Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilnzanii, H. felis et H. mustelae.

Bien qu'H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanfi et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Helicobacter. GashSospirillum hominis a également été décrite chez l'homme.

Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.

H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.

Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à Helicobacter.

A ce jour, plusieurs protéines d'Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et la méthode de vaccination qui est couramment préconisée consiste à délivrer l'antigène au niveau de la muqueuse gastrique, c'est-à-dire à l'endroit même où la réponse immune est souhaitée. Pour ce faire, I'administration par voie orale a donc été retenue.

Toujours dans le même but (induction d'une réponse immunitaire au niveau de l'estomac), il a été proposé plus récemment, de délivrer l'antigène en un site muqueux

autre que la muqueuse gastrique ; tel que par exemple la muqueuse nasale ou rectale (WO 96/31235). Des lymphocytes stimulés par l'antigène en un territoire muqueux dit inducteur peuvent migrer et circuler de manière sélective pour aller induire une réponse immunitaire en d'autres territoires muqueux, dits effecteurs.

Une variante de ces méthodes consiste à effectuer une primo-immunisation par voie systémique avant d'administrer l'antigène par voie nasale.

Pour administration par voie muqueuse, I'antigène, le plus souvent un lysat bactérien ou une protéine purifiée, est associé à un adjuvant approprié comme la toxine cholérique (CT) ou la heat-labile toxine (LT) d'E. coli.

Lorsque l'administration par voie muqueuse est mise en oeuvre, la réponse humorale que l'on observe, est de manière prédominante de type IgA. Ceci indique bien qu'il y a eu une réponse immunitaire locale.

Certains auteurs ont pensé très tôt qu'il existait une bonne corrélation entre une forte réponse de type IgA et un effet protecteur (Czinn et al, Vaccine (1993) 11 : 637). D'autres ont émis un avis plus réservé (Bogstedt et al, Clin. Exp. Immunol.

(1996) 105 : 202). Bien qu'il n'existe pas à ce jour de véritable certitude concernant ce sujet, I'induction d'anticorps qui soient notamment de type IgA, apparaît quoi qu'il en soit souhaitable pour la plupart des auteurs.

De manière générale, I'apparition des IgA témoigne de la mise en oeuvre d'une réponse de la part des lymphocytes T-helper de type 2 (réponse Th2).

En effet, la stimulation des lymphocytes T-helper par un antigène particulier permet d'obtenir différentes sous-populations de cellules T-helper, caractérisées par des profils de synthèse de cytokines différents.

Les cellules Thl produisent notamment de manière sélective l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron-y (INF-y), tandis que les cellules Th2 sécrètent de préférence l'IL-4, -5, et -10. En raison de leur production différentiée de cytokines, ces deux types de cellules T-helper ont des rôles distincts : les cellules Th I favorisent l'immunité à médiation cellulaire i.a. une réponse de type inflammatoire, tandis que les cellules Th2 stimulent la réponse humorale de type IgA, IgE et de certaines sous- classes d'IgG. On sait aussi que les cytokînes produites par des cellules Thl de souris

peuvent stimuler la réponse anticorps et en particulier que I'IFN-y induit une réponse IgG2a.

Ainsi, des différentes études de l'art antérieur, émerge l'opinion selon laquelle l'induction d'une réponse Th2 caractérisée par l'apparition d'aga est indispensable, sinon suffisante, afin d'obtenir un effet protecteur.

De manière surprenante, on a maintenant découvert que, même si une réponse Th2 ne nuit pas, il est aussi nécessaire d'induire une forte réponse Thl. En effet, des résultats expérimentaux démontrent maintenant qu'un effet protecteur peut-être corrélé plus aisément avec une réponse Th 1 qu'avec une réponse Th2.

Contrairement à ce qui était initialement recherché (D'Elios et al, J. Immunol.

(1997) 158 : 962), la présente demande révèle donc l'importance d'induire une réponse Thl de type inflammatoire au moment de l'immunisation, sans laquelle on ne peut observer d'effet protecteur.

On peut parvenir à induire une réponse Thl à l'encontre d'Helicobacter en jouant sur un certain nombre de facteurs, comme par exemple la nature de l'agent immunogène. Ainsi, on sait que dans la majorité des cas, une vaccination à base d'ADN favorise l'induction d'une réponse Thl à un niveau significatif. On a maintenant mis en évidence qu'en effectuant une vaccination à base d'ADN à l'encontre d'Helicobacter, on peut obtenir un taux de protection similaire ou supérieur à celui observé lorsque l'on utilise un antigène e.g., par la voie muqueuse.

C'est pourquoi l'invention a notamment pour objet: (i) une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère (ii) L'usage d'une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, dans la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection à Helicobacter; et

(iii) une méthode pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter chez un mammifère, selon laquelle on administre audit mammifère, une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, méthode par laquelle ledit mammifère est protégé contre une infection à Helicobacter ou par laquelle la charge infectieuse d'Helicobacter est réduite chez ledit mammifère.

Le mammifère auquel est destinée la composition pharmaceutique ou la méthode est avantageusement un primate, de préférence un humain.

En ce qui concerne la méthode, on indique que, de manière avantageuse, I'administration de la molécule d'ADN est répétée une ou plusieurs fois, de préférence au moins deux fois, pour que soit induite la réponse immune recherchée.

Une méthode thérapeutique préférée est une méthode par laquelle la charge infectieuse d'Helicobacter est éliminée. Dans le cadre de la méthode selon l'invention, on utilise avantageusement la voie systémique, et de préférence de manière exclusive.

La molécule d'ADN peut avantageusement être un plasmide qui est incapable à la fois de se répliquer et de s'intégrer de manière substantielle dans le génome d'un mammifère. La séquence codante citée ci-dessus est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dans une cellule de mammifère. Ce promoteur peut être ubiquitaire ou spécifique d'un tissu. Parmi les promoteurs ubiquitaires, on cite le promoteur précoce du Cytomegalovirus (décrit dans le brevet US n" 4,168,062) et le promoteur du virus du sarcome de Rous (décrit dans Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5 : 281). Le promoteur desmine (Li et al, Gene (1989) 78 : 244443 ; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268 : 10403) est un promoteur sélectif permet l'expression dans les cellules musculaires et aussi dans les cellules de la peau. Un promoteur spécifique des cellules musculaires est par example le promoteur du gène de la myosine ou de la dystrophine. Des vecteurs plasmidiques que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention sont décrits ion., dans WO 94/21797 et Hartikka et al, Human Gene Therapy (1996) 7 1205.

Le polypeptide dérivé d'Helicobacter qui peut être exprimé par une molécule d'ADN selon l'invention peut être n'importe quel polypeptide d'Helicobacter e.g,

d'H. pylori. Il peut notamment s'agir d'un polypeptide présent dans le cytoplasme, d'un polypeptide de la membrane interne ou externe ou d'un polypeptide sécrété dans le milieu extérieur. De nombreux polypeptides d'Helicobacter ont déjà été décrits dans la littérature, soit par référence à leur séquence d'acides aminés déduites de la séquence du gène correspondant cloné ou identifié, soit par référence à un procédé de purification qui permet de les obtenir sous forme isolée du reste de leur environnement naturel. A titre indicatif, on cite en particulier les document suivants WO 94/26901 and WO 96/34624 (HspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (HpaA), WO 93/181150 (cytotoxine), WO 95/27506 et Hazell et al, J. Gen. <BR> <BR> <BR> <P>Microbiol. (1991)137 : 57 (catalase), FR 2 724 936 (recepteur membranaire de la lactoferrine humaine), WO 96/41880 (AlpA), EP 752 473 (FibA) and O'Toole et al, <BR> <BR> <BR> J. Bact. (1991)173 505 (TsaA). D'autres polypeptides sont aussi décrits dans WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 et WO 96/33220. Un polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à l'un de ceux cités en référence dans la mesure où il est capable de promouvoir une réponse immune à l'encontre d'Helicobacter. A condition de remplir cette dernière condition, L'agent immunogène peut aussi être un peptide dérivé d'un polypeptide cité en préférence.

De manière avantageuse, une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention comporte une séquence codant pour un polypeptide sélectionné parmi les sous-unités UreA et UreB de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori (voir WO 90/4030). De préférence, la molécule d'ADN comporte une première séquence codant pour la sous-unité A de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori, et une deuxième séquence codant pour la sous-unité B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori ; chaque séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.

On appelle "peptide" toute chaîne d'acides aminés dont la taille est inférieure à environ 50 acides aminés. Lorsque la taille est supérieure, on utilise le terme de "polypeptide" qui est aussi interchangable avec le terme "protéine". Un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à celui existant dans les conditions naturelles. Il est similaire en ce qu'il est capable d'induire une réponse immune de la même nature mais il peut comporter certaines variations structurelles comme par exemple une mutation, l'adjonction d'un résidu de nature lipidique ou bien être sous forme de peptide ou de polypeptide de fusion.

Une molécule d'ADN peut aussi comporter une séquence additionnelle codant pour une cytokine, par exemple une lymphokine telle que l'interleukine-2 ou -12, sous le contrôle d'élements appropriés pour expression dans une cellule de mammifère. Une alternative à cette option consiste aussi à ajouter dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention comprenant une molécule d'ADN ou un vecteur, une autre molécule ou vecteur viral codant pour une cytokine.

Dans une composition pharmaceutique selon la présente invention, la molécule nucléotidique e.g. la molécule d'ADN peut etre formulée ou non. Le choix de la formulation est très varié. L'ADN peut être simplement dilué dans une solution acceptable d'un point de vue physiologique avec ou sans porteur. Lorsque ce dernier est présent, il peut être isotonique ou faiblement hypertonique et avoir basse force ionique. Par exemple, ces conditions peuvent être remplies par une solution de sucrose e.g. à 20 %.

De manière alternative, le polynucléotide peut être associé avec des agents qui favorise l'entrée dans la cellule. Ce peut être (ii) un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire, telle que la bupivacaine (voir par exemple WO 94/16737) ou (ii) un agent s'associant au polynucléotide et agissant en tant que véhicule facilitant le transport du polynucléotide. Ce dernier peut être notamment des polymères cationiques e.g. de la polylysine ou une polyamine e.g. des dérivés de la spermine (voir WO 93/I 8759). Ce peut être également des peptides fusogéniques c.g. du GALA ou de la Gramicidine S (voir WO 93/19768) ou bien encore des peptides dérivés des protéines de fusion virales.

Il peut aussi s'agir de lipides anioniques ou cationiques. Les lipides anioniques ou neutres sont connus depuis longtemps comme pouvant servir d'agents de transport, par exemple sous forme de liposomes, à un grand nombre de composés y compris les polynucléotides. Une description détaillée de ces liposomes, de leurs constituants et de leurs procédés de fabrication est par exemple fournit par Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).

Les lipides cationiques sont aussi connus et communément utilisés comme agents de transport pour les polynucléotides. On cite par exemple la LipofectinTN' aussi connue sous le nom de DOTMA (N-[l -(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N- trimethylammonium chloride), le DOTAP (1,2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)

propane), le DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), le DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) et les dérivés du cholestérol tel que le DC-chol (3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-carbamoyl) cholestérol). Une description de ces lipides est fournie par EP 187,702, WO 90/11092, le brevet US N" 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 et le brevet US N" 5,527,928. Les lipides cationiques sont utilisés de préférence avec un lipide neutre tel que la DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) comme cela est par exemple décrit dans WO 90/11092.

Des microparticules d'or ou de tungstène peuvent aussi être utilisées comme agents de transport, tel que c'est décrit dans WO 91/359, WO 93/17706 et Tang et al, Nature (1992)356 : 152. Dans ce cas là, le polynucléotide est précipité sur les microparticules en présence de chlorure de calcium et de spermidine puis l'ensemble est administré par jet à haute vitesse dans le derme ou dans l'épiderme, à l'aide d'un appareil sans aiguille tel que ceux décrits dans les brevets US N" 4,945,050 et N" 5,015,580 et WO 94/24243.

La quantité d'ADN qui peut être utilisée pour vacciner un individu dépend d'un certains nombre de facteurs tels que par exemple la force du promoteur utilisé afin d'exprimer l'antigène, I'immunogénicité du produit exprimé, la condition du mammifère auquel est destinée l'administration (e.g., le poids, l'âge, et l'état de santé général), le mode d'administration et le type de formulation. On indique en particulier, que l'administration par voie intramusculaire requièrt une quantité d'ADN plus importante que l'administration par voie intradermique à l'aide d'un appareil sans aiguille. En général une dose appropriée à un usage prophylactique ou thérapeutique chez un adulte de l'espèce humaine est d'environ 1 ,ug à environ 5 mg, de préférence d'environ 10 pIg à environ 1 mg, et de manière tout particulièrement préférée d'environ 25 ptg à environ 500 pg.

Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut contenir une unique molécule d'ADN selon l'invention ou plusieurs, chacune comportant une séquence codant pour un polypeptide différent. Une alternative à cette dernière possibilité consiste à utiliser une molécule d'ADN unique mais comportant plusieurs séquences, chacune codant pour un polypeptide particulier.

Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre contenir des composés autres que l'agent immunogène lui-même, la nature de ces composés dépendant dans une certaine mesure ira., de la voie d'administration. Ainsi

comme on l'a déjà vu précédemment, la composition pharmaceutique peut inclure différents agents de formulation. A titre d'information, on indique que d'une manière générale, une molécule d'ADN peut ne pas réquérir l'adjonction d'un adjuvant.

L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'une composition, méthode ou d'un usage selon l'invention peut être évaluée selon des méthodes standard e.g., en mesurant l'induction d'une réponse immune ou l'induction d'une immunité thérapeutique ou protectrice en utilisant e.g., le modèle souris / H. felis et les procédures décrits dans Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (1995) 2 <BR> <BR> <BR> 303 ou Lee et al, J. Infect. Dis. (1995)172 161. L'homme de l'art s'avisera que H. felis peut être remplacé dans le modèle souris par une autre espèce d'Helicobacter.

Par exemple, I'efficacité d'un agent immunogène dérivé d'H. pvlori est de préférence évalué dans un modèle souris mettant en oeuvre une souche d'H. pylori adaptée à la souris. L'efficacité peut être déterminée en comparant le degré d'infection dans le tissu gastrique (en mesurant l'activité uréase, la charge bactérienne ou l'état de la gastrite) à celui d'un groupe contrôle. Il y a effet thérapeutique ou effet protecteur lorsque l'infection est réduite par comparaison au groupe contrôle.

Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, elle peut être formulée avec un diluent ou un porteur acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g., de I'eau ou une solution saline. En général, le diluent ou le porteur peut être selectionné en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Des porteurs ou des diluents appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remington's Pharnzacc'ttical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine.

Une composition, méthode ou un usage selon l'invention peut être mis en oeuvre pour traiter ou prévenir i.a. les infections à Helicobacter, notamment à H. pylori et par conséquent, les maladies gastroduodénales associées à ces infections, y compris les gastrites aiguës, chroniques ou atrophiques, les ulcères peptiques e.g., les ulcères gastriques ou duodénaux.

Une composition selon l'invention peut être administrée par toute voie d'aministration conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins.

Avantageusement, on utilise la voie systémique i. a., la voie parentérale qui elle-

même peut être choisie parmi les voies intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intraépidermique et sous-cutanée ; ces quatre dernières étant toutefois préférées à la voie intraveineuse.

Afin d'obtenir un effet protecteur ou thérapeutique. I'opération qui consiste à administrer une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être répétée une ou plusieurs fois, en laissant un certain intervalle de temps entre chaque administration ; intervalle qui est de l'ordre de la semaine ou du mois. Sa détermination précise est à la portée de l'homme du métier et peut varier en fonction de divers facteurs tels que la nature de l'agent immunogène, I'âge de l'individu, etc.

Lorsque la même voie d'administration est utilisée pour la primo-immunisation et les rappels, on parle d'administration par voie stricte e.g., par voie systémique stricte.

"Une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systémique stricte" est définie comme une méthode ne mettant pas en jeu de voie d'administration autre que la voie systémique. Par exemple, une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systémique et par voie muqueuse, ne répond pas à la définition énoncée ci-avant. En d'autres termes, "une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systémique stricte" doit être comprise comme une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systémique à l'exclusion de toute autre voie, notamment la voie muqueuse.

A titre illustratif non-limitatif, on évoque un schéma de vaccination qui consiste à administrer une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour la sous-unité A et une séquence codant e.g., pour la sous-unité B de l'apoenzyme de l'uréase trois fois par voie intramusculaire, dans la région dorso-lombaire avec un intervalle de trois à quatre semaines entre chaque administration.

Selon un mode alternatif, on peut aussi mettre en oeuvre une méthode comprenant plusieurs étapes d'administration concomitantes ou consécutives (dans ce dernier cas, on parle de primo-immunisation suivie d'un ou plusieurs rappels) ; et notamment (a) une première étape qui consiste à administrer à un mammifère, une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention et (b) une deuxième étape qui consiste à administrer audit mammifère un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter qui correspond de préférence, à la séquence codante dérivée d'Helicobacter de la molécule d'ADN. Ladite première étape peut être

utilisée en rappel ou en primo-immunisation ; ce dernier mode étant préféré. Pour une telle méthode on peut prévoir d'opérer en mode d'administration systémique stricte ou bien encore selon un tout autre mode. A titre illustratif non-limitatif, on évoque un protocole de vaccination selon lequel on administre en primo- immunisation, une molécule d'ADN codant pour UreA et UreB par voie systémique, suivie d'un ou plusieurs rappels consistant notamment à administrer l'apoenzyme de l'uréase par voie muqueuse e.g., orale.

Ainsi l'invention a aussi pour objet: (iv) une composition kit comprenant pour administration concomitante ou consécutive, (a) un premier produit contenant une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention, de préférence formulée pour administration par voie systémique et (b) un deuxième produit contenant un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter; de préférence à condition que la molécule d'ADN comporte une séquence codant pour le peptide ou le polypeptide présent dans le deuxième produit.

(v) une méthode selon laquelle on administre de manière concomitante ou consécutive, (a) une molecule d'ADN utile aux fins de la présente invention, de préférence par voie systémique et (b) un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter; de préférence à condition que la molécule d'ADN comporte une séquence codant pour le peptide ou le polypeptide administré de manière concomitante ou consécutive.

Pour usage dans une telle méthode, le peptide ou polypeptide sous forme purifiée peut être administré par toutes les voies conventionnelles et notamment par toutes voies systémiques e.g., intramusculaire, sous-cutanée, intraépidermique et intraveineuse ; et muqueuses e.g. par voie oculaire, nasale orale e.g. buccale ou gastrique, pulmonaire, intestinale, rectale, vaginale ou urinaire.

On précise que tous les documents publiés et cités dans la présente demande sont incorporés par référence.

La Figure 1 se réfère aux expériences décrites dans l'exemple ci-après et présente les niveaux d'activité uréase mesurée 4 à 6 semaines après épreuve. Les souris ont reçues au préalable les plasmides VR-ureA et VR-ureB, dans les muscles dorso-

lombaires (a), ou dans les quadriceps (b) ou bien le plasmide VR-ureB seul, dans les quadriceps (c). Les souris du groupe de référence standard ont reçues de l'uréase recombinante associée à de la toxine cholérique, par voie intragastrique (d). Les groupes (e) et (f) correspondent respectivement aux contrôles positifs (infection, sans immunisation) et négatifs (pas d'infection).

La Figure 2 présente une carte schématique du plasmide VR1012 décrit dans Hartikka et al, sztpra.

Exemple : Mise en évidence d'un effet protecteur à l'encontre d'une infection à H. pylori induit par un plasmide comportant ureA ou ureB A - Matériel et méthodes Souris Des souris femelles Swiss de 6/8 semaines ont été fournies par Janvier (France).

Pendant toute la durée de l'expérience on a utilisé du matériel stérilisé ; les cages étaient protégées par des "isocaps" ; les souris ont été nourries avec de l'eau filtrée et des aliments irradiés.

Plasmides VR-ureA et VR-ureB Ces plasmides ont été obtenues par insertion dans le polylinker du plasmide VR1012 (Figure 2) situé entre le promoteur CNiiIV et la séquence de polyadénylation, d'un fragment d'ADN obtenu par PCR (polymerase chain reaction) à partir du génome d'H. pylori et codant respectivement pour UreA et UreB. Une souche d'E. coli a été transformée par chacun de ces plasmides puis les deux transformants ont été mis en culture de manière conventionnelle. Les plasmides ainsi amplifiés ont été récoltés de manière usuelle par lyse alcaline suivie d'un gradient isopicnique en chlorure de césium. L'ADN a été repris soit en eau distillée soit en eau physiologique (NaCI 0,9 o> Autre antigène et adjuvant L'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori a été exprimée dans E. coli et purifiée comme cela a été décrit dans l'exemple 5 de WO96/31235. Dans la suite du texte pour désigner cette apoenzyme, on emploie le simple terme d'uréase.

La toxine cholérique provient de chez Pasteur Mérieux sérums & vaccins.

Protocole d'administration Lors de chaque expérience, les souris sont constituées en groupe de 8 à 10 souris et rçoivent 3 doses du même produit ; chaque dose sous un volume de 50 pll et à 28 jours d'intervalle (les jours 0, 28 et 56). Les différents protocoles sont comme suit: (a) (b) (c) (d) VR-ureA 50 Clg 50 g VR-ureB 50 I-19 50 g 50 g 40 g Urease CTX - - 10 llg Voie IM IM IM IG d'administration dos quadriceps quadriceps On précise que les injections intramusculaires ont été effectuées dans les muscles dorso-lombaires en une injection unique.

Epreuve Deux semaines après le deuxième rappel, les souris ont été soumises à un gavage gastrique avec 300 pll d'une suspension d'une souche d'H. pylon. adaptée à la souris, la souche ORV2002 (1.6 x 106 bactéries vivantes dans 200 1ll de PBS ; DO550 de 0.5 environ). Un groupe n'ayant reçu aucune dose d'antigène et servant de contrôle est éprouvé de même.

Analyse de l'épreuve Six semaines après l'épreuve, les souris ont été sacrifiées par rupture des vertèbres cervicales. Les estomacs ont été prélevés pour évaluer l'activité uréase. L'activité uréase a été évaluée après 4 et 24 heures (OD à 550 nm) avec le Jatrox test, Procter & Gamble) et après 24 heures le nombre de souris encore négatives a été relevé.

B- Résultats Les résultats sont présentés dans la Figure 1 décrite ci-avant et commentée comme suit

Avant tout commentaire au sujet de cette figure, on note qu'elle présente les résultats obtenus avec l'antigène utilisé sous forme adjuvantée par de la toxine cholérique et administré par voie intragastrique. Cette expérience est dite expérience de référence standard dans la mesure où l'association de l'art antérieur CT / IG est celle qui donne les meilleurs résultats à ce jour.

La Figure 1 montre que quelque soit la composition plasmidique utilisée, on observe une diminution significative de la charge infectieuse par rapport au groupe contrôle positif. Les meilleurs résultats étant obtenus lorsque les deux plasmides comportant ureA et ureB sont administrés.

De plus, on fait référence aux expériences (a) à (f) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 2 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 2/9, (b) 2/9, (c) 1/9, (d) 1/8, (e) 0/10 et (f) 5/5.