Cytochrom P450 Monooxygenasen besitzen die Fähigkeit technisch interessante Oxygenierungsreaktionen zu katalysieren und werden daher seit einiger Zeit inten- siv untersucht. So wurde beispielsweise die Cytochrom P450 Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium isoliert und charakterisiert und ist mittlerweile auf rekombi- nantem Weg zugänglich (vgl. z. B. DE-A-199 35 115).

Diese Cytochrom P450-Monooxygenase katalysiert gewöhnlich die subterminale Hydroxylierung langkettiger, gesättigter Säuren und der entsprechenden Amide und Alkohole davon oder die Epoxydation ungesättigter langkettiger Fettsäuren oder gesättigter Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge. Die optimale Kettenlänge gesättig- ter Fettsäuren beträgt 14 bis 16 Kohlenstoffatome.

Die Struktur der Harn-Domäne von P450 BM-3 wurde durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Die Substratbindungsstelle liegt in Form einer langen tunnelartigen Öff- nung vor, welche von der Moleküloberfläche bis hin zum Häm-Molekül reicht und wird fast ausschtießtich von hydrophoben Aminosäureresten begrenzt. Die einzigen geladenen Reste an der Oberfläche der Harn-Domäne sind die Reste Arg47 und Tyr51. Man nimmt an, daß diese an der Bindung der Carboxylatgruppe des Sub- strates durch Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind. Durch ge- zielte Einführung von Punktmutationen ist es zwischenzeitlich gelungen, das Sub- stratspektrum dieses Enzyms zu erweitern. So können nunmehr auch kürzer-als~ auch längerkettige Carbonsäuren, Alkane, Alkene, Cycloalkane, Cycloalkene und verschiedenste Aromaten durch dieses Enzym oxidiert werden (vgl. DE-A-199 35 115,199 55 605, 100 11 723 und 100 14 085).

Um die industrielle Anwendbarkeit dieser Enzymklasse weiter zu verbessern, wäre es daher wünschenswert neue Cytochrom P450-Monooxygenasen zu finden, wel- che besser an industrielle Produktionsbedingungen angepasst sind, wie z. B. Enzy- me mit erhöhter thermischer Stabilität.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung von Cytochrom P450-Monooxygenasen, welche besser an industrielle Produktionsbedingungen angepasst sind Obige Aufgabe wurde gelöst durch Bereitstellung einer Cytochrom P450 Monooxy- genase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Aminosäuresequenz auf- weist, welche eine Teilsequenz von Aminosäurerest Pro328 bis Glu345 gemäl3 SEQ ID NO : 2 und vorzugsweise außerdem eine Teilsequenz von Aminosäurerest Val216 bis Ala227 gemäß SEQ ID NO : 2 umfasst.

Erfindungsgemäß bevorzugte Cytochrom P450 Monooxygenasen weisen eine Ami- nosäuresequenz auf, welche wenigstens eine weitere Teilsequenz umfasst, die ausgewählt ist unter einer Teilsequenzen von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäure aus den durch die Aminosäurereste Met1 bis Phe327 und Gly346 bis Ala389 gemäß SEQ ID NO : 2 vorgegebenen Sequenzbereichen.

Eine besonders bevorzugte Cytochrom P450 Monooxygenase besitzt eine Ami- nosäuresequenz, welche im wesentlichen SEQ ID NO : 2 entspricht.

Erfindungsgemäße Cytochrom P450 Monooxygenasen sind insbesondere aus thermophilen Bakterien, vorzugsweise der Gattung Thermus sp., wie z. B. der Spe- zies Thermus thermophilus, Stamm HB27 (hinterlegt bei der DSM unter der Num- mer DSM7039) isolierbar."Thermophile"Bakterien erfüllen erfindungsgemäß die Temperaturtoleranzkriterien nach H. G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag Stuttgart, 5. Auflage, Seite 173, für thermophile und extrem thermophile Or- ganismen (d. h. Wachstumsoptimum bei über 40 °C).

Die erfindungsgemäßen Monooxygenase sind vorzugsweise durch eine erhöhte Temperaturstabilität gekennzeichnet. Diese drückt sich in einem in Vergleich zum P450 BM-3 aus Bacillus megaterium geringeren Aktivitätsverlust bei erhöhter Tem- peratur (z. B. in einem Bereich von 30 bis 60 °C, pH 7,5,25mM Tris/HCI) aus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus dem thermophilen Bakterium T. thermophilus bereitge- stellt. Das Protein besitzt ein Molekulargewicht von etwa 44 kDa (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese), ist löslich und zeigt im reduzierten Zustand, oxidierten Zu- stand und als Carbonyl-Addukt ein Absorbtionsspektrum analog zu dem anderer P450 Enzyme. Aus Sequenzvergleichen dieses erfindungsgemäßen Enzyms aus T. thermophylus und anderen bekannten P450 Enzymen konnten folgende Identitäten bestimmt werden : P450 BM3,32% Identität ; CYP119, 29% Identität ; P450eryF, 31% Identität. Das erfindungsgemäße Enzym zeigt eine außerordentliche Thermo- stabilität, veranschaulicht durch eine Schmelztemperatur von etwa 85°C, welcher Wert um 30°C über demjenigen für P450cam liegt.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Oligonukleotide, welche mit einer Nuklein- säuresequenz hybridisieren, die für eine erfindungsgemäße Cytochrom P450 Mo- nooxygenase kodiert. insbesondere sind Gegenstand der Erfindung auch solche Oligonukleotide, welche eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen komplementär ist zu ei- nem wenigstens 30 bis 45 aufeinanderfolgende Nukleotidreste umfassenden Nu- kleotidsequenzbereich gemäß SEQ ID NO : 1.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Polynukleotide, welche mit einem Otigonukfeotid gemäß obiger Definition hybridisieren und für eine Cytochrom P450 Monooxygenase kodieren, insbesondere eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus anderen Mikroorganismen, wie z. B. solchen der Gattung Thermus sp..

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch Polynukleotide, die für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß obiger Definition kodieren, sowie dazu komplementäre Polynukleotide.

Bevorzugte Polynukleotide sind solche, die im wesentlichen eine Nukleinsäurese- quenz gemäß SEQ ID NO : 1 besitzen, sowie die dazu komplementären und davon abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Expressionskassetten zur rekombi- nanten Herstellung erfindungsgemäßer Monooxygenasen, umfassend wenigstens eine regulatorische Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft mit wenigstens einer der oben angegebenen Polynukleotide.

Weiter Gegenstände der Erfindung betreffen rekombinanter Vektoren, welche we- nigstens ein Polynukleotid oder wenigstens eine Expressionskassette gemäß obiger Definition tragen ; sowie Mikroorganismen, enthaltend wenigstens einen solchen rekombinanten Vektor ; sowie Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Cyto- chrom P450 Monooxygenasen, bei welchen man einen Mikroorganismus, welcher Cytochrom P450 Monooxygenase produziert, kultiviert und die Monooxygenase aus der Kultur isoliert.

Die erfindungsgemäßen Enzyme und davon ableitbaren Mutanten sind als Biokata- lysatoren für unterschiedliche biochemische Oxygenierungsreaktionen organischer Verbindungen von technischer Bedeutung brauchbar. In analoger Weise sind auch die erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismen zur Durchführung solcher Oxygenierungsreaktionen einsetzbar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur mikrobiologi- schen Oxidation einer organischen Verbindung, wobei man diese Verbindung mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Cytochrom P450 Monooxygenase umsetzt.

Vorzugsweise wird dieses Verfahren so durch geführt, dass man a1) einen rekombinanten Mikroorganismus gemäß obiger Definition in

einem Kulturmedium, in Gegenwart der exogenen (von außen zuge- setzten) oder intermediär gebildeten organischen Verbindung, welche ein Substrat der Monooxygenase ist, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff und gegebenenfalls einem Elektronendonor, kultiviert ; oder a2) ein Substrat-haltiges Reaktionsmedium, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff und einem Elektronendonor, mit einer erfindungsge- mäßen Cytochrom P450 Monooxygenase inkubiert ; und b) das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

Das exogene oder intermediär gebildete Substrat kann dabei ausgewählt sein unter : a) gegebenenfalls substituierten N-, O-oder S-heterocyclischen ein-, zwei-oder mehrkernigen aromatischen Verbindungen ; b) gegebenenfalls substituierten ein-oder mehrkernigen Aromaten ; c) geradkettigen oder verzweigten Alkanen und Alkenen ; d) gegebenenfalls substituierten Cycloalkanen und Cycloalkenen ; und e) aliphatischen, vorzugsweise terminal gesättigten, Carbonsäuren.

Nach einer ersten bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Oxidation durch Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Kultivierungstemperatur von mindestens etwa 20 °C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt.

Nach einer zweiten bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man als exogenes Substrat wenigstens eine Verbindung, ausgewähit unter den oben definierten Gruppen a) bis e), einem Medium zu und führt die Oxidation durch enzymatische Umsetzung des substrathaltiges Mediums in Gegenwart von Sauer- stoff bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durch, wobei das substrathaltige Medium außerdem bezogen auf das Sub- strat einen etwa 10-bis 100-fachen molaren Überschuß an Reduktionsäquivalenten (Elektronendonor) enthält.

Obige Verfahren können bevorzugt in Bioreaktoren durchgeführt werden. Gegen- stand der Erfindung sind daher solche Bioreaktoren, umfassend wenigstens eine erfindungsgemäße Monooxygenase oder wenigstens einen rekombinanten Mikroor- ganismus, gegebenenfalls jeweils in immobilisierter Form.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer Cytochrom P450 Monooxy- genase, eines Vektors oder eines Mikroorganismus gemäß, vorliegender Erfindung zur mikrobiologischen Oxidation oben genannter organischer Verbindungsklassen.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf beiliegenden Figuren näher erläutert.

Dabei zeigt Figur 1 einen Sequenzvergleich von P450 aus Thermus thermophilus mit der Häm- Domäne von P450 BM3 aus Bacillus megaterium. Doppelt unterstrichen ist dabei die Häm-Bindungsstelle gezeigt (Cys400 in P450 BM3 ist der Cysteinrest, der mit dem Eisenatom der prosthetischen Gruppe koordiniert). Einfach unterstrichen ist die Region die in Kontakt steht mit dem T-Ende der Fettsäurekette. Die Grad der Über- einstimmung ist durch verschiedenen Symbole gekennzeichnet ("*" = identische Re- ste ;":"und"."= ähnliche Reste).

Figur 2 zeigt das Ergebnis eines Vergleichstests zzur Bestimmung der Thermosta- bilität von P450 BM3 und P450 aus Thermus sp.. Die Thermostabilität wurde spek- trometrisch im Wettenfängenbereich zwischen 400 und 500nm über den Häm- Gruppen-Gehalt bestimmt.

Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls"funktionale Aquivalente"der konkret offenbarten neuen P450 Monooxygenasen.

"Funktionale Aquivalente"oder Analoga der konkret offenbarten Monooxygenasen sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Enzyme, welche weiterhin die gewünschte Substratspezifität im Rahmen wenigstens einer der oben bezeichneten Oxidationsreaktionen a) bis e) besitzen und/oder im Vergleich zu P450 BM3 eine erhöhte Thermostabilität, z. B. bei Temperaturen im Bereich von et-

wa 30 bis 60 °C und gegebenenfalls höheren Temperaturen nach 30-minütiger Be- handlung in 25mM Tris/HCI, besitzen.

Unter"funktionalen Aquivalenten"versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten Oxidationsreaktionen katalysieren."Funktionale Äquivalente"um- fassen somit die durch eine oder mehrere, wie z. B. 1 bis 30 oder 1 bis 20 oder 1 bis 10, Aminosäure-Additionen,-Substituenten,-Deletionen und/oder-lnversionen er- hältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Se- quenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungs- gemäßen Eigenschaftsprofi) führen. Funktionate Äquivatenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Enzym qualitativ übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate mit unter- schiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

Erfindungsgemäß mit umfasste"funktionale Aquivalente"weisen eine von SEQ ID NO : 2 in mindestens einer Position abweichende Aminosäuresequenz auf, wobei die Veränderung in der Sequenz die Monooxygenase Aktivität vorzugsweise nur unwe- sentlich, das heißt um nicht mehr als etwa 90%, insbesondere 50% oder nicht mehr als 30% verändert. Diese Veränderung kann unter Verwendung eines Refe- renzsubstrates, wie zum Beispiel ß-lonon, unter standardisierten Bedingungen (zum Beispiel 0,1 bis 0,5 M Substrat, pH-Bereich 6 bis 8, insbesondere 7 ; T = 60 bis 70°C, insbesondere 65°C) bestimmt werden.

Erfindungsgemäß mit umfasste"funktionale Aquivalente"sind Homofoge zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise we- nigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z. B. 90%, 95% oder 99%, Ho- mologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algo- rithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988,2444- 2448.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Muta- genese erzeugt werden, z. B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.

Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatori- scher Banken von Mutanten, wie z. B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden.

Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinato- rische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z. B. durch enzyma- tisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Viel- zahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus ei- ner degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemi- sche Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA- Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degene- rierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren.

Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann be- kannt (Z. B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39 : 3 ; Itakura et al. (1984) Annu. Rev.

Biochem. 53 : 323 ; Itakura et al., (1984) Science 198 : 1056 ; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 : 477).

"Funktionale Äquivalente"umfassen natürlich auch P450-Monooxygenasen, welche aus anderen Organismen, z. B. aus anderen als den hierin konkret genannten Bak- terien, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festle- gen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzy- me ermitteln.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe a) sind gegebenenfaf) s substi- tuierte heterocyclische ein-, zwei-oder mehrkernigen aromatischen Verbindungen ; insbesondere oxidierbare oder hydroxylierbare N-, 0-oder S-heterocyclische ein-, zwei-oder mehrkernige aromatische Verbindungen. Sie umfassen z. B. zwei oder drei vier-bis siebengliedrige, insbesondere sechs-oder fünfgliedrige, kondensierte Ringe, wobei wenigstens einer, vorzugsweise alle Ringe aromatischen Charakter

besitzen und wobei wenigstens einer der aromatischen Ringe ein bis drei, vorzugs- weise ein N-, O-oder S-Heteroatom im Ring tragt. In der gesamten Ringstruktur können gegebenenfalls ein oder zwei weitere gleiche oder verschiedene Heteroa- tome enthalten sein. Die aromatischen Verbindungen können weiterhin 1 bis 5 Sub- stituenten an den Ring-Kohlenstoff-oder an den Heteroatomen tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind C1 bis C4-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyl oder n-, i-oder t-Butyl oder C2 bis C4-Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl oder 3-Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genannten Alkyl-oder Alkenylsubstituenten können gegebenenfalls auch eine Keto- oder Aldehydgruppe aufweisen ; Beispiele hierfür sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on- 4-yl, 3-Buten-2-on-4-yl. Nichtlimitierende Beispiele für geeignete heterocyclische Substrate sind insbesondere zweikernige Heterocyclen, wie Indol, N-Methylindol und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon, wie z. B. 5-Chlor-oder 5-Brom-indol ; sowie Chinolin und Chinolinderivate, wie z. B. 8-Methylchinolin, 6-Methylchinolin und Chinaldin ; und Benzothiophen und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga da- von. Außerdem seien genannt dreikernige Heteroaromaten, wie Acridin, und die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga davon.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe b) sind gegebenenfalls substi- tuierte ein-oder mehrkernige, insbesondere ein-oder zweikernige Aromaten, wie Benzol und Naphthalin. Die aromatischen Verbindungen können gegebenenfalls ein oder mehrfach substituiert sein und z. B. 1 bis 5 Substituenten an den Ring- Kohlenstoffatomen tragen. Beispiele für geeignete Substituenten sind Ci bis C4- Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyí oder n-, i-oder t-Butyl, oder C2 bis C4- Alkenyl, wie Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl oder 3-Butenyl, Hydroxyl und Halogen, wie F, Cl, und Br. Die genannten Alkyl-oder Alkenylsubsti- tuenten können gegebenenfalls auch eine Keto-oder Atdehydgruppe aufweisen ; Beispiele hierfür sind Propan-2-on-3-yl, Butan-2-on-4-yl, 3-Buten-2-on-4-yl. Der Aromat kann gegebenenfalls mit einem vier-bis siebengliedrigen, nichtaromati- schen Ring kondensiert sein. Der nichtaromatische Ring kann gegebenenfalls eine oder zwei C-C-Doppelbindungen aufweisen, ein-oder mehrfach mit oben genann- ten Substituenten substituiert sein und gegebenenfalls ein oder zwei Ringheteroa-

tome tragen. Beispiele für besonders brauchbare Aromaten sind einkernige Aro- maten, wie Cumol, sowie zweikernige Substrate, wie Inden und Naphthalin, sowie die mit ein bis drei Substituenten an Kohlenstoffatomen substituierten Analoga da- von.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe c) sind geradkettige oder ver- zweigte Alkane oder Alkene mit 4 bis 15, vorzugsweise 6 bis 12 Kohlenstoffatomen.

Als Beispiele können genannt werden n-Pentan, n-Hexan, n-Heptan-, n-Oktan, n- Nonan, n-Decan, n-Undecan und n-Dodecan, sowie die ein-oder mehrfach ver- zweigten Analoga dieser Verbindungen, wie z. B. analoge Verbindungen mit 1 bis 3 Methyl-Seitengruppen ; oder die ein-oder mehrfach, beispielsweise einfach unge- sättigen Analoga der oben genannten Alkane.

Erfindungsgemäß oxidierbare Substrate der Gruppe d) sind gegebenenfalls substi- tuierte Cycloalkane und Cycloalkene. Beispiele hierfür sind Cyclopentan, Cyclo- penten, Cyclohexan, Cyclohexen, Cycloheptan und Cyclohepten. Die Ringstruktur kann dabei ein-oder mehrfach substituiert sein und z. B. 1 bis 5 Substituenten ge- mäß obiger Definition für Verbindungen der Gruppen a) und b) tragen. Nicht- limitierendes Beispiel hierfür sind lonone, wie V-, 3-und (-lonon, sowie die ent- sprechenden Methylionone und Isomethylionone.

Erfindungsgemäß oxidierbare, Substrate der Gruppe e) sind geradkettige oder ver- zweigte, gesättigte oder ein-oder mehrfach ungesättigte C8-Cso-Carbonsäuren, ins- besondere Monocarbonsäuren, oder Carbonsäurederivate davon, wie Ester und Amide. Als Beispiele sind terminal oder subterminal (T-1-, T-2-oder T-3-Position) hydroxylierbare gesättigte Monocarbonsäuren zu nennen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel-und doppel- strängige DNA-und RNA-Sequenzen), kodierend für eine der obigen Monooxyge- nasen und deren funktionale Äquivalente. Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäu- resequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO : 1 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide,

kodieren aber weiterhin für eine Monooxygenase mit der gewünschten Eigen- schaftsprofil.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die soge- nannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs-oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret ge- nannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Spleißvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nu- kleotidsubstutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequen- zen.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind.

Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Bibliotheken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorga- nismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung.

Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide"hybridisieren"zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly-oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingun- gen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterblei- ben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komple- mentär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northem-oder Southern- Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicher- weise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt.

Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-

Technik die Verwendung einer 50-70 °C, vorzugsweise 60-65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0, 1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC : 3M NaCI, 0, 3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komple- mentäre Nukleinsäuren aneinander gebunden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für eine erfin- dungsgemäße Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz ; sowie Vektoren, umfas- send wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen sol- che erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodieren- den Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ ver- knüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer"operativen Verknüpfung"versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestim- mungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknApfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungs- signale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Mar- ker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulati- onssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch geneti- sche Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulations- sequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression ge- steigert oder verringert wird. Die Nukleinsäure'sequenzen können in einer oder meh- reren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind : cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp- lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR-oder im I-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden ; sowie die gram- positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren Camp/353, SSU, OCS, lib4, usp, STLS 1, B33, not oder der Ubiquitin-oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht-und insbesondere tem- peraturinduztierbarer Promotoren, wie der PrP,-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen ver- wendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nu- kleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermögfichen. Dies kann beispiels- weise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion expri- miert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexpri- miert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Ex- pression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkription- sebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer"verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Trans- lation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase-Nukleotidsequenz sowie einem Terminator-oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombi- nations-und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.

Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Ber- man und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labo-

ratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley interscience (1987) be- schrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vekto- ren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der Mutanten eingesetzt werden können.

Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombi- nanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs-und Trans- fektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektro- poration, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeig- nete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.

Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Esche- richia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorga-

nismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Die Selekition erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfol- gen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Bei- spiele fur solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden.

Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechen- des Antibiotikaresistenzgen (z. B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Mar- kerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen 8 oder : oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequen- zen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff"Expressi- onssystem"die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie trans- genen Tieren, wie insbesondere Mäusen oder Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Monooxygenase, wobei man einen Monooxygenase- produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Mo- nooxygenase induziert und die Monooxygenase aus der Kultur isoliert. Die Mo- nooxygenase kann so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Monooxygenase nicht in das Kulturmedium sezer- niert wird, aufgeschlossen und das Enzym nach bekannten Proteinisolierungsver- fahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfre- quenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organi- schen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Monooxygenase kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristall- sation, Aussalzen, Dialyse und nativer Geletektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Sprin- ger Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsy- steme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nucleo- tidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikatio- nen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte"Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Anti- körpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer

Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet wer- den. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Flores- zenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektier- bares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation or- ganischer Verbindungen obigen Typs.

Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z. B. TB-oder LB-Medium bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelidichte erreicht ist. Um die Oxidationsreakti- on besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren Promotors. Die Kultivierung wird nach Induktion der Monooxygenaseproduktion in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt.

Wird die erfindungsgemäße Umsetzung dagegen mit gereinigtem oder angerei- chertem Enzym durchgeführt so löst man das erfindungsgemäße Enzym in einem exogenes Substrat enthaltenden Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umsetzung, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, bei ei- ner Temperatur von etwa 10 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 (wie z. B. eingestellt mit 100 bis 200 mM Phosphat-oder Tris-Puffer), sowie in Ge- genwart eines Reduktionsmittels durch, wobei das Substrat-haltige Medium außer- dem bezogen auf das zu oxidierende Substrat einen etwa 10-bis 100-fachen mola- ren Überschuß an Reduktionsäquivafenten enthält. Bevorzugtes Reduktionsmittel ist NADPH.

Beim erfindungsgemäßen Substratoxidationsprozess wird im Reaktionsmedium enthaltener oder zugesetzter Sauerstoff reduktiv enzymatisch gespalten. Die erfor- derlichen Reduktionsäquivalente werden von dem zugesetzten Reduktionsmittel (Elektronendonor) zur Verfügung gestellt.

Das gebildete Oxidationsprodukt kann dann in herkömmlicher Weise, wie z. B. durch Extraktion oder Chromatographie, vom Medium abgetrennt und gereinigt werden.

Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.

Allgemeine experimentelle Angaben : a) Allgemeine Klonierungsverfahren Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA- Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wur- den wie bei Sambrook et al. (1989) a. a. O. beschrieben durchgeführt. b) Polymerasekettenreaktion (PCR) PCR wurde nach Standardprotokoll mit folgendem Standardansatz durchgeführt : 8 ul dNTP-Mix (200uM), 10 pI Taq-Polymerase-Puffer (10 x) ohne MgC12, 8p1 MgC12 (25mM), je 1 ul Primer (0,1 uM), 1µl zu amplifizierende DNA, 2,5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 ul demineralisiertes Wasser. c) Kultivierung von E. coli

Die Kultivierung von rekombinanten E. coli-Stämme DH5# wurde in LB-Amp Medi- um (Trypton 10,0g, NaCl 5,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, Ampicillin 100 g/ml H20 ad 1000 ml) bei 37 °C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei einer Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Medium in einem 2-l-Kolben mit 4 mi Kultur inokuliert. Die Induktion der P450-Expression in E. coli erfolgte nach Errei- chen eines OD578-Wertes zwischen 0,8 und 1,0 durch eine drei-bis vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42 °C. d) Zellaufschluß Zellpellets mit einer Biofeuchtmasse von bis zu 15 g E. coli DH5V wurden auf Eis aufgetaut und in 25 ml Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5,1 mM EDTA) oder Tris/HCI Puffer (50 mM, pH 7,5,1 mM EDTA) suspendiert. Mittels dreiminütiger Ul- traschallbehandlung (Branson Sonifier W250, (Dietzenbach, Deutschland), Lei- stungsabgabe 80 W, Arbeitsintervall 20 %) wurde die auf Eis gekühlte E. coli- Zellsuspension aufgeschlossen. Vor der Proteinreinigung wurde die Zellsuspension für 20 min bei 32 500 g zentrifugiert und durch einen 0,22 mm Sterivex-GP-Filter (Millipore) filtriert, wobei man einen Rohextrakt erhalt.

Beispiel 1 : Klonierung und Expression von P450 aus Thermus thermophilus HB27 und den His- tag-Derivaten davon 1. Klonierung von P450 aus Thermus fhermophílus HB27 Die kodierende P450-Sequenz (blunt ended) wurde in die Hincil-Schnittstelle des Plasmids pTZ19R (MBI Fermentas) einkloniert. Aus dem so erhaltenen Plasmid TTHB66 wurde die kodierende P450-Sequenz mit Hilfe der PCR amplifiziert. Dazu wurden folgende Primer verwendet :

a) 30-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des P450-ATG-Startcodons : 5'-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG (SEQ iD NO : 7). b) 30-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoRI-Schnittstelle (kursiv ge- druckt) als Teil des TGA-Stopcodons : 5'- GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG (SEQ ID NO : 8).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel-Schnittstellen des Vektors pCYTEXP1 (Plasmid mit dem temperaturinduzierbaren PRPL-Promotorsystem des Bakteriophagen 8 (Belev T. N., et al., Plasmid (1991) 26 : 147)) kloniert und in E. coli DH-5a (Clontech, Heidelberg) transformiert.

E. coli DH-5a, enthaltend das interessierende Plasmid wurde in LB-Medium in Ge- genwart von Ampicillin inokuliert und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inku- biert. Ein Teil der Probe wurde in frisches LB-Medium (in Gegenwart von Ampiciffin) inokuliert und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C bis zu OD = 0,9 kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die Veränderung des P450-Gehaltes während der Expression wurde anhand von Messungen des CO-Differenzspektrums bestimmt. Expressionszeit AA45o-49o P450 Konzentration [µM] [h3 4 0, 092 0, 056 8 0, 176 0, 106 24 0, 106 0, 064 2. Klonierung von P450 aus Thermus thermophilus HB27 mit N-terminalem His- tag Die kodierende P450-Sequenz wurde durch PCR aus dem Plasmid TTHB66 unter Verwendung folgender Primer amplifiziert :

(a) 50-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv ge- druckt) als Teil des P450 ATG-Startcodons und die tag-codierenden Codons (unterstrichen) : 5'-CGAAGCTCATATGCATCACCATCATCATCACAAGCGCCTTTC (SEQ ID NO : 9) ; (b) 30-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoRi-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des TGA-Stop-Codons : 5'-GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG (SEQ ID NO : 8).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel-und EcoRI-Schnittstellen des Vek- tors p-CYTEXP1 kloniert und in E. coli DH-5a exprimiert.

E. coli DH-5a, enthaltend das interessierende Plasmid, wurde in LB-Medium in Ge- genwart von Ampicillin inokuliert und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inku- biert. Ein Teil der Probe wurde in frisches LB-Medium (in Gegenwart von Ampicillin) inokuliert und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C bis zu OD = 0,9 kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die Veränderung des P450-Gehaltes während der Expression wurde anhand von Messungen des CO-Differenzspektrums bestimmt. Expressionszeit #A450-490 P450 Konzentration l, uM] [h] 4 ND ND 8 0, 097 0, 073 24 0,111 0,073 3. Clonierung von P450 aus Thermus thermophilus HB27 mit C-terminalem His- tag Die kodierende P450-Sequenz wurde durch PCR aus dem Plasmid TTHB66 unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert :

(a) 30-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv ge- druckt) als Teil des P450 ATG-Start-Codons : 5'-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG (SEQ ID NO : 7) (b) 47-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoRI-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des TGA-Stop-Codons sowie die unterstrichene tag- codierende Teilsequenz : 5'-CGGAATTCAGTGATGATGATGGTGATGCGCCCGCACCTCCTC (SEQ ID NO : 10).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel-und EcoRI-Schnittstellen des Vek- tors p-CYTEXP1 cloniert und in E. coli DH-5a exprimiert.

E. coli DH-5a, enthaftend das interessierende Plasmid wurde in LB-Medium in Ge- genwart von Ampicillin inokuliert und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inku- biert. Ein Teil der Probe wurde in frisches LB-Medium (in Gegenwart von Ampicillin) inokuliert und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C bis zu OD = 0,9 kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die Veränderung des P450-Gehaltes während der Expression wurde anhand von Messungen des CO-Differenzspektrums bestimmt. Expressionszeit #A450-490 P450 Konzentration [h] [µM] 4 ND ND 8 0,1 0,075 24 ND ND Beispiel 2 : Bestimmung der Thermostabilität von P450 aus Thermus thermophilus im Vergleich zu P450 BM3

Die beiden Enzyme wurden jeweils 30 Minuten in Tris/HCI-Puffer pH 7,5,25mM bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend abge- kühlt und die P450 Konzentration wurde spektrometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt und in Figur 2 graphisch dargestellt. Temperatur [°C] 30 40 50 60 P450 Konzentration [%] P450 thermus 100 89 29 22 P450 BM3 92 63 0 0 Wie man den Versuchsergebnissen entnimmt, besitzt das erfindungsgemäße En- zym nach 30-minütiger Inkubation bei allen Temperaturen eine signifikant höherer Temperaturstabilität.

Beispiel 3 : Biotransformationsexperimente Der endogene Redoxpartner für die erfindungsgemäße Cytochrom P450 aus T. thermophilus konnte bisher noch nicht zweifelsfrei identifiziert werden. Es konnte jedoch beispielsweise Enzymaktivität bei der Hydroxylierung von 8-und/oder a- lonon beobachtet werden. Mit p-lonon als Substrat konnte die Umwandlung zu ei- nem Hauptprodukt beobachtet werden, wohingegen a-lonon zu einem Produktge- misch umgesetzt wurde. Durch Vergleich mit synthetischen Standards konnte fest- gestellt werden, daß das Hauptprodukt der p-lonon-Umwandlung 4-Hydroxy--lonon ist.

Vorkulturen von T. thermophilus [5 ml Medium Tt (2 g Hefeextrakt, 1g Trypton, 1g NaCI in 500 ml entionisiertem Wasser)] wurden aus Agarplatten-Kulturen inokuliert und 24 Stunden bei 65°C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert. Anschließend wurde 100 mi Medium Tt mit der Vorkultur inokuliert und bei 65°C unter Schütteln inkubiert.

ß-lonon (107, uUml Kultur) wurde jeder Kultur nach 24 Stunden zugesetzt. Die Kulti- vierung wurde 78 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden anschliel3end abzentrifu- giert und der Überstand mit Diethyläther extrahiert. Der Extrakt wurde durch GC und TLC analysiert. Kontrollkulturen ohne Substrat wurden unter den gleichen Bedin- gungen hergestellt und analysiert.