L'invention concerne essentiellement un agent cyto-photo- protecteur cutané, en particulier, des cellules de Langerhans, à base de complexes nucléiques : ribonucléoprotidiques, ribonucléoti- diques, ribonucléosidiques, composition cosmétique ou dermo- pharmaceutique en contenant pour utilisation par voie topique, ainsique des nouveaux composés constitués par exemple, par des associations avec des photo-protecteurs de préférence biologiques, particulièrement ceux existant dans l'épiderme ayant une action photo-protectrice directe comme la kératine, les urocanates, certains acides aminés, soit une action indirecte comme des compositions tyrosiniques, tryptophane stimulateurs de bio¬ synthèse de mélanine (laquelle est reconnue comme l'un des meilleurs agents photo-protecteurs naturels contre les effets nocifs du rayonnement solaire ou UV) . On connaît déjà dans l'art antérieur de nombreux agents photo-protecteurs de la peau. Par exemple, le document FR-A-2 026 267 décrit l'emploi d'association avec de l'uracile, de la cytosine, de la guanine et/ou du 5-chloro-uraci le comme agents photo-protecteurs de la peau, des tests de contrôle de photo-protection étant donnés par détermination du "facteur moyen de protection" d'après SCHULZE (Parfumerie und Kosmetik 37, 310/365 ⁽ 1956)). Dans ce dernier document, on décrit également des combinaisons de ces substances, qui sont des bases puriques, pyrimidiques avec des agents photoprotecteurs usuels tels que des cinnamates, en particulier le pméthoxycinnamate d ¹ éthyIhexyle.

Cependant, ces bases puriques ou pyrimidiques sont peu ou pas solubles dans l'eau.

On connaît également par le document antérieur de la demanderesse EP-B-10 483 des agents accélérateurs de bronzage aboutissant ainsi à une photo-protection de la peau, à base de tyrosinate d'arginine et prévoyant des combinaisons avec l'acide

urocaπique ou des urocanates d'arginine. Les agents accélérateurs de bronzage ont un effet photo-protecteur parstimulation de la formation de mélanine. On décrit également dans FR-A-2 579 461 des amides de l'acide urocanique comme filtre solaire. On connaît également, par le document FR-A-2 511 243, l'emploi d'ADN hautement polymérisé principalement dans des compo¬ sitions cosmétiques telles que des crèmes, laits ou lotions, pour améliorer l'élasticité ou la régénération cellulaire. Il est évoqué dans ce document une possibilité de protection de la peau vis-à-vis des rayons nocifs du soleil. Cependant, dans le cadre du lait solaire, il est proposé d'ajouter un filtre solaire résistant aux ultraviolets dont il est indiqué qu'il doit être non sensibilisant. Aucun d'entre eux n'a été décrit par l'auteur. Par ailleurs, divers dérivés nucléiques ont été décrits en tant que tel, dans certains cas avec une application thérapeutique principalement pour lutter contre l'asthénie de l'insuffisante hépatique (voir FR-A-2 329 289 ; FR-A-2 181 220 ; US-A-3326 892 ; AU-B-461 034 ; FR-A-1 440 795 ; FR-A-2354774 ; FR-A-2 113 774 ; BSM-A-3 932 ; BSM-A-5 032 et BSM-A-4811). Tous les agents photo-protecteurs connus ont pour but de protéger la peau contre les dangers de l'exposition solaire abusive ou chronique dont il est bien connu que les effets nocifs sont liés principalement aux rayonnements ultraviolets, type UVB et UVA. On sait que ces effets nocifs se traduisent par des manifestations aiguës allant de l'érythème solaire simple aux nécroses cutanées en passant par les brûlures de différents degrés ; des effets tardifs résultant d'expositions prolongées et répétées aboutissant à un vieillissement cutané précoce ; enfin des effets carcinogènes cutanés à long terme, consécutifs à des expositions UVR chroniques. La photo-protection est donc apparue depuis longtemps comme une nécessité pour se prémunir des effets nocifs du rayon¬ nement solaire.

Ainsi, ont été commercialisés de nombreux produits cosmé¬ tiques dits solaires devant apporter une garantie contre les méfaits du soleil, appliqués topiquement et contenant diverses variétés d'agents photo-protecteurs ou antisolaires dont des

exemples représentatifs sont donnés par les documents ci-dessus mentionnés.

Pour les consommateurs, l'efficacité photo-protectrice de ces produits "soLaires" est spécifiée sur les produits par l'indi- cation d'indice de photo-protection ou S.P.F. (Sun Protecting Factor) déterminés par des photobiologistes sur des séries de sujets volontaires de phototypes courants, selon des méthodes offi ci alisées.

Ces méthodes reposent en particulier sur la détermination visuelle de la MED (Minimum Erythemal Dosis) correspondant à la plus petite dose d'irradiation UVR capable de produire, à l'aide d'un simulateur solaire, un érythème visible, à bords nets, 24 h après l'irradiation.

Mais il est apparu par des contrôles hi stologiques que, bien avant le début de l'apparition d'érythèmes liminaires, des dégâts cellulaires se produisaient déjà à des doses UVR bien infé¬ rieures à la MED. La valeur SPF n'est donc pas adaptée à la cyto- photo-protection. Ainsi, il a pu être constaté l'apparition dans l'épiderme de cellules "coup de soleil (Sunburn Cells") tout à fait caractéristiques correspondant à des kérat nocytes épidei— miques lésés par les UVR à des doses inférieures à la MED, donc sans qu'il ait été constaté l'apparition d'érythèmes. Ainsi, si des dégâts cellulaires dans la peau peuvent apparaître à des doses UVR inférieures à celles produisant un érythème visible, il y a un intérêt manifeste à ne pas se contenter d'assurer une photo- protection permettant d'éviter l'érythème solaire, mais d'assurer en outre une véritable photo-protection des cellules vivantes de l'épiderme et du derme, ce que n'apportent pas ou mal des filtres solaires alignés sur une simple MED de valeur moyenne, d'ailleurs inconnue généralement des utilisateurs et de plus évolutive.

Parmi ces cellules vivantes pouvant subir des dommages par UVR, on peut citer principalement :

* Pour l'épiderme : - les kératinocytes épidermiques, essentiels pour la protection de la peau, et tout particulièrement,

- les cellules de Langerhans, élément fondamental du système de défense immunitaire cutané. Elles jouent un rôle fondamental dans la captation et le traitement des antigènes :

. antigènes exogènes : par exemple virus, substances toxiques, substances sensibilisantes,

. antigènes endogènes : cellules épidermiques anormales ou trans¬ formées, voire malignes.

Selon B. GILCHREST , si le nombre de cellules de Langerhans et leur fonctionnalité (explorée par le test du DNCB) diminue avec l'âge en zones couvertes (vieillissement physiolo¬ gique), cette diminution est encore plus importante avec l'âge en zones exposées par rapport aux zones couvertes (vieillissement actinique) .

Cette altération avec l'âge du nombre et de la fonction des cellules de Langerhans, principalement liée aux expositions solaires répétées, entraîne une diminution du système de défense immunitaire cutané et favorise notamment la carcîno et photo- carcinogénèse cutanée.

- autres cellules épidermiques concernées : les cellules de RERCKEL et les mélanocytes dont le nombre et la vitalité diminuent avec l'âge, ce qui diminue d'autant la capacité d'auto-photo- protection cutanée par pigments mélaniques.

* Pour le derme : - les fîbroblastes-fibrocytes, responsables de la biosynthèse des éléments constitutifs du derme.

Par ailleurs, les présents inventeurs ont tenu à vérifier si les préparations solaires et éventuellement les filtres solaires classiques, tels que les cinnamates et esters de PABA, ne seraient pas susceptibles d'avoir un effet cytotoxique ou photo-cyto-toxique sur les cellules vivantes de l'épiderme et/ou du derme dont ils doivent assurer la photo-protection, et particulièrement sur les

Barbara A. GILCHREST - SKIN * AGING PROCESSES - CRC Press -

1984 - pages 73, 87, 102, 103.

cellules de Langerhans qui constituent l'élément essentiel du capital immunitaire cutané.

Or, les présents inventeurs ont pu découvrir de manière inattendue que les filtres testés, mis en contact avec des cellules épidermiques et dermiques vivantes, en conditions in vivo et in vitro étaient non seulement mal tolérés, mais présentaient une cytotoxicite non négligeable particulièrement en contrôle in vitro. En ce qui concerne les cellules de Langerhans, les filtres couramment utilisés se comportent comme des haptènes et, de ce fait, bloquent ou altèrent la fonction essentielle de réponse immunologique des cellules de Langerhans. Ce processus se manifeste entre autres par le blocage du site HLADR qui joue un rôle capital dans la reconnaissance, et la présentation des anti¬ gènes. Or, la cyto-photo-protection devient aberrante si l'agent photo-protecteur est lui-même cytotoxique ou perturbateur de fonc¬ tion.

Le constat d'une cytotoxicite de filtres solaires connus testés au contact des cellules vivantes précitées Laisse supposer que le risque existe non seulement en culture de cellules, mais in vivo au cas où ces filtres pourraient traverser la peau par simple usage topique.

Or, les travaux récents, effectués sur divers esters cinnamiques, qui sont des agents photo-protecteurs courants, démontrent que, lorsqu'ils sont introduits dans des excipients cosmétiques solaires, ces filtres pénétraient relativement rapi¬ dement dans la peau, mais en plus étaient présents dans le sang circulant (voir la thèse de pharmacie de Monsieur CLAUS Denis présentée à l'Université de Strasbourg FRANCE (1982), ayant pour titre "Etude de la stabilité photochimique et de la pénétration cutanée d'esters de l'acide para-méthoxycinnamique") .

De même, d'autres publications font état de sensibili¬ sations et de réactions allergiques (entre autres le livre de J. Foussereau ayant pour titre "Les eczémas allergiques, au chapitre : Les Anti-solaires" paru aux éditions MASS0N en 1987, en particulier pages 312-319, et l'article de MAYBACH paru dans

Contact Dermatitis 1978, pages 1665-1666 ayant pour titre "Allergie Contact Photo-dermatitis to PABA ; l'article de JEANMOUGIN paru dans Photo-dermatoses, page 180 concernant les allergies et photo-allergies de Contact ; l'article de DAVIES paru dans Contact dermatitis 1982, _8_, pages 190-192 ayant pour titre "Acute Photo-sentivity fro sunscreen 2, EE PMC ; l'article de Horio paru dans Dermatologica 1978, 156, pages 124-128 ayant pour titre "Photo Contact Dermatitis from PABA", l'article de THOMSON et MAIBACH paru dans Arch. Dermatology, 1977, 113, pages 1252-1253, également.

La présente invention a donc pur but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux agents cyto-photo-protecteurs spécifiques pouvant être utilisés topiquement pendant de longues périodes, cyto-compatibles, et bien tolérés en usage topique courant même prolongé, comme pour les produits dénommés "anti-âge" d'utilisation journalière, de préférence sans emploi de filtres solaires classiques.

La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux agents photo-protecteurs ayant une activité spécifique de photo¬ protection cellulaire dite cyto-photo-protection, notamment pour les cellules essentielles de l'épiderme et du derme, telles que les kératinocytes, les fibroblastes, et tout particulièrement les cellules de Langerhans. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux agentscyto-photo-protecteurs ne se comportant pas ou essentielle¬ ment pas comme des haptènes, donc ne bloquant pas la fonction essentielle de réponse immunologique des cellules de Langerhans. La présente invention a également pour but de résoudre ces nouveaux problèmes techniques énoncés ci-dessus en fournissant de tels nouveaux agents cyto-photo-protecteurs cutanés, qui soient en outre compatibles et stables dans La plupart des préparations cosmétiques ou dermatologiques, tout en étant de préférence hydro- solubles, permettant ainsi une meilleure pénétration dans Les

couches épidermiques, ce qui permet de différencier les agents bio-cyto-photo-protecteurs des filtres solaires classiques.

Ces nouveaux problèmes techniques sont résolus pour la première fois par la présente invention, d'une manière simultanée, utilisable à l'échelle industrielle.

Ainsi, la présente invention fournit, selon un premier aspect, un agent cyto-photo-protecteur cutané, d'origine biolo¬ gique ou biotechnologique, notamment ayant une activité photo¬ protectrice des cellules fonctionnelles de la peau, en parti- culier des cellules de Langerhans, de préférence ne contenant pas de filtre solaire cyto-toxique, synthétique, en particulier du type cinnamate ou PABA ou leurs dérivés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé choisi parmi le groupe des composés et dérivés nucléiques comprenant : A - Les acides ribonucléiques, ainsi que leurs dérivés, en particulier leurs sels, avec des bases minérales ou organiques, et de préférence des sels complexes de proteides basiques, des aminoacides basiques ou des peptides basiques ;

B - Les ribonucleotides, ainsi que leurs dérivés type sels, avec des bases minérales ou de préférence organiques incluant des sels complexes avec des proteides basiques, des amino¬ acides basiques ou des peptides basiques ; et C - Des ribonucléosides.

Selon un mode de réalisation particulier, les acides ribonucléiques sont sous forme de sels avec des bases minérales, avantageusement choisies parmi NaOH, KOH, NH,0H, ou des bases organiques, en particulier les éthanolamines.

Selon un autre mode de réalisation particulier, les acides ribonucléiques sont sous forme de leurs sels avec des pro- téides basiques, tels que :

- les histones ou microprotéines de poids moléculaire compris entre 11 000 et 24 000 environ, fortement basiques en raison de leur richesse en acides aminés basiques type Arginine et Lysine, qui constituent jusqu'à 25 % des résidus aminés de ces molécules. Des histones préférées sont celles du type H1, H2A, H3, H4 qui sont par exemple rapportées page 818 du livre de A. LEHNINGER. De

teLles histones se rencontrent en particulier dans Le sperme de certains poissons. Les Leucocytes, Le thymus et plus généralement dans tous les noyaux celLulaires ; - Les gLobines dont Les poids moléculaires sont compris entre environ 15 000 et environ 70 000, et qui sont riches en amino- acides basiques constitutifs du type Histidîne (5 à 9 %) et Lysine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, Les acides ribonucléiques sont sous forme de leurs sels complexes avec des aminoacides basiques, de préférence choisis parmi la

L-histidîne, la L-arginine, La L-lysine, La L-hydroxylysine, La

L-ornithine.

Selon une autre variante, Les acides ribonucléiques sont sous forme de Leurs sels avec des peptides basiques. En outre, il est à observer que Les sels complexes des acides ribonucléiques précités présentent L'avantage d'être hydrosolubles, de présenter une bonne dîffusibi Lîté dans l'épiderme et qu'ils peuvent être utilisés à des concentrations permettant d'obtenir de préférence des pH bio-compatibles compris entre 5,8 et 8, le milieu liquidien interstitiel étant à un pH voisin de 7,4.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'inven¬ tion, Les ribonucleotides précités sont choisis parmi le groupe des mono-ribonucléotides courants, c'est-à-dire Les constituants normaux des acides nucléiques correspondants qui présentent un fort pouvoir UV absorbant dans les Longueurs d'onde de 250 à 280 nm. Les ribonucleotides préférés sont Les suivants :

AMP ADP ATP

IMP IDP ITP

XMP XDP XTP

De préférence, on utilise les ribonucleotides précités sous forme de Leurs sels avec des bases, ce qui permet d'obtenir des pH de l'ordre de 5,8 à 8 qui sont biocompatibles.

Selon un mode de réalisation particulier, les ribonu- cléotides précités sont sous forme de leurs sels avec des bases minérales, de préférence choisies parmi NaOH, K0H, NH.0H, ou avec des bases organiques, en particulier les éthanolamines. Un exemple de sel particulièrement préféré est le sel de sodium de L'ATP pour son effet photo-cyto-protecteur spécifique des cellules de Langerhans.

Selon un autre mode de réalisation particulier, Les ribo¬ nucleotides précités sont sous forme de Leurs sels avec des proteides basiques, tels que :

- les histones ou microprotéines de poids moléculaire compris entre 11 000 et 24 000 environ. En particulier, il s'agit des histones type H1, H2A, H3B, H3, H4 définies plus avant.

- les globines ou copules protéiques des hémoglobines et des myo- globines dont Les poids moléculaires sont compris entre environ 15 000 et environ 70 000. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'inven¬ tion, les ribonucleotides précités sont sous forme de leurs sels avec les aminoacides basiques, en particulier un ou plusieurs aminoacides basiques choisis parmi le groupe consistant de la L-histidine, la L-arginine, La L-ornithine, la L-hydroxylysine, La L-Lysine.

Selon une autre variante, les ribonucleotides sont sous forme de Leurs sels avec des peptides basiques.

Selon un autre mode de réalisation particulier, les ribo- nucléosides précités sont choisis parmi le groupe consistant des monoribonucléosides courants, qui sont Les constituants normaux des acides nucléiques correspondants qui présentent un fort pouvoir UV

absorbant dans Les Longueurs d'onde de 250 à 280 nm, de préfé¬ rence :

RIBONUCLEOSIDES

. Adénosine . Cytidine . Guanosine . Inosine . Uridine . Xanthosine

L'avantage des ribonucléosides est qu'ils présentent la plupart du temps directement des pH compatibles avec la physio¬ logie cellulaire cutanée, donc ne nécessitant pas a priori la formation de sels, complexes ou combinaisons biochimiques avec des proteides basiques, peptides basiques et aminoacides basiques.

Ces nucléosides peuvent, seLon certains modes de réali¬ sation particuliers, être associés ou combinés à un ou plusieurs des nucLeoprotides ou ribonucleotides précités ainsi que leurs sels, en des proportions calculées pour l'obtention de pH biocompatibles compris entre 5,8 et 8.

On comprend que, selon l'invention, il est préféré d'uti¬ liser des agents cyto-photo-protecteurs hydrosolubles présentant une bonne dîffusi i lité dans L'épiderme, à des concentrations per¬ mettant d'obtenir des pH biocompatibles ou compris entre 5,8 et 8.

IL est à noter que La nature de L'acide nucléique ARN ou des poly-ribo-nucléotides utilisés pour la formation des dérivés selon L'invention peut être quelconque. En effet, il peut s'agir de poly-ribo-nucléotides de départ dont la structure secondaire ou tertiaire est conservée, mais aussi des acides ribonucléiques résultant de La dénaturatîon plus ou moins partielle des poly- ribo-nucléotides, car cette dénaturation plus ou moins partielle n'est pas gênante. On peut ainsi utiLiser des acides dont La structure primaire peut être conservée au maximum, ou Le produit de La dénaturatîon-dégradation, plus ou moins ménagée de ces

structures primaires, résultant en fragments de structure primaire, allant des poly- aux oligo- et aux mono-nueLéotides et/ou aux poly-, oligo- ou mono-ribonucléosides correspondants.

Cette dénaturation plus ou moins partielle n'est pas gênante pour la formation des dérivés selon l'invention utilisés comme agents cyto-photo-protecteurs, car cette utilisation n'a surtout pas pour but de traduire le message génétique original de l'ARN utilisé pour La préparation des dérivés selon L ^* invention. II résulte de ce qui précède que le but de l'utilisation topique des dérivés selon L'invention est d'exercer des effets cyto-photo-protecteurs en déposant Les composés selon l'invention sur ou dans les couches superficielles cutanées.

Ils jouent ainsi Le rôle de chromophores ou de cibles passives Les plus avancées qui absorberont ou piégeront l'énergie du rayonnement, compétitivement et préférentiellement, empêchant les radiations d'atteindre les cibles potentielles qu'il faut réellement protéger des dommages des irradiations, constituées par les organites cellulaires actifs et macro-molécules constitutives. En outre, la présence des composés selon L'invention en quantité importante, comprenant des poly-, oligo- et mono-ribo- nucléotides, sels, complexes, combinaisons et dérivés de poly-, d'oligo- et de mono-ribonucléosides, est parfaitement tolérée par Les cellules puisqu'on en trouve naturellement un pourcentage élevé situé entre 5 et 15 % par rapport au poids desséché des cellules vivantes, et que L'on en trouve normalement dans les couches épi¬ dermiques cornées.

Les composés selon L'invention sont donc des substances biologiques homologues ou analogues aux substances naturellement présentes dans l'épiderme.

Il est préféré d'utiliser les dérivés de l'acide ribonucléique ou des constituants d'ARN par rapport aux dérivés de l'ADN en raison du fait que : - les ARN et constituants dérivés sont naturellement présents dans les cellules eucaryotes à des concentrations habituellement de 2

à 8 fois plus fortes que les dérivés d'ADN et se rapprochent ainsi davantage du milieu physiologique cellulaire et tissulaire,

- Les ARN et ribonucLéodérivés apparaissent comme étant moins sensibles aux irradiations UVB, - les ARN sont plus Labi Les à La dépolymérisation et hydrolyse partielle en nucléotides de Leur molécule que Les ADN, ce qui est favorable pour La cyto-photo-protection de La peau,

- Les ARN sont aussi indispensables au fonctionnement normal des cellules cutanées que le sont Les ADN et les protéines de ces mêmes cellules.

Selon un autre mode de réalisation particulier de L'inven¬ tion, les agents cyto-photo-protecteurs de La peau selon L'inven¬ tion sont caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre des dérivés d'acide urocanique ou urocanoprotides, car ces dérivés présentent un effet de synergie avec Les composés précédents ribonucléoprotides, ribonucleotides et ribonucléosides.

Ces dérivés d'acide urocanique ou urocanoprotides sont des sels simples ou complexes de L'acide urocanique ou des dérivés d'acide urocanique avec certains proteides, peptides, acides aminés.

Ces dérivés d'acide urocanique ou urocanoprotides sous forme de sels complexes sont obtenus de préférence par une combi¬ naison de L'acide urocanique avec : a) des proteides basiques, avantageusement des histones ou des globines, en particulier, telles que précédemment définies ; b) des ribonucleotides tels que AMP, ADP, ATP photo-absorbants ; c) des peptides basiques, d) des aminoacides basiques, de préférence L-hîstidine, L-arginine, L-lysine, L-hydroxylysine, L-ornithine, pris seuls ou en combinaisons.

On comprendra que Le but de ces combinaisons biochimiques est de réaliser des sels complexes biologiques hydrosolubles contrairement à L'acide urocanique qui l'est peu ou insuffisamment et plus cyto-compatible que Les urocanates de Na, K. Ces dérivés urocaniques développent un effet très forte¬ ment absorbant des UVR, notamment dans les bandes 265, 290 à

320 n , ces composés étant d'autant plus UV absorbants qu'ils sont associés à des ribo-nucléotides, proteides, peptides, aminoacides eux-mêmes photo-absorbants couvrant une bande d'absorption s'éten- dant de 265 à 320 nm. Ils sont intéressants, du fait qu'ils sont solubles, net¬ tement substantifs et que Leurs solutions peuvent être ajustées à des pH physiologiques de 6,0 à 8,0, suivant les proportions de chacun des constituants.

Un autre effet particuLièrement avantageux, inattendu des agents cyto-photo-protecteurs de L'invention réside dans Le fait que La combinaison des dérivés de l'acide urocanique avec Les agents cyto-photo-protecteurs de L'invention réalise un processus naturel de photo-défense cutanée. On peut observer que la proportion des sels et complexes urocaniques augmente de manière considérable, jusqu'à 10 fois, dans l'épiderme et particulièrement dans la partie réservoir de la couche cornée après les irradia¬ tions solaires et suite aux stimuli thermiques des glandes sudori- pares par les rayonnements infrarouges solaires.

Selon l'invention, on donne la préférence dans Les dérivés urocaniques aux complexes urocanoprotidiques, à savoir les urocano- histones, urocano-peptides, urocano-aminoacides basiques et urocano-nucléotidiques plus cytophiles que Les dérivés ou sels minéraux alcalins ou alcalino-terreux.

Selon un autre mode de réalisation particulier de L'inven- tion, les agents cyto-protecteurs de La peau selon L'invention comprennent en outre des aminoacides et des peptides ou protéines.

Avantageusement, ces aminoacides et ces peptides et pro¬ téines sont choisis parmi :

1) un ou plusieurs des 20 aminoacides courants habituels des protéines, dont la liste suit :

. Aminoacides engagés dans Les complexes, combinaisons précitées

L-histidine, L-arginine, L-lysine, L-citrul Une, L-ornithine,

L-hydroxylysine.

. Aminoacides aromatiques L-tyrosine, L-phénylalanine, L-trypto- phane. Très avantageux, car disposant eux-mêmes d'un effet UVR absorbant important dans la bande 280 nm.

. Aminoaci des dîcarboxy li ques : acide L-g lutami que, acide L-aspar- ti que.

. Acides ami nés cyc l iques : L-proline (L-hydroxypro Li ne) . . Acides ami nés monocarboxyliques : g lyci ne, a lanine, L-va Line , L- Leucine , L-isoleuci ne .

^* * ^* -k

. Acides aminés "aLcool" : L-sérine , L-thréonine . . Acides aminés "amidés" : L-gLutamine , L-asparagine.

. Acides aminés soufrés et oligo-peptides soufrés : L-cystéine , L-

* . * methiomne , cystine , *Aminoacides épidermiques abondants dans La kératine dont on connaît le pouvoir photo-protecteur.

2 ⁾ Un ou plusieurs des peptides et protéines habituels des cellules et/ou peptides résultant de l'hydrolyse acide, basique ou enzymatique, de polypeptides et/ou protéines scLéoroprotéines et protéines solubles.

Par exemple : GLUTATHION : tripeptide parfaitement hydro- soLuble et habituellement présent dans tous Les tissus vivants à concentration élevée (5 mM) et qui joue un rôle important dans Le transport intra-cellulai re des acides aminés et dans les réactions biologiques d'oxydo-réduction.

Les peptides hormonaux sont exclus de La présente inven¬ tion. Par contre sont avantageusement complémentaires, les . Scléroprotéines et Leurs hydrolysats partiels. Par exemple : - fibroïne de la soie concentrations de 1 à 10 %

- collagène concentrations de 1 à 10 %

- élastine concentrations de 1 à 10 %

- kératines hydrophiles

. Protéines solubles et Leurs hydrolysats partiels : Par exemple : (en concentrations de 0,10 à 10 %)

- histones

- globines (hémoglobines et yoglobines ⁾

- protéines plasmatiques (par exemple sérum-albumine, sérum- globulines) - protéines plasmatiques partiellement hydrolysées (voie enzy¬ matique), soit de plasma sanguin riche en protéines (environ

8 %) et utilisable comme solvant biologique synergique de photo-protection et véhicule transporteur biologique, grâce à la pression osmotique qu'il développe, particulièrement actif et à son pH d'origine 7,4 pour dissoudre et diffuser les ribo- nucléo-dérivés précités.

L'intérêt de ces peptides et protéines est qu'ils ont eux- mêmes un pouvoir photo-absorbant dans le spectre ultraviolet :

- dans la zone 250 à 300 nm (absorption résultant principalement de la présence des 3 aminoacides aromatiques : tyrosine-tryptophane- phénylalanine,

- dans La zone 210 à 250 nm (absorption due notamment aux amino¬ acides : cystéine, éthionine, histidine),

- dans La zone inférieure à 210 nm (absorption due aux liaisons peptidiques), et qu'ils peuvent être utilisés en synergie avec tous Les nucLeo¬ protides précités et tous Les urocanoprotides précités renforçant Le pouvoir cyto-photo-protecteur des précédents.

La présente invention couvre, selon un deuxième aspect, les compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques à activité cyto-photo-protectrice de la peau, notamment à activité photo- protectrice cellulaire et antiviei llissement précoce cutané, en particulier protectrice des cellules de Langerhans, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un agent cyto-photo-protecteur tel que précédemment défini. Dans ces compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques selon l'invention, la concentration totale en agents photo- protecteurs selon L'invention est habituellement similaire aux concentrations en agents photo-protecteurs antérieurement connus utilisés pour La photo-protection de La peau. Cette concentration en principe(s ⁾ actif(s ⁾ selon l'invention sera avantageusement comprise entre 0,01 % et 10 % en poids, de préférence 0,1 à 3 %, par rapport au poids total de la composition cosmétique ou dermo- phar aceutique.

On pourra utiliser tout type d'excipient habituel de telles compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques pour uti¬ lisation par voie topique.

La présente invention concerne encore, selon un troisième aspect, de nouveaux composés, caractérisés en ce qu'il s'agit des composés choisis parmi le groupe consistant de :

A - Les sels simples ou complexes des acides ribonucléiques précé- demment énoncés avec des bases organiques, choisies parmi les groupes consistants des proteides basiques tels qu'histone, globine, des peptides basiques, ou des peptides tels que glutathion.

B - Les sels simples ou complexes des ribonucleotides précédemment décrits, avec Les bases organiques choisies parmi Les groupes consistants des proteides basiques et des peptides basiques précités.

Selon une variante, Les ribonucleotides sont choisis parmi :

AMP ADP ATP

XMP XDP XTP

Enfin, selon un quatrième aspect, La présente invention concerne encore un procédé de préparation d'un agent cyto-photo- protecteur de La peau, en particulier des cellules de Langerhans, caractérisé en ce qu'on utilise, à titre d'agent cyto-photo- protecteur, au moins un composé choisi parmi Le groupe consistant des composés et dérivés nucLéoprotidiques et ribonucléosidiques précédemment définis. Les modes de réalisation particuliers de préparation de ces agents cyto-photo-protecteur de La peau résultent également de La description précédente.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de préparation selon l'invention, on prépare Les sels des acides ribo¬ nucléiques avec des bases minérales ou organiques, ou mieux Les sels complexes avec des proteides basiques, des aminoacides ou des peptides basiques tels que précédemment définis, selon une réaction classique acide-base complète, ou partielle, dans le cas de sels complexes.

Selon un autre mode de réalisation du procédé selon L'invention, on prépare les sels des ribonucleotides avec des bases minérales ou organiques incluant des sels complexes avec des proteides basiques, des aminoacides basiques ou des peptides basiques, tels que précédemment définis, également selon une réaction acide-base classique.

La présente invention concerne aussi un procédé de prépa- ration de compositions cosmétiques et/ou dermo-pharmaceutiques, caractérisé en ce qu'on incorpore au moins un agent cyto-photo- protecteur de La peau tel que précédemment défini dans un exci¬ pient, véhicule ou support cosmétologiquement et/ou pharmaceutique- ment compatible. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven¬ tion apparaîtront clairement à la lumière de la description expli¬ cative qui va suivre, faite en référence à de multiples exemples de l'invention, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter La portée de l'invention. Dans La présente description, notamment les exemples, tous Les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire.

EXEMPLE 1

Préparation d'un ribonucléate de base minérale. On prépare par exemple un ribonucléate de potassium de la manière suivante : on utilise 5,7 ml de K0H 0,5 N pour dissoudre 1 g de ARN préalablement dispersé dans 2 g d'eau distillée.

On obtient ainsi une solution à pH : 6,85. Cet ajout d'acide ribonucléique se fait sous agitation vigoureuse pendant quelques minutes.

On sépare Le ribonucléate de potassium ainsi préparé de La manière suivante : pour obtenir Le ribonucléate de potassium sous forme de poudre blanc jaune pâle, il suffit de Lyophiliser rapidement cette solu- tion. On obtient Les caractéristiques physîcochimiques suivantes :

- spectre ultraviolet (eau distillée) = maximum 260 nm,

- pH (solution aqueuse) préparée comme ci-avant = 6,85.

On prépare de La même manière Les ribonucléates de sodium ou d'ammonium à partir des bases minérales correspondantes NaOH, NH ₄ 0H.

EXEMPLE 2 Ribonucléate de protéide

On prépare le ribonucléate d'histone en utilisant par exemple de l'ARN (qualité CODEX) disponible dans Le commerce.

On prépare une solution aqueuse d'histone (type IV très riche en Arginine).

A cette solution aqueuse, on ajoute sous agitation L'ARN par petites quantités, puis on continue à agiter jusqu'à dissolution complète et obtention d'un pH de 6,8.

La séparation du ribonucléate d'histone obtenu se fait : par Lyophilisation, soit par précipitation par L'éthanoL à 96 . Centrifugation - Lavage à L'éthanol anhydre - séchage sous vide. Spectre ultraviolet Longueur d'onde : 258 - 262 nm.

EXEMPLE 3 Ribonucléate d'aminoacide basique On prépare Les ribonucléates d'arginine, d'histidine et de Lysine

3 - A - Ribonucléate d'arginine

- Dans un erlenmeyer, 0,665 g de L-arginine sont dissous par agita¬ tion dans 100 ml d'eau distillée.

- 1,335 g d'ARN CODEX est ajouté progressivement, par petites fractions, sous agitation, à la température du Laboratoire.

- Poursuivre l'agitation jusqu'à dissolution complète (1 h envi¬ ron) .

- Le liquide obtenu est filtré et déshydraté par exemple par Lyophilisation : obtention d'une poudre blanche. (rendement : environ 95 %) .

. Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 258 nm . pH (eau distillée) : 6,3.

3 - B - Ribonucléate d'histidine

- Dans un erlenmeyer, 0,947 g de L-histidine sont dissous par agi- tation dans 100 ml d'eau distillée.

- 1,053 g d'ARN CODEX est ajouté progressivement, par petites fractions, sous agitation, à la température du Laboratoire.

- Poursuivre l'agitation jusqu'à dissolution complète (12 h envi¬ ron) . - Le liquide obtenu est filtré et déshydraté par exemple par lyophilisation : obtention d'une poudre blanche.

(Rendement : environ 95 %).

. Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 258 nm

. pH (eau distillée) : 6,4 3 - C - Ribonucléate de Lysine

- Dans un erlenmeyer, 0,619 g de L-lysine sont dissous par agi¬ tation dans 100 ml d'eau distillée.

- 1,481 g d'ARN CODEX est ajouté progressivement, par petites fractions, sous agitation, à la température du laboratoire. - Poursuivre L'agitation jusqu'à dissolution complète (1 h envi ron) .

- Le liquide obtenu est filtré et déshydraté, par exemple par Lyophilisation : obtention d'une poudre blanche.

(Rendement : environ 95 %) . . Spectre ultraviolet ⁽ eau distillée) : maximum 258 nm . pH (eau distillée) : 6,2

EXEMPLE 4

Ribonucléotidate de base minérale En procédant de manière générale comme décrit à l'exemple

1, on prépare Les ribonucléotidates de base minérale suivants :

4 - A . Cytidîne monophosphate de sodium

4 - B . Uridine monophosphate de sodium

4 - C . Inosine monophosphate de sodium

4 - D . Adénosine diphosphate de sodium 4 - E . Adénosine triphosphate de sodium

4 - F . Guanosine monophosphate de sodium

4 - G . Adénosine monophosphate de sodium

EXEMPLE 5 Ribonucléotidate de protéide

On prépare Les ribonucléotidates de protéide suivants, selon la procédure suivante :

- Cytidine monophosphate d'histone.

La préparation a lieu comme suit, La cytidîne monophos- phate étant très soluble dans l'eau, ainsi que L'histone, iL suffit de préparer des solutions respectives de 1 % et de les mélanger jusqu'à obtention d'un pH compris entre 6 et 7, puis de Lyophiliser la préparation obtenue. Absorption UV moyenne = 270 nm. EXEMPLE 6

Ribonucléotidate de peptide On prépare les ribonucléotidates de peptide suivants :

- La cytidine monophosphate de protamine selon Le même procédé qu'à L'exemple 5.

EXEMPLE 7

Ribonucléotidate d'aminoacide On prépare Les ribonucléotidates d'aminoacides basiques suivants : 7 - A - Cytidine monophosphate d'arginine

- Dans un erlenmeyer, 0,857 g de L-arginine est dissous par agita¬ tion dans 100 ml d'eau distillée.

- 1,143 g de cytidine monophosphate est ajouté progressivement, par petites fractions, sous agitations, à la température du labora- toire.

- Poursuivre L' agitation jusqu' à di ssolution complète .

- Le soluté obtenu est filtré et déshydraté par exemple par Lyophi lisation.

- Obtention d'une poudre beige (Rendement : environ 95 %) . Spectre ultraviolet ⁽ eau distillée) : maximum 272 nm . pH (eau distillée) : 6,2.

7 - B - Cytidine monophosphate d'histidine

- Dans un erlenmeyer, 1,07 g de L-histidine est dissous par agi¬ tation dans 100 ml d'eau distillée.

- 0,93 g de cytidine monophosphate est ajouté progressivement par petites fractions, sous agitation, à la température du Labora- toire.

- Poursuivre l'agitation jusqu'à dissolution complète.

- Le soluté obtenu est filtré et déshydraté, par exemple par lyo¬ phi lisation. - Obtention d'une poudre beige (Rendement : environ 95 %) . . Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 272 nm . pH (eau distillée) : 6,2.

7 - C - Adénosine triphosphate d'arginine

- Dans un erlenmeyer, 0,966 g de L-arginine sont dissous par agita- tion dans 100 ml d'eau distillée.

- 2,034 g d'adénosine triphosphate de sodium sont ajoutés progres¬ sivement par petites fractions, sous agitation, à la température du Laboratoire.

- Poursuivre L'agitation jusqu'à dissolution complète. - Le soluté obtenu est filtré et déshydraté, par exemple par lyo¬ phi lisation.

- Obtention d'une poudre beige (Rendement : environ 95 %) . . Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 260 nm

. pH (eau distillée) : 6,7. 7 - D - Adénosine triphosphate d'histidine

- Dans un erlenmeyer, 1 g de L-histidine est dissous par agitation dans 100 ml d'eau distillée.

- 1 g d'adénosine triphosphate de sodium est ajouté progressive¬ ment, par petites fractions, sous agitation, à la température du laboratoire.

- Poursuivre L'agitation jusqu'à dissolution complète (1 h environ).

- Le soluté obtenu est filtré etdeshydrate par exemple par lyophi¬ lisation. - Obtention d'une poudre beige (Rendement : environ 95 Y...

. Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 259 nm

. pH (eau distillée) : 6,6.

EXEMPLE 8 Ribonucléosides

Les ribonucléosides suivants sont disponibles dans le commerce : 8 - A . Adénosine 8 - B . Cytidine 8 - C . Inosine 8 - D . Uridine 8 - E . Uridine/cytidine (50/50)

EXEMPLE 9 Urocanate de protéide

On prépare L'urocanate d'histone en opérant de manière similaire à La préparation de L'urocanate de protamine énoncée à L'exemple 10, mais en opérant à une température < 50 C.

EXEMPLE 10

Urocanate de peptide On prépare L'urocanate de protamine de La manière sui¬ vante :

- Dans un erlenmeyer, 1,40 g de protamine est dissous par agitation dans 100 ml d'eau distillée.

- 1,40 g d'acide urocanique est ajouté progressivement.

- Poursuivre l'agitation à 70 C, jusqu'à dissolution complète.

- Filtrer et déshydrater, par exemple par Lyophilisation.

- Obtention d'une poudre beige (Rendement : environ 90 %) . . Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 269 nm.

EXEMPLE 11 Urocanate d'aminoacide basique On prépare les urocanates d'arginine, d'histidine de La manière suivante : . Urocanate d'arginine

- Introduire dans un réacteur muni d'un dispositif à reflux 720 g de méthanol, 135 g d'eau distillée, et ajouter sous agitation 69 g d'acide urocanique et 87 g d'arginine.

- Chauffer lentement Le mélange réactionnel, continuer à chauffer jusqu'à reflux ; maintenir L'agitation jusqu'à précipitation complète.

- Refroidir le mélange, puis centrifuger et sécher (Rendement : environ 90 %) .

. Spectre ultraviolet (eau distillée) : maximum 267 nm . pH (eau distillée) : 7,4.

. Urocanate d'histidine décrit antérieurement

- Introduire dans un réacteur muni d'un dispositif à reflux 720 g de méthanoL, 135 g d'eau distillée et ajouter sous agitation 69 g d'acide urocanique et 78,57 g d'histidine. - Chauffer lentement Le mélange réactionnel, continuer à chauffer jusqu'à reflux ; maintenir L'agitation jusqu'à précipitation complète.

- Refroidir le mélange, puis centrifuger et sécher (Rendement : environ 90 %) . Spectre ultraviolet (eau distillée ⁾ : de 260 à 268 nm.

Suivent une série d'exemples de compositions sous forme de poudre amorphe soluble permettant de réaliser des hydrosolutés dans L'eau distillée à diverses concentrations présentant des pH bio-compatibles compris par exemple entre 6 et 7,5.

EXEMPLE 12 d'une composition

Ribonucléate d'histidine 31,65

Chlorhydrate d'histidine 18,33 Hydrolysat partiel de coLLagène lyophilisé 50,02

Spectre ultraviolet (eau distillé) de 260 à 268 nm, suivant

La nature du collagene gène H 6,0 - 6,8.

EXEMPLE 13

Composition forme poudre amorphe Ribonucléate d'histidine 31,65 Cydidine/un ^" dine 16,65 Chlorhydrate d'histidine 18,33 Hydrolysat de collagene déshydraté 33,37

EXEMPLE 14

Composition forme poudre amorphe Ribonucléate d'histidine 47,83 Ribonucléate de sodium 8,15 Urocanate d'arginine 16,66 Uridine/cytidîne 1,32 Hydrolysat de collagene déshydraté 26,04

EXEMPLE 15

Composition forme poudre amorphe

Ribonucléate d'arginine 26,00

Urocanate d'histidine 15,63 Chlorhydrate d'arginine 1,03

Chlorhydrate d'histidine 24,67

Hydrolysat de collagene déshydraté 17,02

Uridine/cytidine 16,65

EXEMPLE 16

Composition forme poudre amorphe

Ribonucléate d'histidine 31,65

Histidîne 18,33

Urocanate d'arginine 16,65 Uridine/cytidine 16,65

Hydrolysat de collagene déshydraté 16,72.

EXEMPLE 17

Composition forme poudre amorphe Ribonucléate d'histidine 31,65 Histidine 18,33

Urocanate d'arginine 16,65 Hydrolysat de collagene lyophilisé 33,37.

EXEMPLE 18

Composition forme poudre amorphe Ribonucléate d'arginine 37,50

Urocanate d'arginine 35,67

Urocanate d'histidine 20,00

GLutat ion 1,25

L-tyrosine 3,00 L-phénylalanine 0,50

L-tryptophane 0,75

L-histidine CLH 1,33 pH dans eau distillée = 6,5 - 7

EXEMPLE 19

Composition forme poudre amorphe Ribonucléate d'arginine 37,50 Urocanate d'arginine 35,67 Urocanate d'histidine 20,00 GLutathion 1,25

L-tyrodise/L-phényLalanine/L-tryptophane 4,25 Chlorhydrate d'histidine 1,33

EXEMPLE 20 Composition forme poudre amorphe

Adénosine 0,04

Guanosine 0,04

Inosine • 0,04

Cytidine 0,04 Uridine 0,04

Glucose 9,40

Urocanate d'arginine 15,00

Hydrolysat de plasma sanguin Lyophilisé 75,04

Les compositions de base constituent des compositions d'agents cyto-photo-protecteurs de l'invention et peuvent être incorporées en tant que principes actifs à des doses comprises entre 0,01 % et 5 %, exceptionnellement de + 10 % et, de préférence, de 0,10 - 3 % dans des préparations dermatologiques, cosmétoLogiques et dermo-pharmaceutiques, pour constituer des compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques selon L'inven¬ tion. Cette incorporation s'effectue de manière extrêmement simple, habituellement par dissolution dans La phase aqueuse de ces préparations, à des températures comprises entre 20 C et 70 C.

On peut utiliser tout type d'excipient habituel de telles compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques contenant de L'eau. Il peut s'agir de Lotions aqueuses, de gels aqueux, d'émul- sions, de pommades, de crèmes, d'onguents, présentation en capsules, gélules.

En outre, ces principes actifs peuvent être incorporés dans des Liposomes, micelles et autres formes de mîcro- encapsulation pour en accélérer ou retarder la pénétration.

On donne ci-après un exemple de préparation d'une composi¬ tion cosmétique et/ou dermo-pharmaceutique contenant l'une des compositions précitées faisant L'objet de. L'invention.

IL est bien entendu que L'on peut faire de même avec les autres compositions.

Par exemple, la composition selon l'exemple 13 est incor¬ porée à la dose de 1 % dans l'émulsion suivante :

Propylèneglycol stéarate SE 1,00

Huile de paraffine 7,70 Stéarine 1,50

Alcool stéarylique 0,40

Glycérine 4,00

Carbomer 934 0,10

Triéthanolamine 0,80

Conservateur qs

Eau distillée qsp 100,00.

RESULTATS EXPERIMENTAUX

Afin d'illustrer et de démontrer les avantages des agents cyto-photo-protecteurs biologiques selon L'invention, on a réalisé sur ceux-ci des travaux expérimentaux, comparativement aux agents photo-protecteurs classiques, visant : - d'une part à évaluer leur cyto-toxicité propre,

- d'autre part Leur pouvoir cyto-photo-protecteur en contact avec les cellules. C'est ainsi que Les résultats obtenus pour quelques composés cités dans les exemples des pages précédentes sont regroupés dans Les trois tableaux suivants.

IL est à noter que, du point de vue de La capacité de photo-protection cutanée de ces composés par rapport aux méthodes de SCHULTZE ou variantes basées sur La MED donc La dose d'irradiation pour l'apparition d'un érythème Limité, Les forces de protection antisolaire pouvant être obtenues, se situeraient dans des indices faibles à moyens.

Par contre, du point de vue d'appréciation de La cyto- photo-protection par contact in vitro, les agents cyto-photo- protecteurs, objet des présentes revendications, sont dépourvus de cyto-toxicité aux concentrations utiles et exercent une réelle cyto-photo-protection solaire et essentiellement UV-B, à

des taux d'irradiations normalement supportables par chaque utili¬ sateur, par rapport à Leur MED.

IL est encore à noter qu'un essai comparatif réaLisé avec un sel de sodium de L'acide désoxyribonucLéique ne procure pas de cyto-photo-protection significative. IL est donc surprenant et tout à fait non évident pour L'homme de L'art que Les dérivés organiques de L'acide ribonucléique selon l'invention ont par contre un effet cyto-photo-protecteur.

- IL est connu d'autre part que les UV-B entraînent une dégradation morphologique et fonctionnelle des cellules de Langerhans, et il est connu que Les filtres solaires courants, type cinnamate, PABA n'empêchent pas cette dégradation.

- de même, iL est connu que Les UV-B entraînent une chute de L'activité ATP-asique des cellules de Langerhans, et que cette dégration ne peut être empêchée par les filtres solaires pré¬ cités.

- Ces mêmes filtres sont sans action pour assurer la protection des cellules de Langerhans contre La dégradation et négativatîon de La réponse au test immunologique au DNFB par Les UV-B.

PROTOCOLE type I

DL-.. sur fibroblastes MRC5, in vitro

. Les cellules Fibroblastes MRC5 sont ensemencées sur milieu EMEM, complémenté en sérum de veau foetal (5 %) .

. 24 h plus tard, le milieu est remplacé par une solution saline (PBS) du produit à tester (dans le cas des filtres PMCEH et PABEH, on prépare une solution mère).

. Un nombre suffisant de boîtes est préparé, par introduction de dilutions croissantes de La substance à tester (de 0,01 % à 0,03 %), de façon à réaliser une gamme d'explorations.

Toutes les bo tes sont alors incubées à 37 C, durant 2 h,

La solution saline est ensuite remplacée par le milieu de crois¬ sance habituel (EMEM + 5 % SVF) .

72 h plus tard, les cultures cellulaires sont colorées.

Le nombre de cellules vivantes est évalué par mesure de l'inten¬ sité de coloration de chaque boîte à L'Analyseur Electronique d' Images.

La DL _C Q correspond à la dose juste suffisante de produit testé, inhibant Le taux de croissance cellulaire de 50 %, par rapport au témoin.

PROTOCOLE type II

Toxicité sur fibroblastes MRC5

Les cellules MRC5 sont ensemencées sur milieu de culture classique.

24 h plus tard, mises en contact avec Le produit à tester, préa¬ lablement mis en solution dans du PBS.

Puis La solution est remplacée par le milieu de croissance = EMEM + 5 % SVF.

3 jours plus tard, Le taux de croissance est évalué :

- par mesure de la coloration à l'Analyseur Electronique d'Images ou - par mesure du taux d'ATP intracellulaire.

PROTOCOLE type III

DL- sur kératinocytes épidermiques, in vitro

Les kératinocytes épidermiques isolés sont mis en culture sur boîtes (culture de 1ère explantation) dans Le milieu DMEM à 10 _ de SVF.

24 h plus tard. Le milieu de culture précédent est remplacé par une solution saline enrichie en acides aminés (= DMEM) du produit à tester.

Un nombre suffisant de boîtes est préparé, de façon à réaliser une gamme de dilutions croissantes de la substance à tester.

Toutes les bo tes sont incubées à 37 C pendant 3 jours.

Puis, L'adénosine triphosphate* intracelLulaire est extrait et dosé dans chaque bo te, par technique de bioLumînescence.

La toxicité de chaque substance étudiée est estimée en pourcen¬ tage, par rapport au milieu témoin (DMEM).

La dose Létale ⁽ DL,- _n ⁾ est déterminée graphiquement, comme étant La dose minimum de produit qui diminue Le taux d'ATP de 50 % par rapport au témoin.

E T U D E d e t C Y T O T O X I C I T E D L

5 O

ETU D E D E C Y TOTOX I C I T E s u r C ELLUL E S de L ANG E R H ANS ( L . C . )

PROTOCOLE IV

Evaluation du pouvoir cyto-photo-protecteur de substances en contact avec fibroblastes MRC5

Le but de cette étude est d'évaluer Les capacités cyto-photo- protectrices de diverses substances sur la croissance de fibro¬ blastes MRC5, en culture in vitro, lorsqu'elles sont irradiées par une source d'UVB.

Les cellules sont ensemencées à un faible taux.

24 h après, les cellules MRC5 sont recouvertes par une solution de la substance à étudier dans Le PBS, puis irradiées par une

2 dose définie (en mJ/cm ) d'UVB.

Puis La solution saline est remplacée par le milieu de croissance EMEM + 5 % SVF.

72 h après, les cultures cellulaires sont colorées, et Le taux de croissance est évalué par Analyse Electronique d'Images.

PROTOCOLE type V

Etude du pouvoir cyto-photo-protecteur de substances en contact avec des cellules de Langerhans

Dénombrement microscopique des cellules de Langerhans HLA-DR+

A partir de biopsie de la peau, on prépare une suspension de cellules épidermiques.

Cette suspension cellulaire est divisée en 2 :

1/ une partie sert de témoin, additionnée seulement du tampon PBS a) 1er Lot non irradié

2 b) 2èrne Lot irradié par UVB (x mJ/cm )

2/ L'autre partie reçoit La substance à étudier en solution dans Le tampon PBS : a) 3ème lot non irradié b) 4ème Lot irradié par UVB (x mJ/cm )

Les 4 Lots précités de cellules épidermiques contenant Les cellules de Langerhans sont ensuite marqués par immunocytochimie (marquage des sites antigéniques HLA-DR spécifiques des cellules de Langerhans).

Pour chacun des 4 lots, les cellules HLA-DR sont ensuite dénom¬ brées par comptage microscopique.

Résultats :

Le 1er Lot : Correspond au nombre initial de L.C. intactes (témoin) HLA-DR+ par unité de volume.

Le 2ème lot : l'irradiation à une dose déterminée d'UVB entraîne une réduction du nombre initial de

L.C.-HLA-DR+ par unité de volume

Le nombre restant de L.C.-HLADR+ = N-Lot 2.

- Le 3έme lot la substance présumée photo-protectrice pour Les L.C. peut exercer éventuelLement une cyto- toxicité spécifique à une concentration donnée. La valeur retenue est celle du nombre restant de L-C.-HLADR+ par unité de volume en contact avec La substance à La concentration étudiée. Le nombre correspondant L.C.-HLADR+ = N-Lot 3.

- le 4ème lot : permet de déterminer Le nombre de L.C.-HLADR+ en contact avec la substance à tester à concentration identique au 3ème lot et après irradiation UVB à la même dose que 2ème lot. Le nombre de L.C.-HLADR+ restants par unité de volume = N-Lot 4.

ETUD E de l a C Y T 0 P H 0 T 0 P R 0 T E C T I 0 EN C ONTA C T

* : Pouvoir cytophotoprotecteur maximum = 100 % NS : non significatif