Einleitung

Die vorliegende Erfindung betrifft Futtermitteladditive enthaltend chemisch geschützte Dipeptide in Form von Dike- topiperazinen (cyclo-Dipeptiden, Dehydrodipeptiden) von essentiellen, limitierenden Aminosäuren wie z.B. Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Cystein und Cystin, sowie deren Synthese und Verwendung in Futtermitteln für die Ernäh- rung von Wiederkäuern und besonders von Fischen und Krustentieren in Aquakulturen.

Stand der Technik

Die essentiellen Aminosäuren (EAA) Methionin, Lysin, Threo- nin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin sind sehr wichtige Bestandteile in Futtermitteln und spielen bei der wirtschaft ^¬ lichen Aufzucht von Nutztieren wie z.B. Hühnern, Schweinen, Wiederkäuern und Aquakulturen eine bedeutende Rolle. Dabei ist vor allem eine optimale Verteilung und ausreichende

Versorgung mit EAAs entscheiden. Da Futter aus natürlichen Eiweißquellen wie z.B. Soja, Mais und Weizen meist in bestimmten EAAs defizitär ist, ermöglicht die gezielte

Supplementierung mit synthetischen EAAs wie beispielsweise DL-Methionin, L-Lysin, L-Threonin oder L-Tryptophan zum einen ein schnelleres Wachstum der Tiere bzw. eine höhere Milchproduktion bei Hochleistungsmilchkühen, zum anderen aber auch die effizientere Verwertung des gesamten Futters. Dies stellt einen sehr großen wirtschaftlichen Vorteil dar. Die Märkte für Futtermitteladditive sind von großer indus ^¬ trieller und wirtschaftlicher Bedeutung. Zudem sind sie starke Wachstumsmärkte, was nicht zuletzt auf die steigende Bedeutung von Ländern wie beispielsweise China und Indien zurückzuführen ist.

L-Methionin ( (5) -2-Amino-4-methylthiobuttersäure) stellt für viele Tierarten die erste limitierende Aminosäure aller EAAs dar und spielt daher in der Tierernährung und als Futtermitteladditiv eine der bedeutendsten Rollen (Rosenberg et al., J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700). Bei der klas ^¬ sischen chemischen Synthese fällt Methionin jedoch als Ra- cemat, eine 50 : 50-Mischung aus D- und L-Methionin, an. Die- ses racemische DL-Methionin kann jedoch direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt werden, da bei einigen Tierarten unter in vivo-Bedingungen ein Umwandlungsmechanismus besteht, der das unnatürliche D-Enantiomer von Methionin in das natürliche L-Enantiomer überführt. Dabei wird das D- Methionin zuerst mit Hilfe einer unspezifischen D-Oxidase zu -Keto-Methionin desaminiert und anschließend mit einer L-Transaminase zu L-Methionin weiter umgewandelt (Baker, D.H. in „Amino acids in farm animal nutrition", D'Mello, J.P.F. (ed.), Wallingford (UK) , CAB International, 1994, 37-61) . Dadurch wird die verfügbare Menge an L-Methionin im Organismus erhöht, die dann dem Tier zum Wachstum zur Verfügung stehen kann. Die enzymatische Umwandlung von D- zu L-Methionin wurde bei Hühnern, Schweinen und Kühen, insbesondere aber auch bei Fischen, Shrimps und Prawns festge- stellt. So konnte beispielsweise Sveier et al . (Aquacult. Nutr. 2001, 7 (3), 169-181) und Kim et al . (Aquaculture 1992, 101 (1-2), 95-103) zeigen, dass die Umwandlung von D- in L-Methionin bei carnivoren atlantischen Lachsen und Regenbogenforellen möglich ist. Gleiches konnte von Robinson et al. (J. Nutr. 1978, 108 (12), 1932-1936) und Schwarz et al . (Aquaculture 1998, 161, 121-129) für omnivore Fischar ^¬ ten wie zum Beispiel Catfish und Karpfen zeigen. Darüber hinaus konnten Forster und Dominy (J. World Aquacult. Soc. 2006, 37 (4), 474-480) in Fütterungsversuchen von Omnivoren Shrimps der Art Litopenaeus vannamei zeigen, dass DL- Methionin die gleiche Wirksamkeit wie L-Methionin besitzt. 2007 wurden weltweit über 700.000 t kristallines DL- Methionin bzw. racemisches, flüssiges Methionin-Hydroxy- Analog (MHA, rac-2-Hydroxy-4- (methylthio) butansäure (HMB) ) und festes Calcium-MHA produziert und erfolgreich bei mono- gastrischen Tieren wie z.B. Geflügel und Schweinen direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt.

Im Gegensatz zu Methionin können von Lysin, Threonin und Tryptophan nur jeweils die L-Enantiomere als Futtermittel ^¬ additive verwendet werden, da die jeweiligen D-Enantiomere dieser drei essentiellen und limitierenden Aminosäuren vom Organismus unter physiologischen Bedingungen nicht zu den entsprechenden L-Enantiomeren umgewandelt werden können. So lag allein der Weltmarkt für L-Lysin, die erstlimitierende Aminosäure beispielsweise bei Schweinen, für das Jahr 2007 bei über einer Million Tonnen. Für die beiden anderen limitierenden essentiellen Aminosäuren L-Threonin und L- Tryptophan lag der Weltmarkt 2007 bei über 100.000 t bzw. einigen 1000 t.

Bei monogastrischen Tieren wie z.B. Geflügel und Schweinen wird üblicherweise DL-Methionin, MHA, aber auch L-Lysin, L- Threonin und L-Tryptophan direkt als Futtermitteladditiv verwendet. Im Gegensatz dazu ist die Supplementierung des Futters mit EAAs wie Methionin, Lysin, Threonin oder auch MHA bei Wiederkäuern nicht effektiv, da die Hauptmenge im Pansen der Wiederkäuer durch Mikroben abgebaut wird. Aufgrund dieses Abbaus gelangt daher nur ein Bruchteil der supplementierten EAAs in den Dünndarm des Tiers, wo im Allgemeinen die Absorption ins Blut erfolgt. Unter den EAAs spielt vor allem Methionin bei Wiederkäuern eine entschei- dende Rolle, da nur bei optimaler Versorgung eine hohe

Milchproduktion gewährleistet ist. Damit dem Wiederkäuer Methionin mit hoher Effizienz zur Verfügung stehen kann, muss eine pansenstabile geschützte Form eingesetzt werden. Dabei gibt es mehrere Möglichkeiten DL-Methionin bzw. rac- MHA diese Eigenschaften zu verleihen. Eine Möglichkeit be- steht darin, durch Anbringung einer geeigneten Schutzschicht bzw. Verteilung des Methionins in einer Schutzmat ^¬ rix eine hohe Pansenstabiliät zu erreichen. Dadurch kann Methionin den Pansen praktisch ohne Verlust passieren. Im weiteren Verlauf wird die Schutzschicht dann z. B. im Lab ^¬ magen durch saure Hydrolyse entfernt und das freiwerdende Methionin kann dann im Dünndarm vom Wiederkäuer absorbiert werden. Kommerziell erhältliche Produkte sind z.B. Mepron ^® der Firma Evonik Degussa und Smartamine™ der Firma Adisseo. Die Herstellung bzw. die Beschichtung von Methionin stellt meist ein technisch kompliziertes und aufwendiges Verfahren dar und ist daher teuer. Zudem kann die oberflächliche Be ^¬ schichtung der fertigen Pellets leicht durch mechanische Belastung und Abrieb während der Futterverarbeitung beschä- digt werden, was zur Verminderung bzw. bis zum vollständigen Verlust des Schutzes führen kann. Deshalb ist es auch nicht möglich, die geschützten Methioninpellets in ein grö ^¬ ßeres Mischfutterpellet zu verarbeiten, da dadurch wiederum die schützende Schicht durch die mechanische Beanspruchung aufbrechen würde. Dies schränkt die Verwendung solcher Pro ^¬ dukte ein. Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Pan ^¬ senstabilität ist die chemische Derivatisierung von Methio ^¬ nin bzw. MHA. Dabei werden die funktionellen Gruppen des Moleküls mit geeigneten Schutzgruppen derivatisiert . Dies kann z.B. durch Veresterung der Carbonsäurefunktion mit Alkoholen erfolgen. Dadurch kann der Abbau im Pansen durch Mikroorganismen verringert werden. Ein kommerziell erhält ^¬ liches Produkt mit chemischem Schutz ist beispielsweise Me ^¬ tasmart™, der racemische ίso-Propylester von MHA (HMBi) . In WO00/28835 wurde eine Biowertigkeit von mindestens 50% für HMBi bei Wiederkäuern veröffentlicht. Der Nachteil der che ^¬ mischen Derivatisierung von Methionin bzw. MHA besteht oft in der schlechteren Bioverfügbarkeit und dem vergleichswei ^¬ se niedrigen Wirkstoffgehalt . Neben der Problematik des Abbaus im Pansen von supplemen- tiertem EAAs wie Methionin, Lysin oder Threonin bei Wieder- käuern kann es aber auch bei Fischen und Krustentieren zu unterschiedlichen Problemen bei der Supplementierung von EAAs zum Futter geben. Durch die rasante wirtschaftliche Entwicklung der Fisch- und Krustentierzucht in hoch indust- rialisierten Aquakulturen gewinnt eine optimale, wirt ^¬ schaftliche und effiziente Supplementierungsmöglichkeit von essentiellen und limitierenden Aminosäuren gerade in diesem Bereich in den letzten Jahren eine immer bedeutendere Rolle (Food and Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department „State of World Aquaculture

2006", 2006, Rome . International Food Policy Research In ^¬ stitute (IFPRI) „Fish 2020: Supply and Demand in Changing Markets", 2003, Washington, D.C.) . Dabei kann es im Gegen ^¬ satz zu Hühnern und Schweinen bei der Verwendung von kri- stallinen EAAs als Futtermitteladditiv jedoch bei bestimmten Fisch- und Krustentiersorten zu unterschiedlichen Problemen kommen. So berichten Rumsey und Ketola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426), dass die Verwendung von Soja ^¬ mehl in Verbindung mit einzeln supplementierten, kristalli- nen Aminosäuren zu keiner Wachstumssteigung bei Regenbogenforellen führte. Murai et al . (Bull. Japan. Soc. Sei. Fish. 1984, 50 (11), 1957) konnte zeigen, dass die tägliche Füt ^¬ terung von Fischdiäten mit hohen Raten an supplementierten, kristallinen Aminosäuren bei Karpfen dazu führten, dass ü- ber 40% der freien Aminosäuren über die Kiemen und Nieren ausgeschieden werden. Aufgrund der schnellen Resorption von supplementierten Aminosäuren kurz nach der Futteraufnahme, kommt es zu einem sehr schnellen Anstieg der Aminosäurenkonzentration im Blutplasma des Fisches (Fast-Response) . Zu dieser Zeit befinden sich aber die anderen Aminosäuren aus den natürlichen Proteinquellen wie z.B. Sojamehl noch nicht im Plasma, was zur Asynchronität der gleichzeitigen Verfüg ^¬ barkeit aller wichtigen Aminosäuren führen kann. Ein Teil der hochkonzentrierten Aminosäuren wird in Folge dessen schnell ausgeschieden bzw. im Organismus schnell metaboli- siert und z.B. als reine Energiequelle genutzt. Dadurch kommt es beim Karpfen nur zu einer geringen bzw. keiner Wachstumssteigerung bei der Verwendung von kristallinen A- minosäuren als Futtermitteladditive (Aoe et al . , Bull. Jap. Soc. Sei. Fish. 1970, 36, 407-413). Bei Krustentieren kann die Supplementierung von kristallinen EAAs noch zu weiteren Problemen führen. Durch das langsame Fressverhalten von bestimmten Krustentieren wie z.B. Shrimps der Art Litopenaeus Vannamei kommt es, aufgrund der langen Verweilzeit des Fut ^¬ ters unter Wasser, zum Herauslösen der supplementierten, wasserlöslichen EAAs (Leaching) , was zur Eutrophierung des Gewässers und nicht zu einer Wachstumssteigerung der Tiere führt (Alam et al . , Aquaculture 2005, 248, 13-16) . Die ef ^¬ fektive Versorgung von Fischen und Krustentieren, die in Aquakulturen gehalten werden, erfordert somit für bestimmte Arten und Anwendungen eine spezielle Produktform der EAAs wie z.B. eine entsprechend chemisch oder physikalisch geschützte Form. Dabei ist das Ziel zum einen, dass das Pro ^¬ dukt während der Fütterung in der wässrigen Umgebung hinreichend stabil bleibt und nicht aus dem Futter herausge ^¬ löst wird. Zum anderen, dass das schließlich vom Tier auf- genommene Aminosäureprodukt im tierischen Organismus opti ^¬ mal und mit hoher Effizienz verwertet werden kann.

In der Vergangenheit wurden viele Anstrengungen unternommen, um geeignete Futtermitteladditive, im Besonderen auf der Basis der essentiellen Aminosäuren Methionin- und Ly- sin, für Fische und Krustentiere zu entwickeln. So wird beispielsweise in WO8906497 die Verwendung von Di- und Tri- peptiden als Futtermitteladditiv für Fisch- und Krustentieren beschrieben. Dadurch soll das das Wachstum der Tiere gefördert werden. Dabei kamen aber bevorzugt Di- und Tri- peptide aus nicht essentiellen und auch nicht limitierenden Aminosäuren wie z.B. Glycin, Alanin und Serin zum Einsatz, die in vielen pflanzlichen Proteinquellen mehr als ausreichend vorhanden sind. Als methioninhaltige Dipeptide wurde nur DL-Alanyl-DL-Methionin und DL-Methionyl-DL-Glycin be- schrieben. Dadurch sind im Dipeptid aber nur effektiv 50% Wirkstoff (mol/mol) enthalten, was unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten als sehr nachteilig einzustufen ist. In WO02088667 wird die enantioselektive Synthese und Anwendung von Oligomeren aus MHA und Aminosäuren wie z.B. Methionin als Futtermitteladditive, unter anderem auch für Fische und Krustentiere, beschrieben. Dadurch soll ein schnelleres

Wachstum erzielt werden können. Die beschriebenen Oligomere werden durch eine enzymkatalysierte Reaktion aufgebaut und weisen eine sehr breite Verteilung der Kettenlänge der einzelnen Oligomere auf. Dadurch wird das Verfahren unselek- tiv, teuer und aufwendig in der Durchführung und Aufreinigung. Dabrowski et al . beschreibt in US20030099689 die Ver ^¬ wendung von synthetischen Peptiden als Futtermitteladditive zur Wachstumsförderung für aquatische Tiere. Dabei können die Peptide einen Gewichtsanteil von 6-50% der gesamten Futterformulierung ausmachen. Die synthetischen Peptide bestehen bevorzugt aus EAAs . Die enantioselektive Synthese solcher synthetischer Oligo- und Polypeptide ist jedoch sehr aufwendig, teuer und großtechnisch schwer umsetzbar. Zudem ist die Wirksamkeit von Polypeptiden einer einzelnen Aminosäure umstritten, da diese oft nur sehr langsam oder gar nicht unter physiologischen Bedingungen zu freien Aminosäuren umgesetzt werden. So beschreibt beispielsweise Ba ^¬ ker et al. (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132), dass Poly-L- Methionin aufgrund der absoluten Unlöslichkeit in Wasser keine Biowertigkeit bei Hühnern aufweist, da eine Resorpti ^¬ on vom Organismus nicht möglich ist.

Diketopiperazine lassen sich auf mehrere verschiedene Wei ^¬ sen synthetisieren. So beschrieben beispielsweise Jainta et al. (Eur. J. Org. Chem. 2008, 5418-5424) die mikrowellenas- sistierte Synthese von cyclischen Dipeptiden durch Kondensation von Aminosäuren. Zheng-Zheng et al . (Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 1758-1761) beschrieben hingegen die Synthese mit Hilfe biomimetrischer Katalyse. In beiden Fäl ^¬ len werden Lösungsmittel bzw. Katalysatoren eingesetzt, die eine kostengünstige Herstellung der cyclischen Dipeptide unmöglich machen. Naraoka et al . (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1986, 1557- 1560) setzten Aminosäureester um, wobei die Reaktionsge ^¬ schwindigkeit bei den gewählten Reaktionsbedingungen sehr langsam und auch nach mehreren Tagen kein Vollumsatz zu verzeichnen war. Cyclische Dipeptide lassen sich auch aus gewöhnlichen Dipeptiden durch Wasserabspaltung gewinnen. Dies zeigten beispielsweise Kopple et al . (J. Org. Chem., 1968, 33, 862-864) und Tullberg et al . (Tetrahedron, 2006, 62, 7484-7491) . In beiden Fällen müssen jedoch brennbare oder giftige organische Lösungsmittel eingesetzt werden. Snyder et al . konnten cyclische Dipeptide gewinnen, indem sie bereits bestehende Diketopiperazinderivate wie z.B. chlorierte Diketopiperazine (Journal of the American Chemi ^¬ cal Society, 1944, 66, 1002-1004) oder vinylierte Diketopi- perazinderivate (Journal of the American Chemical Society, 1944, 66, 511-512) umfunktionalisierten . Weiterhin gelang Snyder et al . Die Synthese von cyclischen Dipeptiden aus Aminolactonen (Journal of the American Chemical Society, 1942, 64, 2082-2084) . In allen genannten Fällen sind im Vorfeld aufwändig zu synthetisierende Edukte notwendig. Ein gängiges Verfahren zur Synthese gemischter cyclischer Dipeptide ist außerdem die Anwendung der Schutzgruppentechnik, wie z.B. von DesMarteau et al . (Tetrahedron Letters, 2006, 47, 561-564) oder Egusa et al . (Bull Chem. Soc. Jpn . , 1986, 59, 2195-2201) angewandt wurde. Schutzgruppenchemie bedarf jedoch immer zusätzlicher Reaktionsschritte - einerseits um die Amino- oder die Carboxylatgruppe der zu kop ^¬ pelnden Aminosäuren zu schützen und andererseits nach der Kopplung die Schutzgruppen wieder zu entfernen. Eine Ver- einfachung stellt hierbei die Festphasensynthese dar. So konnten beispielsweise Lloyd-Williams et al . (Pept. 1990, Proc. Eur. Pept. Symp. 21st, 1991, 146-148), Compo ET AL . (Tetrahedron, 2009, 65, 5343-5349) oder Wang et al . (Tetra ^¬ hedron Letters, 2002, 43, 865-867) cyclische Dipeptide mit Hilfe der Festphasenchemie herstellen. Die Verwendung der Festphasensynthese ist zur Herstellung von cyclischen Di- Peptiden im Kilogramm-Maßstab nicht geeignet, da die Harze unverhältnismäßig teuer sind.

Neben dem Einsatz neuer chemischer Derivate von EAAs wie z.B. methioninhaltige Peptide und Oligomere wurden auch verschiedene physikalische Schutzmöglichkeiten wie z.B Coa- tings bzw. die Einbettung einer EAA in einer Schutzmatrix untersucht. So konnten beispielsweise Alam et al . (Aqua- cult. Nutr. 2004, 10, 309-316 und Aquaculture 2005, 248, 13-19) zeigen, dass gecoatetes Methionin und Lysin im Ge- gensatz zu nicht gecoatetem einen sehr positiven Einfluss auf das Wachstum von jungen Kuruma Shrimps besitzt. Obwohl die Verwendung eines speziellen Coatings das Leaching von Methionin und Lysin aus dem Futterpellet unterdrücken konnte, gibt es einige gravierende Nachteile. Die Herstellung bzw. die Beschichtung von Aminosäuren stellt meist ein technisch kompliziertes und aufwendiges Verfahren dar und ist daher teuer. Zudem kann die oberflächliche Beschichtung der fertig gecoateten Aminosäure leicht durch mechanische Belastung und Abrieb während der Futterverarbeitung beschä- digt werden, was zur Verminderung bzw. bis zum vollständigen Verlust des physikalischen Schutzes führen kann. Hinzukommt, dass durch ein Coating oder Verwendung einer Matrixsubstanz der Gehalt der Aminosäure verringert und damit oft unwirtschaftlich wird.

Aufgabe der Erfindung

Vor dem Hintergrund der Nachteile des Standes der Technik war es vor allem die Aufgabe, ein chemisch geschütztes Pro ^¬ dukt aus der kovalent gebundenen Kombination aus zwei es- sentiellen und limitierenden Aminosäuren wie z.B. DL-

Methionin, L-Lysin, L-Threonin oder L-Tryptophan für Wiederkäuer wie z.B. Milchkühe, aber auch für viele omni-, herbi- und karnivore Fisch- und Krustentierarten, die in Salz- oder Süßwasser leben, bereitzustellen. Insbesondere sollte dieses chemisch geschützte Produkt einen „Slow Re ^¬ lease ^s -Mechanismus, also eine langsame und kontinuierliche Freisetzung von freiem Methionin und EAA (EAA=essentielle Aminosäure) unter physiologischen Bedingungen besitzen. Zu- dem sollte die chemisch geschützte Produktform aus zwei gleichen oder verschiedenen EAAs pansenstabil sein und damit für alle Wiederkäuer geeignet sein. Für die Anwendung als Futtermitteladditiv für Fische und Krustentiere sollte die Produktform ein geringes Löslichkeitsverhalten aus dem Gesamtfutterpellet bzw. -extrudat im Wasser aufweisen (Lea- ching) . Darüber hinaus sollte das Futtermitteladditiv im Verdauungssystem des Fische und Krustentiere besser löslich sein als im umgebenden Salz- oder Süßwasser.

Eine weitere Aufgabe war es, ein Ersatzstoff für kristalli- ne EAAs als Futtermittel bzw. einen Futtermittelzusatzstoff mit sehr hoher Biowertigkeit aufzufinden, der gute Handhab ^¬ barkeit und Lagerfähigkeit sowie Stabilität unter den übli ^¬ chen Bedingungen der Mischfutterverarbeitung, insbesondere der Pelletierung und Extrusion aufweisen sollte. Auf diese Weise sollten Wiederkäuern, Fischen und Krustentieren neben den bekannten kristallinen, gecoateten oder Matrix geschützten EAAs, weitere effiziente Quellen essentieller Aminosäuren zur Verfügung gestellt werden, welche möglichst die Nachteile der bekannten Produkte nicht oder nur in verringertem Umfang aufweisen.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Futtermittel bzw. ei ^¬ nen Futtermittelzusatzstoff für die Tierernährung auf Basis eines sechsgliedrigen heterocyclischen Ringsystems (2,5- Piperazindion, Diketopiperazin [DKP] , cyclo-Dipeptid, De- hydrodipeptid) bereit, bei dem Aminosäurereste essentieller und limitierender Aminosäuren wie z.B. DL-Methionin, L- Lysin, L-Threonin und L-Tryptophan kovalent an den 3, 6- Positionen des Diketopiperazins gebunden sind und welcher als Futtermitteladditiv für die Ernährung von Wiederkäuern wie z.B. Milchkühe, insbesondere aber auch von Fischen und Krustentieren in Aquakulturen verwendet werden kann.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Futtermitteladditiv enthaltend mindestens ein Diketopiperazin (cyclisches Dipep- tid) mit der folgenden allgemeinen Formel IV oder ein Salz davon :

wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest R darstellen (vorzugsweise in der L-Konfiguration) ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R = - (CH ₂ ) ₂ SCH ₃ ) , Lysin (R = -(CH ₂ ) ₄ NH ₂ ), Threonin (R = -CH (OH) (CH ₃ ) ) , Tryptophan (R = - indolyl), Histidin (R = -imidazoyl) , Valin (R = -CH(CH ₃ ) ₂ ), Leucin (R = -CH ₂ CH ( (CH ₃ ) ₂ ) , Isoleucin (R = -CH (CH ₃ ) CH ₂ CH ₃ ) , Phenylalanin (R = -CH ₂ Ph) , Arginin (R = - (CH ₂ ) ₃ NHC (=NH) CH ₂ ) , Cystein (R = -CH ₂ SH) , wobei gegebenenfalls R ¹ gleich R ² sein kann; oder enthaltend mindestens eine Verbindung mit der folge den allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R ¹ ui R ² wie oben definiert sind

In einer bevorzugten Ausführungsform liegen R und/oder R ^' in der L-Konfiguration vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Futtermitteladdi- tivs ist R ¹ oder R ² ein Methionyl-Rest (R = -(CH ₂ ) ₂ SCH ₃ ) in der DD-, LL, LD- oder DL-Konfiguration .

Weiterhin ist bevorzugt, dass das im Futtermitteladditiv enthaltene Diketopiperazin als cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L- EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA oder Mi- schungen davon, insbesondere als Diastereomerengemisch cyc- lo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, wobei EAA eine Aminosäure aus ^¬ gewählt aus der Gruppe Metionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet. Zudem ist weiter bevorzugt, dass R ¹ und R ² jeweils einen

Methionyl-Rest (R = -(CH ₂ ) ₂ SCH ₃ ) darstellen, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; dabei ist bevorzugt, (d.h. wenn R ¹ und R ² gleich -(CH ₂ ) ₂ SCH ₃ sind), dass das Di- ketopiperazin mit der LL-Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt.

Besonders bevorzugt ist, dass das im Futtermitteladditiv enthaltene Diketopiperazin als Diastereomerengemisch

DD/LL/meso-cyclo-Met-Met vorliegt (d.h. als Mischung von DD/LL-cyclo-Met-Met und meso-cyclo-Met-Met ) , wobei Met Methionin bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Futtermittelmischung enthaltend das oben beschriebene Futtermitteladdi- ti .

In einer bevorzugten Ausfühungsform der Futtermittelmischung sind zusätzlich in Mischung enthalten: eine oder mehrere der folgenden Substanzen: DL-Methionin, L-EAA, DL- EAA, die Diastereomerengemische DD/LL/DL/LD-Methionyl- EAAbzw . DD/LL/DL/LD-EAA-Methionin, DD/LL-Methionyl-EAA,

DD/LL-EAA-Methionin, D-Methionyl-L-EAA, L-Methionyl-L-EAA, D-Methionyl-D-EAA, L-Methionyl-D-EAA, D-EAA-L-Methionin, L- EAA-L-Methionin, D-EAA-D-Methionin, L-EAA-D-Methionin, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit DL-Methionin, vorzugsweise mit einem DL-Methioninanteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevor ^¬ zugt von 1 bis 30 Gew. -%, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit einer L-EAA wie beispielsweise L-Lysin, vorzugsweise mit einem L-EAA Anteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.

Das Futtermitteladditiv enthaltend Diketopiperazine (cycli- sche Dipeptide) und deren Salze ist geeignet als Additiv in Futtermischungen für Wiederkäuer, insbesondere aber auch für Fische und Krustentiere aus Aquakulturen. Besonders be ^¬ vorzugt ist die Verwendung als Additiv in Futtermischungen für Wiederkäuer.

In bevorzugter Weise enthält die Futtermittelmischung 0,01 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-% Diketopipera- zin, allein oder in Mischung mit einer oder mehrere freien Aminosäuren (EAA) , in Mischung eines oder mehrerer natürlicher oder unnatürlicher Dipeptide (EAA-EAA) oder in Mi- schung enthaltend Aminosäuren (EAA) und Dipeptide (EAA- EAA) .

Die Verwendung von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (cyclo-Met-Met, Methionin-diketopiperazin) hat sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, weil dieses Diketopiperazin ein besonders gutes Leaching- Verhalten aufgrund der niedrigen Löslichkeit aufweist.

Weiterhin zeigt die Verbindung eine gute Pelletier- und Extrusionsstabilität bei der Futtermittelherstellung. Die Diketopiperazine sind stabil in Mischungen mit üblichen

Komponenten und Futtermitteln wie z.B. Getreide (z.B. Mais, Weizen, Tritikale, Gerste, Hirse, u.a.), pflanzliche oder tierische Eiweißträger (z.B. Sojabohnen und Raps und deren Weiterverarbeitungsprodukte, Leguminosen (z.B. Erbsen, Boh- nen, Lupinen, etc.), Fischmehl, u . a . ) und in Kombination mit supplementierten essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Vitaminen, Mineralien, Fetten und Ölen.

Weiterhin ist von Vorteil, dass durch den besonders hohen Wirkstoffanteil von Diketopiperazinen pro kg Substanz, im Vergleich zu zwei Mol Aminosäuren pro Mol Diketopiperazin zwei Mole Wasser eingespart werden.

Darüber hinaus ist das Diketopiperazin als Feed Additiv für in Aquakulturen gehaltene Fische und Krustentiere besonders geeignet, da die Löslichkeit des Diketopiperazins allgemein sehr gering ist (siehe Abb. 2), sich jedoch im Verdauungstrakt der Fische bzw. Krustentiere besser löst als im unge- benden Wasser (siehe Abb. 1) .

In einer bevorzugten Verwendung enthält die Futtermittelmi- schung Proteine und Kohlenhydrate, vorzugsweise auf Basis von Fisch-, Soja- oder Maismehl, und können mit essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Vitaminen, Mineralien, Kohlenhydraten, Fetten und Ölen supplementiert sein. Insbesondere ist bevorzugt, dass in der Futtermittelmi ^¬ schung cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D- EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbesondere als Diastereomerenge- misch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, bevorzugt jeweils zu ^¬ sätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA wie beispielsweise Methionin, Lysin, Threonin oder Tryptophan, jeweils allein oder in Mischung untereinander, vorzugsweise mit einem Aminosäureanteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevor- zugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.

Weiterhin ist bevorzugt, dass in der Futtermittelmischung cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L- EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbesondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit Dipeptiden der allgemeinen Formel EAA-EAA, allein als L-EAA-L-EAA, D-EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA und D-EAA-D- EAA oder in Mischungen untereinander, insbesondere als Di- astereomerengemisch DL-EAA-DL-EAA, vorliegt bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA wie beispielsweise Methionin, Lysin, Threonin oder Tryptophan, jeweils allein oder in Mischung untereinander, vorzugsweise mit einem Aminosäureanteil und/oder Dipeptidan- teil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.- %, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.

Gemäß der Erfindung wird das Diketopiperazin cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L- EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinan- der, insbesondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA- DL-EAA, oder im Falle von geladenen EAA-Resten wie z.B. im Falle von Lysin, Histidin oder Arginin dessen Alkali- und Erdalkalisalze wie z.B. die schwerlöslichen Calcium- oder Zinksalze, alleine oder in Mischung mit jeweils zusätzlich in Mischung mit Dipeptiden der allgemeinen Formel EAA-EAA, allein als L-EAA-L-EAA, D-EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA und D-EAA- D-EAA oder in Mischungen untereinander, insbesondere als Diastereomerengemisch DL-EAA-DL-EAA, vorliegt bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA vorzugsweise für Wiederkäuer und besonders bevorzugt für Fische und Krustentiere, verwendet (siehe Schema 1) :

cyclo-L-EAA-D-EAA cyclo-D-EAA-D-EAA

Schema 1

Dabei stehen die Reste R und R der EAAs für:

R = 2- (methylthio) ethyl) - (Methionin

R = 1-Methylethyl- (Valin)

R = 2-Methylpropyl- (Leucin)

R = (15) -1-Methylpropyl- ( Isoleucin

R = (1R) -1-Hydroxyethyl- (Threonin)

R = 4-Aminobutyl- (Lysin)

R = 3- [ (Aminoiminomethyl ) -amino ] propyl- (Arginin9 R Benzyl- ( Phenylalanin)

R (lfi-Imidazol-4-yl) methyl- (Histidin)

R (lH-Indol-3-yl) methyl- (Tryptophan)

R Mercaptomethyl- (Cystein) Im Falle des Cystins liegt eine Verbindung der Formel (cyc- lo-EAA-Cystin) -S-S- (cyclo-Cys-EAA) vor.

In einer bevorzugten Verwendung sind die in Aquakulturen gehaltene Tiere Süß- und Salzwasserfische und -krustentiere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Karpfen, Forellen, Lachse, Welse, Barsche, Plattfische, Störe, Thunfische, Aa ^¬ le, Brassen, Dorsche, Shrimps, Krill und Prawns, ganz be ^¬ sonders für Silver- (Hypophthalmichthys molitrix) , Gras- (Ctenopharyngodon idella) , Schuppen- (Cyprinus carpio) und Bigheadkarpfen (Aristichthys nobilis) , Karausche (Carassius carassius) , Catla (Catla Catla) , Roho Labeo (Labeo rohita) , pazifischer und atlantischer Lachs (Salmon salar und On- corhynchus kisutch) , Regenbogenforelle (Oncorhynchus my- kiss) , amerikanischer Wels (Ictalurus punctatus) , afrikani- scher Wels {Ciarias gariepinus) , Pangasius (Pangasius bo- courti und Pangasius hypothalamus) , Niltilapie (Oreochromis niloticus) , Milchfisch (Chanos chanos) , Cobia (Rachycentron canadum) , Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) , Black Ti ^¬ ger Shrimp (Penaeus monodon) und Giant River Prawn (Mac- robrachium rosenbergii) .

Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Diketopiperazinen (cyclo-Dipeptiden) allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbe- sondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, als Wachstumspromotor für Wiederkäuer, aber auch für omni-, carni- und herbivore Fische und Krustentiere in Aquakultu ^¬ ren. Zudem kann durch die Verwendung von cyclo-DL-EAA-DL- EAA als Futtermitteladditiv die Milchproduktion bei Hoch- leistungsmilchkühen gesteigert werden. So konnte erfinderisch gezeigt werden, dass DD/LL/meso- cyclo-Met-Met als Diastereomerengemisch aus einer 50:50- Mischung von DD/LL-cyclo-Met-Met und meso-cyclo-Met-Met un ^¬ ter physiologischen Bedingungen enzymatisch von Fischen wie z.B. Karpfen und Forellen zu freiem D- bzw. L-Methionin gespalten werden kann (siehe Abb. 3) .

Weiterhin konnte erfinderisch gezeigt werden, dass gemischte cyclische Dipeptide wie z.B. cyclo-D-Met-L-Leu, cyclo D- Met-L-Phe oder cyclo-D-Met-L-Lys unter physiologischen Be- dingungen enzymatisch von Verdauungsenzymen aus Spiegelkarpfen in in vitro Spaltungsversuchen gespalten werden konnte (siehe Abb. 5-8) . Damit eignen sich auch nicht na ^¬ türliche cyclische Dipeptide mit D-Aminosäuren (D-EAA) als Futtermitteladditive (siehe Schema 2) . Dazu wurden die entsprechenden Verdauungsenzyme aus Omnivo ^¬ ren Karpfen und karnivoren Forellen isoliert und in optimierten in vitro Versuchen unter physiologisch vergleichbaren Bedingungen mit DD/LL/meso-cyclo-Met-Met als Diastereo ^¬ merengemisch aus einer 50 : 50-Mischung von DD/LL-cyclo-Met- Met und meso-cyclo-Met-Met umgesetzt. Die erfindungsgemäße Besonderheit der Spaltung von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met liegt darin, dass neben dem in der Nahrung auf natürliche Art und Weise auftretenden Diastereomer cyclo-L-Met-L-Met auch die Diastereomere cyclo-D-Met-L-Met und cyclo-D-Met-D- Met unter physiologischen Bedingungen gespalten werden können (siehe Abb. 3 und 4) . Unter in vitro Bedingungen sind isolierte Enzymcocktails aus Verdauungssystemen von Fischen nur kurze Zeit aktiv, sodass über die mehrstündige Reakti ^¬ onszeit die Spaltungsgeschwindigkeit drastisch abnimmt und schließlich zum Erliegen kommt, obwohl das cyclische Dipep- tid noch nicht vollständig umgesetzt wurde. Es ist davon auszugehen, dass unter in vivo Bedingungen im lebenden Fisch die Enzymaktivität deutlich höher ist, durch ständige Erneuerung der Enzyme stabil bleibt und letzendlich auch zur vollständigen Verwertung des Futtermitteladditives führt .

cyclo-D-Met-L-

Verdauungs- ι _{H 0}

enzyme ¹

D-Met-L-EAA -EAA- D-Met

VerdauungsH?0

enzyme

-Met -L-EAA L-EAA-L-Met

VerdauungsH ₂ 0

enzyme

cyclo-L-Met -L-EAA

Schema 2 Die Diketopiperazine wurden mit Verdauungsenzymen aus car- nivoren Regenbogenforellen und Omnivoren Spiegelkarpfen in- vitro verdaut. Dazu wurden die Enzyme aus den Verdauungs ^¬ trakten der Fische und Shrimps separiert. Die Diketopipera- zine würden anschließend mit den erhaltenen Enzymlösungen versetzt. Für eine bessere Vergleichbarkeit der Verdaulich ^¬ keiten von Dipeptiden verschiedener Spezies wurden gleiche Bedingungen für die in vitro Verdauungsuntersuchungen gewählt (37°C, pH 9) . Wie aus den Abbildungen 3 und 4 hervorgeht, kann das Di- astereomerengemisch DD/LL/meso-cyclo-Met-Met bzw. das Di- astereomere DD/LL-cyclo-Met-Met von Verdauungsenzymen der Regenbogenforelle und des Spiegelkarpfens gespalten werden. Die enzymatischen Spaltungen in den aufgeführten Beispielen sind nicht quantitativ verlaufen, da die Enzyme in den in vitro-Verdauversuchen unter den gewählten Bedingungen

(37°C, pH 9) nur kurze Zeit stabil sind und die Enzymakti ^¬ vität bereits nach kurzer Zeit drastisch abnimmt. Es ist davon auszugehen, dass die Reaktion unter in vivo Bedingun- gen deutlich schneller und effizienter abläuft.

Aus den erhaltenen Ergebnissen geht hervor, dass sowohl natürliche cyclische Dipeptide (z.B. cyclo-L-Met-L-Met) , als auch unnatürliche cyclische Dipeptid (z.B. cyclo-D-Met-D- Met und cyclo-D-Met-L-Met ) von Verdauungsenzymen carnivorer und omnivorer Fischarten in vitro gespalten werden können. Durch Zugabe von natürlichen und unnatürlichen cyclo-Met- Met Diketopiperazinen zum Futter können also defiziente essentielle Aminosäuren (hier: DL-Met) gezielt zudosiert wer ^¬ den . Die Aufgabe wird zudem gelöst durch ein Diketopiperazin o- der ein Salz davon, mit der folgenden allgemeinen Formel IV: IV wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest darstellen ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R ^{1 2} = - (CH ₂ ) ₂ SCH ₃ ), Lysin (R ^1/2 = -(CH ₂ ) ₄ NH ₂ ), Threonin (R ^1/2 = - CH (OH) (CH ₃ ) ) , Tryptophan (R ^1/2 = -indolyl) , Histidin (R ^1/2 = -imidazoyl), Valin (R ^1/2 = -CH(CH ₃ ) ₂ ), Leucin (R ^1/2 = - CH ₂ CH ( (CH ₃ ) ₂ ) , Isoleucin (R ^1/2 = -CH (CH ₃ ) CH ₂ CH ₃ ) , Phenylalanin (R ^1/2 = -CH ₂ Ph) , Arginin (R ^1/2 = - (CH ₂ ) ₃ NHC (=NH) CH ₂ ) , Cystein (R ^{1 2} = -CH ₂ SH) , wobei gegebenenfalls R ¹ gleich R ² sein kann; mit der Voraussetzung dass wenn R ¹ und R ² gleich -(CH ₂ ) ₂ SCH ₃ sind, dann das Diketopiperazin nicht ausschließlich als cyclo-L-Met-L-Met vorliegt; oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R ¹ und R ² wie oben definiert sind

In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die C-Atome mit R ¹ und/oder R ² in der L-Konfiguration vor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R oder R ² ein Methionyl-Rest (R = -(CH ₂ ) ₂ SCH ₃ ) in der DD-, LL, LD- oder DL-Konfiguration an den zugehörigen C-Atomen. In bevorzugter Weise liegt das Diketopiperazin als cyclo-D- EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L- EAA-L-EAA oder Mischungen davon, insbesondere als Diastere- omerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vor, wobei EAA eine Ami- nosäure ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threo- nin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet.

Weiterhin ist bevorzugt, dass R ¹ und R ² jeweils einen

Methionyl-Rest (R = - ( CH2 ) 2 S CH3 ) darstellt, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; mit der Voraussetzung, dass wenn R ¹ und R ² gleich - ( CH2 ) 2 S CH3 sind, das Diketopipe ^¬ razin mit der LL-Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt. In einer weiteren Ausführungsform liegt das Diketopiperazin in einer Mischung als DD/LL/meso-cyclo-Met-Met , vorzugswei ^¬ se in einer 50 : 50-Mischung aus DD/LL-cyclo-Met-Met und me- so-cyclo-Met-Met , vor.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung der Diketopiperazine bereit als Futtermitteladditiv für Wiederkäuer, Süß- oder Salzwasserfische und Krustentiere.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Diketopiperazins mit der folgenden allge ^¬ meinen Formel IV oder ein Salz davon:

IV oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel oder ein Salz davon,

aus einem oder mehreren Aminosäureestern der folgenden all- gemeinen Formel III:

wobei R und R unabhängig voneinander wie folgt definiert sind :

Formel IV und V:

_R l/2 = 2- (methylthio) ethyl) - (Methionin)

_R l/2 = 1-Methylethyl- (Valin)

_R l/2 = 2-Methylpropyl- (Leucin)

_R l/2 = (15) -1-Methylpropyl- ( Isoleucin)

_R l/2 = ( 1R) -1-Hydroxyethyl- (Threonin)

_R l/2 = 4-Aminobutyl- (Lysin)

_R l/2 = 3- [ (Aminoiminomethyl ) -amino ] propyl- (Arginin)

_R l/2 = Benzyl- ( Phenylalanin)

_R l/2 = (lfi-Imidazol-4-yl) methyl- (Histidin)

_R l/2 = (lH-Indol-3-yl) methyl- (Tryptophan)

_R l/2 = Mercaptomethyl- (Cystein)

Formel III:

R ^1/2 = -CH2-S-S-CH2-CH (NH ₂ ) COOR ^' (Cystin) wobei gegebenenfalls R gleich R sein kann;

und wobei R lineare oder verzweigte aliphatische Reste o- der aromatische Reste definiert und verschiedene R ^' in ver ^¬ schiedenen Aminosäureestermolekülen vorkommen können;

wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopipera- zin in Substanz erfolgt.

In einem bevorzugten Verfahren wird der Aminosäureester der allgemeinen Formel III durch Veresterung einer Aminosäure mit der allgemeinen Formel I R ^1/2 -CH (NH ₂ ) -COOH oder Cystin mit einer Verbindung mit der allgemeinen Formel II R'-OH, gewonnen .

Weiterhin ist bevorzugt, dass die Veresterung in Anwesenheit einer starken Säure durchgeführt wird, vorzugsweise in Anwesenheit von HCl oder H ₂ SO ₄ . In einem bevorzugten Verfahren ist der Rest R ^' ein Ci-Cs- Alkylrest, weiter bevorzugt ein Ci-C6-Alkylrest besonders bevorzugt ein Ci-C ₄ -Alkylrest , wobei der Alkylrest jeweils linear ist oder ggf. verzweigt sein kann.

In einem bevorzugten Verfahren ist der Rest R' ausgewählt aus der Gruppe Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n- Butyl, iso-Butyl, sek.-Butyl, Benzyl-.

In einem anderen bevorzugten Verfahren ist der Rest R' ein C ₂ -C8-Alkenylrest , weiter bevorzugt ein C ₂ -C6-Alkenylrest besonders bevorzugt ein C ₂ ^~ C ₄ -Alkenylrest , wobei der Alke- nylrest jeweils linear ist oder ggf. verzweigt sein kann.

In einem bevorzugten Verfahren wird vor der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin der Aminosäurester aufkonzentriert . Wie oben erwähnt erfolgt die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin erfindungsgemäß in Substanz und zwar ohne Verwendung von Lösungsmitteln. Dies bedeutet, dass gemäß der Erfindung bei der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin, keine Lösungsmittel, insbesondere kei ^¬ ne organischen, polaren oder wässrigen Lösungsmittel, und insbesondere vorzugsweise keine Basen vorhanden sind, außer den folgenden Substanzen: das bei der Umsetzung entstehende Diketopiperazin selbst und die Verbindung mit der allgemei- nen Formel R'-OH, welche während der Umsetzung destillativ entfernt wird.

Besonders bevorzugt erfolgt die Umsetzung des Aminosäurees ^¬ ters zum Diketopiperazin ohne Verwendung von Transamidie- rungskatalysatoren . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin in Reinsubstanz, vorzugsweise mit einer Reinheit von > 50 Gew.-%, bevorzugt > 90% Gew.-%, besonders bevorzugt von > 95 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von > 98 Gew.-%. In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin bei einer Tempera ^¬ tur von 30 bis 220°C, bevorzugt bei einer Temperatur von 50 bis 170°C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 70 bis 140°C durchgeführt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin bevorzugt durch destillatives Abtrennen der Verbindung mit der allgemeinen Formel R'-OH (z.B. ein Alkanol) durchgeführt, beispielswei ^¬ se unter Eigendruck, Normaldruck oder vermindertem Druck, bevorzugt bei einem Druck von 0,01 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 0,05 bis 1,5 bar, ganz besonders bevorzugt bei Atmosphärendruck. Vorzugsweise wird das Diketopiperazin bei der genannten Destillation durch Kristallisation erhalten.

In einem weiteren bevorzugten Verfahren kann der bei der Reaktion nicht vollständig umgesetzte Aminosäureester rück- gewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden.

Auch kann in einem wiederum weiteren bevorzugten Verfahren die bei der Veresterung der Aminosäure zum Aminosäureester nicht vollständig umgesetzte und/oder die bei der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin wieder erhaltene Verbindung mit der allgemeinen Formel R'-OH rückgewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden.

Insbesondere ist dabei bevorzugt, dass der Aminosäureester in der DL, L- oder D-Konfiguration aus der Gruppe Methio- nin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein, Cystin in Reinsubstanz ohne Verwendung von Lösungsmitteln erwärmt wird. Sowohl die hierbei abgespaltene Verbindung R'-OH (z.B. ein Alkanol) , als auch nicht umgesetzter Aminosäureester können vollständig recycliert und dem Prozess erneut zugeführt werden (siehe Schema 3 und 4) . Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Ester vorzugsweise zunächst aus der in einer Verbindung R'-OH (z.B. ein Alkanol) suspendierten freien Aminosäure unter Wasserapspaltung durch Zugabe einer starken Säure wie z.B. HCl oder H2 S O4 gewonnen. Nach Freisetzung des Aminosäureesters, z.B. aus dessem Hydrochlorid, durch eine Base wie z.B. NH3 oder K2CO3 und Aufkonzentration wird das resultierende Öl (d.h. das Diketopiperazin in Reinsubstanz) erwärmt, wobei der Alkohol destillativ abge- trennt und das cyclische Dipeptid (Diketopiperazin der For ^¬ mel IV) hochselektiv aus der Reaktionsmischung auskristallisiert. Nach Filtration und Waschen des Produktes mit ei ^¬ nem Lösungsmittel wird nicht umgesetzter Aminosäureester zurückgewonnen und kann dem Prozess wieder zugeführt werden .

Schema 3

Es ist hierbei zu beachten, dass Schema 3 vereinfacht dar ^¬ gestellt ist, denn das Reaktionsschema lässt unberücksich ^¬ tigt, dass verschiedene Aminosäure-Moleküle eingesetzt er ^¬ den können bzw. verschiedene Aminosäureester verwendet werden können, bezogen auf den Aminosäurerest aber auch möglicherweise bezüglich R' .

EAA

Veresterung

recycli e rter

Alkohol

DKP-Synthese

recyclierter

EAA-Ester

Filtration

DKP ( cyclo-Dipeptid)

Schema 4

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können zur Synthese von gemischten Diketopipera- zinen der allgemeinen Formel cyclo-EAA-EAA zwei oder mehr verschiedene Aminosäureester in der DL, L- oder D- Konfiguration aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein, Cystin in beliebigen Mischungen untereinander umgesetzt werden.

Weiterhin kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in dem Fachmann bekannten Batch-Verfahren oder in kontinuierlichen Verfahren ausgeführt werden.

Abbildungen Die Abbildung 1 zeigt die Löslichkeit von cyclo-DL-Met-DL- Met in Gallenflüssigkeit/Wasser-Mischungen (Gallenflüssigkeit aus Spielgelkarpfen entnommen) .

Die Abbildung 2 zeigt Löslichkeit von cyclo-DL-Met-DL-Met in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung.

Die Abbildung 3 zeigt die Spaltung von DD/LL/meso-cyclo- Met-Met mit Enzymen aus der Regenbogenforelle.

Die Abbildung 4 zeigt die Spaltung von DD/LL-cyclo-Met-Met mit Enzymen aus Spiegelkarpfen. Die Abbildung 5 zeigt die Spaltung von cyclo-L-His-L-His mit Enzymen aus Spiegelkarpfen.

Die Abbildung 6 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Leu mit Enzymen aus Spiegelkarpfen.

Die Abbildung 7 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Phe mit Enzymen aus Regenbogenforelle.

Die Abbildung 8 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Lys mit Enzymen aus Regenbogenforelle.

Die Abbildung 9 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Thr mit Enzymen aus Whiteleg Shrimp.

Beispiele Beispiel 1 :

Synthese von DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe)

200 g (1,34 Mol) DL-Methionin wurden in 1 L Methanol sus- pendiert. In diese Suspension wird solange HCl-Gas einge ^¬ leitet, bis der Feststoff gelöst war und dann noch 1 Stunde mit dem Einleiten fortgefahren. Die Temperatur stieg dabei bis auf 60°C an. Anschließend wurden ca. 200 mL Methanol aus der Reaktionslösung bei 30°C am Rotationsverdampfer abdestilliert, hierbei wird der Hauptteil des überschüssigen HCL-Gases entfernt. In die verbleibende Lösung wird an ^¬ schließend bei 10-20°C so lange H ₃ ^~ Gas eingeleitet, bis die Reaktionslösung deutlich alkalisch reagiert. Das ausgefallene NH ₄ C1 wur abgesaugt und mit Methanol nachgewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdamper eingeengt, in 750 mL Ethylacetat aufgenommen, 2 mal mit je 50 mL 10%iger K ₂ CO ₃ - Lösung gewaschen. Über MgSC^ getrocknet und am Rotations- Verdampfer eingeengt.

Auswaage: 203 g (93% d. Th.) leicht gelbliches klares Öl Das ¹ R und ¹³ C-NMR stimmte mit den Literaturwerten überein.

Beispiel 2 :

Synthese von DL-Methionin-iso-propylester (DL-Met-OiPr)

200 g (1,34 Mol) DL-Methionin wurden in 1 L iso-Propanol suspendiert. In diese Suspension wird solange HCl-Gas ein ^¬ geleitet, bis der Feststoff gelöst war und dann noch 1 Stunde mit dem Einleiten fortgefahren. Die Temperatur stieg dabei bis auf 60°C an. Anschließend wurden ca. 200 mL iso- Propanol aus der Reaktionslösung bei 30°C am Rotationsverdampfer abdestilliert, hierbei wird der Hauptteil des über ^¬ schüssigen HCL-Gases entfernt. In die verbleibende Lösung wird anschließend bei 10-20°C so lange H ₃ ^~ Gas eingeleitet, bis die Reaktionslösung deutlich alkalisch reagiert. Das ausgefallene NH ₄ C1 wur abgesaugt und mit iso-Propanol nach ^¬ gewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdamper eingeengt, in 750 mL Ethylacetat aufgenommen, 2 mal mit je 50 mL 10%iger K ₂ C0 ₃ ~Lösung gewaschen. Über MgSC^ getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt.

Auswaage: 233 g (91% d. Th.) leicht gelbliches klares Öl Das ¹ R und ¹³ C-NMR stimmte mit den Literaturwerten überein. Beispiel 3:

Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (DD/LL/meso-cyclo-Met-Met) aus DL-Methioninmethylester (DL- Met-OMe)

272 g (1,67 Mol) DL-Methioninmethylester wurden unter gutem Rühren auf 130 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Tempera ^¬ tur gerührt. Dabei wurden 36 g Methanol abdestilliert und das cyclo-Met-Met kristallisierte aus. Nach dem Abkühlen wurde der Kristallbrei mit 250 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit Methanol gewaschen und im Vaku- umtrockenschrank bei 30 °C getrocknet. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer bei 40 °C eingeengt und dem nachfolgenden Ansatz wieder zugeführt. Auswaage: 149 g (68% d. Th.) weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) , Schmelzpunkt 235-236°C.

¹ H-NMR von 3 , 6-Bis [ 2 - (methylthio ) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 1, 85-2, 05 (m, 4H, 2 x SCH ₂ CH ₂ ) ;

2, 049 (s, 6H, 2 x SCH ₃ ) ; 2, 46-2, 60 (m, 4H, 2 x SCH ₂ ) ; 3,92- 3, 99 (m, 2H, 2 x CH) ; 8,213 (s, 2H, 2 x NH)

¹³ C-NMR von 3 , 6-Bis [ 2 - (methylthio ) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,35 (CH ₃ ) ; 14,38 (CH ₃ ) ; 28,50 (CH ₂ S); 28, 68 (CH ₂ S) ; 31,92 (CH ₂ CH ₂ S); 32, 33 (CH ₂ CH ₂ S); 52,92 (CH) ; 52,96 (CH) ; 167,69 (C=0) ; 167,71 (C=0) Elementaranalyse für Ci ₀ H ₁₈ N ₂ O ₂ S ₂ (M = 262, 39 g/mol) :

Berechnet: C 45,77; H 6,91; N 10,68; S 24,44

Gefunden: C 45,94; H 6,96; N 10,64; S 24,38 Beispiel 4 :

Synthese von 3 , 6-Bis- (S) - (lH-imidazol-4-yl) -2 , 5- piperazindion (cyclo-L-His-L-His) aus L-Histidinmethylester (L-His-OMe)

8,46 g (50 mMol) L-Histidmmethylester (L-His-OMe) wurden unter gutem Rühren auf 80 °C erwärmt und 5 Stunden im Wasserstrahlvakuum bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Ab kühlen wurde der Kristallbrei mit 25 mL Ethylacetat ver ^¬ setzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit Ethylacetat gewa ^¬ schen und im Olpumpenvakuum getrocknet.

Auswaage: 7,80 g (57% d. Th.) als weißer Feststoff. Έ-NMR von 3 , 6-Bis- ( S) - ( 1H-imidazol-4 -yl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-L-His-L-His) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 2,94 (dd, ³ J = 6,8 Hz, ¹ J = 15,4 Hz, 2H, 2 x CH'H" ) ; 3,07 (dd, ³ J = 3,8 Hz, ¹ J = 15,4 Hz, 2H, 2 x CH'H"); 4, 30-4, 34 (m, 2H, 2 x CH) ; 7,31 (bs, 2H, 2 x N=CH-N) ; 8,17 (bs, 2H, 2 x NH) ; 8,82 (bs, 2H, 2 x NH-CH=C) ; 13-15 (bs, 2H, 2 x CH-NH-CH)

Beispiel 5:

Synthese der cyclischen cyclo-Met-Leu Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Leucinmethylester (L-Leu-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio)ethyl] -6- (S) - (2- (methyl) ropyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3, 63 g (25 mMol) L-Leucinmethylester (L-Leu-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Ab- kühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Leu wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .

3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- (methyl ) propyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu) :

Auswaage: 320 mg (59% d. Th.) als weißer Feststoff.

H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- (methyl ) propyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 0,87 (d, ³ J = 6,6 Hz, 3H, CH (CH ₃ ) (CH ₃ ) ) ; 0,88 (d, ³ J = 6,6 Hz, 3H, CH (CH ₃ ) (CH ₃ ) ) ; 1, 50-1, 58 (m, 2H, SCHCH ₂ ) ; 1, 72 - 1, 84 (m, 1H, CH(CH ₃ ) ₂ ); 1, 88-2, 02 (m, 2H, (CH ₃ ) ₂ HCH ₂ ) ; 2,04 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2, 44-2, 58 (m, 2H, SCH ₂ ) ; 3,68-3,74 (m, 1H, CH) ; 3,94-4,00 (m, 1H, CH) ; 8.11 (bs, 1H, NH) ; 8.19 (bs, 1H, NH)

¹³ C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- (methyl) propyl) -2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu)

(125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,40; 21,82; 22,77; 23,51;

28,51; 31,28; 41,92; 52,50; 52,90; 167,67; 168,82

Beispiel 6:

Synthese der cyclischen cyclo-Met-Phe Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-

Phenylalaninmethylester (L-Phe-OMe) und Isolation eines Di- astereomers 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- phenylmethyl) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 4,48 g (25 mMol) L-Phenylalaninmethylester (L-Phe-OMe) wur- den unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2,5 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 30 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Phe wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .

3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2-phenylmethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) :

Auswaage: 360 mg (77% d. Th.) als weißer Feststoff.

H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- phenylmethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 1, 76-1, 82 (m, 2H, SCHCH ₂ ) ; 1,97 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2, 30-2, 46 (m, 2H, SCH ₂ ) ; 2,89 (dd, 1H, ³ J = 4,8 Hz, ¹ J = 13,5 Hz, PhCH'H"); 3,05 (t, ³ J = 5,0 Hz, 1H, CH) ;

2,89 (dd, 1H, ³ J = 4,8 Hz, = 13,5 Hz, PhCH'H"); 4,10- 4,16 (m, 1H, CH) ; 7,14-7,30 (m, 5H, Ph) ; 8.03 (bs, 1H, NH) ; 8.13 (bs, 1H, NH) ¹³ C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- phenylmethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) (125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,38; 28,22; 31,56; 38,44; 52,16;

55,43; 126,64; 128,00; 129,97; 135,92; 167,24; 167,33

Beispiel 7:

Synthese der cyclischen cyclo-Met-Thr Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Threoninmethylester (L-Thr-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (1- (R) -Hydroxyethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,33 g (25 mMol) L-Threoninmethylester (L-Thr-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 100 °C erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 150 mL Methanol ver ^¬ setzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewa ^¬ schen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Thr wurden an einer Kieselgel-Säule mit n-

Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .

3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (1- (R) -Hydroxyethyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) :

Auswaage: 250 mg (54% d. Th.) als weißer Feststoff.

H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] -6- (S) - ( 1 - (R) - Hydroxyethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 1,09 (d, 3H, ³ J = 6,3 Hz, CH(OH)CH ₃ ); 1, 86-2, 02 (m, 2H, SCH ₂ CH ₂ ) ; 2,04 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2,42-2,60

(m, 2H, SCH ₂ ) ; 2, 42-2, 46 (m, 1H, CH) ; 4, 00-4, 06 (m, 2H, CH, OCH ₃ ) ; 4,98 (d, ³ J = 5,3 Hz, 1H, OH); 8.01 (bs, 1H, NH) ; 8.07 (bs, 1H, NH)

¹³ C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - (1- (R) - Hydroxyethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) (125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,41; 19,88; 28,50; 30,77; 52,06;

60,93; 68,17; 168,61; 168,69

Beispiel 8 : Synthese der cyclischen cyclo-Met-Lys Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Lysinmethylester (L-Lys-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (S) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (4-Aminobutyl) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L-Lys x HCl)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,33 g (25 mMol) L-Lysinmethylester Monohydrochlorid (L- Lys-OMe x HCl) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlva ^¬ kuum auf 130°C erwärmt und 1,5 Stunden bei dieser Tempera- tur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 150 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Lys wurden an einer Kieselgel- Säule mit n-Butanol/Ethylacetat/Triethylamin = 70:30:2 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde ex ^¬ emplarisch in ethanolischer HCl-Lösung gelöst, wieder eingeengt, am Ölpumpenvakuum von Lösungsmittelresten befreit und charakterisiert.

3- (5) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (4-Aminobutyl) -2,5- piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L-Lys x HCl) :

Auswaage: 190 mg (40% d. Th.) als weißer Feststoff.

H-NMR von 3- ( S) -[ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( S) -( 4 - Aminobutyl ) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L- Lys x HCl) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 1, 26-1, 44 (m, 2H, CH ₂ ) ; 1, 50-1, 60 (m, 2H, CH ₂ ) ; 1, 62-1, 74 (m, 2H, CH ₂ ) ; 1,82-1,92 (m, 2H, SCHCH ₂ ) ; 2,04 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2, 50-2, 60 (m, 2H, SCH ₂ ) ; 2, 70-2, 78 (m, 2H, NCH ₂ ) ; 3, 82-3, 88 (m, 1H, CH) ;

3, 92-3, 96 (m, 1H, CH) ; 8,01 (bs, 3H, NH ₃ ⁺ ) ; 8.16 (bs, 1H, NH) ; 8.19 (bs, 1H, NH)

¹³ C-NMR von 3- ( S) -[ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( S) -( 4 - Aminobutyl ) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L- Lys x HCl) (125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,38; 21,02; 26,57; 28,77; 31,92; 32,48; 38,41; 52,93; 53,60; 167,66; 167,86 Beispiel 9:

Synthese der cyclischen cyclo-Met-Val Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Valinmethylester (L-Val-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio)ethyl] -6- (S) - (1- (methyl) ethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,28 g (25 mMol) L-Valinmethylester (L-Val-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Val wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert . 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (1- (methyl ) ethyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) :

Auswaage: 380 mg (82% d. Th.) als weißer Feststoff. ¹ H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - ( 1 -

(methyl ) ethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 0,85 (d, ³ J = 7,0 Hz, 3H, CH (CH ₃ ) (CH ₃ ) ) ; 0,93 (d, ³ J = 7,0 Hz, 3H, CH (CH ₃ ) (CH ₃ ) ) ; 1, 88-2, 00 (m, 2H, SCHCH ₂ ) ; 2,04 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2,10-2,18 (m, 1H, CH(CH ₃ ) ₂ ); 2, 42-2, 58 (m, 2H, SCH ₂ ) ; 3, 58-3, 62 (m, 1H, CH) ; 3,94-4,00 (m, 1H, CH) ; 8.11 (bs, 1H, NH) ; 8.13 (bs, 1H, NH)

¹³ C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - ( 1 - (methyl ) ethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) (125.8 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 14,42; 16,98; 18,32; 28,36; 31,71;

31,94; 52,40; 59,72; 167,53; 167,78

Beispiel 10:

Synthese der cyclischen cyclo-Met-Ile Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L- Isoleucinmethylester (L-Ile-OMe) und Isolation eines Dias- tereomers 3- [2- (methylthio) ethyl] -6- (1- (methyl) propyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile)

4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3, 63 g (25 mMol) L-Isoleucinmethylester (L-Ile-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Ile wurden an einer Kieselgel-Säule mit n-

Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .

3- [2- (methylthio) ethyl] -6- (1- (methyl) propyl) -2, 5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) :

H-NMR von 3- [ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( 1 - (methyl ) propyl ) - 2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) (500 MHz, D ₆ -DMSO) : δ = 0,85 (t, ³ J = 7,4 Hz, 3H, CH ₂ CH ₃ ) ; 0,90 (d, ³ J = 7,4 Hz, 3H, CHCH ₃ ) ; 1,10-1,50 (m, 2H, SCH ₂ CH ₂ ) ; 1, 80-1, 90 (m, 1H, CH) ; 1, 90-2, 00 (m, 2H, CH ₂ ) ; 2,04 (s, 3H, SCH ₃ ) ; 2,42-2,58 (m, 2H, SCH ₂ ) ; 3, 64-3, 68 (m, 1H, CH) ; 3, 94-3, 98 (m, 1H, CH) ; 8.08-8,16 (m, 2H, 2 x NH)

¹³ C-NMR von 3- [ 2- (methylthio) ethyl ]- 6- ( 1- (methyl ) propyl ) - 2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) (125.8 MHz, D ₆ - DMSO+HC1) : δ = 12,02; 14,85; 15,27; 24,61; 28,74; 32,15; 39, 90; 52, 92; 59, 34; 167, 90; 168,10

Beispiel 11:

In vitro Verdauungsversuche von 3,6-Bis[2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (DD/LL-cyclo-Met-Met) mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Spiegelkarpfen a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Spiegelkarpfen

(Cyprinus carpio morpha noblis)

Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von sechs einjähri ^¬ gen Spiegelkarpfen {Cyprinus carpio morpha noblis) freige ^¬ legt, mit Wasser gespült, längs aufgeschnitten und jeweils die Darmschleimhaut abgekratzt. Diese wurde zusammen mit zerstoßenem Eis mit einem Mixgerät zerkleinert. Die resul ^¬ tierende Suspension wurde mit einem Ultraschallstab behan ^¬ delt, um noch intakte Zellen aufzuschließen. Zur Abtrennung der Zellbestandteile und Fett wurde die Suspension 30 Minu ^¬ ten lang bei 4°C zentrifugiert , das Homogenat abdekantiert und mit einer Spur Thimerosal sterilisiert. Aus 6 Spiegel ^¬ karpfen wurden 49 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewonnen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen

DD/LL-cyclo-Met-Met wurde in TRIS/HCl-Pufferlösung aufge ^¬ nommen und mit der Enzymlösung versetzt. Als Vergleich und zur Abschätzung der rein chemischen Spaltungsgeschwindig- keit wurde jeweils ein Blindwert ohne Enzymlösung angesetzt (siehe Tabelle 1) . Von Zeit zu Zeit wurde eine Probe ent ^¬ nommen und deren Zusammensetzung mit Hilfe eines kalibrierten HPLCs detektiert und quantifiziert. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. Methionyl- methionin (Met-Met) und und des Gehaltes von DD/LL-cyclo- Met-Met bestimmt (siehe Abb. 4) . In der Blindprobe fand praktisch keine Umsetzung von DD/LL-cyclo-Met-Met zum Di- peptid DD/LL-Met-Met bzw. DL-Methionin statt.

Tabelle 1: Spaltung von DD/LL-cyclo-Met-Met

Probe Blindwert

Vorlage Substrat 0,15 mmo1 0,15 mmo1

(DD/LL-cyclo- Met-Met)

TRIS/HCl- 90,9 ml 95, 0 ml Pufferlösung,

pH 9, 5

Gallenflüssigkeit 5,00 ml 5,00 ml

Reaktionsstart Enzymlösung 4, 1 ml

( 50%

Karpfenlsg . )

Reaktion 37 °C 37 °C

Reaktionsabbr . 1,0 ml Reaktionslösung wurde in 5,0 ml einer 1:1 (v/v) Mischung aus 10%iger H ₃ PO ₄ -

Lösung und Acetonitril aufgenommen, 20 Min gerührt und über einen 20ym Spritzenfilter filtriert . Der Versuch aus Beispiel 11 b) wurde analog mit den cycli- schen Dipeptiden cyclo-L-His-L-His und cyclo-D-Met-L-Leu durchgeführt (siehe Abbildung 5 und 6) .

Beispiel 12:

In vitro Verdauungsversuche von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met mit Verdauungsenzymen aus karnivoren Regenbogenforellen a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von fünf einjährigen Regenbogenforellen {Oncorhynchus mykiss) freigelegt und wie in Beispiel 11 beschrieben aufgearbeitet. Aus 5 Regenbogen- forellen wurden 56 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewonnen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen

Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 11 durchgeführt. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. Methionylmethionin (Met-Met) und und des Gehaltes von cyclo-Met-Met bestimmt (siehe Abb. 3) . In der Blindprobe fand praktisch keine Umsetzung von ΌΌ/ /meso- cyclo-Met-Met zum Dipeptid DD/LL/meso-Met-Met bzw. DL- Methionin statt. Tabelle 2: Spaltung von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met

Probe Blindwert

Vorlage Substrat 0,10 mmo1 0,10 mmo1

(DD/LL/meso- cyclo-Met-Met)

TRIS/HC1- 5,0 mL 10,3 ml

Pufferlösung,

pH 9, 5

Gallenflüssigkeit 1,0 mL 0, 0 ml

Leberhomogenat 1 , 5 mL 0, 0 ml

Reaktionsstart Enzymlösung 2, 8 ml

( 25% Forel- lelsg . )

Reaktion 37 °C 37 °C

Reaktionsabbr . 1,0 ml Reaktionslösung wurde in 5,0 ml einer 1:1 (v/v) Mischung aus 10%iger H ₃ PO ₄ -

Lösung und Acetonitril aufgenommen, 20 Min gerührt und über einen 20ym Spritzenfilter filtriert .

Der Versuch aus Beispiel 12 b) wurde analog mit den cycli- schen Dipeptiden cyclo-D-Met-L-Phe und cyclo-D-Met-L-Lys durchgeführt (siehe Abbildung 7 und 8) .

Beispiel 13:

In vitro Verdauungsversuche von cyclo-D-Met-L-Thr mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Shrimps a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Whiteleg Shrimps

(Litopenaeus Vannamei)

Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von Ezquerra und Garcia-Carreno (J. Food Bio- chem. 1999, 23, 59-74) durchgeführt. Dazu wurde das Hepato- pankreas aus 2,1 Kilogramm (57 Tiere) Whiteleg Shrimps (Li- topenaeus Vannamei) entfernt und zusammen mit zerstoßenem Eis mit einem Mixer zerkleinert. Die weitere Aufarbeitung wurde analog Beispiel 11 durchgeführt. Aus 57 Whiteleg Shrimps wurden 74 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewon- nen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen

Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 11 durchgeführt. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. D-Met-L-Thr und und des Gehaltes von cyclo-D-Met-L-Thr bestimmt (siehe Abb. 9) . In der Blindpro ^¬ be fand praktisch keine Umsetzung von cyclo-D-Met-L-Thr zum Dipeptid D-Met-L-Thr bzw. zu den freien Aminosäuren statt.

Tabelle 3: Spaltung von cyclo-D-Met-L-Thr

Probe Blindwert

Vorlage Substrat 0,15 mmo1 0,15 mmo1

(cyclo-D-Met-L- Thr)

TRIS/HC1- 8, 5 ml 14,0 ml Pufferlösung,

pH 9, 5

Reaktionsstart Enzymlösung 6,5 ml

(= 5 Shrimps)

Reaktion 37 °C 37 °C

Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml

10%iger HsPC^-Lösung aufgenommen.