Technisch angewandte, aus Silicaten bestehende Materialien sind beispielsweise Glas, Porzellan, Email, Tonwaren, Zement und Wasserglas. Einige Silicate besitzen katalytische Eigenschaften. Durch teilweisen Austausch der von Silicium eingenom- menen Gitterstellen gegen andere Elemente, insbesondere Aluminium, wird die Vielfalt in den möglichen Strukturen und technischen Einsatzmöglichkeiten noch er- weitert. So besitzen die Alumosilicate, zu denen die Feldspäte und die Zeolithe gehö- ren, Bedeutung u. a. auf Grund ihrer Molekularsieb-und lonenaustauscher- Eigenschaften. Weitere Silicium-Verbindungen, wie die Silicone (Siloxane), besitzen u. a. auch medizinische Bedeutung, wie zur Herstellung von Implantaten.

1. 1. Siliciumdioxid Siliciumdioxid (Si02) kommt sowohl in kristalliner als auch in amorpher Form vor. Zu den verschiedenen Formen des kristallinen Si02 gehören u. a. Quarz, Tridymit und Cristobalit. Achat, Opal und Feuerstein stellen amorphe Siliciumdioxid-Mineralien dar. In allen diesen Erscheinungsformen besitzt Silicium die Koordinationszahl 4 und ist tetraedrisch von vier Sauerstoff-Atomen umgeben.

Aus amorphem Si02 bestehen auch die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen) und die Nadeln (Spiculae) von Kieselschwämmen.

1. 2. Kieselsäuren und Silicate Das tetraedrisch gebaute [Si04] 4--lon neigt zur Polymerisation durch Verknüpfung von Si04-Einheiten, wobei jeweils zwei Si-Atome über ein O-Atom miteinander ver- bunden werden. Durch Kondensation (Wasserabspaltung) entsteht dabei aus der Orthokieselsäure zunächst die Orthodikieselsäure (Pyrokieselsäure ; H6Si207). Die weitere Kondensation führt über die Polykieselsäuren zu den Metakieselsäuren [(H2SiO3) n]. Bei kleinerer Zahl der Si04-Einheiten (n = 3,4 oder 6) können sich dabei auch ringförmige Moleküle bilden.

Die wasserlöslichen Salze der Kieselsäuren, die Alkalisilicate, welche beispielsweise durch Schmelzen von Quarz mit Soda, Lauge oder Kaliumcarbonat gewonnen wer- den, enthalten neben [Sio4] 4--auch [Si207] 6~-, [Si3010] 3--und größere Anionen. Nach Ansäuerung einer solchen Alkalisilicatlösung kondensieren die durch Protonenauf- nahme gebildeten Säuremoleküle untereinander zu Polykieselsäuren, wobei die Lö- sung gelartig wird. Bei weiterem Fortschreiten der Kondensation entstehen aus den zunächst erhaltenen Ketten oder Netzen dreidimensionale Strukturen, welche der Zusammensetzung Si02 entsprechen.

Die Silicate lassen sich einteilen in. 1.) Silicate mit diskreten Anionen, nämlich 1a.) Insel-Silicate (Ortho-Silicate mit dem Anion [Si04] 2- ; Beispiel : Phenakit, Olivin, Zir- kon), 1b.) Gruppen-Silicate (Verknüpfung der Si04-Tetraeder zu kurzkettigen Ein- heiten ; Beispiel : Di-Silicate und Tri-Silicate) und 1c.) Ring-Silicate (ringförmige Ver- knüpfung der Si04-Tetraeder ; Beispiel : Benitoid mit 3-er-Ring, Axinit mit 4-er-Ring und Beryll mit 6-er-Ring), 2.) Ketten-Silicate und Band-Silicate (kettenartig miteinan- der verbundenen Si04-Tetraedern, die Polymere des Anions [Si03] 2- darstellen, und bandförmige Moleküle, die durch Verknüpfung mehrerer Si04-Ketten entstehen ; Bei- spiele : Hornblenden, Asbeste), 3.) Schicht-oder Blatt-Silicate (aus ebenen Schichten von Si04-Tetraeder, die Polymere des Anions [Sl401p] 4- darstellen und durch dazwi- schen gelagerte Kationen zusammengehalten werden ; Beispiel : Talk, Kaolinit) und 4. ) Gerüstsilicate (Verknüpfung der tetraedrischen Si04-Gruppen zu dreidimensio- nalen Gittern ; Beispiel : verschiedene Modifikationen von Siliciumdioxid wie Feldspä- te).

Allgemeine Literatur : Hinz, Silicat-Lexikon (2 Bd.), Berlin : Akademie Verl. 1985 ; Lie- bau, Structural Chemistry of Silicates, Berlin : Springer 1985 ; Petzold und Hinz, Ein- führung in die Grundlagen der Silicatchemie, Stuttgart : Enke 1979 ; CD Römpp Che- mie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York : Georg Thieme Verlag 1995.

1. 3. Silicone Durch teilweises Ersetzen der OH-Gruppen der Kieselsäure durch einbindige Or- ganylreste, die sich nicht am Kondensationsvorgang beteiligen, entstehen verschie- dene Silicone (Siloxane). Sie werden eingeteilt in : 1. ) lineare Polysiloxane (Bautyp :<BR> R3SiO [R2SiOlnSiR3), 2. ) verzweigte Polysiloxane (mit trifunktionelle oder tetrafunktio-<BR> nelle Siloxan-Einheiten an den Verzweigungsstellen), 3. ) cyclische Polysiloxane (aus<BR> difunktionellen Siloxan-Einheiten) und 4. ) vernetzte Polymere (Verknüpfung von ket- ten-oder ringförmige Moleküle zu zwei-oder dreidimensionalen Netzwerken).

Silicone sind bedeutsame technische Werkstoffe. Die Viskosität der kettenförmig aufgebauten Silicone (Siliconöle) nimmt mit wachsen- der Kettenlänge zu. Silicone, die in geringem Maß vernetzt sind, zeigen Kautschuk-Elastizität (Siliconkautschuk), stark vernetzte Ketten sind harzartige (Siliconharze).

1. 4. Biomineralisation (Bildung von biogenem Siliciumdioxid) in Kieselschwämmen Viele Siliciumverbindungen sind nur kostenintensiv herzustellen. Der Prozess der chemischen Synthese der Silicate bedarf oft drastischer Bedingungen wie hoher Druck und hohe Temperatur. Kieselschwämme sind dagegen-ebenso wie Kieselal- gen-befähigt, mit Hilfe spezifischer Enzyme Silicatgerüste unter milden Bedingun- gen, d. h. bei relativ niedriger Temperatur und niedrigem Druck, zu bilden. Weiterhin ist die SiO2-Synthese bei diesen Organismen durch hohe Spezifität, Regulierbarkeit und die Möglichkeit der Synthese von definierten Mikrostrukturen (Nanostrukturen) ausgezeichnet.

Die Hauptelemente des Skeletts der Kiese ! schwämme sind die nadelförmigen Spi- culae, die bei der Gruppe der Demospongien (Hornschwämme) und Hexactinellida (Glasschwämme) aus amorphem nichtkristallinem Siliciumdioxid bestehen. Die De- mospongien und Hexactinellidae sind die einzigen Metazoen, die Siliciumdioxid an- stelle von Calcium in ihrem Skelett besitzen.

Das opale Siliciumdioxid in den Spicule der Kieselschwämme enthält 6-13% Was- ser, was die ungefähre Formel (Si02) 25H20 ergibt (Schwab DW, Shore RE (1971) Mechanism of internal stratification of siliceous spicules. Nature 232 : 501-502).

Ein Enzym, das bei silicatbildenden Organismen an der Synthese des Si02-Skeletts beteiligt ist, und seine technische Verwendung wurden beschrieben (PCT/US99/30601. Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silica- teins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polyconden- sation of silicon alkoxide, metal alkoxide, and their organic conjugates to make sili- ca, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly (silicon/ metallo) oxane materi- als under environmentally benign conditions. Inventors/Applicants : Morse DE, Stucky GD, Deming, TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y ; DE 10037270 A 1. Silicatein- vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxane und ihre Verwendung.

Deutsches Patentamt 2000. Anmelder und Erfinder : Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC ; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous sili- cates and siloxane and use thereof. Inventors/Applicants : Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC). Dieses Enzym wurde aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula kloniert (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S. domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267 : 4878- 4887). Das aus natürlichen Quellen isolierte Enzym ("Silicatein") ist in der Lage, aus organischen Siliciumverbindungen (Alkoxysilanen) amorphes Siliciumdioxid (Polykie- selsäuren und Polysilicate) zu synthetisieren (Cha JN, Shimizu K, Zhou Y, Christi- anssen SC, Chmelka BF, Stucky GD, Morse DE (1999) Silicatein filaments and su- bunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro.

Proc Natl Acad Sci USA 96 : 361-365).

Überraschenderweise konnte von den Erfindern-zunächst in dem Meeresschwamm S. domuncula als Modellsystem, ein Enzym (genannt :"Silicase") entdeckt werden, das in der Lage ist, sowohl amorphes als auch kristallines Siliciumdioxid aufzulösen.

Dieses Enzym, das am Katabolismus von Siliciumdioxid in Schwämmen beteiligt ist, wurde unter Anwendung der Technik des"Differential Display"der mRNA unter Be- nutzung des in vitro Primmorphe-Zellkultursystems (siehe unten) aufgefunden.

Die Silicase ist in der Lage, zwei Funktionen auszuüben : erstens besitzt sie die Fä- higkeit (i) -in Analogie zu der Carboanhydrase-Kalkmaterial aufzulösen und (ii)- und dies war überraschend-auch Siliciumdioxid aufzulösen unter Bildung von Kie- selsäure. Deshalb ist die-zuerst in S. domuncula aufgefundene-Silicase in der La- ge, sowohl beim Katabolismus von kalkhaltigem Material als auch beim Katabolis- mus der kieselsäurehaltigen Spiculae mitzuwirken.

Neu an der vorliegenden Erfindung ist außerdem, daß das Silicase-Gen durch Erhö- hung der Silicium-Konzentrationen im Medium (auf gewöhnlicherweise 60 pM) indu- ziert werden kann (siehe Abbildung 7).

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird allgemein ein Ver- fahren zum in vitro oder in vivo Abbau von amorphem oder kristallinem Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silici- um (IV)- oder Metall (IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindun- gen zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Poly- peptids zum Abbau eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit (siehe Abbildung 3) zu der in SEQ ID Nr. 1 ge- zeigten Sequenz aufweist. Bisher war es nicht bekannt, daß solche Carboanhydra- sen-Domänen enthaltende Enzyme in der Lage sind, solche Silikate oder Silicone abzubauen. Aufgrund der Reversibilität dieses Prozesses betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid ' (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silici- um (IV)- oder Metall (IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindun- gen, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakteri- elle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Synthese Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxy- silandiole, Trialkoxysilanole, Tetraalkoxysilane, Alkyl-oder Aryl-Silantriole, Alkyl-oder Aryl-Monoalkoxysilandiole, Alkyl-oder Aryl-Dialkoxysilanole, Alkyl-oder Aryl- Trialkoxysilane oder andere Metall (IV)-Verbindungen als Reaktanten (Substrate) ein- gesetzt werden. Durch Verwendung definierter Mischungen der Verbindungen kön- nen Mischpolymere definierter Zusammensetzung hergestellt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch das Polype- tid oder ein Metallkomplex des Polypeptids oder die Bindung des Polypeptids oder eines Metallkomplex des Polypeptids an andere Moleküle oder die Oberflächen von Glas, Metallen, Metalloxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Materialien als Template die Ausbildung definierter zwei-und dreidimensialer Strukturen erfol- gen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Modifikation einer Kieselsäure oder Silicium (IV)- oder Metall (IV)-Verbindung enthal- tenden Struktur oder Oberfläche zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Modifikation eingesetzt wird, dadurch ge- kennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Carboanhydrase-Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist. Bevorzugterweise liegt die Kieselsäure enthaltende Struktur oder Oberfläche in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins vor.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Modifikation eine Glät- tung, ein Anätzen oder ein Herstellen von Ausbohrungen der Kieselsäure oder Silici- um (IV)- oder Metall (IV)-Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche durch das Polypeptid oder einen Metallkomplex des Polypeptids umfaßt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine chemische Verbindung oder Kieselsäure-enthaltende Struktur oder Oberfläche, die mit einem erfindungsge- mäßen Verfahren erhalten wurde, insbesondere in Form eines Edelsteins oder Halb- edelsteins.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Polypeptid einer Sili- case aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Poly- peptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Me- tallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, ins- besondere gemäß SEQ ID Nr. 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in Form einer DNA, cDNA, RNA oder Gemischs davon vorliegen und dadurch gekenn- zeichnet sein, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form ihrer komplementären"antisense"- Sequenz.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine erfindungs- gemäße Nukleinsäure in Form eines (a) Fusionsprotein- (chimäres Protein) Kon- struts, (b) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Protease-Spaltstelle) oder (c) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Kassetten-Expression). Die erfin- dungsgemäße Nukleinsäure kann synthetisch hergestellt worden sein. Verfahren da- zu sind im Stand der Technik gut bekannt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors oder Partikels, Nanopartikeln oder Liposomen, wobei der Vektor eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Weiterhin können Vektoren zum Transfer von Proteinen vorgesehen werden, vorzugsweise in Form eines Nano- partikels oder Liposoms, die ein Polypeptid der Erfindung umfassen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, transfiziert mit einem Vektor oder infiziert oder transduziert mit einem Partikel gemäß der Erfindung, zur Verfügung gestellt. Diese Wirtszelle nach kann dadurch gekenn- zeichnet sein, daß sie ein Polypeptid nach Anspruch 1, einen Metallkomplex des Polypeptids oder Teile davon exprimiert. Als Wirtzellen eignen sich alle bekannten Wirtszell-Organismen, so u. a. Hefen, Pilze, Schwämmw, Bakterien, CHO-Zellen oder Insektenzellen.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es syn- thetisch hergestellt worden ist oder daß das Polypeptid oder der Metallkomplex des Polypeptids in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder-lysat vor- liegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex vivo oder ex vitro ge- wonnen werden, zum Beispiel einer rekombinanten bakteriellen Zelle oder einem Meeresschwamm.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann nach herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden und somit im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorliegen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Auf- findung von Inhibitoren oder Aktivatoren eines Polypeptids einer Silicase aus Sube- rites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einem dazu homologen Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequen- zähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, wobei a) ein Poly- peptid einer Silicase aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz be- sitzt zur Verfügung gestellt wird, b) das Polypeptid aus Schritt a) mit einem opotenti- ellen Inhibitor oder Aktivator in Kontakt gebracht wird, und c) die Fähigkeit des Poly- peptids gemessen wird, Silikate oder Silicone abzubauen oder zu synthetisieren. Mit diesem Verfahren lassen sich wertvolle Substanzen aufspühren, die sich unter Um- ständen als Therapeutika eignen (dazu siehe im folgenden). Verfahren zur Auffin- dung solcher Substanzen sind dem Fachmann bekannt und schließen z. B. die Ver- wendung von radioaktiv markierten oder enzymatisch markierten Kandidaten- Verbindungen ein. Verfahren zur Messung der Aktivität der Silicase sind im folgen- den beschrieben und können leicht durch den Fachmann auf ein Testformat hin an- gepaßt werden. Ein Inhibitor verringert dabei die Aktivität des Enzyms im wesentli- chen vollständig, ein Aktivator induziert eine Aktivität oder verstärkt diese über den Ausgangsspiegel.

Gemäß einer Alternative des Verfahrens kann das Polypeptid einer Silicase aus Su- berites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Carboanhydrase-Domäne mindestens 25% Sequen- zähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt in vivo, in einem pro- karyontischen oder eukaryontischen Zellextrakt oder-lysat oder in gereinigter Form für den Test zur Verfügung gestellt wird.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Auffinden eines Inhibitors oder Aktivators nach Anspruch 25 oder 26 und b) Mischen des wie oben angegeben auf- gefundenen Inhibitors oder Aktivators mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Hilfsstoff. Mittels dieser Zusammensetzung werden wertvolle Pharmazeutika zur Verfügung gestellt, die, wie das Polypeptid oder eine Nukleinsäure der Erfindung zur Prävention oder Therapie der Silikose verwendet werden können. Bevorzugt ist eine Verwendung, wobei die Prävention und Therapie der Silikose durch Auflösen von Quarzkristallen erfolgt. Weiterhin kann die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure oder pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon- lmplantaten erfolgen. Schließlich läßt sich die vorliegende Erfindung auch zur Transfektion von Zellen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten verwen- den. Die oben genannten Verwendungen und die Verfahren dazu sind dem Fach- mann bekannt und können leicht auf die hier vorhandenen Bedürfnisse und Anforde- rungen angepaßt werden.

1. 5. Klonierung des die Silicase codierenden Gens Unter Anwendung der Technik des"Differential Display"wurde eine cDNA identifi- ziert, die für eine Carboanhydrase codiert. Bei Carboanhydrasen war bisher lediglich eine Beteiligung an der pH-Regulation, der HCO3~-Reabsorption und der COs- Exspiration bekannt, nicht jedoch eine Beteiligung an der-bisher unbekannten-en- zymatischen Auflösung von Siliciumdioxid-Materialien.

Die für die Silicase aus dem Meeresschwamm S. domuncula codierende cDNA (ge- nannt : SDSIA) sowie das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid (genannt : SIA SUBDO) besitzen folgende Eigenschaften. Länge der cDNA : 1395 Nucleotide (nt) ; offenes Leseraster : von nt122-nt124 bis nt1259-nt1261 (Stoppcodon) ; Länge des Polypeptids : 379 Aminosäuren ; relative Molekülmasse (Mr) des Polypeptids : 43131 ; isoelektrischer Punkt (pl) : 6,5 (berechnet mit : PC/GENE (1995) Data Banks CD- ROM ; Release 14. 0. IntelliGenetics, Inc. Mountain View, CA).

Die Northern-Blot-Analyse mit dem Schwamm SDSIA-Klon als Sonde ergibt eine Bande von--1, 5 kb.

Abbildung 2 (unten) zeigt die Nucleotidsequenz der-mit Hilfe der Differential- Display-Technik identifizierten-Schwamm-Silicase-cDNA und Abbildung 2 (oben und unten) sowie Abbildung 3A zeigen das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid der Schwamm-Silicase (SIA_SUBDO).

Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Schwamm-Silicase besitzt eine große Ähn- lichkeit zu den Aminosäuresequenzen der Carboanhydrase-Familie. Bis jetzt wurden mehr als sieben Isoenzyme der Carboanhydrasen bei Menschen identifiziert (Sun MK, Alkon DL (2002) Carbonic anhydrase gating of attention : memory therapy and enhancement. Trends Pharmac Sci 23 : 83-89). Der"Expect value" [E] (Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT (2000) Current protocols in protein science. John Wiley & Sons, Chichester) der Schwamm-Silicase mit der humanen Carboanhydrases II (CAH2_HUMAN ; P00918) beträgt 2e 29. Die Eukaryonten-Typ- <BR> <BR> Carboanhydrase-Domäne (PFAM00194 [www. ncbi. nlm. nig. gov] ) wird bei der Schwamm-Silicase im Aminosäure-Bereich von aa87 bis aa335 gefunden (Abbildung 3A). Das Alignment der Schwamm-Silicase mit der humanen Carboanhydrase II zeigt, daß die meisten der charakteristischen Aminosäuren, welche die Eukaryonten- Typ-Carboanhydrase-Signatur bilden (Fujikawa-Adachi K, Nishimori I, Taguchi T, Yuri K, Onishi S (1999) cDNA sequence, mRNA expression, and chromosomal loca- lization of human carbonic anhydrase-related protein, CA-RP XI. Biochim Biophys Acta 1431 : 518-524 ; Okamoto N, Fujikawa-Adachi K, Nishimori I, Taniuchi K, Onishi S (2001) cDNA sequence of human carbonic anhydrase-related protein CA-RP X and XI in human brain. Biochim Biophys Acta 1518 : 311-316), auch in der Schwamm- Silicase vorhanden sind. Bei der Schwamm-Sequenz sind jedoch die Aminosäurere- ste 192 (Alanin), 205 (Phenylalanin) und 207 (Phenylalanin) ersetzt (Abbildung 3A).

Die Carboanhydrasen bilden eine Familie von Zinkmetall-Enzymen, die an der rever- siblen Hydratation von C02 beteiligt sind (Sly WS, Hu PY (1995) Human carbonic anhydrases and carbonic anhydrase deficiencies. Annu. Rev. Biochem. 64 : 375-401).

Die drei konservierten Histidinreste werden in der Silicase bei den Aminosäuren aaisi, aa-) s3 und aa206 gefunden (Abbildung 3A).

1. 6. Phylogenetische Analyse der Silicase Abbildung 3B zeigt die Position der Schwamm-Silicase unter verschiedenen, ausge- wählten Vertretern der Carboanhydrase-Familie (phylogenetischer Baum ;"rooted tree"mit der bakteriellen Carboanhydrase-Sequenz von Neisseria gonorrhoeae). Die Schwamm-Silicase bildet mit der Carboanhydrase von Caenorhabditis elegans die Basis für die Carbonanhydrasen der anderen Metazoen. Die Metazoen-Enzyme sind von den Pflanzen-Enzymen und auch von den bakteriellen Enzymen getrennt.

2. Herstellung der Silicase Die Silicase kann aus Geweben oder Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt werden.

2. 1. Reinigung der Silicase aus natürlichen Quellen Alle Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Zur Reinigung der Silicase (oder Carbo- anhydrase oder Carboanhydrase-verwandtes Enzym) wird das-beispielsweise in einem Tris-SO4/Natriumsulfat-Puffer (pH 8,7)-homogenisierte Gewebe (oder wer- den die in diesem Puffer homogenisierten Zellen) zentrifugiert und zu dem erhalte- nen Überstand eine Affinitätschromatographie-Matrix wie beispielsweise CM-Bio-Gel A, gekoppelt mit p-Aminomethylbenzolsulfonsäureamid, hinzugegeben. Danach wird die Suspension auf einem Rotationsschüttler (beispielsweise für 24 h) inkubiert. Das Affinitätsgel wird dann durch Absaugen über einen Glasfilter gesammelt und mit ei- nem Puffer (beispielsweise 0,1 M Tris-S04, pH 8,7, enthaltend 0,2 M Na2S04, 1 mM Benzamidin und 20% Glycerin) gewaschen. Danach ist es zweckmäßig, einen zwei- ten Waschschritt mit demselben Puffer bei einem niedrigeren pH (beispielsweise pH 7,0) anzuschließen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Das Gel wird dann in eine Säule überführt und mit demselben Puffer (pH 7,0) gewaschen. Zur Elu- tion des Enzyms kann beispielweise ein 0,1 M Tris-S04-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,4 M NaN3, 1 mM Benzamidin und 20% Glycerin, benutzt werden. Das eluierte En- zymprotein wird dann beispielsweise gegen einen 10 mM Tris-S04-Puffer, pH 7,5, enthaltend 1 mM Benzamidin, dialysiert und danach auf eine lonenaustauscher- Säule (beispielsweise DEAE-Sephacel) gegeben, die beispielsweise mit 10 mM Tris- S04, pH 7,5, äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wird das Enzym durch Anlegen eines linearen Salz-Gradienten (beispielsweise 0 bis 0,1 M Na2S04) eluiert und gesammelt. Mit Hilfe dieser Prozedur kann die Silicase unter anderem aus dem Schwamm S. domuncula gereinigt werden.

2. 2. Herstellung der rekombinanten Silicase 2.2. 1. Clonierung der cDNAs aus marinen Schwämmen Die Durchführung der Technik des"Differential Display"der mRNA/Transkripte ist Stand der Technik (Müller WEG, Krasko A, Skorokhod A, Bünz C, Grebenjuk VA, Steffen R, Batel R, Müller IM, Schröder HC (2002) Histocompatibility reaction in the sponge Suberites domuncula on tissue and cellular level : central role of the allograft inflammatory factor 1. Immunogenetics 54,48-58). Gesamt-RNA wird von Kontroll- kulturen (gehalten bei einer niedrigen Silicium-Konzentration von 5 pM) sowie von in Gegenwart von 60 pM Silicium behandelten Kulturen unter Benutzung von TRlzol Reagens (GibcoBRL) isoliert. Die Synthese des ersten cDNA-Stranges wird mit"an- <BR> <BR> chored"oligo (dT) -Primern und AMV Reverser Transkriptase nach den Vorschriften des Herstellers (Promega) durchgeführt. Nach der Synthese des ersten Stranges wird die resultierende cDNA zehnfach mit H2O verdünnt und ein aliquotes Teil davon (2 pl) der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unterworfen. Die Reaktion wird in ei- nem Volumen von 20 pl nach Zugabe des"arbitrary"Primers 1 (5'-GTGATCGCAG- 3') oder 2 (5'-CTTGATTGCC-3') sowie von 2 uM dNTP, TuGC, 5 Units BioThem Polymerase (Genecraft) und [a-32P] dATP durchgeführt. Folgende Reaktionsbedin- gungen haben sich bei der PCR als geeignet erwiesen : initiale Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, dann 40 Amplifizierungscyclen bei je 95°C für 20 Sekunden, 42°C für 120 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden, gefolgt von einer Endinkubation von 10 Minuten bei 72°C. Die Proben werden dann in einem 5% igen Polyacrylamidgel (in 1 x TBE) aufgetrennt. Nach dem Lauf wird das Gel getrocknet und 4 Tage mit einem Röntgenfilm exponiert. Die interessierenden, im Autoradiogramm detektierten Ban- den werden ausgeschnitten, 15 Minuten in 200 pl H20 gekocht, auf Eis gekühlt und 10 Minuten bei 14000 x g zentrifugiert. Die resultierenden Überstände werden mit dem gleichen Volumen an 10 M Ammoniumacetat, 20 ug/ml tRNA versetzt und mit 2,5 Volumina an Ethanol bei-80°C über Nacht präzipitiert. Die cDNA-Pellets werden dreimal in 75% Ethanol gewaschen und in 20 pl H20 gelöst.

Etwa 2 ut der eluierte Banden werden in 50 pl-Reaktionsansätzen unter Benutzung der oben beschriebenen Primer unter denselben Bedingungen reamplifiziert, in ei- nem pGEM-T-Vector (Promega) subcloniert und sequenziert.

Diejenigen Transkripte werden ausgewählt, die differentiell exprimiert werden, d. h. die zusätzlich in den Gelen mit den RNAs von Zellen erhalten werden, die mit 60 uM Silica behandelt wurden (Abbildung 1). Die identifizierten cDNAs/Transkripte werden mit den in der BLAST Data Base enthaltenen Sequenzen verglichen. In dem in Ab- bildung 1 gegebenen Beispiel zeigten die folgenden Moleküle die größte Verwandt- schaft : Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaM Kinase) II gamma (XM_044349 ; Expect value [E] : le-16) ; hypothetisches Protein (XP_101359, E 1,6) ; MUC3B Mucin (AJ291390, E 0,20) ; hypothetisches Protein (XP_067115, E 5,9) ; hy- pothetisches Protein (XP_090138, E 2, 9) ; ATP-bindende Kassette, Unterfamilie A Mitglied 4 (XM_001290, E 1,6) ; Polypeptid ähnlich dem Zinkfingerprotein 91 (XM_091947, E 3,1) ; hypothetisches Protein (XP_104250, E 0,48), hypothetisches Protein (XP_169372, E 8,6) ; hypothetisches Protein (XP_104250, E 4, 1), hypotheti- sches Protein (XP_098020, E 3, 3) und hypothetisches Protein (XP_169372, E 8,6).

Zusätzlich zu diesen Sequenzen wurde die Silicase als weiteres Transkript identifi- ziert und in größerem Detail analysiert.

Das Silicase-Gen kann auch aus cDNA-Bibliotheken, z. B. in ZapExpress und in Escherichia coli XL1-Blue MRF', mit geeigneten degenerierten Primern mittels der PCR-Technik identifiziert werden ; hierzu werden entsprechende vektorspezifische Primer eingesetzt. Die erhaltenen Syntheseprodukte werden zum Screenen in den betreffenden cDNA-Bibliotheken benutzt. Danach werden die identifizierten Clone in einen Vektor (beispielsweise pGem-7) subcloniert und anschließend sequenziert.

2.2. 2. Expression und Isolierung der rekombinanten Silicase Die Herstellung der rekombinanten Silicase (genannt : rSIA SUBDO) erfolgt bevor- zugt in E. coli. Aber auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich und wurde erfolgreich durchgeführt. Im Folgenden ist als Beispiel die Expression des SDSIA-Gens von S. domuncula in E. coli unter Benutzung des"GST (Glutathion-S- Transferase) Fusions"-Systems (Amersham) beschrieben. In dem Beispiel werden zwei Inserte benutzt, um potentielle Effekte von Signalpeptiden während der Expres- sion zu eliminieren ; ein Insert umfaßt das gesamte abgeleitete Protein (lange Form ; von der Aminosäure aal bis zur Aminosäure aa379) und das andere Insert lediglich die Aminosäuren aa96 bis aa379 (kurze Form) (Abbildung 3A). Die entsprechenden Klone werden als SDSIA-I und SDSIA-s bezeichnet. Sie werden in einen entspre- chenden Vektor eincloniert, z. B. in das Plasmid pGEX-4T-2, welches das Glutathion S-Transferase (GST) -Gen von Schistosoma japonicum enthält. Auch andere Expres- sionsvektoren haben sich als geeignet erwiesen. Nach Transformation von E. coli wird die Expression der Silicase üblicherweise durch IPTG (Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid) induziert und in Gegenwart von 1 mM ZnS04 für 4 oder 6 Stunden bei 37°C durchgeführt (Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Smith JA, Seidmann JG, Struhl K (1995) Current Protocols in Molecular Biology.

John Wiley and Sons, New York). Die erhaltenen GST-Fusionsproteine mit der Be- zeichnung rSIA_SUBDO-I (lange Form ; Mr 69 kDa) bzw. rSIA SUBDO-s (kurze Form ; Mr 58 kDa) werden z. B. durch Affinitätschromatographie an Glutathion- Sepharose 4B gereinigt. Zur Abtrennung der Glutathion-S-transferase von der re- kombinanten Schwamm-Silicase werden die Fusionsproteine mit Thrombin (10 Units/mg) gespalten. Die Proteine werden dann der Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol unterworfen. Die Gelelektrophorese kann in 10% igen Po- lyacrylamidgelen mit 0, 1% NaDodS04 (PAGE) durchgeführt werden. Die Gele wer- den mit Coomassie Brillant Blau gefärbt.

Nach der Spaltung, Reinigung und anschließender PAGE werden die lange Form (rSIA_SUBDO-I [43 kDa] ) und die kurze Form (rSIA_SUBDO-s [32 kDa] ) der rekom- binanten Proteine erhalten (Abbildung 4).

2.2. 3. Expression und Isolierung der rekombinanten Silicase aus weiteren Organis- men Entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise kann die Isolierung, Clonie- rung und Expression der Silicase-cDNA auch aus anderen Organismen durchgeführt werden, beispielsweise aus (Siliciumdioxid-produzierenden) Diatomeen (z. B. Cylind- rotheca fusiformis). Die Gewinnung von Diatomeen in axenischen Kulturen ist Stand der Technik (Kröger N, Bergsdorf C, Sumper M (1996) Europ J Biochem 239 : 259- 264).

2. 3. Isolierung und Reinigung der Silicase mittels Antikörper Nach Extraktion oder partieller Renigung nach einem der oben geschilderten Verfah- ren wird die Silicase an einer Antikörper-Affinitätsmatrix gereinigt. Die Affinitätsmatrix wird hergestellt, indem ein Silicase-spezifischer Antikörper an eine feste Phase (CNBr-aktivierte Sepharose oder anderer geeigneter Träger) immobilisiert wird. Als Antikörper werden monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Silicase ein- gesetzt, die nach Standard-Methoden hergestellt werden (Osterman LA (1984) Me- thods of Protein and Nucleic Acid Research, Vol 2, Springer-Verlag, Berlin). Die Kopplung des Antikörpers an die Säulenmatrix wird nach den Angaben des Herstel- lers (Pharmacia) durchgeführt. Die Elution der reinen Silicase erfolgt mittels pH- Änderung oder Änderung der lonenstärke.

3. Nachweis der Silicase-Aktivität Im Folgenden werden lediglich die Aktivitäten, die für die kurze Form der rekombi- nanten Schwamm-Silicase (rSIA SUBDO-s) gefunden werden, angegeben.

3. 1. Carboanhydrase-Aktivität Zur Bestimmung der Carboanhydrase-Aktivität der rSIA_SUBDO-s kann ein Assay angewandt werden, der auf der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat basiert (Arm- strong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241 : 5137-5149). 0,5 ml einer 3 mM p-Nitrophenylacetat-Lösung (Sigma) wird mit 0,05 ml eines 0,3 mM Tris-HCI- Puffers (pH 7,6) gemischt. Nach Präinkubation bei 25°C für 5 Minuten werden 50 pl der rekombinanten Silicase (rSIA_SUBDO) hinzugefügt, und der Anstieg der Extink- tion bei 348 nm wird über einen Zeitraum von 5 Minuten bestimmt.

Abbildung 5 zeigt, daß die Aktivität der rekombinanten Silicase von der Konzentration des Enzyms im Assay abhängt. Die Enzymaktivität wird in optische Dichte (OD)- Einheiten pro Minute angegeben. Der Zusatz von 1 pg Silicase pro Assay (0,56 pI) ergab eine Aktivität von 0,005 OD348nm, die mit steigender Proteinkonzentration bis auf 0,04 OD34snm anstieg.

3.2. Silicase-Aktivität Als Substrat (amorphes Siliciumdioxid) für die Silicase können beispielsweise Spicu- lae von S. domuncula dienen. Die Spicule können aus Schwammgewebe durch 12- stündige Inkubation in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure (20 mM, in PBS ; PBS = Phosphatpuffer-Salz-Lösung, bestehend aus 1,15 mM KH2P04, 8,1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCI und 2,7 mM KCI) erhalten werden. Nach Waschen mit de- stilliertem Wasser und mit Ethanol (zweimal) werden die Spicule getrocknet (56°C) und dann in einem Mörser zu einem Pulver zerrieben.

Die Silicase-Aktivität kann wie folgt bestimmt werden. Üblicherweise werden 100 pg der getrockneten Spicule (Pulver) zu einem geeigneten Puffer wie 50 mM Tris-HCI- Puffer (pH 7,2 ; 10 mM DL-Dithiothreitol, 100 mM NaCI) und 0,5 mM ZnS04 in 2 mi Eppendorf-Gefäßen hinzugegeben. Dann werden üblicherweise 50 pl der rekombi- nanten Silicase hinzugefügt und bei 25°C inkubiert (die Inkubation ist auch bei ande- ren Temperaturen zwischen 5°C und etwa 65°C möglich). Die durchschnittliche Inku- bationszeit beträgt 60 Minuten. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an gelö- stem Siliciumdioxid werden die nichtgelösten Spicule abzentrifugiert (14000 x g ; 15 Minuten ; 4°C). Die freigesetzte, lösliche Kieselsäure kann z. B. mit Hilfe eines Mo- lybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem kolorimetrischen"Silicon Test" (Merck ; 1.14794), quantitativ bestimmt werden. Die Menge an Kieselsäure wird in diesem Fall anhand einer Kalibrierungskurve mit einem Siliciumstandard (Merck 1.09947) aus den Extinktionswerten bei 810 nm berechnet.

Abbildung 5 zeigt, daß die rekombinante Silicase den Abbau (Auflösung) von amor- phem Siliciumdioxid katalysiert. Üblicherweise werden bei einer Enzym- Konzentration von 1 pg rekombinante Silicase pro Assay 3 ng Kieselsäure/Assay freigesetzt. Bei höheren Proteinkonzentrationen (3 oder 10 ug/Assay) beträgt die Freisetzung von Kieselsäure 20 bzw. 43 ng/Assay.

3.3. Silicase-Aktivität in Escherichia coli-Lysat Die Silicase-Aktivität ist auch in Lysaten von E. coli nachweisbar, die mit dem SDSIA- Gens von S. domuncula (in dem folgenden Beispiel wurde die kurze Form verwen- det ; = SDSIA-s) unter Benutzung des"GST Fusions"-Systems transformiert wurden.

Bei dem in Tabelle 1 gezeigten Experiment wurden Schwamm-Spiculae (Nadeln ; 1 mg) mit 1,5 ml Lysat, dem 1 mM ZnCI2 und 0,1 M NaCI hinzugefügt wurden, bei ver- schiedenen Temperaturen inkubiert. Nach 1,3, 6 und 24 h wurden die Proben durch Erhitzen auf 95°C für 10 min denaturiert (zur Inaktivierung der Silicase) und dann mit Proteinase K (30 Units/ml) bei 37°C für 1 h inkubiert. Danach wurde zentrifugiert (5 min, 14000 rpm) und der Molybdat-Assay (Kit der Firma Merck ; siehe oben) zur Be- stimmung des freigesetzten Silicats durchgeführt. Es wurde gefunden, daß bei 4°C nur eine sehr geringfügige Menge an Silicat freigesetzt wurde, bei Raumtemperatur (22°C) und 56°C jedoch bis zu 3,4 bzw. 4,1 ng/ml (24 h).

Eine etwas geringere Menge an freigesetztem Silicat ließ sich auch in Lysaten aus nichttransformierten E. coli nachweisen, was zeigt, daß auch in bakteriellen Zellex- trakten eine deutliche Silicat-abbauende Aktivität vorhanden ist. Tabelle 1. Silicase-Aktivität in Lysaten von transformierten (+) und nichttransfor- mierten (-) E. coli bei verschiedenen Inkubationstemperaturen. Zur Transformation wurde die kurze Form des SDSIA-Gens von S. domuncula (= SDSIA-s) verwendet.

Die Freisetzung von Silicat wurde nach einer Inkubationszeit von 1,3, 6 und 24 Stunden bestimmt. Temperatur Freigesetztes Silicat (ng/ml) 1 h 3h 6h 24h 4°C (-) 0, 113 0, 124 0, 242 0, 303 4°C (+) 0, 110 0, 140 0, 526 0, 828 22°C (-) 0, 197 0, 415 1, 467 2, 068 22°C (+) 0, 528 0, 540 1, 939 3, 409 56°C (-) 0, 345 1, 009 1, 824 2, 447 56°C (+) 1, 542 1, 747 2, 275 4, 092 3.4. Silicase-Aktivität kommerzieller Carboanhydrasen Silicase-Aktivität ist nicht nur bei dem Schwammenzym, sondern überraschender- weise auch bei kommerziellen Carboanhydrasen meßbar. Tabelle 2 zeigt die Frei- setzung von Silicat aus Diatomeen-Skeletten (Silicat-Gerüsten von Kieselalgen) so- wie aus Sand durch eine kommerzielle Carboanhydrase-Präparation (aus Rinder- Erythrozyten ; Firma Calbiochem). In dem Experiment wurden die Silicat-Proben zu- nächst zweimal mit Wasser und zweimal mit Äthanol gewaschen und danach ge- trocknet. Anschließend wurden die Proben in 50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,6, sus- pendiert (1 mg/ml) und in 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt (100 ul pro Reak- tionsgefäß ; = 100 pg Silicat pro Reaktionsgefäß). Danach wurde 1,4 ml bovine Car- boanhydrase (10 Units ; Firma Calbiochem) in 50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,6 (mit und ohne 1 mM ZnCI2) pro Reaktionsgefäß hinzugefügt. Die Gefäße wurden bei Raum- temperatur (22°C) unter Schütteln für 24 h inkubiert. Danach wurden die Ansätze zentrifugiert (14000xg, 15 min, 4°C). Der Silicat-Gehalt im Überstand wurde mit Hilfe des Molybdat-Assay der Firma Merck (siehe oben) bestimmt. Tabelle 2. Silicase-Aktivität einer kommerziellen Carboanhydrase-Präparation (Fir- ma Calbiöchem) mit und ohne Zusatz von ZnCiz. Die Freisetzung von Silicat wurde nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bestimmt. Freigesetztes Silicat (ng/ml) Diatomeen Sand Minus ZnCl2 0, 0018 0, 0036 Plus ZnCl2 0, 0233 0, 0359 3.5. Reversiblität der Silicase-Aktivität Die Silicase-Reaktion ist prinzipiell reversibel. Deshalb kann die Reaktion auch zur Synthese von amorphem Siliciumdioxid oder Siliconen verwendet werden. Für die Silicase-vermittelten Synthese können auch Alkyl-oder Aryl-substituierte Alkoxyver- bindungen von Silicium (IV) wie Tetraalkoxysilane, Trialkoxysilanole, Dialkoxysilan- diole, Monoalkoxysilantriole, Alkyl-oder Aryl-Trialkoxysilane, Alkyl-oder Aryl- Dialkoxysilanole oder Alkyl-oder Aryl-Monoalkoxysilandiole eingesetzt werden. Auch Mischungen dieser Substrate werden polymerisiert. Somit können auch Mischpoly- mere hergestellt werden.

4. Ligation der cDNA für Silicase mit einer oder mehreren cDNA (s) für anderer Pro- teine 4. 1. Herstellung von Silicase-Fusionsproteinen Zur Herstellung von Fusionsproteinen mit der Silicase wird ein geeigneter Expressi- onsvektor (beispielsweise pQE-30-Vektor ; Qiagen) eingesetzt. Die Silicase-cDNA- mit z. B. einer BamHI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und z. B. einer Sall- Restriktionsstelle am 3'-Terminus-wird hergestellt. Das Stopp-Codon in der Silicas- cDNA wird entfernt. Hierzu wird die PCR-Technik eingesetzt und zum Amplifizieren Primer, welche die betreffenden Restriktionsstellen besitzen, benutzt. Die cDNA für das zweite Protein wird entsprechend gewonnen, wobei am 5'-Terminus die gleiche Schnittstelle wie am 3'-Terminus der Silicase-cDNA (im Beispiel Sall) und am 3'- Terminus eine von den anderen verschiedene (z. B. eine Hindlll-Stelle) vorliegt. Falls sich in den betreffenden cDNAs interne Restriktionsstellen befinden, können alterna- tive Restriktionsenzyme eingesetzt werden. Darüber hinaus können auch Linker zwi- schen die beiden cDNAs eingesetzt werden.

Die beiden cDNAs werden nach den üblichen Verfahren ligiert, gereinigt und in den pQE-30-Vektor einligiert. Die Ligation erfolgt im Anschluß an das Histidin-Tag (etwa 6 Histidin-Codons). Die Expression und Reinigung des Fusionsproteins über z. B. das Histidin-Tag, das an dem rekombinanten Protein vorliegt, kann an entsprechenden Affinitätssäulen, z. B. einer Ni-NTA-Matrix, durchgeführt werden (Skorokhod A, Schäcke H, Diehl-Seifert B, Steffen R, Hofmeister A, Müller WEG (1997) Cell Mol Biol 43 : 509-519).

4.2. Getrennte Expression I (Protease-Spaltstelle) Alternativ zu dem Verfahren unter 4.1. kann zwischen der cDNA für die Silicase und der cDNA für ein weiteres Protein eine Protease-Spaltstelle (wie z. B. eine Enteroki- nase-Stelle) eincloniert werden. In diesem Falle kann ein Codon für ein neues Start- Methionin vor den codierenden Bereich des Gens für das weitere Protein insertiert werden. Nach Expression und Reinigung wird das Fusionsprotein proteolytisch ge- spalten. Jetzt liegen beide Proteine separat vor.

4.3. Getrennte Expression II (Kassetten-Expression) Alternativ können beide Proteine auf einem Konstrukt separat exprimiert werden.

Hierzu wird in einem Expressions-Vektor das Silicase-Gen dem His-Tag nachge- schaltet. Am Ende der Silicase-cDNA wir ein Stopp-Codon insertiert. Zwischen der cDNA für die Silicase und der cDNA für das weitere Protein wird eine Ribosomen- Bindungsstelle mit Codon für ein Start-Methionin eincloniert. Wiederum wird ein His- Tag der cDNA für das weitere Protein vorgeschaltet. Ebenfalls erhält dieses Gen ein Stopp-Codon.

Die His-Tags können deletiert werden, wenn die Proteine zur Funktionsanalyse in den betreffenden Wirtszellen benutzt werden.

4.4. Erweiterungen Für die unter 4.1 bis 4.3 beschriebene Expression können sowohl bakterielle als auch eukaryotische Zellen benutzt werden.

Die unter 4.1 bis 4.3 beschriebene Expression kann auch für drei und mehr offene Leserahmen eingesetzt werden.

5. Das Modellsystem für die Synthese/den Abbau von biogenem Siliciumdioxid : Primmorphe 5. 1. Primmorphe Das Primmorphe-System wurde zum Patent angemeldet (DE 19824384. Herstellung von Primmorphe aus dissoziierten Zellen von Schwämmen, Krallen und weiteren Invertebraten : Verfahren zur Kultivierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detektion von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland. Er- finder und Anmelder : Müller WEG, Brümmer F).

Primmorphe sind Aggregate, die aus proliferierenden und differenzierenden Zellen bestehen (Müller WEG, Wiens M, Batel R, Steffen R, Borojevic R, Custodio MR (1999) Establishment of a primary cell culture from a sponge : Primmorphs from Su- berites domuncula. Marine Ecol Progr Ser 178 : 205-219). Primmorphe werden aus Schwamm-Einzelzellen, die aus Schwammgewebe nach Dissoziation in Ca2+-und Mg2+-freiem, EDTA enthaltendem künstlichem Seewasser erhalten werden, gebildet.

Aus den Schwamm-Einzelzellen bilden sich nach Überführung in Ca2+-und Mg2+- enthaltendes Seewasser Aggregate, die nach 3 Tagen eine Größe von 1 mm errei- chen, und nach 5 Tagen Primmorphe mit einem Durchmesser von etwa 5 mm.

Die Primmorphe werden von epithelartigen Zellen, den Pinacocyten, umgeben. Die Zellen innerhalb der Primmorphe sind überwiegend sphärulöse Zellen, daneben kommen Amoebocyten und Archaeocyten vor.

5.2. Effekt von Silicium auf die Spiculae-Bildung Das Primmorphe-System von Schwämmen, z. B. S. domuncula, kann zur Untersu- chung der Spiculae-Bildung oder-Auflösung benutzt werden.

Dazu werden Primmorphe für 8 Tage in Seewasser, das mit 30 uM Fe (+++) (hinzu- gegegeben als Citrat) und 10% RPM11640-Medium ergänzt wird, kultiviert. Die Silici- um-Konzentration im Seewasser/Medium ist 5 pM. Nach 8 Tagen werden die Prim- morphe entweder in diesem Medium weiter inkubiert oder in ein Medium, das 60 pM Silicium enthält (die für die Spiculae-Bildung optimale Silicium-Konzentration ; hinzu- gegeben als Na-Hexafluorosilicat), überführt und für 1 oder 3 Tage kultiviert.

Primmorphe, die ohne Zugabe von Silicium kultiviert werden, zeigen überwiegend eine runde, sphärische Gestalt.

Abbildung 6A zeigt, daß die meisten der Primmorphe nach zusätzlicher 3-tägiger Kultivierung in Gegenwart von 60 pM Silicium jedoch ovalförmig werden. In Gegen- wart von Silicium beginnen die Primmorphe mit der Spiculae-Bildung. Teilweise kann die Synthese von langen (>100 pm) Spicule beobachtet werden (Abbildung 6B), meist werden jedoch kleinere Spicule (30 um) gefunden (Abbildung 6D). In Abwe- senheit von Silicium sind keine Spicule vorhanden (Abbildung 6C).

5.3. Silicium-responsive Gene In Primmorphen von S. domuncula wird in Gegenwart von Silicium die Expression des Silicase-Gens hochreguliert. Daneben wird auch die Expression der folgenden Gene erhöht : Silicatein, Kollagen, Myotrophin und Isocitrat-Dehydrogenase.

Die Expression des Silicase-Gens kann durch Northern-Blotting unter Anwendung von Methoden, die Stand der Technik sind und beispielsweise zur Bestimmung der Expression von Silicatein und Kollagen angewandt wurden, bestimmt werden (Kras- ko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge Suberites domuncula is controlled by sili- cate and myotrophin. Europ J Biochem 267 : 4878-4887).

In dem in Abbildung 7 gezeigten Experiment blieben die Primmorphe entweder un- behandelt oder wurden mit 60 pM Silicium für 1 bis 3 Tage inkubiert. Die RNA wurde dann extrahiert. Eine Menge von je 5 pg Gesamt-RNA wurde elektrophoretisch an einem 1% igen Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt und auf eine Hybond-N+ Ny- lon-Membran entsprechend der Vorschrift des Herstellers (Amersham) geblottet. Die Hybridisierung wurde mit 400 bis 600 bp großen Segmenten der folgenden Sonden durchgeführt : SDSIA (codiert für Silicase), SDSILICA (codiert Silicatein) und SDIDH (codiert für die a-Untereinheit der Isocitrat-Dehydrogenase). Die Sonden wurden mit dem PCR-DIG-Probe-Synthesis Kit entsprechend der Vorschrift des Herstellers (Ro- che) markiert. Nach dem Waschen wurde die DIG-markierte Nucleinsäure mit anti- DIG Fab Fragmenten (konjugiert mit alkalischer Phosphatase ; Verdünnung : 1 : 10000) detektiert und mit Hilfe der Chemolumineszenztechnik unter Verwendung von CDP (Roche), dem Chemolumineszenzsubstrat der alkalischen Phosphatase, sichtbar gemacht.

Abbildung 7 zeigt die erhaltenen Northern-Blots. Es ist sichtbar, daß die Gene für die Silicase und Silicatein als Antwort auf höhere Siliciumkonzentrationen stark hochre- guliert werden. Weiterhin wird auch das Isocitrat-Dehydrogenase-Gen (codiert für ein am Citratcyclus beteiligtes Enzym) hochreguliert, was anzeigt, daß die Bildung von amorphem Siliciumdioxid eine erhöhte metabole Rate der Zellen erfordert.

6. Wirkmechanismus der Silicase Überraschend war der durch Sequenzvergleiche erhaltenen Befund, daß die Silicase ein Mitglied der Familie der Carboanhydrasen (Carbonat-Hydrolase ; EC 4.2. 1.1) ist.

Diese Enzyme katalysieren die reversible Hydration von Kohlendioxid (Abbildung 8 [1] ). Kohlendioxid wird durch die Carboanhydrase in HCO3-und H+ umgewandelt.

Die Silicase besitzt in der Tat auch eine Carbonanhydrase-Aktivität, wie mit einem kolorimetrischen Assay (Armstrong JM, Myers DV, Verpoorte JA, Edsall JT (1966) Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrase. J Biol Chem 241 : 5137-5149) nachgewiesen werden kann. Demzufolge ist es möglich, daß die Silicase infolge der Umwandlung von C02 zu HC03-eine Änderung des pH bewirkt <BR> <BR> (Abbildung 8 [1] ). Dies ermöglicht eine Anätzung von Kalksubstraten, aber nicht von Siliciumdioxid-Materialien, deren Löslichkeit mit steigendem, aber nicht mit fallendem pH ansteigt.

Es ist bekannt, daß einige Schwammspezies wie Spezies des Genus Cliona fähig sind, Calciumcarbonat aufzulösen und Löcher in Calcit/Aragonit-Substrate zu boren (Rützler K, Rieger G (1973) Sponge burrowing : fine structure of Cliona lampa pene- trating calcareous substrata. Mar Biol 21 : 144-162).

Unbekannt und überraschend war jedoch die Silicase-Aktivität des Enzyms.

Es ist bekannt, daß am Wirkmechanismus (Carboanhydrase-Aktivität) der Carboan- hydrasen drei Histidinreste beteiligt sind, die an ein divalentes Zinkion binden ; dem- entsprechend kann für die Silicase-Aktivität folgender Wirkmechanismus formuliert <BR> <BR> werden (Abbildung 8 [2] ). Bei der Silicase von S. domuncula werden die Histidinreste in dem abgeleiteten Polypeptid bei den Aminosäurepositionen aa181, aa183 und aa206 gefunden (Abbildung 3A). In Wasser (Lewis-Base) wird ein an das Zn2+ (Lewis- Säure) gebundenes Hydroxidanion gebildet. Dieses führt einen nucleophilen Angriff an einem der Siliciumatome durch, die über Sauerstoffatome miteinander verknüpft sind (Abbildung 8). Im nächsten Schritt bindet der Zink-Komplex an das Siliciumatom unter Spaltung der Sauerstoffbindung. Unter Verbrauch von H20 wird letztendlich eine freie Kieselsäure freigesetzt und das initiale Zink (11)-gebundene Hydroxidanion wieder gebildet.

7. Verwendungen der Silicase und Silicase-Fusionsproteine Für die rekombinante Silicase, die aus verschiedenen Quellen ge- reinigte Silicase und die Silicase-Fusionsproteine ergeben sich eine Reihe unterschiedlicher industriell-technischer Verwendungen, und zwar : <BR> <BR> 1. ) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Biomaterialien (Verbesserung der Biokompatibilität). Oberflächen-modifizierte Biomaterialien finden u. a. Verwendung zur Beeinflussung von Zelladhäsion und Wachstum, zur Modifizierung der Blut- Kompatibilität oder zur Kontrolle der Protein-Adsorption (z. B. Herabsetzung der Ad- sorption von Kontaktlinsen). Eine Literatur-Übersicht findet sich in : Ratner BD et al (Hrsg) Biomaterials Science-An Introduction to Materials in Medicine. Academic Press, San Diego, 1996. Ein Problem besteht darin, daß die zur Herstellung dieser Modifikationen angewandten Bedingungen oft einen schädlichen (destruierenden) Effekt auf die benutzten Biomaterialien haben. Eine im Vergleich zu den benutzten physikalisch/chemischen Verfahren"milde", Biomaterialien schonenden Methode stellt eine Modifikation der Oberflächen dar, die allein auf bioche- misch/enzymatischen Reaktionen beruht, was mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglicht wird (Silicase-vermittelter enzymatischer Abbau und-als rever- sible Reaktion-enzymatische Synthese von Si02-oder Siloxan-enhaltenden Ober- flächen mit Hilfe der rekombinanten/gereinigten Silicase). Insbesondere ergibt sich auch eine Verwendung der rekombinanten oder aus natürlichen Quellen gereinigten Silicase bei der Herstellung von Oberflächen-Modifikationen (beim Coating) von Sili- con-Materialien, wie Silicon-Brust-Implantaten, Endoprothesen oder Metall- lmplantaten (Verbesserung der Verbindung zwischen Knochen und Metall-Implantat, Biologisierung der Metall-Implantate) sowie Kontakt/Plastiklinsen. Weitere Verwen- dungen betreffen das Coating von Collagen, das als Knochenersatzmaterial dient, und von Collagen-Vliesen, die z. B. für das"Tissue Engineering"benutzt werden.

Das Ziel ist hierbei die Erhöhung der Stabilität und der Porosität sowie die Verbesse- rung der Resorbierbarkeit. <BR> <BR> <P>2. ) Verwendung zur Herstellung neuer Biomaterialien wie Knochenersatzmaterialien oder Zahnersatzmaterialien durch Co-Synthese von Polysilicaten, Siliconen oder Mischpolymeren. <BR> <BR> <P>3. ) Verwendung zur Oberflächen-Modifikation (Kontaktzonen-Behandlung) von (Sili- cium)-Halbleitern oder Silicium-Chips.

4. ) Verwendung zur Modifikation oder zur Synthese von Nano-Strukturen aus amor- phem Siliciumdioxid. Mittels der rekombinanten Silicase, der rekombinanten Silicas- Fusionsproteine oder der gereinigten Silicase ist es möglich, spezifische zwei-und dreidimensionale Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid im Nano-Maßstab zu mo- difizieren oder zu synthetisieren. Die gebildeten Strukturen können in der Nanotech- nologie angewandt werden.

5. ) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Silicium-haltigen Edelsteinen und Halbedelsteinen. Zu den amorphen bzw. feinkristallinen Modifikationen des Si02 zählen u. a. Achat, Jaspis und Onyx. Aufgrund der Möglichkeit, mit Hilfe der Silicase unter kontrollierten Bedingungen die Oberfläche dieser Minerale zu modifizieren, er- gibt sich die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Herstellung oder Bearbeitung dieser Edelsteine/Halbedelsteine. Hierbei ergibt sich auch die Möglichkeit, gezielt Fremdmoleküle/atome einzufügen.

6. Verwendung bei der Modifikation oder Synthese von Silicium-organischen Verbin- dungen einschließlich Sila-Pharmaka. Für einen Überblick über die Herstellung von Silicium-organischen Verbindungen als Grundlage für sogenannte Sila-Pharmaka (Pharmaka, bei denen C durch Si ersetzt ist), siehe : Chem. unserer Zeit 14,197-207 (1980), sowie : Bioactive Organo-Silicon Compounds (Topics Curr. Chem. 84), Berlin, Springer 1979). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens sind neue, enzymatische Wege zur Modifikation oder Synthese derartiger Verbindungen möglich.

8. Verwendungen der Silicase und Silicase-Fusionsproteine zur Prävention und Therapie der Silikose (Quarzstaublungen- erkrankung) 8. 1. Silikose Kristalline Kieselsäure (Siliciumdioxid) in Form von Quarz, Tridymit oder Cristobalit ist wahrscheinlich einer der wichtigsten Arbeitsplatzgefahrenstoffe. Die Schwere der Gesundheitsbeeinträchtigungen und die Vielfalt der möglichen Expositionsquellen sind lange bekannt. Auf Grund des weitverbreiteten Auftreten von kristallinem Silici- umdioxid in der Erdkruste und des häufigen Gebrauchs von Materialien, die es ent- haltenden, sind insbesondere Arbeiter in einer Vielzahl unterschiedlicher Industrie- betriebe gegenüber kristallinem Siliciumdioxid ausgesetzt. Es kann davon ausge- gangen werden, daß in der Landwirtschaft, im Bergbau, in der Glas-und Faser- glaslndustrie, bei der Zement-Produktion, bei der Herstellung von Keramiken, in Gie- ßereien, in der Farben-, Seifen-und Kosmetika-Produktion oder in der Dental-Manu- faktur/Reparatur Millionen von Beschäftigten regelmäßig gegenüber kristallinem Sili- ciumdioxid exponiert sind. Nach der"American Thoracic Society"ist Siliciumdioxid weltweit eine der Hauptursachen von Lungenerkrankungen. Somit besteht ein großer Bedarf zur Entwicklung von Strategien zur Prävention und Therapie.

Es ist bekannt, daß inhaliertes kristallines Siliciumdioxid Lungenfibrose (Silikose) und Lungenkrebs verursacht. Die Silikose ist eine maligne Pneumokoniose, die durch eine Akkumulation von Siliciumdioxid-Partikeln im Lungengewebe verursacht wird und durch das Auftreten von silikotischen Knötchen charakterisiert ist. Eine rationale Therapie dieser zu schweren Behinderungen führenden Krankheit existiert nicht.

Ein Hauptgrund für die Toxizität von staubförmigen, kristallinem Siliciumdioxid liegt darin, daß die Lunge nicht in der Lage ist, die eingeatmeten Staubpartikel zu elimi- nieren. Die im Lungengewebe verbleibenden Siliciumdioxid-Partikel führen zu Ent- zündungsreaktionen und zur Bildung von zelltoxischen Zytokinen, Proteasen und reaktive Sauerstoffradikalen. Bei Fortdauer dieser Erscheinungen kommt es zu einer Bindegewebsvermehrung mit einer gesteigerten Bildung von Kollagen in der Lunge, was zur Entstehung der Pneumokoniose führt.

Die Silikose entwickelt sich im allgemeinen sehr langsam über Jahrzehnte. Sie ist eine fortschreitende Erkrankung, die nicht heilbar ist. Sie zeigt sich zunächst durch Atemnot, Reizhusten und Stechen in der Brust. Durch Überlastung des Herzens und Einschränkung von Atmung und Kreislauf kommt es schließlich zum Tod. Der durch- schnittliche Zeitraum zwischen der Staubexposition und dem Auftreten der Silikose liegt bei etwa 20 Jahre. Eine gefährliche Komplikation der Silikose ist die Silikotuber- kulose. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Lungenkrebs durch kristallines Siliciumdioxid führt, wird noch wenig verstanden.

Die Silikose ist die häufigste Staublungenerkrankung unter den Berufskrankheiten.

Die mittleren Gesamtkosten eines Silikose-Patienten liegen bei etwa 130.000 Euro.

8.2. TherapeutikalProtektiva bei Silikose Die Silicase, die an der Auflösung von biogenem Siliciumdioxid beteiligt ist, kann als Therapeutikum/Protektivum zur Behandlung der Silikose eingesetzt werden.

Die Silicase ist nicht nur zur Auflösung von amorphem, sondern auch von kristalinem Siliciumdioxid (Quarzkristallen) in der Lage.

Die Silicase besitzt somit die notwendigen Eigenschaften, um Siliciumdioxid aus der Lunge zu eliminieren und/oder den Verlauf dieser Lungenerkrankung zu modulieren.

Verschieden Methoden zur Administration des rekombinanten Enzyms kommen in Betracht : a) als Enzympräparation, b) verpackt in Liposomen, c) assoziiert mit Mikro- sphären oder d) Adenovirus-vermittelter Gentransfer.

Mikrosphären als Carrier-Systems für die rekombinante Silicase zur Behandlung der Silikose (Auflösung von Si02) können z. B. aus Schwamm-Collagen analog zu Käl- ber-Callagen-Mikrosphären hergestellt werden (Rössler et al., Pharmazie 49 (1994) 175-179). Die Schwammm-Collagen-Mikropartikel werden durch Adsorption des re- kombinanten Proteins (Silicase) beladen, wie beschrieben (Rössler et al., J. Microen- capsulation 12 (1995) 49-57 ; Berthold et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45 (1998) 23- 29). Die Vorteile des Collagens sind seine Bioabbaubarkeit sowie seine niedrige To- xizität und Immunogenität. Als weitere"Delivery"-Systeme kommen u. a. auch Lipo- somen mit dem eingeschlossenen rekombinanten Enzym sowie Lipid-Nanopartikel in Frage (Jenning et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 49 (2000) 211-218).

8.3. Veränderung der Eigenschaften von Zellen durch Transfektion mit einem Sili- case-Gen/cDNA-enthaltenden Plasmid Durch Transfektion von Zellen mit einem Silicase-Gen/cDNA-enthaltenden Plasmid lassen sich deren Eigenschaften verändern, was u. a. eine Verwendung bei der Her- stellung von Knochenersatzmaterialien oder eine Gentherapie (z. B. bei Silikose) er- möglicht.

Erläuterungen zu den Abbildunaen : Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den beigefügten Abbildungen und dem Sequenzprotokoll aufgeführt. Es zeigen : SEQ ID No. 1 : Die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Silicase aus S. domuncula (SIA_SUBDO), SEQ ID No. 2 : Die Nukleinsäuresequenz der cDNA der erfindungsgemäßen Silicase aus S. domuncula.

Abbildung 1 : Identifizierung von Transkripten in Primmorphen, die nach Inkubation in 60 pM Silici- um für 1 oder 3 Tage hochreguliert wurden, mit Hilfe der Technik des Differential Display. Die Primmorphe blieben entweder bei der normalen Silicium-Konzentration von 5 uM (Spur a) oder wurden in Gegenwart von 60 uM Silicium inkubiert (Spur b und c). Die RNA wurde extrahiert und für die Analyse benutzt. Zur Amplifizierung der Transkripte wurden zwei unterschiedliche willkürliche Primer (1 und 2) benutzt. Die- jenigen Transkripte, die lediglich bei höherer Silicium-Konzentration (Spur b und c) auftraten und analysiert wurden, sind markiert Abbildung 2 : Oben : Aus der Nucleotidsequenz des offenen Leserahmens (codierende Region) der S. domuncula Silicase-cDNA (S) ASUBDO) abgeleitete Aminosäuresequenz. Unten : Nucleotidsequenz der S. domuncula Silicase-cDNA (SIA_SUBDO). Die aus der Nucleotidsequenz des offenen Leserahmens abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nucleotidsequenz angegeben.

Abbildung 3 : (A) Alignment der S. domuncula Silicase (SIA_SUBDO) mit der humanen Carboan- hydrase 11 (Carbonat-Dehydratase II) (CAH2HUMAN ; P00918). Die Carboanhydra- se-Domäne ist eingerahmt (| e-CAdom JI). Die charakteristischen Aminosäuren, welche die Eukaryonten-Typ-Carboanhydrase-Signatur bilden, sind markiert (A : in beiden Sequenzen gefunden ;- : lediglich in der Carboanhydrase, aber nicht in der Silicase vorhanden). Die zusätzlichen-Zeichen (+) zeigen diejenigen Reste, die das Hydrogen-Netzwerk des aktiven Zentrums bilden. Die drei Zink-bindenden Histidin- Reste sind markiert (Z). Ähnliche Aminosäurereste zwischen den beiden Sequenzen sind hervorgehoben. Die Grenzen der langen (~rec~ bis ~rec~) sowie der kurzen re- kombinanten Silicase (~rec-s~ bis ~rec~) sind markiert und doppelt unterstrichen. (B) Phylogenetischer Baum, konstruiert mit der Schwamm-Silicase und folgenden ver- wandten Enzymen : humane Carbonanhydrase I (Carbonatdehydratase I) (CAH1_HUMAN ; P00915), II (CAH2_HUMAN), lil (CAH3_HUMAN ; P07451), IV (CAH4_HUMAN ; P22748), VI (CAH6_HUMAN ; P23280), VII (CAH7_HUMAN ; P43166), Vlil (CAH8_HUMAN ; P35219), IX (CAH9_HUMAN ; Q16790), X (CAHA HUMAN ; Q9NS85), VA (CAH5_HUMAN ; P35218), VB (CA5B_HUMAN ; Q9Y2D0), XII (CAHC_HUMAN ; 043570), XIV (CAHE_HUMAN ; Q9ULX7), Carboan- hydrase von Caenorhabditis elegans (CAH_CAEEL ; Nu-510674. 1), Carboanhydrase von Drosophila melanogaster (CAH1_DROME ; NP523561. 1), Carboanhydrase der Pflanzen Arabidopsis thaliana (CAH-I_ARATH ; NP_196038. 1) und Chlamydomonas reinhardtii (Carbonatdehydratase 1) (CAH1CHLRE ; P20507) sowie bakterielle Car- boanhydrasen von Neisseria gonorrhoeae (CAH_NEIGO ; Q50940), Klebsiella pneu- moniae (CAH_KLEPN ; 052535) und den Cyanobakterien Nostoc sp. PCC 7120 (CAHANASP ; P94170). Die letztgenannte Sequenz diente als Outgroup. Die Meß- balken zeigen eine evolutionäre Distanz von 0,1 Aminosäure-Substitutionen pro Po- sition in der Sequenz an. Der phylogenetische Baum wurde mittels"Neighbour- Joining"konstruiert ("Neighbor"Programm : Felsenstein, J. (1993). PHYLIP, ver. 3.5.

University of Washington, Seattle).

Abbildung 4 : Herstellung der rekombinanten Silicase. Die rekombinante S. domuncula Silicase (rSIA_SUBDO) wurde als GST-Fusionsprotein hergestellt. Sowohl die lange als auch die kurze SDSIA wurden in ein pGEX-4T-2-Plasmid kloniert, das das Glutathion S- Transferase (GST)-Gen enthielt. Die Fusionsproteine wurden entweder ohne vorher- gehende Induktion mit IPTG (-IPTG) oder nach Inkubation mit IPTG (+IPTG) für 4 oder 6 Stunden isoliert, danach gespalten, gereinigt und anschließend der Na- DodS04-PAGE unterworfen. Das Gel wurde mit Coomassie Brillant Blau gefärbt. Die gereinigte lange Form rSIA_SUBDO-I mit einer Größe von 43 kDa sowie die kurze Form (Mr 32 kDa) der Silicase wurden erhalten.

Abbildung 5 : Bestimmung der Enzymaktivität der Silicase im Carboanhydrase-und im Silicas- Assay. Die rekombinante Silicase wurde zu den Reaktionsmischungen hinzugefügt in Konzentrationen zwischen 1 und 10 pg pro Assay (0,56 pI). Zur Bestimmung der Carboanhydrase-Aktivität (*) wurde p-Nitrophenylacetat als Substrat benutzt. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde bei einer Wellenlänge von 348 nm gemessen. Die Aktivität der Silicase (-) wurde unter Verwendung von S. domuncula Spicule be- stimmt. Die freigesetzte, durch Depolymerisation (Abbau) von amorphen Siliciumdi- oxid gebildete Kieselsäure wurde mit Hilfe der"Silicon Test"kolorimetrischen Reakti- on bestimmt.

Abbildung 6 : Effekt von Silicium auf die Bildung von Spicule in Primmorphen. Für die Bildung der Primmorphe wurden dissoziierte Zellen des Meeresschwammes S. domuncula in Seewasser, ergänzt mit 10% RPM11640-Medium und 30 pM Fe (+++), inkubiert. Die Primmorphe wurden dann für 3 Tage in ein Medium (RPMI 1640, Fe (+++)), das mit 60 uM Silicium angereichert wurde, überführt. (A) Die Primmorphe wurden in Medi- um plus Silicium inkubiert. Vergrößerung : x6. (B) In einigen Fällen begannen die Primmorphe mit der Synthese von Spicule (sp). Vergrößerung : x10. Zur semiquan- titativen Messung wurden die Primmorphe zwischen zwei Deckgläser gepresst (C und D). (C) Primmorphe, die in Abwesenheit von Silicium inkubiert wurden, waren fast komplett ohne Spicule, während diejenigen, die in Gegenwart von Silicium kul- tiviert wurden, neugebildete Spicule enthielten (>) (D) ; Vergrößerung : x200.

Abbildung 7 : Expression der Silicase, des Silicateins und der Isocitrat-Dehydrogenase, bestimmt durch Northern-Blotting. Die RNA wurde aus Primmorphen extrahiert, die in Abwe- senheit von zusätzlichem Silicium (-Si) oder in Gegenwart von 60 uM Silicium (+ Si) für 1 bis 3 Tage inkubiert worden waren. 5 pg der Gesamt-RNA wurde elektrophore- tisch aufgetrennt, auf Nylonmembranen geblottet und mit den folgenden Sonden hy- bridisiert : SDSIA (Silicase), SDSILICA (Silicatein) und SDIDH (a-Untereinheit der Isocitrat-Dehydrogenase). Die Größen der Transkripte sind angegeben.

Abbildung 8 : Enzymatische, von der Silicase (Carboanhydrase) von S. domuncula vermittelte Re- aktionen. In [1] ist die Überführung von C02 in HC03-gezeigt. In [2] ist die Reaktion der Silicase gezeigt. Die Silicase bindet mit ihren drei Histidin-Resten ein Zinkatom.

Das Zinkion, eine Lewis-Säure, bindet ein Hydroxid-Anion, das aus Wasser, einer Lewis-Base, stammt. Der Silicase/Zink-Komplex unternimmt einen nucleophilen An- griff auf ein Siliciumatom zwischen den Sauerstoffbindungen. Dadurch wird die Hy- drolyse des polymeren Siliciumdoxids bewirkt, das zunächst-mit einer der beiden Produkthälften-an das Enzym gebunden bleibt. Unter weiterem Verbauch von H20 wird das Produkt freigesetzt bis nach mehreren Cyclen letztendlich freie Kieselsäure zurückbleibt.

Abbildung 9 : Links : Spicule (Nadeln) von Suberites domuncula nach 6 stündiger Inkubation in Abwesenheit von Silicase. Rechts : Spicule von Suberites domuncula nach 6 stün- diger Inkubation in Gegenwart von Silicase. Die Inkubation erfolgte unter den in Ta- belle 2 beschriebenen Bedingungen.