Die Erfindung betrifft den Naturstoff Cycloacetamid, insbesondere die Cycloacetamide A bis F, welcher als Naturstoff durch den Pilz Mortierella alpina während der Fermentation synthetisiert und in den Kulturüberstand bzw. das Mycel abgegeben wird, ein Herstellungsverfahren sowie die biologische Wirksamkeit der Cycloacetamide A bis F und den Produzentenstamm / Pilzstamm Mortierella alpina DSM 34346.

In der Naturstoffforschung wie auch der Pharmazie werden neue Wirkstoffe traditionell aus Bakterien oder höheren Pilzen (Asco- oder Basidiomyceten) isoliert. Häufig kommt es dabei aber immer wieder zur Re-Identifikation von gleichen Substanzen oder Substanzklassen. Es ist daher zielführend neue Wirkstoffproduzenten zu suchen, die bisher nicht im Fokus der Naturstoffforschung lagen.

Naturstoffe werden bereits seit hunderten von Jahren aus Mikroorganismen isoliert und bilden den Grundstock für mehr als ein Drittel aller auf dem Markt erhältlichen Antibiotika, Immunsuppressiva und Zytostatika.

Naturstoffe sind niedermolekulare chemische Verbindungen, die dem Sekundärstoffwechsel entstammen, und werden von Pflanzen aber auch von Mikroorganismen gebildet. Hierbei sind die wichtigsten pharmazeutischen Produzenten Bakterien sowie höhere Pilze der Abteilung der Ascomyceten und Basidiomyceten.

Basale Pilze, d.h. evolutionär früh entwickelte Pilze, wie bspw. Mortierella alpina, waren bisher nicht im Fokus der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, weil sie dem Dogma unterlagen, keine Naturstoffe produzieren zu können.

Basale Pilze - bis 2016 im Paraphylum „Zygomyceten“ zusammengefasst - sind erst seit wenigen Jahren in den Fokus der Naturstoffchemiker gekommen, da einige Vertreter entgegen dem bisherigen Dogma in der Lage sind, Sekundärmetabolite zu bilden. Der Vertreter Mortierella alpina gehört in das Subphylum der Mortierellomycotina und wird als GRAS-Organismus (Generally Recognized As Safe; „allgemein anerkannt als sicher“) bereits in der Nahrungsmittel- und Futtermittel-Industrie zur Herstellung von Ölen mit vielfach ungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäuren und y- Linolensäure großtechnisch fermentiert.

Erst seit wenigen Jahren ist bekannt, dass Mortierella alpina auch peptidische Naturstoffe produziert, nämlich die Biotenside Malpinin A- D (Hexapeptide), die antimycobakterielle Substanz Calpinactam (Hexapeptid) und die Antibiotika Malpicycline A-D (Cyclopentapeptide) (Baldeweg F, Wamcke P, Fischer D, Gressler M. Fungal Biosurfactants from Mortierella alpina. Org Lett. 2019 Mar 1;21(5): 1444-1448. doi: 10.1021/acs.orglett.9b00193. Epub 2019 Feb 21. PMID: 30789272; Wurlitzer JM, Stanisic A, Wasmuth I, Jungmann S, Fischer D, Kries H, Gressler M. Bacterial-Like Nonribosomal Peptide Synthetases Produce Cyclopeptides in the Zygomycetous Fungus Mortierella alpina. Appl Environ Microbiol. 2021 Jan 15;87(3):e02051-20. doi: 10.1128/AEM.02051-20. PMID: 33158886; PMCID: PMC7848919; Koyama N, Kojima S, Nonaka K, Masuma R, Matsumoto M, Omura S, Tomoda H. Calpinactam, a new anti-mycobacterial agent, produced by Mortierella alpina FKI-4905. J Antibiot (Tokyo). 2010 Apr;63(4): 183-6. doi: 10.1038/j a.2010.14. Epub 2010 Feb 26. PMID: 20186169.).

Daneben produziert der Pilz Mortierella alpina auch Malpibaldine A-C, hydrophobe Cyclopentapeptide mit unbekannter Funktion (Balde weg F, Wamcke P, Fischer D, Gressler M. Fungal Biosurfactants from Mortierella alpina. Org Lett. 2019 Mar 1;21 (5): 1444-1448. doi: 10.1021/acs.orglett.9b00193. Epub 2019 Feb 21. PMID: 30789272).

Mortierella alpina kommt ubiquitär vor und kann aus dem Erdboden vornehmlich aus den gemäßigten, subpolaren und polaren Zonen isoliert werden. Vor wenigen Jahren wurden MortzereZZa-Spezies aus der Antarktis isoliert, die eine insektizide Wirkung auf die Puppen der Gemeinen Stubenfliege sowie auf Larven der Wachsmotte besitzen, wenngleich auch der Grund für dieses Phänomen nicht beschrieben wurde (Edgington S, Thompson E, Moore D, Hughes KA, Bridge P. Investigating the insecticidal potential of Geomyces (Myxotrichaceae: Helotiales) and Mortierella (Mortierellacea: Mortierellales) isolated from Antarctica. Springerplus. 2014 Jun 9;3:289. doi: 10.1186/2193-1801-3- 289. PMID: 25013747; PMCID: PMC4071458.).

In den Stammsammlungen der Jena Microbial Resource Collection (JMRC) sind eine Vielzahl an Mortierella alpina -Isolaten hinterlegt und als solche bereits 2013 genetisch re-identifiziert worden (Wagner L, Stielow B, Hoffmann K, Petkovits T, Papp T, Vägvölgyi C, de Hoog GS, Verkley G, Voigt K. A comprehensive molecular phylogeny of the Mortierellales (Mortierellomycotina) based on nuclear ribosomal DNA. Persoonia. 2013; 30:77-93. doi: 10.3767/003158513X666268. PMID: 24027348; PMCID: PMC3734968).

Insektizide sind Pestizide, die eine Wachstumshemmung und eine Abtötung von adulten Insekten oder ihren Entwicklungs Stadien (Ei, Larve, Puppe) induzieren. Momentan sind sehr viele Insektizide auf dem Markt, die oftmals energieaufwendig durch mehrstufige Synthese hergestellt und deren toxische (halogenierte oder sulfurierte) Nebenprodukte dann kostenintensiv entsorgt werden müssen. Da es sich bei Insekten auch um Eukaryonten handelt, sind die gängigen Insektizide oft auch toxisch für höhere Organismen (Tiere und den Menschen). Entsprechend der Vorgabe durch das Insecticide Resistance Action Committee (IRAC), einem Zusammenschluss namhafter insektizidproduzierender Unternehmen https://irac-online.or /), werden Insektizide nach ihrem Wirktarget und chemischer Struktur in 26 Klassen eingeteilt.

Die meisten der 26 synthetischen Verbindungen wirken unspezifisch (d.h. art-übergreifend) und enthalten Halogene (Fluor, Chlor) oder Schwefel, was die Umweltverträglichkeit mindert und die Toxizität für den Menschen erhöht.

Eine Alternative stellen daher Proteine oder Peptide dar, die in den o.g. Substanzklassen vollkommen unterrepräsentiert sind.

Proteine wie die o.g. Bacillus thuringensis-Toxine werden in der Agrarindustrie als Fraßschutzmittel bereits eingesetzt, sind aber chemisch weniger stabil, da sie durch Proteasen hydrolytisch abgebaut werden können (Palma L, Munoz D, Berry C, Murillo J, Caballero P. Bacillus thuringiensis toxins: an overview of their biocidal activity. Toxins (Basel). 2014 Dec 11 ;6(12):3296-325. doi: 10.3390/toxins6123296. PMID: 25514092; PMCID: PMC4280536.).

Bisher wurden nur wenige, wenngleich auch pharmazeutisch / agrarwirtschaftlich bedeutsame Insektizide aus Mikroorganismen, Pflanzen oder Würmern gewonnen. Dazu zählen die Avermectine (Makrolide aus Streptomyces avermitilis), Milbemycine (Makrolide aus Streptomyces hygroscopicus), Spinosyne (cyclisches Polyketide aus dem Bakterium Saccharopolyspora spinosa), Nereistoxin (niederes Organodisulfid aus dem Anneliden Lumbriconereis heteropoda) und die o.g. Bacillus thuringensis-Toxine (kleine ribosomal gebildete Proteine).

Cyclische Oligopeptide mit insektizider Wirkung sind sehr selten. Das nicht-ribosomal gebildete Cyclodepsioctapeptid Bassianolid aus Beauveria bassiana zeigt neben insektizider Wirkung auch eine Inhibition der acetylcholin-induzierten glatten Muskulatur sowie antiplasmodiale und antimycobacterielle Aktivitäten.

Bassianolid wirkt daher eher unspezifisch (Xu Y, Orozco R, Kithsiri Wijeratne EM, Espinosa- Artiles P, Leslie Gunatilaka AA, Patricia Stock S, Molnar I. Biosynthesis of the cyclooligomer depsipeptide bassianolide, an insecticidal virulence factor of Beauveria bassiana. Fungal Genet Biol. 2009 May;46(5):353-64. doi:

10.1016/j.fgb.2009.03.001. Epub 2009 Mar 11. PMID: 19285149).

Die nahe verwandte Verbindung PF1022A, isoliert aus Mycelia sterila, wirkt anthelminthisch, aber nicht insektizid (Harder A, Schmitt-Wrede HP, Krücken J, Marinovski P, Wunderlich F, Willson J, Amliwala K, Holden-Dye L, Walker R. Cyclooctadepsipeptides— an anthelmintically active class of compounds exhibiting a novel mode of action. Int J Antimicrob Agents. 2003 Sep;22(3):318-31. doi: 10.1016/s0924- 8579(03)00219-x. PMID: 13678839.).

Die cyclischen Hexadepsipeptide Beauvericin aus Beauveria bassiana und Enniatine aus Fusarium spec, sind insektizid und zeigen ebenso eine sehr breite biologische Aktivität (Xu Y, Zhan J, Wijeratne EM, Bums AM, Gunatilaka AA, Molnar I. Cytotoxic and Antihaptotactic beauvericin analogues from precursor-directed biosynthesis with the insect pathogen Beauveria bassiana ATCC 7159. J Nat Prod. 2007 Sep;70(9): 1467-71. doi: 10.1021/np070262f. Epub 2007 Sep 6. PMID: 17803266 und Firäkovä S, Proksa B, Sturdikova M. Biosynthesis and biological activity of enniatins. Pharmazie. 2007 Aug;62(8):563-8. PMID: 17867547).

Die am besten untersuchten Cyclopeptide sind die Destruxine A-F aus Metarhizium anisopliae/ Oospora destructor (Dometshuber-Fleiss R, Heffeter P, Mohr T, Hazemi P, Kryeziu K, Seger C, Berger W, Lemmens-Gruber R. Destruxins: fungal-derived cyclohexadepsipeptides with multifaceted anticancer and antiangiogenic activities. Biochem Pharmacol. 2013 Aug 1 ;86(3):361-77. doi: 10.1016/j.bcp.2013.05.022. Epub 2013 Jun 6. PMID: 23747344; PMCID: PMC5850990).

Sie wirken insektizid auf den Seidenspinner (Bombyx mori), den Gemeinen Rosenkäfer (Cetonia aurata), den Mexikanischen Bohnenkäfer (Epilachna sparsa), die Große Wachsmotte Galleria mellonella), den Baumwollkapselbohrer (Heliothis virescens), die Gemeine Stubenfliege Musea domestica), den Asiatischen Nashornkäfer (Oryctes rhinoceros), den Senfkäfer (Phaedon cochleariae) und die Kohlschabe (Plutella xylostella), zeigen aber auch breite phytotoxische Effekte auf Brassica spec., Camelina sativa, Capsella bur sa-pastoris, Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Citrullus lanatus, Diplotaxis erucoides, Eruca sativa, Hirschfeldia incana, Hordeum vulgare, Lycopersicon esculentum, Nicotiana spec., Phaseolus vulgaris, Raphanus sativus, Sinapis spec., Sisymbrium officinalis, Solanum tuberosum, Thlaspi arvense, Triticum aestivum usw. (Pedras MS, Irina Zaharia L, Ward DE. The destruxins: synthesis, biosynthesis, biotransformation, and biological activity. Phytochemistry. 2002 Mar;59(6):579-96. doi: 10.1016/s0031-9422(02)00016-x. PMID: 11867090.).

Als Fazit zum dem zuvor stehend aufgeführten vorbekannten Stand der Technik lässt sich festhalten, dass bisher keine selektiv insektizid wirkenden Cyclopeptide entdeckt wurden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, einen neue Naturstoff (Biowirkstoff) aus einer bisher kaum erforschten Gruppe von basalevolutionären Pilzen wie Mortierella spec, durch Isolation und Identifizierung anzugeben, der eine neue pharmazeutische Leitstruktur darstellt, ein biologisches Verfahren zu seiner wirtschaftlichen und zeitsparenden Herstellung mit hoher Produktausbeute und ohne besonderen apparativen Aufwand und alternativ ein chemisches Syntheseverfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen sowie seine Verwendung (Bioaktivität) darzulegen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des 1. Patentanspruchs gelöst. Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.

Diese Aufgabe wird gelöst, indem mehrere Mortierella spec. -Isolate in Kulturmedium angezogen und deren Extrakte chromatografisch analysiert wurden.

Bevorzugt wurden die zwei Mortierella alpina- Stämme JMRC:SF:10519 und JMRC:SF: 10520 aus der JMRC kultiviert, um so die Produktion, Isolation und Wirkstoffanalyse des neuen Naturstoffs zu ermöglichen.

Es war so möglich aus den Stämmen JMRC:SF:10519 und JMRC:SF: 10520 sechs neuartige Substanzen, Cylcoacetamide A-F, zu identifizieren, von denen die zwei Vertreter Cycloacetamid A und B isoliert, strukturaufgeklärt und in einem Screening-Verfahren auf Bioaktivität getestet wurden. Cycloacetamide A-F haben eine insektizide Wirkung gegen Fruchtfliegenlarven.

Besonders bevorzugt wird der Mortierella alpina- Stamm DSM 34346 kultiviert, um so die Produktion, Isolation und Wirkstoffanalyse (Strukturaufklärung) des neuen Naturstoffs in Form des strukturaufgeklärten Cycloacetamide A und B zu ermöglichen.

Cycloacetamide A und B haben insektizide Aktivität gegenüber Fliegenlarven, zeigen aber kaum Bioaktivität gegenüber anderen Organismen.

Cycloacetamide gehören in die Gruppe der Cyclodepsitetrapeptide. Cyclodepsitetrapeptide zeichnen sich durch eine kanonische peptidisch- verknüpfte Kette an Aminosäuren aus, die durch eine Esterbindung zu einem Ring geschlossen sind. Für diesen Ringschluss werden nucleophile Aminosäuren benötigt, die eine freie Hydroxyl- oder Thiolgruppe tragen (wie Threonin, Serin und Cystein).

Es sind bisher viele Cyclodepsitetrapeptide aus Bakterien bekannt, die diverse biologische Funktionen besitzen. Hierzu zählen das Antibiotikum Xenamid A aus Xenorhabdus nematophila, das Antibiotikum Teixobactin aus Eleftheria terrae sowie die Cyclodepsit Fatflabet A und Xeneprotid A mit unbekannter biologischer Funktion (aus Xenorhabdus und Photorhabdus spec, isoliert).

Die verzweigende Aminosäure in den Cycloacteamiden ist L-Threonin, an deren N-Terminus eine Acetylgruppe amidiert ist.

Neben den oben genannten Cyclopeptiden, gibt es zahlreiche bioaktive, Threonin- verzweigende Cyclopenta- bis -decapeptide aus Bakterien - unter ihnen das Antiprozoikum Taxlllaid A aus Xenorhabdus indica, das Antibiotikum Tumescenamid C aus Streptomyces spec, und das kommerziell verwendete Antibiotikum Daptomycin aus Streptomyces roseo. Cyclische Peptide aus Pilzen sind eher selten: Hierzu zählen das immun- modulierende Aspergillicin F aus Aspergillus flavus sowie das cytotoxische Zygosporamid aus Zygosporium masonii.

Mit dem vorliegenden Verfahren wird eine neuartige Familie von sechs peptidischen Wirkstoffen, die Cycloacetamide, aus dem basalevolutionären Pilz Mortierella alpina- Stamm JMRC:SF:10519 und JMRC:SF: 10520, wobei als Produzentenstamm JMRC:SF:10519 als DSM 34346 hinterlegt ist, isoliert, charakterisiert und auf biologische Aktivität/Wirksamkeit getestet.

Die Wirkstoffe / Naturstoffe Cycloacetamide A bis F werden kontinuierlich, unabhängig von dem verwendeten Kulturmedium gebildet, was eine nachhaltige Produktion auch auf organischen Industrieabfällen als Kohlenstoffquelle ermöglicht. Die Substanzen lassen sich sowohl im Mycel des Pilzes als auch aus dem Kulturfiltrat isolieren, wobei letzteres die Substanzen in größerer Reinheit enthält. Cycloacetamide A bis F, insbesondere A und B, zeichnet sich durch eine selektiv insektizide Wirkung aus.

Bei dem Verfahren zur Herstellung von Cycloacetamide A und B durch den Mucoromyceten Mortierella alpina, wird das Pilzmyzel in für Pilzkulturen bekannter Weise auf einer Agaroberfläche gezüchtet und homogenisiert (mechanisch zerkleinert), das homogenisierte Pilzmyzel wird in eine Nährlösung für eine Vorkultur überführt, die Vorkultur wird bebrütet oder geschüttelt und, falls erforderlich, erneut zerkleinert. Zur Produktion des Naturstoffes Cycloacetamide, insbesondere Cycloacetamide A und B, wird die Vorkultur in ein Produktionsgefäß überführt und einer weiteren Nährlösung ausgesetzt. Das Gemisch der Naturstoffe Cycloacetamide A bis F wird im Produktionsgefäß geerntet oder nach Abzug dieser von der Nährlösung getrennt.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass mit dem Mucoromyceten Mortierella alpina ohne die Notwendigkeit der Fixierung an einen Träger an sich bekannten Produktionsgefäßen, wie Rührkesselreaktor, Fermenter etc., der neue Naturstoff Cycloacetamide A und der neue Naturstoff Cycloacetamide B (im Gemisch A-F) gewonnen werden kann, ohne die Scherkraftbelastung während der Naturstoffbildung in der Nährlösung zu reduzieren. Dies bedeutet, dass der Pilz Mortierella alpina keine besonderen Anforderungen an die Erzeugung der Vorkultur sowie an die Form und Funktion des Produktionsgefäßes gestellt werden. Während bei bekannten technischen Lösungen zur Fermentation von Pilzen teilweise sehr spezielle und aufwendige Strukturen für die Lagerung, Behandlung und Umwälzung erforderlich sind, um schädliche Auswirkungen von Scherkräften auf das naturstoffbildende Myzel zu vermeiden oder zumindest zu reduzieren, werden bei der erfindungsgemäßen Produktionslösung Produktionsgefäße verwendet, ohne dass deren Größe, Form und Funktion die Konsistenz der Nährlösung und die Bildung des Naturstoffs Cycloacetamide A bis F negativ beeinflussen. Auf diese Weise wird ein großer Durchsatz und eine effektivere Bildung des Naturstoffs Cycloacetamide A bis F ermöglicht. Als besonders vorteilhaft hat sich zum einen die Verwendung von herkömmlichen Pilzmedien und zum anderen die Durchführung von zyklischen oder kontinuierlichen Naturstoffgewinnungsprozessen erwiesen. Dies ermöglicht die Gewinnung von Naturstoff in herkömmlichen Produktionsgefäßen, wobei die Produktausbeute und die Zeiteffektivität sehr gut sind.

Die Abtrennung / Isolation von Cycloacetamide A und Cycloacetamide B aus dem Gemisch A bis F erfolgt nach Flüssig-Flüssig-Extraktion, Abtrennung der organischen Phase der Extraktion, Eindampfen und Lyophilisation des aufkonzentrierten Extraktes mit an sich bekannten Methoden der Chromatographie, in Form der präparativen HPLC und der semipräparativen HPLC. Das Schema zur Abtrennung / Isolation der einzelnen Cycloacetamide A und B aus dem Gemisch A bis F ist schematisch in Abbildung 8 dargestellt.

In einer Anwendung des Verfahrens wurde der Pilzstamm Mortierella alpina (DSM 34346) in einem einfachen Rührkesselreaktor in einem Nährlösungsvolumen von 30 Litern kultiviert. Die Kultivierungsdauer betrug 5-8 Tage.

Überraschenderweise konnten ein- bis zu 30-fach höhere Kulturvolumina eingesetzt werden, um das Gemisch der Naturstoffe Cycloacetamide A bis F durch Fermentation herzustellen, was allerdings auf den Einsatz von Scheibenrührern mit relativ hohen Scherkräften zurückzuführen ist. In einem weiteren Verfahren wurde die Raum-Zeit- Ausbeute durch den gezielten Austausch des Produktionsmediums noch deutlich erhöht.

Durch den bis zu zehnfachen Medienwechsel kann die Pilzkultur von Mortierella alpina (DSM 34346) auch überraschenderweise für mehrere Wochen in produktivem Zustand gehalten werden und so kann mit einer Kultur bis zum Zehnfachen des üblichen Fermentorvolumens ein aktives naturstoffhaltiges Kulturfiltrat gewonnen werden, wobei der Naturstoff auch im Myzel nachweisbar ist.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der schematischen Abbildungen 1 bis 8 und der Tabellen 1 bis 4 und den Ausführungsbeispiel näher erläutert, ohne auf dieses beschränkt zu werden.

Es zeigen dabei

Abbildung 1: die Strukturformeln der erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivate A bis F,

Abbildung 2: das ESI-MS/MS-Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates A gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%),

Abbildung 3: das ESI-MS/MS-Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates B gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%),

Abbildung 4: des ESI-MS/MS- Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates C gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%), Abbildung 5: ESI-MS/MS-Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates D gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%),

Abbildung 6: das ESI-MS/MS-Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates E gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%),

Abbildung 7 : das ESI-MS/MS-Spektrum des erfindungsgemäßen Cyclo- acetamid-Derivates F gemäß Abbildung 1 (Fragmentierung mit einer Kollisionsdissoziationsenergie von 20%),

Abbildung 8: ein Schema zur Isolation von Cycloacetamid-Derivaten A bis E aus Kulturen von Mortierella alpina,

Abbildung 9: ein Schema zur chemischen Darstellung von Cycloacetamiden,

Abbildung 10: ein ITS-Sequenz- Vergleich zwischen dem Mortierella alpina Referenzstamm ATCC32222 und den beiden Cycloacetamid-produzierenden Mortierella alpina- Stämmen JMRC:SF:10519 und JMRCSF10520

Abbildung 11 : die konzentrationsabhängige Induktion der Mortalität von Larven der Schwarzbäuchigen Fruchtfliege Drosophila melanogaster) durch Cycloacetamid A (linkes Säulendiagramm) sowie Cycloacetamid B (rechtes Säulendiagramm) sowie

Tabelle 1: die physikochemischen Parameter der Cycloacetamid- Derivate A bis F gemäß Abbildung 1,

Tabelle 2: die NMR-Daten von 1 (in DMSO-<7 ₆ ), wobei * überlappende Signale, ** Signale nur detektierbar in DEPT-NMR- Spektren, chemische Verschiebung (8) in ppm, Muliplizität (s: Singulett, d: Dublett, t: Triplett, q: Quartett, m Multiplett), Kopplungskonstanten (J) in Hz, Tabelle 3: die NMR-Daten von 2 (in DMSO- ₆ ), wobei * überlappende Signale, ** Signale nur detektierbar in DEPT-NMR- Spektren, chemische Verschiebung (8) in ppm, Muliplizität (s: Singulett, d: Dublett, t: Triplett, q: Quartett, m Multiplett), Kopplungskonstanten (J) in Hz,

Tabelle 4: die NMR-Daten von 2 (in CD ₃ OD), wobei * überlappende Signale. ** Signale nur detektierbar in DEPT-NMR- Spektren, chemische Verschiebung (8) in ppm, Muliplizität (s: Singulett, d: Dublett, t: Triplett, q: Quartett, m Multiplett), Kopplungskonstanten (J) in Hz,

Tabelle 5: Übersicht über die semipräparativen HPLC-Methoden zur Isolation der Cycloacetamid-Derivaten A bis E aus Kulturen von Mortierella alpina gemäß Abbildung 8 und

Tabelle 6: Daten der Bestimmung der biologischen Aktivitäten der Cycloacetamide A und B mit a) Agardiffusionstest gegen Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (MRSA, VRSA), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa', b) MIC- Bestimmung gegen Mycobacterium smegmatis', c) Agardiffusionstest gegen Streptomyces prunicolor, Streptomyces canus, Streptomyces fradiae; d) Agardiffusionstest gegen Sporidiobolus salmonicolor, Candida albicans, Penicillium notatum, e) Zytotoxizität gegen HeLa, U-937, HUVEC, K-562; f) pro/anti- inflammatorische Freisetzung von Prostaglandinen durch Monocyt-abstammenden M2-Makrophagen; g) ATP- basierter Luciferase-Viabilitätsassay mit Trypanosoma brucei', h) Caenorhabditis elegans. n.b., nicht bestimmt.

Die Strukturformeln der sechs neu bereitgestellten Substanzen Cylcoacetamide A bis F sind in der Abbildung 1 dargestellt.

Bei den beschriebenen Strukturen (siehe Abbildung 1) handelt es sich um Strukturisomere von Cyclodepsitetrapeptiden mit V-terminal acetylierten Threonin (Position 1). Während alle anderen Aminosäuren die kanonische L-Konfiguration aufweisen, ist ausschließlich die Aminosäure an Position 2 D-konfiguriert (D-Leu bei 1-3 und D-Phe bei 4 und 5). An Position 3 befindet sich entweder L-Leu (in 1), L-Phe (in 2, 3, 4 und 5) oder L-Tyr (in 6). An Position 4 befindet sich L-Leu (in 1, 2, 4 und 6) oder L-Phe (in 3 und 5). Die Konfigurationen der Stereozentren in 6 wurden nicht bestimmt.

Die Summenformeln, die Doppelbindungsäquivalente (DBE) und die exakte Masse der Cylcoacetamide A bis F (= Verbindungen 1-6) sind in Tabelle 1 dargestellt.

Die Strukturaufklärung erfolgte mittels HPLC-MS/MS (siehe dazu Abbildungen 2 bis 7) und die Konfiguration der Aminosäuren wurde mittels Marfey's Analyse bestimmt.

Für die Cylcoacetamide A und B (^Verbindung 1 und 2) wurde die Struktur durch ID- und 2D-NMR- Analysen in deuteriertem Dimethylsulfoxid und Methanol bestätigt (siehe dazu Tabellen 2-4).

Die Cylcoacetamide A und B (^Verbindung 1 und 2) sind protease-stabil und lassen sich beispielsweise nicht durch Chymotrypsin abbauen.

Alle Cylcoacetamide A bis F (= Verbindungen 1-6) sind bis zu ihrer Bereitstellung unbekannt, da sie bisher in keiner chemischen Datenbank (SciFinder, Reaxys, Dictionary of Natural Products by Chapman and Hall) hinterlegt sind.

Ausführungsbeispiel 1

-Vorkulturen (2.000 ml Erlenmeyerkolben mit je 500 ml Medium)-

Mortierella alpina (DSM 34346) wird als Stamm verwendet. Der produzierende Organismus Mortierella alpina (DSM 34346) wird auf MEP- Agarplatten (30 g/L Malzextrakt, 3 g/L Soja-Pepton, 18 g/L Agar, pH 5.6) bei 25°C für 7 Tage kultiviert und anschließend für 1-2 Wochen im Kühlschrank (4-7 °C) aufbewahrt, um die Lipidsynthese und Sporulation anzuregen. Die Platten können so bis zu 2 Monate gelagert werden.

Mit je 3-6 bewachsenen MEP-Agarblöcken von der Mortierella alpina- Kultur-Agarplatte (DSM 34346) werden 2.000 ml Erlenmeyerkolben mit je 500 ml Medium beimpft und anschließend bei 25 °C und 130 rpm für mindestens 10 Tage inkubiert werden. Die Ausbeuten an Cycloacetamid B (Verbindung 2) in MEP betragen nach 7 Tagen etwa 0,5-0, 7 mg pro g Biotrockenmasse bzw. nach 10 Tagen etwa 1,2- 1,3 mg pro g Biotrockenmasse. Eine wesentliche Produktsteigerung ist nach 10 Tagen nicht zu erwarten.

Für die Metabolitproduktion kommen diverse komplexe Flüssigmedien wie MEP (30 g/L Malzextrakt, 3 g/L Soja-Pepton pH 5.6) oder YPD (20 g/L Soja-Pepton, 20 g/L Glucose, 10 g/L Hefeextrakt, pH 6-7) in Frage. Die Ausbeute ist in MEP-Medium in der Regel um Faktor 2 höher. Prinzipiell können aber auch diverse andere Vollmedien (inklusive organische Küchen- oder Industrieabfälle) verwendet werden, da die Produktion unabhängig vom Medium erfolgt. Lediglich das Wachstum auf anorganischen Nitrat- oder Ammoniumsalzen als alleinige Stickstoffquelle sollte vermieden werden, da diese die Wachstumsrate enorm verringern.

Um die Produktion von spezifischen Cycloacetamiden anzuregen, empfiehlt sich nach dem Autoklavieren der Medien (121 °C, 20 min) der Zusatz der einzubauenden Aminosäuren (10 mM L-Leucin für Verbindung 1, 10 mM L-Phenylalanin für Verbindung 2 - 5 und 5 mM L-Tyrosin für Verbindung 6).

Die Kultivierung erfolgt zwingend aerob (emers oder submers unter Schütteln in Kolben oder alternativ auch in einem Fermenter mit Sauerstoff- oder Luftzufuhr).

Da es sich bei dem Produzenten um einen psychrotoleranten Organismus handelt, kann die Kultivierung zwischen 4°C und 30°C erfolgen. Höhere Temperaturen sollten vermieden werden.

Tolerierte pH-Bereiche liegen zwischen pH 5 und pH 9, ideal bei pH 6 - pH 7.

Kultiverungszeiten schwanken je nach Kulturmedium zwischen 3 und 21 Tagen. In MEP sind 10 Tage ideal.

Cylcoacetamide A bis F (= Verbindungen 1 - 6) sind sowohl im Kulturfiltrat als auch im Mycel enthalten und die Isolation der erfindungsgemäßen Verbindung erfolgt nach bekannten Methoden entsprechend bekannter physikalisch-chemischer Trennverfahren und der biologischen Aktivität der Wirkstoffe (siehe Schema in Abbildung 8). Der Kultivierungserfolg kann anhand der Biomasse-Zunahme oder besser anhand von extrahierten Kulturfiltrat-Aliquoten und deren nachfolgende chromatographische Analyse verfolgt werden.

Ausführungsbeispiel 2

- MaßstabversrößerunR ein 5 Liter- Fermenter-

Die Vorkulturen (2.000 ml Erlenmeyerkolben mit je 500 ml Medium) von Mortierella alpina (DSM 34346) werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Mit drei dieser Vorkulturen von Mortierella alpina (DSM 34346) als Produktionsstamm wird zur Maßstabvergrößerung ein 5 Liter- Fermenter mit Scheibenrührer beimpft (Kulturdauer 10 Tage, 25 °C und 130 rpm).

Die Kultivierungsbedingungen entsprechen denen gemäß Ausführungsbeispiel 1.

Nach Erreichen der Kultivierungsdauer von 10 Tagen im 5 Liter- Fermenter werden Rühren und Belüftung abgeschaltet (ca. 30 Min.).

Nach dieser Zeit hat sich die Pilzbiomasse am Boden des Fermenters abgesetzt. Der Überstand des naturstoffhaltigen Kulturmediums wird in geeigneter Weise abgetrennt und das Myzel bleibt im 5 Liter- Fermenter zurück. Neues, steriles Medium wird aufgefüllt. Nach 10 Tagen wird die Kultur erneut geerntet. Auf diese Weise wird das Verfahren fortgesetzt (so lange wie nötig). Pro Zyklus können maximal 4,5 1 naturstoffhaltige Kulturlösung gewonnen werden.

Die Ausbeuten an Cycloacetamid B (Verbindung 2) entsprechen den Ausbeuten gemäß Ausführungsbeispiel 1. Eine wesentliche Produktsteigerung ist auch hier nach 10 Tagen nicht mehr zu erwarten.

Die Cycloacetamide A bis E (= Verbindungen 1-6) sind sowohl im Kulturfiltrat als auch im Mycel enthalten und die Isolation der erfindungsgemäßen Verbindung erfolgt nach bekannten Methoden entsprechend bekannter physikalisch-chemischen Trennverfahren und der biologischen Aktivität der Wirkstoffe (siehe Schema in Abbildung 8). Ausführungsbeispiel 3

-Isolation der Cycloacetamide A bis E aus dem MEP-Kulturmedium-

Das Mortierella alpina (DSM 34346)- Mycel wird durch Zentrifugation oder Filtration beispielsweise über Miracloth entfernt.

Das Kulturfiltrat (13-15 Liter) wird mit 3 M Salzsäure auf einen pH- Wert von 2 eingestellt und dreimal mit dem gleichen Volumen eines wasserunlöslichen Lösungsmittels (vorzugsweise Ethylacetat, Chloroform oder Dichlormethan) extrahiert.

Das Lösungsmittel wird mit Hilfe eines Rotationsverdampfers und Lyophilisation entfernt.

Der Cycloacetamid-enthaltene Rückstand wird in 150 ml Methanol auf genommen.

Der Rohextrakt wird für 15 min bei 5.000 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend weiter über eine semipräparative HPLC aufgereinigt.

Das Cycloacetamide A und das Cycloacetamide B (= Verbindung 1 und 2) werden mit der HPLC-Methode 1 und nachfolgend der Methode 2 isoliert (siehe Tabelle 5).

Die Cycloacetamide C bis E (= Verbindungen 3 - 5) werden mit HPLC- Methode 3 vorgereinigt (siehe Tabelle 5).

Die reine Verbindung 5 wird von 3 und 4 mittels HPLC-Methode 4 abgetrennt. Die enantioselektive Separation von 3 und 4 wird mit HPLC- Methode 5 erreicht (siehe Tabelle 5).

Da die Substanzen kaum UV-absorbierend sind, sollte die Analytik mittels Massenspektrometrie erfolgen.

Ausführungsbeispiel 4

Verfahren zur chemischen Synthese der Cycloacetamide A-F (Verbindungen 1-6)

Mit dem erfindungsgemäßen chemischen Syntheseverfahren sind die Cycloacetamide A bis F (Verbindungen 1-6) mit der allgemeinen Formel cyclo-(-V-Ac-L-Thr-A-B-C-O-) herstellbar, wobei L-Thr L-konfiguriertes Threonin darstellt und in welcher A, B und C unabhängig voneinander gleiche oder verschiedene L- oder D-konfigurierte Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten darstellen, insbesondere Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Methionin (Met), Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr) oder Tryptophan (Trp).

Die Verbindungen der Formel cyclo-(-A-Ac-L-Thr-A-B-C-O-) sind jeweils eine Sequenz von Aminosäuren, welche durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind und einen N- sowie einen C-Terminus besitzen. Die in Klammem beschriebene Aminosäuresequenz ist dabei durch einen intramolekularen Ester über die Hydroxygruppe des V-acetylierten Threonins mit der C-terminalen Carboxygruppe der Aminosäure C cyclisiert.

Bei der Formel cyclo-(-A'-Ac-L-Thr-A-B-C-O-) handelt es sich um Cyclotetradepsipeptide, die nach in der Peptidchemie bekannten Methoden in Lösung synthetisiert werden können wie sie beispielsweise in der Literatur in Standardwerken (Houben Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme- Verlag, Stuttgart) oder Übersichtsarbeiten (wie Y. Okada, Synthesis of Peptides by Solution Methods, Current Organic Chemistry) zu finden sind.

Wichtige grundsätzliche Teilschritte der Synthese sind dabei die a) lineare Kopplung der jeweils geeignet geschützten Aminosäure- Derivate b) lineare Veresterung der mit einer Aminoschutzgruppe X protektierten Aminosäure C mit V-Ac-L-Thr -O, wobei Y eine Alkylhydroxyschutzgruppe darstellt c) Abspaltung der Amino- bzw. Carboxylschutzgruppen der jeweils erhaltenen Peptide d) Makrolaktamisierung des finalen linearen Depsipeptids.

Als Aminoschutzgruppe X sind Schutzgruppen geeignet, die die vorhandene Aminogruppe vor chemischen Reaktionen schützen sollen, und nach Belieben durch saure oder alkalische Hydrolyse, Reduktion oder nukleophilen Angriff wieder abgespalten werden kann. Dazu zählen vor allem Urethanderivate wie z.B. die tert-Butyloxycarbonyl (Boc)- Gruppe. Die Blockade der Carboxylfunktion der Aminosäuren erfolgt als Alkylester Y, z.B. als Methylester, welche wiederum durch alkalische oder nukleophile Dealkylierung entschützt wird. Dies entspricht der allgemeinen Peptidschutzgruppenchemie wie beispielsweise in Kocienski, Protecting Groups, Georg-Thieme- Verlag, Stuttgart nachzulesen ist.

Das besondere dieser technischen Lösung besteht darin, dass die nichtkanonische Flüssigphasensynthese eines Cyclotetradepsipeptides unter Zuhilfenahme einer Kombination von standard- sowie nicht standardmäßig verwendeten Entschützungsstrategien erfolgt, um die Integrität des intramolekularen Esters des Peptids zu gewährleisten. Insbesondere die Kombination aus i) der selten verwendete Deprotektion des Methylesters mit Trimethylzinnhydroxid (K. Nicolaou et al., A mild and selective method for the hydrolysis of esters with trimethyltin hydroxide. Angewandte Chemie 44, 1378-1382 und H. A. Grab, Total Synthesis of the Cyclic Depsipeptide Vioprolide D via its (Z)- Diastereoisomer. Angewandte Chemie - International Edition 59, 12357- 12361), ii) der Entschützung der Boc-Gruppe durch Trimethylsilyliodid (M. Jung und M. Lyster, Conversion of Alkyl Carbamates into Amines via Treatment with Trimethylsilyl Iodide, Journal of the Chemical Society, Chemical Communications) und iii) der finalen Makrolaktamisierung statt -laktonisierung stellen dabei ein Novum dar. Als Synthesestrategie dient daher die Herstellung des kompletten linearen Depsipeptids mit anschließender finaler Makrolaktamisierung, so wie in der Abbildung 9 als Übersichts schema dargestellt.

Die dafür notwendige Veresterung erfolgt nach dem Vorbild von Steglich (B. Neises und W. Steglich, Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids, Angewandte Chemie 17, 522-524), jedoch mit Einsatz des Kupplungsreagenzes EDC-HC1 (l-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid) anstelle des DCC (N,N'~ Dicyclohexylcarbodiimid) (M. Tsakos et al., Ester coupling reactions-an enduring challenge in the chemical synthesis of bioactive natural products, Natural Product Reports 32, 605-632).

Die in Abbildung 9 als Übersichts schema aufgeführten Beispiele verweisen exemplarisch auf die Syntheseschritte von cyclo-(V-Ac-L- Thr-L-Leu-L-Phe-D-Leu-O-) (Verbindung 2) und sollen im Folgenden der Erläuterung der Erfindung dienen.

Beispiel 1 in Abbildung 9:

Zur Verknüpfung einer neuen Peptidbindung wird die entschützte Säure (z.B. /V-Boc-D-Leu-COOH) in Dichlormethan (DCM) gelöst, sodass eine 0.2 M-Lösung entsteht. Diese wird mit 4 Äquivalenten DIPEA (V,/V-Diisopropylethy lamin) und 1.1 Äquivalenten TBTU (2-(lH- benzotriazol-l-yl)-l, 1, 1,3,3-tetramethylaminium-tetrafluoroborat) für fünf Minuten inkubiert. Für das Generieren des Tetrapeptids kann DIPEA weggelassen werden, um den intramolekularen Ester zu erhalten. Anschließend wird eine Lösung der zu koppelnden Aminosäure (z.B. NH ₂ -L-Phe-OMe-HCl) bzw. des zu koppelnden Peptides in DCM dazugegeben, um eine Endkonzentration von 0.1 M der jeweiligen Substrate zu erhalten. Die Reaktion wird nach 3.5 - 22 h durch Waschen des Ansatzes mit dreimal 10 - 15 mL gesättigter Ammoniumchlorid- Lösung und einmal mit 10 - 15 mL Wasser beendet. Die vereinigten wässrigen Phasen werden mit 50 mL Dichlormethan gegenextrahiert und alle erhaltenen organischen Phasen vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Dipeptide werden per Flash-Chromatographie über eine FP Si 12 g-Säule bei 30 L/min Flussrate und DCM als Eluent A sowie Methanol als Eluent B aufgereinigt. Das synthetisierte Dipeptid NH ₂ -D-Leu-L-Phe-OMe wird in 5 mL DCM resuspendiert und auf die genannte Säule injiziert und ein Gradient von 0 - 6.4 min: 0 % B, 6.4 - 9.5 min: 20 % B, 9.5 - 12.1 min: 40 % B, 12.1 - 19.6 min: 100 % B verwendet.

Die erhaltenen linearen Tetrapeptide werden mittels Flash- Chromatographie über eine FP Si- Säule mit Hexan als Eluent A und Ethylacetat als Eluent B aufgereinigt. So erfolgt z.B. die Aufreinigung von A-Boc-D-Leu-O-(A-Ac-L-Thr)-L-Leu-L-Phe-OMe über eine FP Si 12 g Säule mit einer Flussrate von 30 mL/min. Dafür wird das Peptid in 5 mL DCM dispergiert und durch Flash-Chromatographie mit einem Gradienten von 0 - 2 min: 0 % B, 2 - 4 min: 20 % B, 4 - 6 min: 40 % B, 6 - 14 min: 60 - 80 % B, 14 - 23 min: 100 % B aufgereinigt.

2 in Abbildung 9:

Das erhaltene Dipeptid (z.B. A-Boc-D-Leu-L-Phe-OMe) wird mit 2 Äquivalenten Anisol in Dichlormethan (DCM) versetzt und tropfenweise Trifluoressigsäure zugegeben, bis eine 20%ige Lösung erreicht wird. Die Reaktion wird nach ca. 2 - 2,5 h bei Raumtemperatur durch Neutralisation mit 3 M Kaliumhydroxidlösung gestoppt und mit gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die wässrige Ammoniumchlorid-Phase wird wiederum dreimal mit Dichlormethan gegenextrahiert und alle organischen Phasen vereinigt und unter Vakuum eingeengt.

3 in Abbildung 9:

Ein Äquivalent der freien Säure z.B. /V-Boc-L-Leu-COOH (0.2M) wird in 8 mL DCM vorgelegt und für 30 min bei Raumtemperatur mit 1.5 Äquivalenten EDC-HC1 und 0.3 Äquivalenten 4-(Dimethylamino)- pyridin (DM AP) vorreagieren lassen. Anschließend wird bei anfangs 0 °C 1 Äquivalent (0.2 M) von A-Ac-L-Thr-OMe in 8 mL DCM zur Reaktion hinzugefügt und für 18 h inkubieren gelassen. Das Produkt wird mit 30 mL 1 M Salzsäure, zweimal 30 mL Ammoniumchlorid- Lösung und 30 mL Wasser gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden mit 50 mL DCM gegenextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat und in vacuo getrocknet. Beispiel 4 in Abbildung 9:

Der erhaltene Ester z.B. A-Boc-L-Leu-O-(A-Ac-L-Thr-OMe) wird in Dichlorethan (DCE) gelöst und mit 6 Äquivalenten Trimethylzinnhydroxid versetzt. Die Reaktion wird nach 26 - 64 h bei 80 °C unter Argonatmosphäre durch Abkühlen beendet und das Reaktionsgemisch in vacuo getrocknet. Das eingetrocknete Reaktionsprodukt wird in 50 mL Ethylacetat wiederaufgenommen und dreimal mit je 50 mL 1 M HCl sowie einmal mit 50 mL gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit Ethylacetat erneut gegenextrahiert und alle Ethylacetat-Phasen vereinigt, mit Natriumsulfat getrocknet und am Rotations verdampf er unter vermindertem Druck eingeengt.

Beispiel 5 in Abbildung 9:

Für das Entschützen des linearen Tetrapeptids wird aufgrund der Säure- bzw. Basenlabilität des intramolekularen Esters Trimethylsilyliodid (TMS-I) als nicht-hydrolytisches Deprotektionsagens verwendet. Dabei wird das Peptid z.B. A-Boc-L-Leu-O-(A-Ac-L-Thr-)-D-Leu-L-Leu- COOH in 3 mL deuteriertem Chloroform (CDC1 ₃ ) gelöst mit

1.5 Äquivalenten TMS-I versetzt. Die Reaktion wird unter Argonatmosphäre nach 3.5 h bei 50 °C durch Zugeben eines Überschusses an Methanol beendet und in vacuo getrocknet. Anschließend erfolgt eine Aufreinigung per Flash-Chromatographie über eine FP ID CI 8 12 g-Säule. Dabei werden die Proben in Methanol/Wasser (83/17) resuspendiert und 4.8 mL injiziert mit Wasser als Eluent A und Acetonitril als Eluent B und einer Flussrate von 30 mL/min unter Verwendung von folgendem Gradienten: 0 - 2.5 min: 0 % B, 2.5 - 5 min: 20 % B, 5 - 7.5 min: 40 % B, 7.5 - 9.5 min: 60 % B,

9.5 - 11.5 min: 80 % B, 11.5 - 15.5 min: 100 % B.

Die finale Cyclisierung der Depsipeptide erfolgt mit 2.5 mM des entschützten linearen Peptides in einem Gemisch aus DCM/Dimethylsulfaoxid (DMSO) (95/5) und wird mit 3 Äquivalenten O-(7 - Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,N, A',A'-tetramethyluronium- hexafluorphosphat (HATU) gestartet.

Wenn nach Reaktionsverlaufkontrolle mittels LC-MS noch Substrat erkennbar ist, wird erneut HATU zugegeben.

Die Reaktion wird nach max. 48 h durch Einengen des DCM in vacuo beendet und der Rückstand in insgesamt 5 mL DMSO resuspendiert und mit Hilfe von Flash-Chromatographie über eine FP Si C18 12 g Säule bei 30 L/min Flussrate aufgereinigt. Dabei wird folgender Gradient mit Wasser als Eluent A und Acetonitril als Eluent B verwendet: 0 - 2.5 min: 0 % B, 2.5 - 5 min: 20 % B, 5 - 7.5 min: 40 % B, 7.5 - 10 min: 60 % B, 10 - 12.5 min: 80 % B, 12.5 - 17.2 min: 100 % B.

Die vereinten gesammelten Fraktionen werden in vacuo eingeengt und in 1.5 mL MeOH resuspendiert und per semipräparativer HPLC weiter aufgereinigt. Dafür wird ein Agilent 1200-System mit einer Agilent Eclipse XDB-C18-Säule (250 x 9.4 mm, 5 pM) mit Wasser + Ameisensäure (0.1 %) als Eluent A und Acetonitril als Eluent B mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 mL/min und einer Säulentemperatur von 12 °C verwendet. Es werden pro Lauf 50 pL injiziert und bei 220 nm detektiert. Dabei wird ein Gradient von 0 - 1.5 min: 30 % B, 1.5 - 16.5 min: 30 - 100 % B, 16.5 - 19 min:

100 % B, 19 - 19.5 min: 100 - 30 % B, 19.5 - 22 min: 30 % B genutzt.

5. Ausführungsbeispiel

-Mortierella algina- Isolate JMRC:SF:10519 und JMRC:SF: 10520-

Von insgesamt 23 untersuchten Stämmen konnten die Cycloacetamide ausschließlich aus den beiden Stämmen JMRC:SF: 10519 und JMRCSF: 10520 isoliert werden, wobei JMRC:SF:10519 = DSM 34346 = der Produzentenstamm ist. Beide Stämme stammen aus einer alpinen Region und wurden bereits in den Jahren 2004-2011 gesammelt.

Die Stämme wurden in der Jena Microbial Ressource Collection (JMRC) deponiert und im Jahr 2013 anhand ihrer LSU- (large ribosomal subunits) und ITS- (internal transcribed spacer) Sequenzen durch Maximum-Liklyhood-Analysen in die Gruppe 6 der Familie der Mortierellacea eingeordnet (Wagner L, Stielow B, Hoffmann K, Petkovits T, Papp T, Vägvölgyi C, de Hoog GS, Verkley G, Voigt K. A comprehensive molecular phylogeny of the Mortierellales (Mortierellomycotina) based on nuclear ribosomal DNA. Persoonia. 2013; 30:77-93. doi: 10.3767/003158513X666268. PMID: 24027348; PMCID: PMC3734968.).

Vor der Naturstoffanalyse wurden die Stämme anhand ihrer mittels PCR-Technik amplifizierten ITS-Region als Mortierella alpina JMRC:SF:10519 (= DSM 34346) und JMRC:SF: 10520 re-identifiziert.

Beide Mortierella alpina- Isolate weisen eine zueinander identische ITS- Sequenz auf und sind wiederum zu 96,4% identisch zum Referenzgenom-Stamm M. alpina ATCC32222 (Wang L, Chen W, Feng Y, Ren Y, Gu Z, Chen H, Wang H, Thomas MJ, Zhang B, Berquin IM, Li Y, Wu J, Zhang H, Song Y, Liu X, Norris JS, Wang S, Du P, Shen J, Wang N, Yang Y, Wang W, Feng L, Ratledge C, Zhang H, Chen YQ. Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina. PLoS One. 2011;6(12):e28319. doi: 10.1371/joumal.pone.0028319. Epub 2011 Dec 8. PMID: 22174787; PMCID: PMC3234268.). Das ITS- Sequenz-Alignment der beiden Produktions Stämme ist nachfolgend in der Abbildung 10 dargestellt.

Naturstoffchemisch lassen sich die 2 Mortierella alpina- Stämme dadurch charakterisieren, dass sie neben den o.g. Cycloacetamide A-F (= Verbindungen 1 - 6) auch Malpinin A (m/z, 859.4827 [M+H] ⁺ ), Malpibaldin A (m/z 626.4062 [M+H] ⁺ ) und Malpicyclin C m z 629.4343 [M+H] ⁺ ) produzieren.

Während Mortierella alpina- Isolat JMRC:SF:10519 zusätzlich Calpinactam (m/z [M+H] ⁺ ) produziert, sind die Calpinactam-

Produktionslevel von Mortierella alpina- Isolat JMRC:SF: 10520 unter dem Detektionsniveau.

Daher wurde Mortierella alpina- Isolat JMRCSF: 1010519 Als Produzentenstamm DSM 34346 ausgewählt.

6. Ausführungsbeispiel

Bioaktivität der Cycloacetamide A und B 1 und 2)- Die Cycloacetamide A und B (= Verbindung 1 und 2) wurden einem intensiven Bioaktivitätsscreening unterzogen.

Cycloacetamide A und B (^Verbindung 1 und 2) zeigen ab 60 pg/ml eine insektizide Wirkung auf Larven der Schwarzbäuchigen Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) (siehe Abbildung 10).

Eine repellente Wirkung auf Insekten ist nicht festzustellen, sodass hier von einem toxischen Effekt auszugehen ist.

Für Cycloacetamide A und B (= Verbindung 1 und 2) konnten keine antimikrobiellen (Pilze / Bakterien), cytotoxischen oder hormonfreisetzenden Wirkungen festgestellt werden (siehe Tabelle 5). Ebenso sind die Substanzen nicht gegen Trypanosomen oder Nematoden wirksam (je >100 pg/ml).

Von besonderem Vorteil ist, dass die hier bereitgestellten Cycloacetamide halogenfreie Cyclooligopeptide sind, die durch einen Pilz Mortierella spec., insbesondere Mortierella alpina, besonders vorteilhaft dem Produzentenstamm Mortierella alpina DSM 34346 auf natürliche Weise gebildet werden und protease-stabil sind. Sie stellen damit eine nachhaltige, ökologisch verträgliche Alternative zu herkömmlichen Insektiziden dar.

Alle in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

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