acides aminés, dont le second contient l'heptapeptide d'alpha -caséine. si

Les peptides obtenus sont alors soumis à l'hydrolyse sous l'action de la protéase de S.aureus, comme décrit précédemment.

EXEMPLE 2 : Hydrolyse acide.

On utilise comme produit de départ une solution de caséine selon Hammarsten (Merck réf. 2242) ou encore la caséine alcalisoluble (Merck réf. 2241).

On rappelle que l a caséine alcalisoluble ainsi que la caséine selon Hammarsten sont de_ caséines totales (alpha+bêta+kappa) .

On solubilise la caséine dans un tampon, acétate 50 mM, pH 3,5, la concentration de la caséine pouvant varier de 1 à 10 % en poids.

Une étude systématique a montré que l'on peut opérer par exemple à température ambiante (20°C) pendant 70 heures, à 35°C pendant 50 heures, à 43°C pendant 45 heures ou à 100°C pendant 15 min, en agitant pendant toute la durée de l'hydrolyse.

Après centrifugation dans les conditions suivantes (30000 g ou mieux 50000 g pendant 15 minutes à 4°C) on obtient une fraction peptidique dont on a vérifié qu'elle présente des propriétés de type opioïde dans les tests sur iléon de cobaye et sur vas deferens de souris ou de rats.

La fraction peptidique peut être concentrée par exemple par lyophilisation puis amenée a un volume déteminé par addition d'eau distillée ou d'une solution de KaCl à 0,9 % ou encore d'une solution tampon.

On peut également purifier davantage la fraction peptidique obtenue par une opération de filtration sur gel, par exemple sur Sephadex G75 équilibré et élue avec un tampon Tris, KC150mM, pH 8,8. Par mesure de la densité optique des éluats à 220 nm on obtient un profil d'élution avec deux pics principaux : le deuxième pic correspond à une fraction ayant une activité de type opioïde plus importante.

Le rendement en peptides à activité opioïde est environ dix fois supérieur au rendement obtenu par protéolyse à l'aide de pepsine selon la méthode décrite par C. ZI0UDR0U et al., article cité précédemment.

Pour l'utilisation dans les compositions cosmétiques selon l'invention, les fractions peptidiques (qui sont obtenues, par voie chimique comme par voie enzymatique, à pH acide) sont neutralisées par une base appropriée telle que l'hydroxyde de sodium.

EXEMPLES DE COMPOSITIONS

EXEMPLE A : Cel après-soleil

CONSTITUANTS % en poids

On peut remplacer l'hydrolysat de caséine par celui de l'exemple 2.

Cette composition a été préparée de la façon suivante : Dans un mélangeur, on prépare le gel en laissant gonfler sous agitation pendant deux heures le polymère carboxylique dans une phase aqueuse chauffée à 70°C renfermant le conservateur, le propylene glycol et le sel de potassium de l'acide ethylenediaminetetracetique. Puis à 40°C, on rajoute sous agitation :

- l'acide 2-hydroxy-4-méthoxybenzophénone 5-sulfonique solubilisé dans l'eau avec la triéthanolamine, - l'hydrolysat de caséine préalablement solubilisé dans l'eau additionnée de parahydroxybenzoate de méthyle.

- le colorant

— le parfum peptisé par l'huile de ricin hydrogénée dans une phase contenant l'alcool éthylique et de l'eau.

Ce gel appliqué sur la peau a un effet protecteur et apaisant.

EXEMPLE B : Emulsion apaisante après-soleil

* ou de l'exemple 2

On a préparé cette emulsion de la façon suivante : La phase grasse est émulsionnée sous agitation à 65°-70°C avec la phase aqueuse renfermant tous les constituants hydrosolubles, sauf l'hydrolysat de caséine et le parfum. L'hydrolysat de caséine est rajouté sous agitation lorsque la température de l'emulsion atteint 35°C. Enfin, on introduit le parfum.

Cette emulsion est appliquée sur la peau pour son effet apaisant après une longue exposition au soleil et en cas de "coup de soleil".

EXEMPLE C : Crème pour les lèvres

* ou à l'exemple 2

Pour préparer cette crème, la phase grasse est maintenue à 70°C puis est émulsionnée dans la phase aqueuse chauffée à la même température. L'hydrolysat de caséine est ensuite ajouté à 30-35°C sous agitation, ainsi que (éventuellement) un parfum. Le pH est ajusté à froid.

Cette crème est particulièrement adaptée aux lèvres gercées ou crevassées, en particulier en raison du froid.

EXEMPLE D : BAUMB GINGIVAL POUR BEBE

On peut remplacer l'hydrolysat de caséine par celui obtenu l'exemple 2.

Préparation

On réalise un gel en mélangeant l'acide polyacrylique, la moitié de l'eau et une partie du conservateur.

Le lendemain, on rajoute dans l'ordre et sous agitation :

- l'hydrolysat de caséine préalablement mélangé au glycérol, - le reste du conservateur solubilisé dans l'eau

- l'agent aromatisant en solution à 2 " dans le propylene glycol

- l'hydroxyde de sodium en solution aqueuse

Une agitation de 45 minutes, avec dégazage, termine la fabrication. - On applique ce baume sur les gencives des nouveau-nés pour calmer les douleurs des premières dents.