DETECTION D'UNE ACTIVITE ENZYMATIQUE DES BÉTA-LACTAMASES Résumé de l'invention Il est crucial de disposer d'outils performants, simples, rapides, et transportables, pour identifier de manière fiable les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques, et plus particulièrement les entérobactéries productrices de β-lactamase à spectre élargi (BLSE) qui sont les plus largement répandues chez les Entérobactéries. La présente invention répond à ce besoin, par sa simplicité d'utilisation et sa rapidité. Elle repose sur la détection de l'activité enzymatique d'hydrolyse de β-lactamines, en utilisant un anticorps capable de discriminer entre la forme intacte du cycle β-lactame d'une β-lactamine et de son produit d'hydrolyse. Cet anticorps peut être utilisé dans des kits et des procédés permettant de détecter très rapidement (en moins d'une heure), sans utiliser un matériel couteux (une bandelette lisible à l'œil nu), la présence de bactéries produisant des enzymes de type pénicillinases, AmpC plasmidiques ou hyper-produites, de BLSE ou de carbapénèmases à partir de colonies ou dans un échantillon. Description de l'art antérieur Suite à la découverte de la pénicilline en 1928, son utilisation n'a fait que de croître, permettant de réduire considérablement la mortalité liée par les maladies infectieuses. Mais dès 1940, la première résistance à la pénicilline a été recensée, remettant en cause son efficacité contre certains germes (Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (ANSES), « Consommation d'antibiotiques et résistance aux antibiotiques en France : une infection évitée, c'est un antibiotique préservé! », 2018). Ce phénomène survient généralement quelques années après l'introduction d'un nouvel antibiotique, du fait de son utilisation massive et répétée en santé humaine et animale, qui génère au fil du temps une augmentation des résistances (Iredell, Brown, et Tagg, « Antibiotic Resistance in Enterobacteriaceae », 2016). En effet, les antibiotiques agissent non seulement sur la bactérie responsable de l'infection à traiter, mais également, sur toutes bactéries constituant les différents microbiotes humain, animal et environnemental. Toutes les bactéries sont ainsi susceptibles de développer des résistances soit par mutations chomosomiques, soit pas acquisition de nouveaux mécanismes de résistance aux antibiotiques en complément de ceux que certaines d'entre-elles possèdent naturellement (Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (ANSES), « Consommation d'antibiotiques et résistance aux antibiotiques en France : une infection évitée, c'est un antibiotique préservé! », 2018). L'apparition et l'émergence de telles résistances ne sont pas surprenantes, car la plupart des antibiotiques sont dérivés directement ou indirectement de produits naturels microbiens (Iredell, Brown, et Tagg, « Antibiotic Resistance in Enterobacteriaceae », 2016). Au début des années 1980, le développement des céphalosporines de 3ème génération (C3G) a permis de lutter efficacement contre les entérobactéries. Toutefois, dès 1983, un premier cas de résistance a été observée en Europe avec l'apparition de bactéries β- lactamases à spectre élargi (ci-après « bactéries BLSE »), autres que les pénicillinases et les céphalosporinases à spectre étroit déjà connues. Les β-lactamases provoquent l'ouverture de la liaison amide du cycle β-lactame, rendant l'agent antibiotique inefficace et la bactérie résistante à son effet délétère. Les bactéries produisant une BLSE sont capables d'hydrolyser les cycles β-lactames présents chez les β-lactamines tels que les pénicillines, ainsi que les différentes classes de céphalosporines (C1G, C2G, C3G, C4G, C5G). Elles sont principalement exprimées par les bactéries à Gram négatif et plus particulièrement chez les entérobactéries, qui sont les principales sources d'antibiorésistances (Bonomo, « β-Lactamases », 2017). Dans les années 1990, de nouvelles BLSE de type CTX-M ont émergé et sont devenues rapidement les β- lactamases les plus répandues dans les isolats cliniques d'entérobactéries. De nos jours, elles sont principalement présentes chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae (Cattoir, « Les nouvelles β-lactamases à spectre étendu (BLSE) », 2008). Ces bactéries productrices de BLSE constituent un réel problème de Santé Publique. En effet, ces dernières sont de plus en plus fréquemment isolées et nécessitent des traitements, pour les infections graves, à base d'antibiotiques de derniers recours (carbapénèmes), ce qui conduit à l'apparition de résistances aux carbapénèmes avec les carbapénémases (Perez et al., « The Continuing Challenge of ESBLs »). Cette évolution de l'antibiorésistance, a conduit à un nombre croissant d'impasses thérapeutiques, rendant ainsi les maladies infectieuses, si rien n'est fait, comme une des premières causes de mortalité à partir de 2050. Le traitement actuel des infections graves à Entérobactéries productrices de BLSE repose sur les carbapénèmes ou sur certains nouveaux inhibiteurs de β-lactamases (avibactam, relebactam, vaborbactam), car les BLSEs sont dans l'incapacité d'hydrolyser ces molécules. Cependant, ces antibiotiques sont utilisés en derniers recours, afin de limiter l'apparition de souches résistantes à ces derniers. En première intention, un traitement antibiotique à base de céphalosporines est souvent prescrit, mais il s'avère inefficace si les bactéries infectantes produisent une BLSE. Ainsi, il est nécessaire d'adapter l'antibiothérapie à chaque type de bactérie infectieuse, selon son antibiogramme, et cela le plus tôt possible afin d'avoir un traitement optimal et un taux de succès thérapeutique élevé (Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (ANSES), « Consommation d'antibiotiques et résistance aux antibiotiques en France : une infection évitée, c'est un antibiotique préservé! »). A cet effet, il est crucial de disposer d'outils performants, simples, rapides, et transportables, pour identifier de manière fiable les bactéries antibiorésistantes, et notamment les bactéries hydrolysant les C3G, et qui nécessitent un traitement à antibiotique de derniers recours. Différentes méthodes génotypiques et phénotypiques ont été développées au cours de ces dernières années pour la détection et l'identification de bactéries possédant une activité β-lactamase et donc capables de résister aux β-lactamines. Chacune de ces méthodes englobe une multitude de tests qui répondent à des besoins et à des objectifs différents. Il n'existe pas de test unique, qui soit idéal dans toutes les situations, ce qui explique la dynamique de développement de ces tests diagnostiques (Aguirre-Quiñonero et Martínez- Martínez, 2017 ). Notamment, les méthodes suivantes ont été décrites dans des documents de brevet: - WO2008/114001 Cette demande de brevet internationale décrit un kit de détection des bactéries BLSE, qui est composé d'un milieu contenant un antibiotique pour tuer les bactéries à Gram positives, un composé antifongique, un antibiotique pour tuer les bactéries à Gram négatives non BLSE, et d'un indicateur coloré. La présence des bactéries BLSE est détectée en incubant l'échantillon à tester sur ledit support pendant 18-24 heures à 36- 37°C et en détectant le changement de couleur de l'indicateur de pH, du fait de l'acidification du milieu liée à la croissance bactérienne des bactéries BLSE. Ce procédé colorimétrique est simple d'utilisation mais l'interprétation du changement de couleur est subjective. De plus, ce changement de couleur est induit par une acidification d'un milieu tamponné par la croissance bactérienne. De ce fait, un temps d'incubation relativement important (16h-24h) est nécessaire pour mettre en évidence la présence des bactéries recherchées. - WO2011/154517 La méthode décrite dans cette demande de brevet internationale requiert de mettre en contact une suspension bactérienne pendant quelques heures avec un substrat approprié (un antibiotique β-lactame ou un dérivé de β-lactame personnalisé), puis de mesurer par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) l'apparition de pics correspondant aux produits d'hydrolyse de l'antibiotique si les bactéries contiennent des β-lactamases. En présence de β-lactamases actives, le poids moléculaire du substrat est modifié, le pic du produit d'hydrolyse apparaît tandis que le pic du substrat intact diminue. Cette méthode présente des inconvénients tels qu'un matériel coûteux, de la main d'œuvre qualifiée, une absence de logiciel d'interprétation automatique des spectres de masse (déterminer les pics et les masses exactes attendus), la non-adaptabilité sur le terrain ainsi qu'une standardisation du protocole parfois floue (temps d'incubation différents, substrats utilisés, calibration du spectromètre de masse, conditions de lyse bactérienne…). - WO2011/107703 Le procédé de détection décrit dans cette demande repose sur l'utilisation d'un substrat chromogène ou fluorogène de β-lactamases permettant de détecter la présence de bactéries BLSE. Pour la mettre en œuvre, il faut : a) concentrer les microorganismes présents dans l'échantillon biologique, éventuellement après une étape de culture des microorganismes ; b) mettre en suspension les microorganismes concentrés à l'étape a) dans une solution comprenant au moins un substrat chromogène ou fluorogène de β- lactamase susceptible de libérer un chromophore ou un fluorophore après hydrolyse par l'enzyme β-lactamase à détecter; c) détecter l'éventuelle libération du chromophore ou du fluorophore obtenue à l'étape b), la détection de la libération du chromophore ou du fluorophore étant indicative de la présence de β-lactamase et donc de bactéries BLSE. L'hydrolyse du substrat provoque l'apparition d'un signal coloré ou fluorescent dans le milieu. Toutefois, le temps d'incubation peut être relativement long pour les enzymes ayant une faible activité enzymatique. Par ailleurs, certaines colorations peu prononcées peuvent être difficilement interprétables et un appareil de lecture est nécessaire pour les substrats fluorogènes. De plus, ces substrats peuvent être sensibles à la lumière, ce qui pose problème si le test doit être adapté sur le terrain. - WO 2013/72494 La méthode décrite dans cette demande viser à la détection de bactéries produisant des ß- lactamases à spectre élargi (ß-lactamase hydrolysant la céphalosporine à spectre élargi). Cette méthode comprend les étapes suivantes : a) effectuer une lyse cellulaire de l'échantillon; b) faire réagir une fraction de la suspension obtenue à l'étape a) avec un kit de réactifs comprenant : i) un substrat de ß-lactamase à spectre élargi choisi dans le groupe constitué par les céphalosporines, l'aztréonam et les céphamycines, et ii) un indicateur de pH qui changera de couleur lorsque le pH de la solution sera compris entre 6,4 et 8,4. Ce changement de pH est induit par l'hydrolyse de la céphalosporine, présente dans le milieu, qui fait apparaitre une fonction acide carboxylique. Le changement de couleur de l'étape b) indique la présence des bactéries productrices de ß-lactamase à spectre élargi dans l'échantillon. Ce procédé colorimétrique est simple d'utilisation mais, comme pour WO2008/114001, l'interprétation du changement de couleur est subjective. De plus, ce changement de couleur est induit par une acidification d'un milieu tamponné par la croissance bactérienne. De ce fait, un temps d'incubation relativement important (16h-24h) est nécessaire pour mettre en évidence la présence des bactéries recherchées. - WO2016/156605 Cette méthode électrochimique permet de déterminer la présence de bactéries BLSE grâce à leurs propriétés électrochimiques, visibles à l'aide d'un appareillage. Cette technique présente un coût d'utilisation élevée (matériel coûteux et personnel qualifié). - US2018/156796 Cette demande de brevet américaine décrit des méthodes pour détecter la présence de bactéries résistantes aux antibiotiques à cycle β-lactame dans un échantillon, en mettant en contact l'échantillon avec des anticorps qui reconnaissent spécifiquement les molécules contenant un cycle β-lactame hydrolysé. La forme hydrolysée de l'antibiotique est quant à elle immobilisée sur un support, par exemple sur une bandelette. Dans ces méthodes, l'anticorps marqué spécifique de l'antibiotique hydrolysé est mis au contact des bactéries de l'échantillon, puis le mélange est déposé sur la bandelette sur laquelle l'antibiotique hydrolysé est immobilisé. Si l'échantillon contient des bactéries résistantes aux antibiotiques (résultat « positif »), alors l'anticorps marqué est saturé par l'antibiotique hydrolysé présent dans l'échantillon en grande quantité, et ne se fixera donc pas sur l'antibiotique immobilisé de la bandelette : il n'y a alors aucun signal sur la zone de test de la bandelette. Dans le cas contraire, i.e., si l'échantillon contient des bactéries non-BLSE (résultat « négatif »), alors l'anticorps introduit dans l'échantillon reste libre de se fixer aux antibiotiques hydrolysés immobilisés sur la bandelette, et le signal devient fort sur la zone de test. En détectant l'apparition du produit de la réaction de l'enzyme que l'on cherche à détecter (i.e., la forme hydrolysée de l'antibiotique), la présence de l'enzyme active dans l'échantillon se traduit donc par une diminution du signal. Lors du choix d'une stratégie de détection, plusieurs facteurs sont à prendre en compte tels que : le coût, le délai d'obtention des résultats, les performances du test et les informations recueillies par le test. L'identification de l'antibiorésistance doit être la plus rapide et la plus précise possible, afin d'adapter au mieux et au plus tôt la thérapie des patients infectés, et de limiter au maximum la dissémination des souches résistantes, en identifiant les patients infectés ou colonisés. Ces tests sont donc très importants pour les professionnels de santé et pour les acteurs de la prévention des infections bactériennes, tant au niveau local, régional que national (Lecour, « Détection des carbapenemases chez les entérobactéries »; Lutgring et Limbago, « The Problem of Carbapenemase-Producing- Carbapenem-Resistant-Enterobacteriaceae Detection », 2016). La présente invention répond à ce besoin, par sa simplicité d'utilisation et sa rapidité. Elle repose sur la détection de l'activité enzymatique d'hydrolyse de β-lactamine en utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la forme intacte du cycle β-lactame d'un antibiotique. Cet anticorps est ensuite utilisé dans des kits et des tests immunochromatographiques permettant d'obtenir un résultat très rapidement (en moins d'une heure), sans utiliser un matériel couteux (une bandelette lisible à l'œil nu). L'utilisation d'un tel anticorps permet de lier la présence d'enzymes actives / de bactéries BLSE dans un échantillon (résultat « positif ») à l'apparition d'un signal, et non l'inverse comme le proposent de nombreux documents de l'art antérieur. En effet, grâce à l'anticorps de l'invention (reconnaissant l'antibiotique au cycle β-lactame intact), il est possible de mesurer la disparition du substrat (antibiotique intact qui est introduit dans l'échantillon) de manière fiable, spécifique et reproductible, en mesurant l'apparition d'un signal (plus facile à observer que la diminution d'un signal). De ce fait, le test de l'invention est extrêmement fiable : une sensibilité de 100% et une spécificité de 100% ont été obtenus pour la détection d'une activité céphalosporinase (activité enzymatique d'hydrolyse du céfotaxime) chez de nombreuses bactéries testées, en 40 minutes (cf. exemples ci-dessous). Les kits et procédés de détection objets de la présente invention permettent de : - Faciliter la détection des bactéries capable d'hydrolyser des β-lactamines (un signal coloré est synonyme de positivité) - éventuellement, identifier quel type d'enzymes est exprimé par les bactéries détectées, - Réduire le temps de détection des bactéries capable d'hydrolyser les β-lactamines (il n'est plus besoin que de 40 minutes pour l'obtention d'un résultat), - Détecter l'ensemble des bactéries produisant des β-lactamases qu'elles soient connues ou inconnues (ils permettent de conclure même en cas d'apparition de nouvelles mutations) - Utiliser l'immunochromatographie, qui présente de nombreux avantages en termes de rapidité, cout, simplicité, et de sensibilité. Description de l'invention La présente invention concerne des nouveaux moyens pour détecter l'hydrolyse de β- lactamine, et donc pour révéler la présence de bactéries produisant une β-lactamase dans un échantillon. Ces nouveaux moyens sont basés sur l'utilisation d'un anticorps spécifiquement mis au point par les inventeurs, pour reconnaitre un antibiotique à cycle β-lactame intact (et non son produit d'hydrolyse). Cet anticorps peut être avantageusement utilisé dans les kits de détection et les procédés de détection décrits ci- dessous. De manière très avantageuse, ces kits contiennent une bandelette (laquelle est également un aspect de l'invention en elle-même), sur laquelle l'anticorps de l'invention a été déposé et séché. Dans le cadre de la présente invention, des anticorps monoclonaux ont été produits et sélectionnés pour reconnaitre spécifiquement la forme intacte d'antibiotiques de type ß- lactamine (i.e., comprenant un noyau β-lactame) (cf. exemples 1 et 2). Pour atteindre cet objectif, des immunogènes (contenant un cycle β lactame intact) et des tests de sélection ont été conçus et mis en œuvre. Les exemples 1 et 2 de la demande, présentés ci-dessous, décrivent comment ces immunogènes ont été conçus, puis produits, et comment des anticorps très discriminants ont ensuite pu être sélectionnés. Les antibiotiques qui ont été utilisés dans ces exemples sont le céfotaxime, une céphalosporine de troisième génération (exemple 1), et le méropénème, un antibiotique de nouvelle génération qui est hydrolysé par certaines enzymes BLSE appelées « carbapénémases » (exemple 2). Comme expliqué en détail dans les exemples ci-dessous, ces anticorps monoclonaux ont été obtenus en procédant aux étapes suivantes : A) Couplage d'un antibiotique contenant un cycle β-lactame intact, avec une grosse molécule immunogénique (type BSA ou hémocyanine), loin du noyau β-lactame. Ce couplage a été réalisé en procédant à une activation au chlorure acétyle de l'antibiotique, puis au greffage de fonctions thiols sur la grosse molécule, puis en mettant en contact les deux molécules activées (cette étape de couplage peut également être réalisée par différents moyens chimiques classiques connus de l'homme du métier). B) Immunisation de souris en injectant aux animaux une quantité suffisante (par exemple 50μg) de l'antibiotique intact couplé à la grosse molécule immunogénique. C) Prélèvement des anticorps produits par les animaux immunisés, et identification des anticorps reconnaissant le cycle β-lactame intact (voir le test présenté sur la figure 1). D) Production d'hybridomes produisant les anticorps sélectionnés (à partir des splénocytes des souris immunisées qui ont été fusionnées avec des cellules de myélome murin). E) Isolement de chaque hybridome produit dans un puits et confirmation que les anticorps monoclonaux produits reconnaissent l'antibiotique dont le cycle β-lactame est intact (cf. test de la figure 1 et test 1 de la figure 9). F) Identification et sélection des hybridomes produisant des anticorps qui ne reconnaissent pas du tout l'antibiotique dont le cycle β-lactame est hydrolysé (anticorps négatifs dans le test 2 de la figure 2 et figure 9). G) Détermination de la spécificité de chaque anticorps sélectionné envers l'antibiotique à cycle β-lactame intact (tests 3 et 4 de la figure 2 et figure 9) avec différentes concentrations de l'antibiotique intact et hydrolysé). En utilisant ce protocole, les inventeurs ont produit de nombreux hybridomes produisant des anticorps discriminants différents, ayant une affinité très forte pour la forme intacte du cycle β-lactame (signal plus faible en présence de l'inhibiteur dans le test 3 de la figure 2 et figure 9, pas de baisse de signal en présence de l'inhibiteur dans le test 4 de la figure 2 et figure 9). Ces anticorps sont très spécifiques de la forme intacte de l'antibiotique (pas de réactions croisées observées avec la forme hydrolysée, cf. figure 3). D'autres anticorps discriminants selon l'invention peuvent être générés en reproduisant ces étapes, à partir d'un autre antibiotique. Anticorps de l’invention Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement une molécule antibiotique contenant un cycle β-lactame intact, cet anticorps ne reconnaissant pas la même molécule antibiotique hydrolysée, i.e., lorsque son cycle β-lactame a été hydrolysé, par exemple par une β-lactamase. Ainsi, l'anticorps de l'invention est capable de se fixer uniquement sur des antibiotiques dont le cycle β-lactame est intact. Il permet donc de discriminer les deux formes de l'antibiotique, puisqu'il sera complexé lorsqu'il est mis en contact avec la forme intacte de l'antibiotique, mais restera libre en présence de la forme hydrolysée de celui-ci. Il suffit ensuite de détecter l'existence de ces complexes, pour savoir si l'antibiotique était sous forme intacte ou hydrolysée. C'est pourquoi, l'anticorps monoclonal de l'invention sera ci-après appelé « anticorps discriminant » selon l'invention. Au sens de la présente invention, le terme « intact » est synonyme de « non hydrolysé ». Ainsi, un cycle β-lactame « intact » est un cycle β-lactame qui est fermé, car il n'a pas subi d'hydrolyse par une β-lactamase. Par extension, on appellera un antibiotique « intact », ou « non-hydrolysé », un antibiotique dont le cycle β-lactame est fermé et donc fonctionnel (ce cycle procure en effet l'effet antimicrobien de l'antibiotique). A l'inverse, on désignera par le terme « hydrolysé » un antibiotique dont le cycle β-lactame est ouvert, car il a été hydrolysé par une β-lactamase, naturellement (dans un échantillon naturel) ou artificiellement (par exemple par une enzyme de synthèse). Un antibiotique « hydrolysé » est généralement non fonctionnel, i.e., il n'a plus ou que peu d'effet antimicrobien. Tel qu'utilisé ici, le terme «anticorps monoclonal» se réfère à un anticorps issu d'une population d'anticorps homogène. Plus particulièrement, les anticorps individuels d'une population d'anticorps monoclonaux sont identiques. En d'autres termes, un anticorps monoclonal est constitué d'une population d'anticorps homogène issue de la croissance d'un clone monocellulaire (par exemple un hybridome, une cellule hôte eucaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, une cellule hôte procaryote transfectée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps, etc.). Elle est généralement caractérisée par des chaînes lourdes, et des chaînes légères. Les anticorps monoclonaux sont hautement spécifiques et sont dirigés contre un seul antigène. Un "antigène" est une molécule prédéterminée à laquelle un anticorps peut se lier sélectivement au niveau d'une région que l'on appelle épitope. Dans le cadre de l'invention, l'épitope cible inclut le cycle β-lactame d'un antibiotique. Par « reconnaissant spécifiquement », on entend ici que l'anticorps monoclonal de l'invention présente une affinité très forte envers l'antibiotique intact cible et une affinité très faible envers l'antibiotique qui a été hydrolysé, par exemple par une β-lactamase. De préférence, sa constante de dissociation K _d pour l'antibiotique cible est comprise entre environ 10 nM et environ 1 pM. De manière plus préférée, ledit K _d est compris entre environ 10 pM et environ 40 pM. L'expression « K _d » se réfère à la constante de dissociation d'un complexe anticorps-antigène donné. K _d = k _off / k _on avec k _off consistant en la constante « off rate » pour la dissociation de l'anticorps du complexe anticorps- antigène et kon étant le niveau auquel l'anticorps s'associe à l'antigène (Chen Y. et al., 1999, J.Mol.Biol., 293:865-881). Il est également possible de mesurer l'affinité de l'anticorps de l'invention envers sa cible en mesurant sa constante d'affinité, K _a , qui correspond à l'inverse de K _d . De préférence, la constante d'affinité K _a de l'anticorps de l'invention pour l'antibiotique cible (ayant un cycle β-lactame intact) est supérieure à environ 10 ⁹ M ^-1 , plus préférentiellement supérieure à 1011 M ^-1 et de manière encore plus préférée, supérieure à 10 ¹² M ^-1 . Les anticorps ayant une faible affinité pour une cible se lient généralement lentement à cette cible et ont tendance à s'en dissocier facilement, tandis que les anticorps de haute affinité pour une cible lient généralement la cible rapidement, et ont tendance à rester liés avec elle plus longtemps. Une variété de méthodes de mesure de l'affinité de liaison sont connues dans l'art (par exemple par une dialyse à l'équilibre, ou par fluoresence, ou encore avec des analyses Biacore), dont l'une quelconque peut être utilisée aux fins de la présente invention. Il est également possible d'utiliser, par exemple, les tests présentés sur les figures 2 et 9. La présente invention vise également les fragments d'anticorps monoclonaux qui sont fonctionnels (i.e., qui reconnaissent spécifiquement une molécule antibiotique dont le cycle β-lactame est intact, mais pas lorsqu'il est hydrolysé). Ce fragment peut être, par exemple, choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab') ₂ , Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies. L'anticorps monoclonal de l'invention peut être produit et isolé par des moyens classiques en utilisant toute technique connue permettant la production de molécules d'anticorps par des lignées cellulaires en culture. Les techniques de production d'anticorps monoclonaux comprennent, sans s'y limiter, la technique des hybridomes, la technique d'hybridome par cellules B humaines et la technique EBV-hybridome. Les exemples de la demande décrivent comment obtenir des anticorps selon l'invention reconnaissant spécifiquement, comme antibiotique cible, le céfotaxime ou le méropénème. D'autres antibiotiques cibles peuvent être utilisés. Au sens de l'invention, le terme « antibiotique cible » désigne tout antibiotique connu pour contenir, dans sa formule chimique, un cycle β-lactame. Autrement appelé «antibiotique β-lactamine » ou « antibiotique β-lactame », il peut être choisi parmi les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, et les carbapénèmes, qui contiennent tous un noyau β-lactame dans leur structure moléculaire. L'antibiotique cible peut notamment être une pénicilline choisie parmi la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la méticilline, la dicloxacilline, la fucloxacilline, l'amoxyicilline, l'ampicilline, la pipéracilline, la ticarcilline, l'azlocilline, et la carbénicilline. L'antibiotique cible peut notamment être une céphalosporine choisie parmi la céphalexine, la céphalotine, la céphazoline, le céfaclor, la céfuroxime, la céfamandole, le céfotétan, la céfoxitine, la ceftriaxone, la céfixine, le céfotaxime, la ceftazidime, le céfépime, la cefpirome, la ceftaroline, et le ceftobiprole. L'antibiotique cible peut notamment être une carbapénème choisi parmi la thiénamycine, l'imipénème, le méropénème, l'ertapénème, biapénème, tébipénème et le doripénème. Ces antibiotiques de nouvelle génération ne sont pas hydrolysés par toutes les BLSE, mais uniquement par certaines enzymes BLSE appelées « carbapénémases ». Il peut être avantageux d'immuniser des animaux avec ce type de molécule, afin de générer des anticorps discriminant leur forme intacte de leur forme hydrolysée, et pouvoir détecter la présence d'enzymes carbapénémases dans un échantillon. L'antibiotique cible peut notamment être un monobactame tel que l'aztréonam. L'antibiotique cible peut notamment être une céphamycine choisie parmi le cefmétazole, et le latamoxef. Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps discriminant de l'invention est caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement une molécule antibiotique choisie parmi les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes, et les céphamycines, dont le cycle β-lactame est intact. Dans un mode de réalisation plus préféré, l'anticorps de l'invention est caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement une molécule antibiotique choisie dans le groupe constitué par : la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la méticilline, la dicloxacilline, la fucloxacilline, l'amoxyicilline, l'ampicilline, la pipéracilline, la ticarcilline, l'azlocilline, la carbénicilline, la céphalexine, la céphalotine, la céphazoline, le céfaclor, la céfuroxime, la céfamandole, le céfotétan, la céfoxitine, la ceftriaxone, la céfixine, le céfotaxime, la ceftazidime, la céfépime, la cefpirome, la ceftaroline, le ceftobirpole, la thiénamycine, l'imipénème, le méropénème, l'ertapénème, le biapenem, le tebipenem, le doripénème, l'aztréonam, le cefmétazole, et le latamoxef, dont le cycle β-lactame est intact. Dans un autre mode de réalisation plus préféré, l'anticorps de l'invention est caractérisé en ce qu'il reconnait spécifiquement une molécule antibiotique choisie dans le groupe constitué par la thiénamycine, l'imipénème, le méropénème, l'ertapénème, et le doripénème. A l'inverse, ledit anticorps ne reconnait pas (ou à une faible affinité pour) ces molécules antibiotiques lorsque le cycle β-lactame a été hydrolysé, par exemple par l'effet d'une enzyme β-lactamase. Le terme « β-lactamase » désigne, dans le cadre de l'invention, les enzymes suivantes : les pénicillinases (ex : TEM-1, SHV-1...), les céphalosporinases (ex : AmpC), les β- lactamases à spectre élargi (ex : dérivés de TEM, SHV, CTX-M…), ainsi que les carbapénémases. Par « enzyme β-lactamase à spectre élargi » ou « BLSE », on entend ici une enzyme ayant un spectre de penicillinase ayant élargi son spectre vis à vis des céphalosporines de 3eme génération, et restant inhibée par l'acide clavulanique. Les « β-lactamases à spectre élargi » (ou « BLSE ») sont une grande famille très hétérogène d'enzymes bactériennes découverte dans les années 80 en France, puis en Allemagne. Elles sont induites soit par des plasmides (fréquent), soit par la mutation du génome naturel chez Klebsiella spp, codant pour une β-lactamase SHV. Les deux mécanismes confèrent aux bactéries touchées la capacité d'hydrolyser une grande variété de pénicillines et de céphalosporines. La majorité des BLSE sont le résultat de mutations génétiques de β-lactamases naturelles, en particulier de TEM-1, TEM-2 et SHV-1. Elles sont très actives contre les pénicillines et moyennement actives contre les céphalosporines de première génération. Les mutations génétiques à l'origine des BLSE élargissent le spectre de ces enzymes et touchent également les céphalosporines de troisième génération (ceftazidime et céfotaxime) et les monobactames (aztréonam). Les exemples ci-dessous expliquent comment identifier l'existence d'anticorps selon l'invention, en utilisant une molécule antibiotique (ici le céfotaxime ou le méropénème) intacte ou hydrolysée au moyen d'une enzyme hydrolysant l'antibiotique concerné (ici l'enzyme CTXM-2 ou la carbapénémase de Klebsiella pneumoniae). L'affinité de l'anticorps de l'invention envers la forme hydrolysée des antibiotiques est très faible. Elle est par exemple telle que soit sa constante de dissociation K _d est très supérieure à celle pour l'antibiotique intact (par exemple 100 fois supérieure à) ou soit que sa constante d'affinité K _a est très inférieure à celle pour l'antibiotique intact (par exemple 100 fois inférieure). Les exemples de la demande démontrent comment obtenir des anticorps reconnaissant spécifiquement l'antibiotique cible céfotaxime ou méropénème intact. Ces anticorps ne reconnaissent pas le céfotaxime / méropénème lorsque celui-ci a été hydrolysé avec une enzyme β-lactamase. Les tests présentés à la figure 2 et à la figure 9 permettent de sélectionner les anticorps appropriés qui peuvent servir pour détecter les bactéries BLSE dans le cadre des méthodes de l'invention. Dans certains modes de réalisation présentés ci-dessous, il peut être avantageux de disposer de l'anticorps de l'invention sous forme détectable. C'est pourquoi l'anticorps de l'invention est de préférence marqué de manière détectable, par exemple en ce qu'il est couplé à un fluorochrome, un ion radioactif, un agent de contraste, un ion métallique, à un chromophore, une enzyme ou tout autre marqueur visible à l'œil nu ou détectable par imagerie. Utilisation de l’anticorps de l’invention pour détecter une β-lactamase hydrolysant une C3G L'invention porte également sur l'utilisation d'un anticorps discriminant selon l'invention (tel que décrit ci-dessus) dans des tests pour détecter rapidement et de manière très fiable, dans un échantillon quelconque, l'activité enzymatique d'une enzyme β-lactamase et donc la présence de bactéries ayant une activité β-lactamase (autrement appelées « bactéries résistantes aux antibiotiques β-lactame »). Plus précisément, l'anticorps de l'invention peut être utilisé pour détecter de manière rapide et fiable la présence de bactéries ayant une activité β-lactamase à spectre élargi (BLSE) dans un échantillon. L'utilisation d'un anticorps pour détecter la présence de telles bactéries n'a jamais été proposée dans l'art. Dans un second aspect, la présente invention couvre donc l'utilisation de l'anticorps discriminant de l'invention, tel que décrit ci-dessus, pour détecter la présence d'une enzyme β-lactamase fonctionnelle, de préférence à spectre élargi, dans un échantillon. Dans le contexte de l'invention, le terme « échantillon » signifie toute fraction biologique, ou environnementale, solide ou liquide, susceptible de contenir une enzyme β-lactamase telle que décrite ci-dessus, ou des bactéries exprimant une telle enzyme, ladite enzyme étant susceptible d'être fonctionnelle. Il peut s'agir, par exemple, d'un échantillon environnemental, ou encore d'un fluide biologique humain, animal ou végétal. De préférence, l'échantillon utilisé dans les procédés de l'invention contient des bactéries. Tel qu'utilisé ici, le terme «fluide biologique» se réfère à tout échantillon qui a été obtenu à partir d'un individu humain, animal, ou végétal et qui est fluide ou visqueux. Il peut s'agir par exemple d'un liquide biologique produit par un humain ou un animal, tel que l'urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide pleural, le liquide synovial, le liquide péritonéal, le liquide amniotique, le liquide gastrique, le sang, le sérum, le plasma, le liquide lymphatique, le liquide interstitiel, la salive, les sécrétions physiologiques, les larmes, le mucus, la sueur, le lait, le sperme, le liquide séminal, les sécrétions vaginales, un liquide des ulcères et autres éruptions de surface, cloques, fèces ou abcès. Il peut s'agir alternativement d'un fluide généré par (ou qui a été au contact d') un végétal tel que la sève, l'eau de ruissellement, la rosée. Dans un mode de réalisation préféré, ledit échantillon, quel qu'il soit, contient des bactéries. L'anticorps de l'invention peut être utilisé dans tout test immunologique permettant de détecter de manière univoque la diminution de la quantité d'antibiotique intact lorsqu'il est mis au contact de l'échantillon. Cette diminution étant due à l'action des enzymes β- lactamases présentes dans l'échantillon, l'anticorps de l'invention pourra ainsi révéler leur présence. L'anticorps de l'invention est de préférence utilisé dans un test biologique par compétition, i.e., dans un test dans lequel la présence d'une β-lactamase sera mise en évidence par l'apparition (et non la diminution) d'un signal détectable. Dans un tel test par compétition, l'anticorps de l'invention sera soit marqué, soit immobilisé, et sera mis en contact avec l'antibiotique à cycle intact qu'il reconnait spécifiquement, qui sera lui- même soit marqué, soit immobilisé. Dans un mode de réalisation préféré, ledit test implique un anticorps de l'invention marqué (mais mobile), et un antibiotique intact immobilisé. Dans un autre mode de réalisation préféré, ledit test implique l'anticorps de l'invention immobilisé, et l'antibiotique intact non-marqué et marqué (mais mobile). Dans un autre mode de réalisation préféré, ledit test est entièrement réalisé en phase liquide, et implique d'utiliser des anticorps de l'invention et des antibiotiques associés qui auront été marqués au moyen de marqueurs différents détectables. Si des fluorophores différents sont utilisés, il sera possible de mesurer la co-localisation des anticorps / antibiotiques par la technique du FRET. Il est par exemple possible de détecter la présence d'activité β-lactamase en comparant le signal obtenu dans les conditions suivantes : - Lorsque l'échantillon est incubé en présence de l'antibiotique intact avant d'être mis en contact des anticorps de l'invention immobilisés dans des puits ou sur un support, en présence d'un antibiotique intact marqué (à la biotine ou à un autre marqueur). - Lorsque l'anticorps de l'invention est mis en contact avec l'antibiotique intact sans avoir été mis en contact avec l'échantillon ou en ayant été mis en contact avec un échantillon ne contenant pas d'enzyme hydrolysant l'antibiotique, avant d'être mis en contact avec l'antibiotique intact marqué (le signal est alors minimal). - Alternativement, l'anticorps de l'invention est mis en contact avec l'antibiotique intact après son incubation avec une β-lactamase purifiée, avant d'être mis en contact avec l'antibiotique intact marqué (le signal est alors maximal). Bien entendu, pour réaliser de telles expériences, il est nécessaire que l'antibiotique utilisé (sous forme intacte) soit reconnu spécifiquement par les anticorps de l'invention. Il peut être utile, dans certains modes de réalisation préférés, d'utiliser également des anticorps qui permettent de détecter certaines enzymes CTX-M ou carbapénémases, de sorte à caractériser quel type d'enzyme est responsable de l'activité BLSE détectée grâce aux anticorps et aux méthodes décrits dans la présente invention. Cette détection de l'activité et identification de l'enzyme impliquée pourront être réalisées simultanément lors d'un même test. Procédés et kits de l’invention Dans un aspect particulier, l'invention vise des procédés permettant de détecter des bactéries produisant des enzymes β-lactamases fonctionnelles, utilisant des anticorps selon l'invention et les antibiotiques qu'ils reconnaissent spécifiquement. Lorsqu'on l'on dispose d'un antibiotique possédant un cycle β-lactame, tel que décrit ci- dessus, sous forme intacte, et éventuellement marqué, et d'un anticorps, éventuellement marqué, permettant de le détecter spécifiquement (car produit comme décrit ci-dessus en utilisant ledit antibiotique comme agent immunogène), ledit procédé peut avantageusement comprendre les étapes suivantes, dans cet ordre : a) Mettre en contact l'échantillon à tester avec ledit antibiotique intact, b) Ajouter ledit anticorps à l'échantillon, c) Détecter si lesdits anticorps sont complexés à l'antibiotique intact. On peut alors ensuite comparer le signal obtenu avec celui qui est généré lorsque l'anticorps et l'antibiotique intact n'ont pas été mis en contact avec l'échantillon (ou lorsqu'ils ont été mis en contact avec un échantillon ne contenant pas d'enzyme hydrolysant l'antibiotique), ou lorsque l'antibiotique intact a été hydrolysé par une β- lactamase avant d'être mis en contact avec l'anticorps. Il est plus précisément possible de détecter la présence d'activité β-lactamase en comparant le signal obtenu en utilisant un anticorps immobilisé, un antibiotique intact et un antibiotique marqué, dans les conditions suivantes : - Lorsque l'échantillon contenant l'enzyme hydrolysant l'antibiotique, est incubé en présence de l'antibiotique intact avant d'être mis en contact des anticorps de l'invention immobilisés (dans des puits ou sur un support), au préalable de l'ajout de l'antibiotique marqué (le signal est alors maximal). - Lorsque l'antibiotique intact est mis en contact avec des anticorps de l'invention sans avoir été mis en contact avec l'échantillon ou est mis en contact avec un échantillon ne contenant pas d'enzyme hydrolysant l'antibiotique, au préalable de l'ajout de l'antibiotique marqué (le signal est minimal). Ces procédés ont été conçus afin que le signal détecté à l'étape d) soit proportionnel à la quantité d'enzymes β-lactamases présente dans l'échantillon. Plus l'enzyme est concentrée dans l'échantillon testé, plus l'hydrolyse de l'antibiotique intact sera rapide, plus l'anticorps ajouté dans l'échantillon restera libre de se complexer à l'antibiotique intact qui sera mis en contact ultérieurement. En détectant ultérieurement la fixation de l'antibiotique intact sur l'anticorps de l'invention, l'intensité du signal sera d'autant plus intense que la concentration d'enzyme initialement présente dans l'échantillon est élevée. Ces procédés sont très avantageux, puisqu'il est bien plus facile et plus fiable de détecter l'apparition d'un signal que sa diminution. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention vise un procédé permettant de détecter la présence de bactéries produisant une enzyme β-lactamase fonctionnelle, de préférence à spectre élargi, ledit procédé utilisant au moins un anticorps tel que défini dans l'invention et la molécule antibiotique contenant un cycle β-lactame intact reconnue spécifiquement par ledit anticorps. Plus spécifiquement, ledit procédé utilise i) un antibiotique possédant un cycle β-lactame intact, tel que décrit ci-dessus, sous une forme marquée et/ou sous une forme non marquée, et ii) au moins un anticorps permettant de détecter spécifiquement cet antibiotique intact, produit comme décrit ci-dessus en utilisant ledit antibiotique ou un analogue intact comme agent immunogène, ledit anticorps étant immobilisé sur un support solide ou aisément détectable. Le procédé peut également utiliser, en plus de l'anticorps spécifique de la forme intacte, des anticorps de capture connus pour reconnaitre les enzymes hydrolytiques exprimées par bactéries. Cette étape permet, si les bactéries de l'échantillon possèdent une activité BLSE, de déterminer quelle est l'enzyme responsable de cette activité et de classer les bactéries en fonction de ce paramètre (ou de détecter une activité due à un type d'enzyme non connu). Il est notamment possible, pour compléter l'information selon laquelle l'échantillon étudié contient des bactéries BLSE, d'utiliser des anticorps anti-CTX-M ou anti-carbapénémases connus dans l'art (par exemple ceux décrits dans Bernabeu et al., 2020; Boutal et al., 2018). La présente invention vise également un kit permettant de mettre en œuvre de tels procédés. Ce kit contient a minima l'anticorps de l'invention et potentiellement l'antibiotique qui a été utilisé pour le produire. Il contient en outre, éventuellement, des moyens pour marquer l'antibiotique et/ou l'anticorps de manière à pouvoir le(s) détecter. Dans un kit particulier, l'anticorps et/ou l'antibiotique est (sont) immobilisé(s) sur un support solide (par exemple une bandelette), ou déjà marqué(s). Un procédé selon l'invention comprend par exemples les étapes suivantes, dans cet ordre : a) Mettre en contact l'échantillon à tester avec ledit antibiotique contenant un cycle β- lactame intact, non marqué, b) Mettre l'échantillon en contact avec ledit anticorps qui a été immobilisé sur un support solide (ou qui est détectable), c) Mettre l'antibiotique contenant un cycle β-lactame intact, marqué, en contact avec ledit anticorps, ou avec l'échantillon de l'étape b), contenant ledit anticorps, d) Détecter si ledit anticorps est complexé à l'antibiotique intact marqué mis en contact à l'étape c). Si la β-lactamase n'est pas présente dans l'échantillon, l'antibiotique (non marqué) ajouté dans l'échantillon (étape a) restera sous forme intacte, les anticorps de l'invention se lieront à cet antibiotique intact et ne pourront pas fixer l'antibiotique intact marqué l'étape c). A contrario, si l'enzyme est présente dans l'échantillon, l'antibiotique (non marqué) sera hydrolysé dans l'étape a), et l'anticorps de l'invention restera libre de se fixer sur l'antibiotique intact marqué l'étape c). Le signal détecté à l'étape d), lorsque l'antibiotique marqué se fixe sur l'anticorps de l'invention, est ainsi proportionnel à la présence d'enzyme dans l'échantillon (le signal augmente plus il y a d'enzyme dans l'échantillon, puisque la compétition imposée est au détriment de l'antibiotique marqué, qui est ajouté après l'antibiotique non marqué). On peut avantageusement comparer le signal obtenu en présence de l'échantillon avec celui qui est généré lorsque l'anticorps et l'antibiotique intact n'ont pas été mis en contact avec l'échantillon (ou avec un échantillon ne contenant pas d'enzyme hydrolysant l'antibiotique), ou lorsque l'antibiotique intact a été hydrolysé avec une β-lactamase avant d'être mis en contact avec l'anticorps (contrôles négatif et positif). Il est également possible, au lieu d'utiliser des antibiotiques marqués et non marqués, d'utiliser des antibiotiques marqués de manière différente, et que l'on peut distinguer l'un de l'autre. Si l'anticorps est immobilisé, on pourra observer l'apparition du signal là où l'anticorps est immobilisé. Si l'anticorps est marqué de manière détectable, on pourra observer la colocalisation des deux marquages anticorps / antibiotique, par exemple par transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET). Dans le cas où l'utilisateur souhaite identifier quelles sont les enzymes β-lactamases ou BLSE exprimées par les bactéries et qui se révèlent actives grâce aux tests de l'invention, il peut également mettre en contact l'échantillon contenant les bactéries avec des anticorps connus reconnaissant spécifiquement ces enzymes (par exemple anti-CTX-Ms ou Carbapénémases), ces anticorps ayant été marqués et/ou ayant été immobilisés, pour une meilleure détection ultérieure. La présente invention vise également un kit permettant de mettre en œuvre de tels procédés. Ce kit contient a minima l'anticorps de l'invention et éventuellement l'antibiotique qui a été utilisé pour le produire. Il contient en outre, éventuellement, des moyens pour marquer l'antibiotique de manière à pouvoir le détecter et/ou des anticorps connus pour reconnaitre des enzymes β-lactamase. Dans un kit particulier, l'anticorps est fourni déjà immobilisé sur un support solide (par exemple une bandelette), ou déjà marqué. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention vise un procédé permettant de détecter des bactéries produisant des β-lactamases fonctionnelles, ledit procédé utilisant au moins i) un antibiotique possédant un cycle β-lactame, tel que décrit ci- dessus, sous forme intacte, et ii) un anticorps permettant de détecter spécifiquement cet antibiotique intact, produit comme décrit ci-dessus en utilisant ledit antibiotique comme agent immunogène, ledit anticorps étant marqué de sorte à être détectable. Un procédé selon l'invention comprend par exemple les étapes suivantes, dans cet ordre : a) Mettre l'échantillon à tester en contact avec de l'antibiotique contenant un cycle β- lactame intact, b) Mettre en contact l'échantillon après l'étape a) avec l'anticorps, qui a été marqué, c) Mettre en contact l'anticorps obtenu après l'étape b) avec l'antibiotique contenant un cycle β-lactame intact, qui a été immobilisé sur un support solide, ou ajouter de l'antibiotique intact marqué de manière distincte de l'anticorps, d) Détecter si ledit anticorps marqué est complexé à l'antibiotique intact mis en contact à l'étape c). Si la β-lactamase n'est pas présente dans l'échantillon, l'antibiotique (non marqué ajouté à l'étape a) ajouté dans l'échantillon restera sous forme intacte, les anticorps de l'invention se lieront à cet antibiotique intact et ne pourront pas fixer l'antibiotique intact immobilisé à l'étape c). A contrario, si l'enzyme est présente dans l'échantillon, l'antibiotique (non marqué) ajouté à l'étape a) sera hydrolysé, et l'anticorps marqué de l'invention à l'étape b) restera libre de se fixer sur l'antibiotique intact immobilisé ou marqué, lors de l'étape c). Le signal détecté à l'étape d) lorsque l'antibiotique immobilisé se fixe sur l'anticorps marqué de l'invention est ainsi proportionnel à la présence d'enzyme dans l'échantillon (le signal augmente plus il y a d'enzyme dans l'échantillon, puisque la compétition imposée est au détriment de l'antibiotique immobilisé). Comme précédemment, on peut avantageusement comparer le signal obtenu en présence de l'échantillon avec celui qui est généré lorsque l'anticorps et l'antibiotique intact n'ont pas été mis en contact avec l'échantillon (ou avec un échantillon ne contenant pas d'enzyme hydrolysant l'antibiotique), ou lorsque l'antibiotique intact a été hydrolysé avec une enzyme β -lactamase avant d'être mis en contact avec l'anticorps (contrôles négatif et positif). Si l'antibiotique est immobilisé, on pourra observer l'apparition du signal là où l'antibiotique est immobilisé. Si l'antibiotique est marqué, on pourra observer la colocalisation avec l'anticorps de l'invention, par exemple par exemple par transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET). Comme mentionné plus haut, dans le cas où l'utilisateur souhaite identifier quelles sont les enzymes β-lactamases ou BLSE, il peut également mettre en contact l'échantillon contenant les bactéries avec des anticorps connus reconnaissant spécifiquement ces enzymes (par exemple anti-CTX-Ms ou carbapénémases), ces anticorps ayant été marqués et/ou ayant été immobilisés, pour une meilleure détection ultérieure. Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend par exemple les étapes suivantes : a) Mettre l'échantillon à tester en contact avec la molécule antibiotique contenant un cycle β-lactame intact, non marquée, b) Mettre en contact l'échantillon obtenu après l'étape a) avec l'anticorps de l'invention (qui reconnait spécifiquement la forme intacte de l'antibiotique ajouté à l'étape a) et avec au moins un anticorps reconnaissant spécifiquement une enzyme β-lactamase (par exemple CTX-M ou carbapénémase), lesdits anticorps ayant été marqués au préalable, c) Mettre en contact la solution de l'étape b) avec ladite molécule antibiotique contenant un cycle β-lactame intact et avec des anticorps reconnaissant spécifiquement une enzyme β-lactamase (par exemple CTX-M ou carbapénémase), qui ont été immobilisés sur un support solide, d) Détecter si lesdits anticorps marqués sont complexés à l'antibiotique intact et/ou aux anticorps anti-β-lactamase complexés avec l'enzyme β-lactamase, mis en contact à l'étape c). La présente invention vise également un kit permettant de mettre en œuvre de tels procédés. Ce kit contient a minima l'anticorps de l'invention et éventuellement l'antibiotique qui a été utilisé pour le produire. Il contient en outre, éventuellement, des moyens pour marquer l'anticorps de manière à pouvoir le détecter et/ou des anticorps connus pour reconnaitre des enzymes β-lactamase. Dans un kit particulier, l'antibiotique est fourni sous forme libre (pour l'étape a)) et également sous forme immobilisée sur un support solide (par exemple une bandelette), ou déjà marqué. D'autres tests, plus ou moins complexes, peuvent être mis au point en utilisant l'anticorps discriminant de l'invention, ainsi que l'antibiotique utilisé pour l'obtenir. Tous les kits de l'invention peuvent également contenir une enzyme β-lactamase qui pourra servir à vérifier la spécificité de l'anticorps de l'invention. Tous les kits de l'invention peuvent également contenir un échantillon témoin ne contenant pas de β-lactamase. Tous les kits de l'invention peuvent également contenir les moyens de détection de l'anticorps marqué de l'invention (par exemple, des anticorps reconnaissant la partie constante d'une immunoglobuline de souris). Tous les kits de l'invention peuvent enfin contenir des instructions permettant d'expliquer aux utilisateurs les détails des expérimentations à réaliser pour détecter des bactéries produisant des β-lactamases fonctionnelles de manière rapide et efficace. Bandelette de l’invention Dans un mode de réalisation particulier, le test immunologique de l'invention est un test immunochromatographique ayant pour support une « bandelette » de détection. Dans ce cas, le test de l'invention est appelé « test bandelette » et le support solide utilisé dans le procédé de l'invention est une bandelette. Cette bandelette constitue un aspect particulièrement important de la présente invention. En effet, les présents inventeurs ont démontré que l'anticorps de l'invention peut avantageusement être utilisé dans un test bandelette. L'anticorps de l'invention est alors de préférence couplé à un fluorochrome ou à un chromophore, ou à tout autre marqueur visible à l'œil nu, par exemple de l'or colloïdal. Le « test bandelette » est un système de détection simple, rapide, peu coûteux, qui peut être utilisé par des non spécialistes sur le terrain. Les bandelettes sont en général formées de trois zones distinctes, qui sont fixées sur un support, le plus souvent plastique : 1) une zone d'absorption favorisant la migration, 2) une zone de réaction (formée généralement d'une membrane de nitrocellulose) et 3) une zone de dépôt où l'échantillon à tester est déposé, située à l'extrémité opposée de la zone d'absorption (cf. figure 5). Sur cette dernière, un anticorps dit « traceur », car il est dirigé contre la cible à détecter et qu'il est lié à des molécules permettant d'obtenir un signal, en général colorimétrique ou fluorescent, est déposé et séché. Dans le cadre de la présente invention, ledit anticorps « traceur » sera l'anticorps discriminant de l'invention, décrit ci-dessus. Dans la zone de réaction, deux lignes sont généralement présentes. La première de ces lignes, dite ligne « test » (LT) , sera ici composée d'antibiotiques à cycle β-lactame. Le signal obtenu au niveau de cette ligne test indiquera la présence ou non de β-lactamase dans l'échantillon. Une deuxième ligne, dite ligne « contrôle » (LC), sera constituée d'anticorps dirigés contre l'anticorps de l'invention. Il peut être avantageux d'immobiliser également sur la bandelette de l'invention des anticorps reconnaissant des enzymes β-lactamases, comme proposé sur la figure 10. De préférence, ces anticorps sont marqués et déposés sur la zone de dépôt et sont également immobilisés sur une ou plusieurs lignes test distinguables de celle contenant l'antibiotique immobilisé. Dans ce cas, la bandelette selon l'invention peut contenir plusieurs lignes tests et une ligne contrôle. Une ligne test correspondra à une zone où l'antibiotique intact couplé à la BSA ou une autre structure porteuse (par exemple la caséine, le dextran ou la polylysine), a été immobilisé, et les autres lignes test correspondront à des zones où des anticorps anti- β-lactamase ont été immobilisés. Dans ce cas, la zone de dépôt contiendra avantageusement les anticorps de l'invention ainsi que les anticorps anti-β-lactamase, tous marqués de manière détectable (les marqueurs utilisés étant distincts ou identiques). Dans ce mode de réalisation particulier, il est préférable de déposer sur la zone de dépôt des anticorps anti-β-lactamase reconnaissant des épitopes de l'enzyme cible différents de ceux reconnus par les anticorps anti-β-lactamase immobilisés sur la ligne test dédiée (les deux populations d'anticorps reconnaissant cependant la même enzyme β-lactamase). Ainsi, la détection de la présence de l'enzyme cible sera bien plus fiable. Si les bactéries de l'échantillon expriment une enzyme β-lactamase reconnue par les anticorps marqués présents sur la zone de dépôt, ceux-ci vont se fixer à l'enzyme β- lactamase, et l'enzyme va également pouvoir se fixer sur les anticorps anti-β-lactamase immobilisés sur la zone de test. Un marquage sera donc visible sur la ligne test correspondant à ces anticorps, et il sera possible de déduire si les bactéries portant l'activité BLSE expriment l'enzyme reconnue par l'anticorps immobilisé sur cette ligne. La zone de réaction peut également contenir plusieurs lignes tests sur lesquelles sont immobilisés différents antibiotiques. Dans ce cas, plusieurs anticorps monoclonaux traceurs spécifiques d'un de ces antibiotiques devront avantageusement être présents sur la zone de dépôt. Par exemple, la zone de réaction peut contenir une ligne test sur laquelle est fixé un antibiotique A à cycle β-lactame intact, et une ligne test sur laquelle est fixé un antibiotique B à cycle β-lactame intact, B étant différent de A. Sur la zone de dépôt, des anticorps monoclonaux discriminant les antibiotiques A et B intacts des antibiotiques A et B hydrolysés ont été avantageusement déposés, de sorte que le signal devrait apparaître sur deux lignes s'il y a dans l'échantillon testé des β-lactamases. Il est également avantageux de disposer dans ce contexte d'anticorps discriminant les formes intactes et hydrolysées des carbapénèmes, ces antibiotiques de nouvelle génération qui sont connus pour être résistants aux enzymes BLSE autres que carbapénémases. L'exemple 2 ci-dessous décrit justement comment obtenir de tels anticorps, utilisables dans les procédés et kits de l'invention. Dans ce mode de réalisation particulier, les anticorps discriminant les formes intacte et hydrolysée d'un carbapénème sont déposés sur la zone de dépôt, et un antibiotique carbapénème intact est immobilisé sur une ligne Test. Le test de l'invention permet d'identifier la présence, dans l'échantillon, d'enzymes carbapénémases, et donc potentiellement de bactéries exprimant ces enzymes. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la bandelette de l'invention contient au moins deux lignes tests, sur lesquelles sont immobilisées respectivement la forme intacte d'un antibiotique non carbapénème (par exemple une céphalosporine) et la forme intacte d'un antibiotique carbapénème, de sorte à identifier dans l'échantillon la présence d'enzymes BLSE autres que carbapénémases (par exemple céphalosporinases, etc) et de carbapénémases. Les anticorps discriminants respectifs, marqués (possiblement avec des marqueurs différents), sont quant à eux déposés sur la zone de dépôt. La bandelette de l'invention peut en outre contenir dans sa zone de réaction, comme expliqué plus haut, d'autres lignes tests, sur laquelle des anticorps anti-enzyme β-lactamase ont été immobilisés. Si l'enzyme n'est pas présente dans l'échantillon, l'antibiotique ajouté dans l'échantillon restera sous forme intacte, les anticorps de l'invention se lieront à cet antibiotique intact et ne pourront plus se fixer sur l'antibiotique intact de la LT. A contrario, si l'enzyme est présente dans l'échantillon, l'antibiotique ajouté sera hydrolysé, et l'anticorps de l'invention restera libre de se fixer sur l'antibiotique intact immobilisé sur la LT. Dans ces deux cas, les anticorps libres, i.e., qui n'ont pas été immobilisés sur la ligne test, seront capturés au niveau de la ligne contrôle par l'anticorps anti-anticorps de l'invention. Le test bandelette de l'invention a été conçu afin que le signal au niveau de la ligne test augmente avec la quantité de β-lactamases présente dans l'échantillon. Plus l'enzyme est concentrée dans l'échantillon testé, plus l'hydrolyse de l'antibiotique sera rapide, moins l'anticorps se complexera à l'antibiotique ajouté, et plus il se fixera sur la LT : l'intensité du signal sur la ligne LT augmentera donc avec cette concentration. Par ailleurs, le test bandelette de l'invention est très fiable, en ce qu'il relie l'apparition d'un signal (et non sa disparition) à la quantité d'enzyme. Or il est bien connu qu'il est plus facile et plus fiable de détecter l'apparition d'un signal que sa diminution. Dans ce mode de réalisation préféré, une bandelette selon l'invention peut être préparée de la façon suivante : - l'anticorps de l'invention, de préférence marqué, est déposé, et par exemple séché, sur la zone de dépôt, - Optionnellement, des anticorps anti-β lactamase, de préférence marqués, sont également déposés sur la zone de dépôt. - l'antibiotique à cycle β-lactame intact est immobilisé sur la LT, dans la zone de réaction (par exemple avec un système de BSA-antibiotique, qui permet l'immobilisation de l'antibiotique sur la nitrocellulose tout en lui permettant d'interagir avec l'anticorps marqué), - Optionnellement, des anticorps anti-β lactamase sont également immobilisés sur une autre ligne de la zone de réaction, - des anticorps reconnaissant les anticorps déposés sur la zone de dépôt de la bandelette (anticorps de l'invention et éventuellement anticorps anti-β- lactamase) sont immobilisés, par exemple par adsorption, sur la LC, à l'opposé de la LT. Dans un aspect particulier, la présente invention vise donc une bandelette contenant (cf. figures 5 et 10): 1) une zone pour déposer l'échantillon, sur laquelle l'anticorps tel que défini ci-dessus a été marqué, déposé et séché, ainsi optionnellement que des anticorps anti-β lactamase marqués, 2) une zone de réaction, comprenant : - au moins une ligne test sur laquelle l'antibiotique à cycle β-lactame intact ayant servi à produire au moins un des anticorps déposés dans la zone de dépôt 1) a été immobilisé, et - optionnellement au moins une ligne test sur laquelle des anticorps anti-β lactamase ont été immobilisés, - une ligne contrôle sur laquelle des anticorps reconnaissant le ou les anticorps présent(s) sur la zone 1) ont été immobilisés, et 3) une zone d'absorption favorisant la migration des anticorps, ladite zone étant située à l'extrémité opposée de la zone de dépôt 1). Les anticorps marqués sont déposés et stockés sur la surface de la bandelette de préférence par séchage. Ils peuvent également être ajoutés à l'échantillon juste avant dépôt de celui- ci sur la bandelette. La zone de réaction est de préférence en nitrocellulose ou en PVDF, cellulose, fibre de verre. L'immobilisation de l'antibiotique sur la LT se fait de préférence par adsorption de l'antibiotique couplé à de la BSA ou d'une autre molécule porteuse (par exemple de la caséine, du dextran, de la polylysine), qui permet de laisser accessible le cycle β-lactame qui doit capter les anticorps de l'invention en migration vers la zone d'absorption. Il est possible également d'adsorber de la BSA-streptavidine complexé avec l'antibiotique couplé à de la biotine ou de coupler l'antibiotique à des billes dont le diamètre est supérieur à la porosité des membranes utilisées pour la zone de réaction. D'autres techniques de fixation connues de l'art pour immobiliser des petites molécules peuvent être utilisées. Sur la ligne contrôle, les anticorps reconnaissant les anticorps utilisés sur la bandelette de l'invention sont par exemple des anticorps anti-partie constante d'immunoglobuline murine, de la protéine A, de la protéine G ou tout autre système reconnaissant les anticorps murins. Comme pour les tests par compétition classiques, les quantités d'anticorps et d'antibiotiques immobilisés ou marqués ou en tant que substrat doivent en effet être rigoureusement contrôlées. Une quantité trop importante en anticorps nécessiterait une concentration importante en substrat pour une occupation de l'ensemble des sites de liaison et donc une concentration plus élevée en β-lactamase pour avoir une baisse significative de l'occupation de ces sites. De même, une concentration trop élevée en antibiotiques marqués ou immobilisés induirait une compétition très élevée vis-à-vis de la liaison du substrat par l'anticorps, ce qui induirait l'apparition d'un signal même en absence de β-lactamase ou alors à l'utilisation d'un excès de substrat afin de maintenir l'occupation totale des sites de liaison de l'anticorps par ce même substrat. Cet excès de substrat conduirait à une forte baisse de sensibilité ou à une durée d'incubation plus élevée. Des exemples illustrant ces étapes d'optimisation sont donnés ci-dessous. On observe dans le tableau 5 que la concentration en substrat permettant une disparition totale du signal n'est pas identique en fonction des quantités d'anticorps et d'antibiotiques marqués ou immobilisés, optimisées pour chacun des anticorps. Ainsi, les concentrations en substrat pour l'anticorps 2 permettant l'occupation de l'ensemble des sites de liaison (qui se traduit par la disparition du signal sur la bandelette) sont plus élevées. L'homme du métier, en suivant les indications mentionnées dans la présente invention, comprend qu'il est important d'ajuster ces paramètres en fonction des chromophores, et des analytes utilisés. Il est capable, grâce aux techniques actuelles et aux explications fournies dans les exemples ci-dessous, d'identifier quelles sont les quantités optimales de chaque analyte, pour un anticorps ayant une affinité donnée pour l'antibiotique intact qu'il reconnait. Il comprend notamment que la quantité d'anticorps à déposer sur la zone de dépôt doit être telle qu'elle permet de saturer tous les sites de fixation à l'antibiotique intact utilisé dans le procédé ou sur la bandelette de l'invention. De plus, il comprend que sa quantité minimum est celle qui permet d'obtenir un signal maximal sur la ligne test contenant l'antibiotique. Pour le céfotaxime marqué à l'or colloïdal (exemple 1), la quantité d'anticorps optimale à déposer sur la zone de dépôt est telle que l'on dépose 10µL de la solution ayant une absorbance relative à l'or colloïdal – DO – comprise entre 0,1 et 10. De plus, la quantité d'antibiotique optimale immobilisée sur la ligne LT (1µL/cm) est idéalement comprise entre 1μg et 1mg/mL. Lorsqu'un couplage par BSA-antibiotique est utilisé, une concentration d'environ 0,1mg/mL donne par exemple d'excellents résultats. De manière générale, pour d'autres anticorps possédant une affinité forte pour l'antibiotique intact qu'ils reconnaissent spécifiquement (K _d compris entre 1 pM et environ 10 nM), il est avantageux d'immobiliser sur la ligne LT de la bandelette une quantité d'antibiotique intact en déposant 1µL de solution par cm ayant des concentrations comprises entre 10μg et 1mg/mL, entre 50μg et 1mg/mL, entre 100μg et 1mg/mL, ou entre 50μg et 0.5mg/mL et de déposer sur la zone de dépôt une quantité d'anticorps en utilisant 10µL de solution ayant une DO (s'il est marqué à l'or colloïdal) comprise entre 0,1 et 10. Pour faciliter l'utilisation des bandelettes de l'invention, il est possible d'insérer les bandelettes de l'invention dans des cassettes plastiques. Kits de l’invention, contenant la bandelette de l’invention Avant d'être déposé sur la zone de dépôt, un antibiotique à cycle β-lactame intact doit être ajouté à l'échantillon à tester, au préalable de la mise en contact avec la bandelette de l'invention. Dans un troisième aspect, la présente invention concerne également un kit contenant, outre la bandelette de l'invention, l'antibiotique à cycle β-lactame intact qui a été utilisé pour obtenir l'anticorps de l'invention, et qui est immobilisé sur la zone de dépôt 1) de la bandelette. Cet antibiotique est de préférence contenu dans un contenant à part, isolé de la bandelette. Par exemple, si l'anticorps de l'invention a été produit en immunisant les animaux avec l'antibiotique céfotaxime (cf. exemple 1 ci-dessous), alors le kit de l'invention contiendra une bandelette sur laquelle ledit anticorps anti-céfotaxime intact est déposé et ledit antibiotique intact est immobilisé, ainsi qu'une fiole ou un tube contenant de l'antibiotique céfotaxime intact. Par exemple, si l'anticorps de l'invention a été produit en immunisant les animaux avec l'analogue carbapénème (cf. exemple 2 ci-dessous), alors le kit de l'invention contiendra une bandelette sur laquelle ledit anticorps anti-carbapénème intact est déposé et ledit antibiotique intact est immobilisé, ainsi qu'une fiole ou un tube contenant de l'antibiotique carbapénème intact. L'utilisateur aura ainsi tous les éléments pour réaliser le test de l'invention : il pourra ajouter extemporanément à l'échantillon à tester le réactif (l'antibiotique) qui permettra de mettre en œuvre le test de l'invention (cf. ci-dessous). Pour contrôler que le test bandelette est bien spécifique, le kit de l'invention peut également contenir un récipient comprenant une β-lactamase fonctionnelle. L'utilisateur pourra ainsi par exemple comparer la différence de signal obtenu dans l'échantillon à tester (i.e., lorsque la β-lactamase endogène est éventuellement présente), ou lorsqu'une enzyme exogène est ajoutée. Cette étape permet de contrôler que le test est bien fonctionnel. Comme indiqué ci-dessus, ce kit peut également contenir un échantillon témoin ne contenant pas de β -lactamase, les moyens de détection de l'anticorps marqué de l'invention (par exemple, des anticorps reconnaissant la partie constante d'une immunoglobuline de souris) et/ou des instructions permettant d'expliquer aux utilisateurs les détails des expérimentations à réaliser pour détecter des bactéries produisant des β- lactamases fonctionnelles de manière rapide et efficace. Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un kit contenant : - au moins une bandelette selon l'invention, et - un récipient séparé contenant l'antibiotique à cycle β-lactame intact ayant servi à obtenir l'anticorps immobilisé sur la zone de dépôt 1) de la bandelette, - optionnellement, un récipient séparé contenant de l'enzyme β-lactamase et/ou un échantillon ne contenant pas d'enzyme β-lactamase. Procédé de l’invention utilisant la bandelette de l’invention Dans un dernier aspect, la présente invention concerne un procédé permettant la détection de β-lactamases, dans un échantillon susceptible d'en contenir. Ledit échantillon a été décrit ci-dessus. Dans un mode de réalisation préféré, ledit procédé utilise la bandelette ou le kit de l'invention contenant cette bandelette, tels que décrits ci-dessus. Ce procédé met en jeu les étapes suivantes : a) Mise en contact d'un antibiotique à cycle β-lactame intact avec l'échantillon à tester, ledit antibiotique étant reconnu de manière spécifique par l'anticorps de l'invention marqué et déposé sur la bandelette, et étant immobilisé sur la ligne LT de la bandelette. b) Incubation pendant un temps suffisant pour que l'enzyme éventuellement présente dans l'échantillon puisse hydrolyser le cycle β-lactame intact de l'antibiotique, c) Après cette incubation, déposer l'échantillon (par exemple 100μL) sur la zone de dépôt de la bandelette, ou tremper la bandelette dans l'échantillon, et laisser réagir pendant un temps suffisant, d) Lire le résultat sur la ligne test de la bandelette. Pour la détection avec une LT (par exemple LT : antibiotique intact) (figure 5), deux cas se présentent alors, en fonction de ce que l'échantillon à tester contient effectivement comme bactérie ou comme enzyme (figure 6) : Cas 1: L'échantillon à tester contient des bactéries ne produisant pas de β-lactamase. Après un temps d'incubation, l'échantillon (contenant l'antibiotique intact et les bactéries) est déposé sur la zone de dépôt de la bandelette. L'antibiotique n'ayant pas été hydrolysé (car il n'y a pas d'activité β-lactamase dans l'échantillon), un complexe se forme entre celui-ci et l'anticorps de l'invention. Ayant migré jusqu'à la ligne test, l'anticorps ainsi complexé ne pourra pas se fixer sur l'antibiotique qui y est immobilisé. En revanche, l'anticorps sera immobilisé au niveau de la ligne contrôle (LC) par l'anticorps anti-anticorps de l'invention. Ainsi seule la LC sera visible. Le test sera négatif et il pourra en être conclu l'absence de bactéries produisant une β-lactamase dans l'échantillon à tester. Cas 2: L'échantillon à tester contient des bactéries produisant une enzyme β-lactamase. Après un temps d'incubation, l'échantillon ne contient plus d'antibiotique intact puisque l'enzyme β-lactamase l'a hydrolysé. Lorsqu'il est déposé sur la zone de dépôt de la bandelette, aucun complexe ne se forme entre l'antibiotique hydrolysé et l'anticorps de l'invention. L'anticorps de l'invention, dont les sites de liaison sont libres, migre vers la ligne test où il peut se fixer sur l'antibiotique intact immobilisé au niveau de la ligne test. L'anticorps de l'invention en excès est quant à lui immobilisé au niveau de la ligne contrôle (LC) par l'anticorps anti-anticorps. Dans ce cas, les deux lignes (la ligne test et la ligne contrôle) sont visibles. Le test est déclaré positif, concluant à la présence d'une bactérie produisant une β-lactamase (BLSE, ou autre β-lactamase) dans l'échantillon. Pour la détection avec deux LT (par exemple LT1 : antibiotique intact ; LT2 : anti-CTX- M) (figure 10), quatre cas se présentent alors, en fonction de ce que la bactérie présente produit comme β-lactamase (figure 11) : Cas 1: L'échantillon à tester contient des bactéries ne produisant pas de β-lactamase. Après un temps d'incubation, l'échantillon (contenant l'antibiotique intact et les bactéries) est déposé sur la zone de dépôt de la bandelette. L'antibiotique n'ayant pas été hydrolysé (car il n'y a pas d'activité β-lactamase dans l'échantillon), un complexe se forme entre celui-ci et l'anticorps de l'invention. Les anticorps anti-CTX-M marqués ne fixent pas d'enzyme CTX-M. Ayant migré jusqu'à la ligne test 1 (LT1), l'anticorps de l'invention ainsi complexé ne pourra pas se fixer sur l'antibiotique qui y est immobilisé. Les anticorps anti-CTX-M marqués n'étant pas complexés avec l'enzyme ils ne pourront pas être fixés par le deuxième anticorps anti-CTXM sur la ligne test 2 (LT2). En revanche, les anticorps seront immobilisés au niveau de la ligne contrôle (LC) par l'anticorps anti- anticorps. Ainsi, seule la LC sera visible. Le test sera négatif et il pourra en être conclu l'absence de bactéries produisant une β-lactamase dans l'échantillon à tester. Cas 2: L'échantillon à tester contient des bactéries produisant une β-lactamase mais pas une enzyme une CTX-M. Après un temps d'incubation, l'échantillon ne contient plus d'antibiotique intact puisque l'enzyme β-lactamase l'a hydrolysé. Lorsque l'échantillon est déposé sur la zone de dépôt de la bandelette, aucun complexe ne se forme entre l'antibiotique hydrolysé et l'anticorps de l'invention. Les anticorps anti-CTX-M marqués ne fixent pas d'enzyme CTX-M. L'anticorps de l'invention, dont les sites de liaison sont libres, migre vers la ligne test où il peut se fixer sur l'antibiotique intact immobilisé au niveau de la ligne test 1 (LT1). Les anticorps anti-CTX-M marqués n'étant pas complexés avec l'enzyme ils ne pourront pas être fixés par le deuxième anticorps anti-CTXM sur la ligne test 2 (LT2). Les anticorps anti-CTX-M et l'anticorps de l'invention en excès sont quant à eux immobilisés au niveau de la ligne contrôle (LC) par l'anticorps anti-anticorps. Dans ce cas, les lignes test 1 et contrôle sont visibles. Le test est déclaré positif, concluant à la présence d'une bactérie produisant une β-lactamase (BLSE, ou autre β-lactamase), mais qui n'est pas une enzyme CTX-M, capable d'hydrolyser l'antibiotique dans l'échantillon. Cas 3: L'échantillon à tester contient des bactéries produisant une enzyme β-lactamase de type CTX-M. Après un temps d'incubation, l'échantillon ne contient plus d'antibiotique intact puisque l'enzyme β-lactamase l'a hydrolysé. Lorsque l'échantillon est déposé sur la zone de dépôt de la bandelette, aucun complexe ne se forme entre l'antibiotique hydrolysé et l'anticorps de l'invention. Les anticorps anti-CTX-M fixent l'enzyme CTX-M présente. L'anticorps de l'invention, dont les sites de liaison sont libres, migre vers la ligne test où il peut se fixer sur l'antibiotique intact immobilisé au niveau de la ligne test 1 (LT1). Les anticorps anti-CTX-M présents sur la ligne test 2 (LT2) fixent l'enzyme CTX-M complexée avec les anticorps anti-CTXM marqués. Les anticorps anti- CTX-M et l'anticorps de l'invention en excès sont quant à eux immobilisé au niveau de la ligne contrôle (LC) par l'anticorps anti-anticorps. Dans ce cas, les lignes test 1, test 2 et contrôle sont visibles. Le test est déclaré positif, concluant à la présence d'une bactérie produisant une β-lactamase (BLSE, ou autre β-lactamase), de type CTX-M, capable d'hydrolyser l'antibiotique dans l'échantillon. Dans l'étape a) de ce procédé, l'antibiotique sous forme intacte (ou « substrat ») est ajouté à l'échantillon à tester. La quantité d'antibiotique intact peut être adaptée pour que la sensibilité du test soit optimale. Pour que le test de l'invention soit fonctionnel, il est nécessaire que la quantité de substrat ajoutée dans l'échantillon permette l'occupation de tous les sites de liaison des anticorps utilisés, sans être en excès. Ainsi, un signal apparait lorsque la quantité du substrat n'est plus suffisante pour occuper l'ensemble des sites de liaison des anticorps de l'invention. Un excès de substrat ne permettrait pas de détecter les faibles concentrations en enzyme ou nécessiterait des temps d'incubation élevés incompatibles avec un test qui se veut rapide et simple. L'homme du métier, en suivant les indications mentionnées dans la présente invention (et notamment dans les exemples) sera en mesure de déterminer la quantité d'antibiotique intact à ajouter à l'échantillon dans l'étape initiale du procédé, de sorte qu'elle permette l'occupation de tous les sites de liaison des anticorps utilisés, sans être en excès. Lorsqu'un anticorps anti- céfotaxime selon l'invention est utilisé (cf. exemple 1 ci- dessous), il est possible d'ajouter, par exemple, entre 10 ng/mL et 50 ng/mL d'antibiotique céfotaxime dans l'échantillon initial. Plus généralement, pour d'autres anticorps possédant une affinité forte pour l'antibiotique intact qu'ils reconnaissent spécifiquement (KD compris entre 1 pM et environ 10 nM), il sera possible d'ajouter entre 1ng/mL et 1μg/mL, entre 10ng/mL et 1μg/mL, entre 50ng/mL et 1μg/mL, entre 100ng/mL et 1μg/mL ou entre 100ng/mL et 0.5μg/mL d'antibiotique intact dans l'échantillon initial (contenant les bactéries produisant ou non une β-lactamase). L'étape b) d'incubation peut se faire à température ambiante. La durée de cette étape peut être adaptée pour que la sensibilité du test soit optimale. Lorsque le céfotaxime est utilisé (cf. exemple 1 ci-dessous), cette étape d'incubation peut durer entre 10 minutes et une heure. De bons résultats ont été obtenus avec une durée de 30 minutes, dans les conditions testées. De manière générale, pour d'autres anticorps possédant une affinité forte pour l'antibiotique intact qu'ils reconnaissent spécifiquement (KD compris entre 1 pM et environ 10 nM), une durée d'incubation entre 10 minutes et une heure est optimale. Une fois que l'échantillon a été mis en contact avec la zone de dépôt, en début d'étape c), il convient de laisser aux anticorps le temps de migrer jusqu'aux lignes test et contrôle. Cette étape de migration peut durer entre 5 minutes et 30 minutes. Lorsque le céfotaxime est utilisé (cf. exemple 1 ci-dessous), de bons résultats ont été obtenus avec une durée comprise entre 10 et 20 minutes, dans les conditions testées. L'étape d) de lecture du résultat peut donc se faire, dans le cas où le céfotaxime est utilisé, environ 40 minutes après la mise en contact de l'échantillon et de l'antibiotique. De manière générale, pour d'autres anticorps possédant une affinité forte pour l'antibiotique intact qu'ils reconnaissent spécifiquement (KD compris entre 1 pM et environ 10 nM), une lecture du résultat pourra se faire environ 10 minutes à 1 heure (de préférence entre 20 minutes et 40 minutes) après la mise en contact de l'échantillon avec la bandelette. Toutes les étapes de ce procédé peuvent être réalisées à température ambiante. Pour être exploitable, le procédé de l'invention doit pouvoir donner des résultats fiables en un temps minimal, idéalement en moins d'une heure. Les inventeurs ont pu démontrer que, dans les conditions mises en œuvre dans les exemples ci-dessous, le test de l'invention a une spécificité de 100% et une sensibilité de 100%, ce qui est excellent. Il peut être avantageux de préparer l'échantillon à tester avant d'utiliser la bandelette de l'invention, notamment si l'échantillon est solide. Si l'échantillon est solide (par exemple de la terre), il est possible de le diluer en ajoutant un tampon avant de procéder à l'étape de mise en contact avec l'antibiotique. Ce tampon peut contenir par exemple du NaCl, une molécule connue pour diminuer les interactions non spécifiques (PVP, PVA, BSA) et du détergent (Tween 20). Son pH est préférentiellement de 8. La concentration de NaCl est préférentiellement proche de 150mM. De préférence, une lyse cellulaire est effectuée, afin de libérer l'enzyme β-lactamase éventuellement contenue dans les bactéries de l'échantillon et de rendre son activité visible plus rapidement. Des tampons de lyse classiques peuvent être utilisés (cf. exemple ci-dessous). Si l'échantillon est liquide (par exemple un fluide biologique), il est possible de le diluer en ajoutant un tampon avant de procéder à l'étape de mise en contact avec l'antibiotique. Ce tampon peut contenir par exemple du NaCl, une protéine connue pour diminuer les interactions non spécifiques (PVP, PVA, BSA) et du détergent (Tween 20). Son pH est préférentiellement de 8. La concentration de NaCl est préférentiellement proche de 150 mM. L'homme du métier sait comment obtenir de tels échantillons exploitables. Il n'y a pas de limite haute pour la concentration en bactérie, contrairement à d'autres tests de l'art antérieur. Ces étapes de préparation ne doivent pas affecter l'activité de l'enzyme β-lactamase éventuellement présente dans l'échantillon. Figures La Figure 1 décrit le principe du test 1 immunoenzymatique utilisé dans la demande pour sélectionner l'anticorps d'intérêt utilisable dans le système de l'invention. Ce test implique du Céfotaxime-biotine non hydrolysé (NH), l'anticorps issu d'un hybridome ou de plasma de souris immunisées avec du céfotaxime et de la Streptavidine- Acétylcholinestérase (G4). L'acétylcholinestérase réagit avec un chromogène pour produire un produit coloré. La Figure 2 décrit le principe de trois autres tests immunoenzymatiques d'intérêt utilisés pour sélectionner l'anticorps d'intérêt utilisable dans le système de l'invention. Le Test 2 utilise : Céfotaxime-biotine hydrolysé (H) + Anticorps d'hybridome ou de plasma de souris immunisées avec du cefatoxime + Streptavidine-G4 Le Test 3 utilise : Céfotaxime-biotine non hydrolysé (NH) + Céfotaxime non hydrolysé (NH) + Anticorps d'hybridome ou de plasma de souris immunisées avec de la céfatoxime + Streptavidine-G4 Le Test 4 utilise : Céfotaxime-biotine non hydrolysé (NH) + Céfotaxime hydrolysé (H) + Anticorps d'hybridome ou de plasma de souris immunisées avec du céfatoxime + Streptavidine-G4 Les Figures 3A et 3B représentent les courbes de compétition obtenues avec du céfotaxime hydrolysé ou non, et les différents anticorps monoclonaux retenus (Ligne pleine : céfotaxime non hydrolysé ; ligne pointillée : céfotaxime hydrolysé). A : Courbes de compétitions non identiques obtenues pour trois anticorps avec le céfotaxime non hydrolysé (trait plein) et le céfotaxime hydrolysé (trait pointillé). B : Courbes de compétitions similaires obtenues pour cinq anticorps avec le céfotaxime non hydrolysé (trait plein) et le céfotaxime hydrolysé (trait pointillé). La Figure 4 représente la courbe de compétition obtenues avec du céfotaxime hydrolysé ou non, avec un des anticorps monoclonaux non sélectionné. La Figure 5 représente les différents éléments constituant les bandelettes classiquement utilisées à des fins de détection d'analyte. La Figure 6 décrit les deux cas attendus lorsque l'échantillon contient (test positif) ou ne contient pas (test négatif) de bactéries BLSE ou d'enzymes β-lactamases. La Figure 7 décrit la cassette plastique qui peut être utilisée pour protéger la bandelette de l'invention. La Figure 8 décrit les structures des composés carbapénèmes utilisés dans l'exemple 2 (B). La Figure 9 présente le principe des tests 1 à 4 qui sont décrits dans l'exemple 2 (C). La figure 10 présente une bandelette selon l'invention, contenant deux lignes tests et une ligne contrôle. La première ligne test correspond à une zone où le Céfotaxime-BSA a été immobilisé, et la seconde ligne test correspond à une zone où ont été immobilisés des anticorps anti-CTX-Ms. La ligne de contrôle correspond à une zone où des anticorps secondaires, reconnaissant les autres anticorps marqués utilisés dans l'invention, ont été immobilisés. Dans la zone de dépôt, ont été déposés des anticorps anti-céfotaxime de l'invention, et des anticorps anti-CTX-Ms, tous marqués à l'or colloïdal. La figure 11 décrit les trois cas attendus lorsque l'échantillon ne contient pas de bactéries ayant une BLSE ou d'enzymes β-lactamases (test négatif), ou contient des bactéries BLSE ou d'enzymes β-lactamases autre que CTX-M (test positif sur une ligne), ou contient des bactéries BLSE ou d'enzymes β-lactamases de type CTX-M (test positif sur les deux lignes). Exemple 1 : Détection de bactéries résistantes au céfotaxime A. Conception et production de l’immunogène Le céfotaxime est une petite molécule incapable d'induire une réponse immunitaire, indispensable à l'obtention d'anticorps. Il a donc été nécessaire de coupler cet antibiotique à une plus grosse molécule immunogénique, l'albumine bovine sérique (BSA). La différence de reconnaissance des anticorps de l'invention devant se faire au niveau du noyau β-lactame, un immunogène particulier a été conçu : il permet une exposition optimale du noyau β-lactame vis-à-vis du système immunitaire. Le couplage avec la BSA a donc été réalisé au niveau de la fonction NH ₂ , qui est la fonction la plus éloignée du noyau β-lactame. Le céfotaxime a été activé avec du chlorure de Chloroacétyle (Rodriguez, « An improved Method for preparation of cefpodoxime proxetil », 2003). Pour cela, une suspension de céfotaxime (500 mg, 1,09 mmol, 1 éq.) dissous dans 2 ml de DMA, a été ajoutée à du chlorure de chloroacétyle (128 µl, 1,65 mmol, 1,5 éq.) à 5°C- 10°C. Le mélange a ensuite été agité pendant 1 h 30 à température ambiante. Une fois l'opération terminée, la solution a été versée dans de la glace. Le précipité a été recueilli par filtration et lavé successivement avec du H ₂ O, de l'éthanol, de l'éther diéthylique et séché pour obtenir le produit souhaité sous forme de poudre blanc-gris (349 mg, 0,66 mmol, 60 %). Cette réaction a abouti à la formation d'une fonction chloroacétamido qui peut réagir notamment avec des fonctions thiols.

En parallèle, 35 mg de sérum albumine bovine (BSA) ont été dissous dans 1 ml de tampon au phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4. 50 µl d'une solution de 122 mg/ml de S- acétylthioacétate de N-succinimidyle (SATA) dans du DMF ont été ajoutés (rapport molaire SATA/BSA = 50). Après une réaction de 16 heures à 4°C, le produit a été purifié par chromatographie moléculaire sur tamis en utilisant une colonne de milieu Sephadex G25. Ensuite, la fonction thiol a été déprotégée en ajoutant 100 µl d'hydroxylamine 1 M pH 7 pendant 30 minutes à 20°C. La concentration de thiol a été mesurée (SH/BSA = 20,7) par réaction avec du DTNB. Ce produit peut ainsi réagir avec la fonction chloroacétamido du céfotaxime modifié. De ce fait, 2,34 mg de chloroacétamido-céfotaxime à 6 mg/ml dans du DMSO ont été ajoutés à 2,76 mg de BSA-SH (rapport molaire chloroacétamido-céfotaxime/SH = 5). Après une réaction de 1 h 30 min à 20°C, 50 µl de tampon borate 1 M pH 9,0 ont été ajoutés et incubés pendant 1 h 30 min. Une dialyse a été effectuée avec une cassette de dialyse de 3500 MWCO. Ensuite, la concentration de BSA-Céfotaxime a été déterminée par réaction BCA.

Le céfotaxime-BSA a été utilisé pour immuniser des souris. Pour réaliser les immunisations, des injections par voie sous-cutanée de 50µg de céfotaxime-BSA/souris ont été réalisées toutes les trois semaines pendant trois mois (4 immunisations au total). Après 2 mois de repos pour les souris, de nouvelles injections de céfotaxime-BSA ont été réalisées par voie intraveineuse à ces dernières : 50µg de produit/souris, une fois par jour pendant trois jours. Après deux jours de repos, les cellules de la rate de la souris ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris NS1, et des anticorps anti-céfotaxime spécifiques dans des surnageants de culture de myélome ont été détectés à l'aide d'un test immunoenzymatique. B. Production et purification des différentes formes de céfotaxime Pour la bonne réalisation de l'invention, il est indispensable que la différence d'affinité des anticorps de l'invention pour la forme intacte et hydrolysée de l'antibiotique soit maximale. Pour ce faire, il a fallu disposer de céfotaxime non-hydrolysé et de céfotaxime hydrolysé. D'autre part, il a également fallu disposer de molécules ‘traceurs' permettant de détecter les anticorps spécifiques que sont le céfotaxime-biotine non-hydrolysé et le céfotaxime-biotine hydrolysé. Ces dernières molécules peuvent ainsi être détectées par réaction avec de la streptavidine-Acétylcholinestérase (G4). L'acétylcholinestérase réagit avec le chromogène pour produire un substrat coloré. Production de céfotaxime-biotine non-hydrolysé et hydrolysé Le céfotaxime-biotine non-hydrolysé a été obtenu par couplage de chloroacétamido- céfotaxime et de biotine couplée à un bras polyéthylène glycol (PEG) et d'une fonction thiol (Biotin-PEGx-Thiol), en utilisant la procédure précédemment décrite pour l'immunogène. Du chloroacétamido-céfotaxime (31,6 mg, 0,06 mmol, 1 eq.) et de la Biotin-PEGx-Thiol (94 mg, 0.119 mmol, 2 éq.) ont été solubilisés dans 0,5 ml de DMF et 2 µl de triéthylamine, et ont ensuite été ajoutés au mélange sous Argon. La réaction a été agitée pendant 3 jours. Une fois la réaction terminée, le mélange a été évaporé sous vide réduit. Ensuite, le produit a été purifié par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile de 0 à 40% (pic isolé à 26% d'acétonitrile). Le poids moléculaire de ce traceur a été vérifié par spectrométrie de masse, où un cycle de purification de 15 minutes sur colonne C18 est réalisée, puis l'échantillon est passé en ionisation sur un quadripôle. Le céfotaxime-biotine hydrolysé a été obtenue par réaction enzymatique avec des billes couplées à KPC-2 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), qui est une β-lactamase recombinante. Pour se faire, 5 mg de billes (Dynabeads M-280 tosylactivées) ont été lavées avec du tampon borate 0,1 M pH 9,5.100 µg de la protéine recombinante KPC-2 ont été ajoutés aux billes dans un volume de 150 µl. Ensuite, 100 µl de tampon borate 0,1 M pH 9,5 + sulfate d'ammonium 3 M ont été ajoutés. Après 16 h de réaction à 37°C, 1 ml de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + chlorure de sodium 0,15 M + BSA 0,5 % ont été ajoutés. Après 1 h de réaction à 37°C, le produit de couplage a été lavé avec du tampon de phosphate de sodium 0,1M pH 7,4 + chlorure de sodium 0,15M + BSA 0,1 % et concentrés à 20 mg/ml de billes. L'activité enzymatique de ce produit a été testée avec de la nitrocéfine. Pour cela, 20µl de nitrocéfine 0,5mM ont été ajoutés à une solution de 10 µg/ml de Billes-KPC-2, diluée dans un tampon de phosphate de sodium 50mM pH 7,4, dans un volume total de 200 µl. Après 30 minutes de réaction à 20°C, l'absorbance est mesurée à 492 nm. Par la suite, à partir du céfotaxime biotine non-hydrolysé, 50 µl de la solution de Billes-KPC-2 à 20 mg/ml ont été ajoutés à 1 ml d'une solution de céfotaxime-biotine non-hydrolysé à 2 mg/ml. Après une réaction de 16 heures à 25°C, les Billes-KPC-2 ont été éliminées grâce à un aimant. Le surnageant a été récupéré et purifié par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile de 0 à 40% (pic isolé à 23% d'acétonitrile). Le poids moléculaire de ce traceur a été vérifié par spectrométrie de masse, où un cycle de purification de 15 minutes sur colonne C18 est réalisée, puis l'échantillon est passé en ionisation sur un quadripôle.

Production de céfotaxime non-hydrolysé et hydrolysé Le céfotaxime non-hydrolysé (Sigma-Aldrich) a été purifié par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile de 0 à 20% (pic isolé à 8.5% d'acétonitrile). Le poids moléculaire de ce produit a été vérifié par spectrométrie de masse, où un cycle de purification de 15 minutes sur colonne C18 est réalisée, puis l'échantillon est passé en ionisation sur un quadripôle. Le céfotaxime hydrolysé a été également obtenu par réaction enzymatique avec des billes couplées à KPC-2. Le même protocole de couplage des billes-KPC-2, cité ci-dessus, a été réalisée. Puis, à partir du céfotaxime non-hydrolysé, 50 µl de la solution de Billes-KPC- 2 à 20 mg/ml ont été ajoutés à 1 ml d'une solution de céfotaxime non-hydrolysé à 2 mg/ml. Après une réaction de 16 heures à 25°C, les Billes-KPC-2 ont été éliminées grâce à un aimant et la solution a été purifiée par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile de 0 à 20% (pic isolé à 2.5% d'acétonitrile). Le poids moléculaire de ce traceur a été vérifié par spectrométrie de masse, où un cycle de purification de 15 minutes sur colonne C18 est réalisée, puis l'échantillon est passé en ionisation sur un quadripôle. Purification des différentes formes de céfotaxime L'ensemble des solutions ont été purifiées par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile à 1ml/ml. Pour le céfotaxime non-hydrolysé, le pic isolé est à 8.5% d'acétonitrile. Pour le céfotaxime hydrolysé, le pic est à 2.5%. Pour le céfotaxime- biotine non-hydrolysé, il est à 26%, alors que pour le céfotaxime-biotine hydrolysé, le pic isolé est à 23.5%. L'ensemble de ces 4 composés ont été caractérisés par spectrométrie de masse. Pour cela, ils ont été purifiés sur un cycle de 15 minutes sur une colonne C18 (gradient eau/acétonitrile), puis ioniser dans un quadripôle. La masse moléculaire de chaque composé a été identifiée : m/z du céfotaxime non-hydrolysé = 456 ; m/z du céfotaxime hydrolysé = 414 ; m/z du céfotaxime-biotine non-hydrolysé = 1241,5 ; m/z du céfotaxime-biotine hydrolysé = 1283,5. Les composés suivants ont bien été obtenus : C. Production et sélection des anticorps d’intérêt

Quatre souris ont été immunisées avec le céfotaxime-BSA. Pour ce faire, des injections par voie sous-cutanée de 50μg de céfotaxime-BSA/souris ont été réalisées toutes les trois semaines pendant trois mois (4 immunisations au total). Après 3 mois de repos pour les souris et afin de sélectionner les souris présentant la meilleure réponse immunitaire, leurs anticorps ont été analysés avec un premier test. Dans ce test, les anticorps murins prélevés au cours du protocole d'immunisation ont été capturés par un premier anticorps antianticorps murin (AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) ; Jackson Immunoresearch LABORATORIES) immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. 100μl à 100 ng/ml de céfotaxime non hydro lysé-biotine a été ajoutée dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, 100 μl de streptavidine-G4 à 1 UE/ml a été ajoutée pour révéler la présence de céfotaxime intact couplé à la biotine et donc la présence d'anticorps anti-céfotaxime non hydro lysé. L'activité de l'acétylcholinestérase (G4) a été mesurée par la méthode d'Ellman (Ellman et al., 1961). Le milieu d'Ellman comprend un mélange de 7,5 10 ^-4 M iodure d'acétylthiocholine (substrat enzymatique) et de 2,5 10 ^-4 M 5,5'-dithiobis (acide 2- nitrobenzoïque) (DTNB) (réactif pour la mesure colorimétrique du thiol) dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. L'activité enzymatique a été exprimée en unités d'Ellman (UE). Une UE est définie comme la quantité d'enzyme produisant une augmentation de l'absorbance d'une unité pendant 1 min dans 1 ml de milieu, pour une longueur de trajet optique de 1 cm : elle correspond à environ 8 ng d'enzyme.

Après une heure d'incubation à température ambiante et après lavage, 200μl de réactif de milieu d'Ellman sont ajoutés dans les puits. Après 30 minutes et/ou une heure, l'intensité des signaux est mesurée. L'intensité des signaux obtenus lors de ce test est alors proportionnelle à la quantité d'anticorps spécifiques du céfotaxime non hydrolysé. Les souris ayant la meilleure réponse immunitaire (plus grande concentration en anticorps spécifiques) ont alors reçu de nouvelles injections de céfotaxime-BSA. Pour cela, le produit a été administré par voie intraveineuse aux souris avec les meilleures réponses : 50μg de produit/souris, une fois par jour pendant trois jours. Après deux jours de repos, elles ont été sacrifiées et leurs splénocytes (cellules de la rate) ont été hybridés avec des cellules de myélome murin NSI afin d'obtenir des hybridomes (producteurs d'anticorps et cellules immortelles) (Grassi,J., Frobert,Y., Lamourette,P. and Lagoutte,B., 1988. « Screening of monoclonal antibodies using antigens labeled with acetylcholinesterase: application to the peripheral proteins of photosystem 1”. Anal. Biochem. 168, 436).

A l'issue de la fusion, l'ensemble des cellules a été réparti dans les puits de 10 plaques de microtitration. Après une semaine, la présence d'anticorps reconnaissant le céfatoxime dans chaque puits a été analysée en utilisant le test 1 (figure 1). Ce test a permis de sélectionner et conserver les cellules de 107 puits. Afin d'affiner cette sélection et ne garder que les hybridomes produisant des anticorps ne reconnaissant que le céfotaxime non hydro lysé, les surnageants de culture des puits sélectionnés ont été analysés à l'aide de 4 tests différents (figures 1 et 2 : tests 1 à 4) :

Test 1 : Dans ce test, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Du céfotaxime non hydrolysé-biotine est ajoutée dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine- G4 est ajoutée pour révéler la présence de céfotaxime non hydro lysé couplé à la biotine et donc d'anticorps anti-céfotaxime non hydrolysé.

Test 2 : Dans ce test, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Du céfotaxime hydrolysé-biotine est ajouté dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence de céfotaxime hydrolysé couplé à la biotine et donc la présence d'anticorps anti-céfotaxime hydrolysé.

Test 3 : Dans ce test, du céfotaxime non hydrolysé-biotine est mis en compétition avec du céfotaxime non hydrolysé vis-à-vis de la reconnaissance par les anticorps spécifiques présents dans les surnageants de culture. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence de céfotaxime intact couplé à la biotine.

Test 4 : Dans ce test, du céfotaxime non hydrolysé-biotine est mis en compétition avec du céfotaxime hydrolysé à la même concentration que le céfotaxime non hydrolysé utilisé dans le test 3, vis-à-vis de la reconnaissance par les anticorps spécifiques présents dans les surnageants de culture. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence de céfotaxime intact couplé à la biotine.

Pour les tests 1 et 2, l'apparition d'un signal dans les puits indique la présence d'anticorps anti-céfotaxime non hydrolysé et anti céfotaxime hydrolysé respectivement.

Pour les tests 3 et 4, une baisse des signaux proportionnelle à la concentration en inhibiteur révèle la présence d'anticorps reconnaissant l'inhibiteur : céfotaxime non hydrolysé (test 3) ou céfotaxime hydrolysé (test 4). D'autre part, ces tests permettent d'évaluer la spécificité relative des anticorps pour le céfotaxime non hydrolysé et le céfotaxime hydrolysé. Ainsi, si la baisse du signal est similaire pour les deux formes de céfotaxime, alors les anticorps possèdent la même affinité pour ces deux molécules. Si la baisse du signal est plus faible pour l'une des deux formes de céfotaxime, alors l'anticorps possède une affinité plus faible pour cette forme.

Ont été sélectionnés les puits pour lesquels est obtenu un signal pour le test 1 et pas de signal pour le test 2, une baisse du signal la plus importante du signal pour le test 3 et pas de baisse du signal pour le test 4. A la fin du processus de sélection, 18 hybridomes ont été conservés pour produire des anticorps monoclonaux.

D. Caractérisation des anticorps monoclonaux

Pour évaluer la spécificité de chaque anticorps monoclonal, les tests 3 et 4 ont été réalisés avec différentes concentrations de céfotaxime non hydrolysé et hydrolysé comme compétiteur. La spécificité a été déterminée en calculant le pourcentage de réaction croisées entre les deux formes de céfotaxime. Pour réaliser ce calcul, la concentration de céfotaxime non hydrolysé a été divisée par la concentration en céfotaxime hydrolysé qui entraine la même baisse de signal. Par exemple, si une baisse du signal est induite par 1 nmol/ml de céfotaxime non hydrolysé et par 100 nmol/ml de céfotaxime hydrolysé, alors le pourcentage de réaction croisée est de : 1/100=0.01 donc de 1%.

Pour réaliser ces tests, l'ensemble des solutions ci-après ont été préparées dans un tampon ayant pour composition : Tampon phosphate de potassium 0.1M pH 7.4 + PVP 0.1% + NaCl 0.15M + Azide de sodium 0.01%. Le céfotaxime-biotine intact a été utilisé à 0,3 pmol/ml. Pour le céfotaxime non hydrolysé et le céfotaxime hydrolysé, une gamme de concentration a été réalisée : 210 pmol/ml ; 21 pmol/ml ; 2,1 pmol/ml ; 0,21pmol/ml et 0 pmol/ml

Les solutions ont été déposées en microplaque 96 puits, sur la paroi desquels un anticorps anti-anticorps de souris (identique à celui utilisé dans les expériences de sélection des anticorps) a été préalablement immobilisé, à raison de 25μl de marqueur (Céfotaxime- biotine intact) et 25μl de compétiteur (Céfotaxime non hydrolysé ou hydrolysé). Puis 50μl de la solution d'anticorps ont été ajoutés. Les microplaques ont été incubées pendant une nuit à 4°C, puis, après lavage, 100μl de Streptavidine-G4 ont été ajoutés pendant 1 heure à température ambiante et sous agitation. Après lavage des puits, 200μl de chromogène (milieu d'Ellman) ont été déposés. La lecture de l'absorbance a été effectuée après 1 heure d'incubation sous agitation, à 414nm au spectrophotomètre. Les graphiques obtenus sont f([Céfotaxime]) = %B/Bo. Le signal Bo correspond à l'absorbance obtenue en absence de compétiteur (Absorbance maximale). Le signal B est l'absorbance obtenue dans le milieu où compétiteur et marqueur sont en interaction avec l'anticorps. Afin que la figure soit lisible, seuls les résultats obtenus avec quelques anticorps ont été représentés (figures 3A et 3B).

Pour 16 anticorps, aucune baisse du signal n'a été observée avec la plus forte concentration en céfotaxime hydrolysé (210 pmol/ml). Les réactions croisées sont donc inférieures à 0,1% (concentration minimale de céfotaxime non hydrolysé induisant une baisse de signal/ 210 pmol/ml, multiplié par 100). Pour les deux autres anticorps, une faible baisse du signal a été observée et les réactions croisées obtenues ne sont que de 0,008% et 0,045%.

On observe sur la figure 3A que les courbes de compétition obtenues avec le céfotaxime non hydrolysé avec les différents anticorps ne sont pas identiques. Alors que pour d'autres anticorps, les courbes de compétitions obtenues avec le céfotaxime non hydrolysé sont similaires (Figure 3B).

On observe donc que les courbes de compétition obtenues avec le céfotaxime non hydrolysé avec les différents anticorps ne sont pas identiques. Cela signifie que les anticorps impliqués sont différents. Ainsi, la spécificité des anticorps de l'invention n'est pas liée à une séquence protéique particulière du site de liaison de ces anticorps. C'est la conception de l'immunogène et la stratégie de sélection retenue qui a permis de sélectionner de tels anticorps.

Parmi ces 18 anticorps, celui qui présente la plus grande affinité pour le céfotaxime non hydrolysé (anticorps 3) a été sélectionné pour le développement du test de détection de l'activité céphalosporinase.

La spécificité d'un anticorps non retenu à l'issue de la sélection a également été analysée. La figure 4 démontre, pour cet anticorps non retenu, une baisse du signal plus importante pour le céfotaxime hydrolysé que pour le céfotaxime non hydrolysé, ce qui signifie que cette dernière forme est moins bien reconnue par l'anticorps non retenu.

E. Test de détection de l’activité B-lactamase selon l’invention

Les anticorps sélectionnés (Anticorps 1 ; 2 ; 3 ; 4 et 5) ont ensuite été utilisés sur des tests bandelettes par compétition.

Comme décrit précédemment, les bandelettes sont constituées de 4 parties distinctes :

1) Le papier échantillon (PE) pour le dépôt de l'échantillon.

2) Le papier conjugué (PC) où l'anticorps marqué (appelé également traceur) est séché. Ce papier peut être accessoire dans le cas où l'anticorps traceur est utilisé en format liquide. Dans ce cas 10μl d'anticorps traceur sont ajoutés à 100μl d'échantillon avant le dépôt sur la bandelette.

3) La membrane de nitrocellulose (MbNC) avec deux lignes (Ligne Test (LT) : BSA- Céfotaxime intact ; Ligne Contrôle (LC) : Anticorps anti-anticorps traceur).

4) Le papier absorbant (PA) pour permettre la migration de l'échantillon à travers la bandelette.

Paramètres du test bandelette

L'ensemble des solutions ci-après ont été préparées dans le tampon bandelette ayant pour composition : Tampon Tris/HCL 0.1M pH8 + NaCl 0.15M + Tween 20 0.5% + Chaps 1% + Azide de sodium 0.01%. Il permet la lyse des bactéries et la libération de son contenu (enzymes par exemple).

Les trois paramètres suivants ont été optimisés :

La quantité de traceur : L'anticorps choisi est couplé à l'or colloïdal (marqueur coloré), son absorbance a pu être mesurée à 530nm. De ce fait, dans les résultats, le terme absorbance (DO) relatif à l'or colloïdal est employé. Plusieurs DO ont ainsi été testées. L'objectif était de déterminer la plus petite quantité en traceur permettant d'observer un signal significatif 10 minutes après le dépôt de l'échantillon sur la bandelette.

La quantité BSA-céfotaxime intact sur la LT : une fois la DO en anticorps fixée, plusieurs concentrations de BSA-Céfotaxime intact sur la LT ont été testées (1 μL/cm). L'objectif était de fixer la concentration, non limitante pour le signal observé au niveau de la LT, la plus faible.

L'optimisation de ces deux paramètres a été conduite pour les 5 anticorps sélectionnés mais pour simplifier les figures seuls les résultats obtenus avec l'anticorps 3 ont été reportés.

La quantité de céfotaxime non hydrolysé à ajouter dans les échantillons : une fois les deux paramètres précédents déterminés, l'objectif a été de fixer la concentration minimale en céfotaxime intact à partir de laquelle aucun signal n'est observé sur la LT. Parallèlement, du céfotaxime hydrolysé a été ajouté pour vérifier que l'anticorps est bien spécifique de la forme non hydrolysée. Pour cela, une gamme de céfotaxime non hydrolysé et une gamme de céfotaxime hydrolysé ont été préparées avec du tampon bandelette : 1000ng/ml ; 100ng/ml ; 10ng/ml ; 1ng/ml.

Pour l'ensemble de ces trois paramètres, une échelle d'intensité de couleur a été utilisée pour évaluer les résultats obtenus sur les tests bandelettes. Cette échelle a été définie de 1 à 10, où chaque valeur est caractéristique d'une intensité de signal croissante.

Pour l'ensemble de ces tests, des microplaques 96 puits ont été utilisées. Pour lancer un test, 10μl de traceur sous forme liquide ont été ajoutés à 100μl de tampon contenant ou non du céfotaxime. Puis, une bandelette composée d'un papier échantillon, d'une membrane de nitrocellulose et d'un papier absorbant, a été déposée dans le puits. Une incubation de 10 minutes a été réalisée, puis l'intensité du signal a été évaluée avec l'échelle d'intensité de couleur.

Résultats

La DO en traceur a d'abord été optimisée. Sur la LT, une concentration par défaut de lmg/ml de BSA-Céfotaxime intact a été déposée. Les résultats des tests sont indiqués dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Optimisation de la DO en traceur.

Afin d'obtenir une intensité en signal suffisante, la DO :1 a été sélectionnée car elle se situe dans l'échelle d'intensité 8.5/9. Différentes concentrations en BSA-Cefatoxime non hydrolysé ont ensuite été déposées sur la LT (1μL/cm). La concentration de DO : 1 précédemment sélectionnée pour le traceur a été utilisée.

Tableau 2 : Optimisation de la concentration en BSA-Céfotaxime sur la LT. L'intensité du signal n'augmente que très faiblement au-delà d'une concentration de 0.1mg/ml en BSA-Céfotaxime. C'est pourquoi cette concentration a été sélectionnée. Afin d'ajuster plus précisément les paramètres, différentes quantités en traceur ont été testées avec cette quantité de BSA-céfotaxime. Tableau 1 : Seconde optimisation de la DO en traceur.

Au vu de ces résultats, la concentration de 0.1mg/ml de BSA-céfotaxime sur la LT et la DO 0.5 en traceur ont été gardées, car le signal obtenu était autour 8.5.

La concentration en céfotaxime non hydrolysé à utiliser dans les échantillons a ensuite été déterminée. Un témoin est réalisé (condition à Ong/ml), pour voir le signal maximum pouvant être obtenu sur la LT (Tableau 4).

Tableau 4 : Optimisation de la concentration en céfotaxime intact à ajouter dans les échantillons. ∅ : aucun signal n'a été observé sur la LT. Pour le céfotaxime non hydrolysé, la concentration à partir de laquelle du signal est visible sur la LT est de lng/ml. La concentration la plus faible permettant une disparition totale du signal (tous les sites de reconnaissance des anticorps traceurs occupés) est donc de 10 ng/ml.

Pour le céfotaxime hydrolysé, le signal est équivalent au témoin (les traceurs se fixent sur la LT). Comme attendu le céfotaxime hydrolysé n'est pas reconnue par l'anticorps traceur dont les sites de liaison sont libres pour interagir avec le céfotaxime de la LT.

La concentration de 10 ng/ml de BSA-Céfotaxime a ensuite été utilisée pour étudier les cinétiques d'hydrolyse du céfotaxime. Pour la même concentration en céfotaxime hydrolysé, aucune diminution du signal n'a été observée. L'hydrolyse du céfotaxime dans l'échantillon va donc entrainer une augmentation du signal au niveau de la LT.

A titre d'exemple, d'autres anticorps ont été testés. Les conditions d'utilisation des anticorps sont les suivantes : Anticorps 1, DO0.5, 0.3mg/ml de BSA-Céfotaxime ; Anticorps 2, DO1, 0.3mg/ml de BSA-Céfotaxime ; Anticorps 3, DO0.5, 0.1mg/ml de BSA-Céfotaxime ; Anticorps 4, DO0.5, 0.3mg/ml de BSA-Céfotaxime ; Anticorps 5, DO0.5, 0.3mg/ml de BSA-Céfotaxime (Tableau 5).

Tableau 5 : Optimisation de la concentration en céfotaxime intact à ajouter dans les échantillons pour différents anticorps. 0 : aucun signal n'a été observé sur la LT.

Au vu de ces résultats, l'anticorps 3 a montré les meilleures performances sous le format bandelette car il permet de détecter une activité enzymatique pour la plus faible concentration en enzyme. Cependant, ce résultat montre que d'autres anticorps auraient pu être utilisés dans le cadre de ce procédé. Pour la suite des développements et optimisations, seul l'Anticorps 3 a été utilisé. Cinétiques d'hydrolyse avec une enzyme recombinante

Une fois les paramètres du test bandelette définis, des cinétiques d'hydrolyse ont été réalisées. Pour cette étude, l'enzyme CTXM-2, une BLSE, de chez Escherichia coli a été utilisée. L'objectif de ces cinétiques est de réussir à obtenir un signal positif « + » (signal visible sur la LT) le plus tôt possible, et à la concentration d'enzymes la plus faible possible.

Pour réaliser ces tests, l'ensemble des solutions ci-après ont été préparées dans le tampon bandelette ayant pour composition : Tampon Tris/HCL 0.1M pH8 + NaCl 0.15M + Tween 20 0.5% + Chaps 1% + Azide de sodium 0.01%. Il permet la lyse des bactéries et la libération de son contenu.

Les concentrations utilisées sont : 10ng/ml ; 3ng/ml ; lng/ml ; 0.3ng/ml ; 0.1ng/ml en enzymes, et sont incubées avec le céfotaxime intact à température ambiante. Deux témoins sont également réalisés contenant, soit uniquement du céfotaxime intact (aucun signal ne doit être observé sur la LT car la totalité des sites de fixation des traceurs est occupée), soit uniquement du tampon bandelette (signal maximal pouvant être obtenu sur la LT car la totalité des sites de fixation des traceurs est libre).

Dans cette étude, le traceur est dans un premier temps ajouté sous forme liquide (10μl à DO :0.5 sont ajoutés à 100μl de la solution enzymatique) puis, dans un deuxième temps, sous format séché sur un papier conjugué (10μl à DO :0.9). Le papier conjugué a par la suite été inséré sur la bandelette entre le papier échantillon et la membrane de nitrocellulose. De ce fait, deux types de bandelettes ont été utilisés, avec ou sans papier conjugué (PC). Il a été indiqué, pour chaque expérience, quel type de bandelette a été utilisé. La LT sur la membrane de nitrocellulose est composé de 0.1mg/ml de BSA- Céfotaxime non hydrolysé. Les différentes conditions ont été préparées puis incubées à température ambiante. Une fois le temps d'incubation écoulé, 100μl de solution ont été prélevés et déposés, soit dans un puits de microplaque, soit dans un puits de dépôt d'une cassette plastique.

Les échantillons ont été testés après 0 minute ; 15 minutes ; 30 minutes ; 45 minutes ; 60 minutes d'incubation. La lecture sur le test bandelette s'effectue après 10 minutes de migration. Un signal sur la LT est considéré comme « P ». Une absence de signal sur la LT est définie comme « N ». Une première cinétique d'hydrolyse a été réalisée à température ambiante. Les tests ont été réalisés en microplaques 96 puits, avec 100μl d'échantillon + 10μl de traceur en format liquide. Les bandelettes sans PC ont été déposées dans les puits. La concentration en céfotaxime intact est de 10ng/ml, avec une DO en traceur de 0.5 (Tableau 6).

Tableau 6 : Cinétique d'hydrolyse à Température Ambiante du céfotaxime par une enzyme CTXM-2, traceur liquide (N : test négatif pas de signal à la LT ; P : test positif signal visible au niveau de LT).

Un signal est visible dès 15 minutes d'incubation pour 10ng/ml d'enzyme, et à 45 minutes pour 3ng/ml d'enzymes. La même expérience a été réalisée, mais cette fois-ci avec une incubation à 37°C (Tableau 7).

Tableau 7 : Cinétique d'hydrolyse à 37°C du céfotaxime intact par CTXM-2, traceur liquide.

On observe dans le tableau 7 que Tincubation à 37°C n'a aucun effet sur les résultats. C'est pourquoi Tincubation à température ambiante a été sélectionnée.

Pour limiter le nombre de manipulation et ainsi faciliter l'utilisation du test, le traceur a été séché sur le PC. Il a été observé qu'après resolubilisation, une partie de l'anticorps traceur est adsorbée par le PC. Pour compenser cette absorption, il faut augmenter la quantité de traceur utilisé. La DO finale en traceur sur le PC a été de 0.9 pour ce premier essai. Les tests ont été réalisés en microplaques 96 puits, avec 100μl d'échantillon. La concentration en céfotaxime non hydro lysé a été de 10ng/ml. De nouvelles cinétiques d'hydrolyse ont été réalisées avec ce protocole (Tableau 8).

Tableau 8 : Cinétique d'hydrolyse à TA du céfotaxime non hydro lysé par CTXM-2.

Un signal a été observé dès 15 minutes à 3ng/ml d'enzymes et dès 45 minutes à lng/ml. Le passage du traceur en format séché et l'augmentation de la DO a permis d'abaisser la concentration en enzymes nécessaire pour avoir un signal visible sur la LT. Toujours dans l'optique d'améliorer les performances du test, deux autres cinétiques d'hydrolyse ont été réalisées où la quantité en traceur dans le PC a été augmentée, soit 10 μl à DO :1 (Tableau 9), soit 10 μl à DO :1.5 (Tableau 10). Pour cette étude les bandelettes ont été insérées dans des cassettes plastiques et 100μl d'échantillon ont été déposés dans le puits de dépôt. La concentration en céfotaxime non hydro lysé a été de 10ng/ml. Les résultats ont été les suivants.

Tableau 9: Cinétique d'hydrolyse du céfotaxime intact par une enzyme CTXM-2 (DO :1).

Tableau 10 : Cinétique d'hydrolyse du céfotaxime non hydrolysé par CTXM-2 (DO1.5). L'augmentation de la DO en traceur a permis d'abaisser la concentration en enzymes nécessaire pour avoir un signal visible sur la LT. La DO 1.5 montre de meilleurs résultats avec une détection à lng/ml dès 15 minutes.

Les résultats obtenus montrent que la DO 1.5 permet une limite de détection lng/ml d'enzymes CTXM-2 après 15 minutes d'incubation.

Finalisation de l'adaptation et validation du test bandelette sur des colonies bactériennes

Pour finaliser l'adaptation du test bandelette et réaliser sa validation sur des colonies bactériennes, deux étapes ont été réalisées :

Identification du temps d'incubation du céfotaxime non hydrolysé avec des colonies bactériennes afin d'identifier une résistance bactérienne de type BLSE.

Pour réaliser ces tests, l'ensemble des solutions ci-après ont été préparées dans le tampon bandelette ayant pour composition : Tampon Tris/HCL 0.1M pH8 + NaCl 0.15M + Tween 20 0.5% + Chaps 1% + Azide de sodium 0.01%, qui permet la lyse des bactéries et la libération de son contenu.

La concentration en céfotaxime non hydrolysé a été de 10ng/ml dans du tampon bandelette. Deux témoins ont également été réalisés contenant, soit uniquement du céfotaxime non hydrolysé, soit uniquement du tampon bandelette. Le traceur a été séché sur le PC. La LT a été composée de 0.1mg/ml de BSA-Céfotaxime non hydrolysé. La migration s'est effectuée en cassette plastique.

150 μl de solution de céfotaxime non hydrolysé ont été prélevés et déposés dans un tube eppendorf. Une colonie bactérienne a été prélevée à partir d'une gélose LB avec un ose de 1μl, puis déposée dans le tube eppendorf préalablement préparé. Le tube a été vortexé cinq secondes, puis incubé selon le temps d'incubation souhaité à température ambiante. Les échantillons ont été testés après 5 minutes ; 10 minutes ; 20 minutes ; 30 minutes d'incubation. Une fois l'incubation terminée, 100μl ont été prélevés et déposés sur la bandelette. La lecture s'est effectuée après 10 minutes de migration. Un signal sur la LT a été considéré comme « P ». Une absence de signal sur la LT a été définie comme «N». Les résultats obtenus sont affichés dans le tableau 11. Trois groupes ont été définis : le groupe des BLSE, le groupe des carbapénémases (dégrade également le céfotaxime intact), et le groupe des bactéries non résistantes au céfotaxime.

Tableau 11 : Détermination du temps d'incubation à température ambiante du céfotaxime avec des colonies bactériennes. N : résultat négatif ; P : résultat positif

Aucun signal sur la LT n'a été visible pour le groupe des bactéries non résistantes après

30 minutes d'incubation. Pour les groupes BLSE et carbapénémases, la totalité des colonies bactériennes a été détectée dès 20 minutes d'incubation, à l'exception de deux colonies bactériennes qui ont montré des signaux sur la LT faible. A 30 minutes, toutes les colonies dites résistantes ont bien été positives dans notre test.

Au regard des résultats obtenus, le temps d'incubation de 30 minutes a été sélectionné. En appliquant cette durée d'incubation, la totalité des colonies résistantes est bien positive et les colonies non résistantes sont négatives. Le test bandelette est donc bien adapté à l'utilisation sur colonies bactériennes.

Validation du test bandelette sur un souchier de bactéries sensibles ou résistantes aux céphalosporines de 3eme generations (C3G).

Afin de valider le test bandelette sur colonies bactériennes pour son utilisation en clinique, un souchier de bactéries résistantes aux céphalosporines a été utilisé.

Pour réaliser ces tests, l'ensemble des solutions ci-après ont été préparées dans le tampon bandelette ayant pour composition : Tampon Tris/HCL 0.1M pH8 + NaCl 0.15M + Tween 20 0.5% + Chaps 1% + Azide de sodium 0.01%. La concentration en céfotaxime non hydrolysé utilisée est de 25ng/ml dans du tampon bandelette. Le traceur est en format séché sur le PC. La LT est composée de 0.1mg/ml de BSA-Céfotaxime non hydrolysé. Une LC a été réalisée, elle est constituée d'anticorps anti-traceur. La migration s'effectue en cassette plastique.

Pour réaliser les tests, 150μl de solution de céfotaxime non hydrolysé ont été transférés dans un tube eppendorf. Une colonie bactérienne a été prélevée à partir d'une gélose URI- 4 avec un ose de 1μl, puis déposée dans le tube eppendorf préalablement préparé. Le tube a été vortexé cinq secondes, puis incubé pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois l'incubation terminée, 100μl ont été prélevés et déposés sur le test bandelette. La lecture s'effectue après 10 minutes de migration. Un signal sur la LT est considéré comme « P ». Une absence de signal sur la LT est définie comme « N ».

Pour analyser les résultats, les bactéries ont été divisées en deux groupes : les producteurs de β-lactamases qui n'hydrolysent pas le céfotaxime et les producteurs de β-lactamases qui hydro lysent le céfotaxime (Tableau 12).

Tableau 12 : Validation du test rapide sur colonies bactériennes

Les 38 souches qui ne peuvent pas hydro lyser le céfotaxime ont été testées négatives. Il n'y a donc eu aucun faux positif. Parmi les 300 souches pouvant hydrolyser le céfotaxime, toutes les souches ont donné un signal sur la LT. Conclusion

Dans les conditions testées, la bandelette test de l'invention a permis d'obtenir une sensibilité de 100% et une spécificité de 100% pour la détection d'une activité céphalosporinase en 40 minutes (incubation + migration). Ces performances sont parfaites pour une utilisation en diagnostic clinique et vétérinaire et aussi dans le cadre d'évaluation environnementale.

Exemple 2 : Détection de bactéries résistantes à un carbapénème

A. Conception et production des immunogènes

1) L'alcyne carbapénème (S. Saidjalolov, Chem. Eur. J., 2021) est une petite molécule incapable d'induire une réponse immunitaire indispensable à l'obtention d'anticorps. Il a donc été nécessaire de coupler cet antibiotique à une plus grosse molécule immunogénique, l'albumine bovine sérique (BSA). La production de l'immunogène (carbapénème-BSA), appelé immunogène A, s'est déroulée en deux étapes : l'étape 1 a consisté à produire de l'azoture BSA, puis l'étape 2 a couplé l'azoture BSA avec l'alcyne carbapénème. 2) En parallèle, un autre immunogène (carbapénème-BSA), appelé immunogène B, a été réalisé par d'autres réactions chimiques. La production de ce second immunogène s'est déroulée en trois étapes : l'étape 1 a consisté à produire du SMC-BSA, puis l'étape 2 a couplé l'amine-carbapénème (lannazzo L et al, 2016) avec le SATA (N-succinimidyl S- acetylthioacetate), et l'étape 3 a couplé le SMC-BSA avec le SATA-carbapénème. 3) L'immunogène A a été utilisé pour immuniser des souris. Pour réaliser les immunisations, des injections par voie sous-cutanée de 50μg de l'immunogène A/souris ont été réalisées toutes les trois semaines pendant trois mois (4 immunisations au total). Après 2 mois de repos pour les souris, de nouvelles injections de l'immunogène A ont été réalisées par voie intraveineuse à ces dernières : 50μg de produit/souris, une fois par jour pendant trois jours. Après deux jours de repos, les cellules de la rate de la souris ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris NSI, et des anticorps anti- carbapénème spécifiques dans des surnageants de culture de myélome ont été détectés à l'aide d'un test immunoenzymatique.

B. Production et purification des différentes formes de carbapénèmes

Pour la bonne réalisation de l'invention, il est indispensable que la différence d'affinité des anticorps de l'invention pour la forme intacte et hydrolysée de l'antibiotique soit maximale. Pour se faire, il a fallu disposer de carbapénèmes non-hydrolysés et de carbapénèmes hydro lysés.

Production des carbapénèmes-biotine non-hydrolysé et hydrolysé

1) Le carbapénème-biotine non-hydrolysé a été obtenu par couplage de l'amine- carbapénème et de la biotinamidohexanoic acid N-hydroxy-succinimide ester (NHS-LC- Biotin). La réaction chimique se produit entre le groupement NH2 de l'amine carbapénème et le groupement N-hydroxy-succinimide de la biotine. Le produit résultant, est appelé traceur A.

2) Le carbapénème-biotine hydrolysé (traceur A H) a été obtenue par réaction enzymatique avec des billes couplées à KPC-2 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), qui est une β-lactamase recombinante. Pour se faire, 50 μl de la solution de Billes-KPC- 2 à 20 mg/ml ont été ajoutés à 1 ml d'une solution de traceur A NH à 2 mg/ml. Après une réaction de 16 heures à 25°C, les Billes-KPC-2 ont été éliminées grâce à un aimant. Le surnageant contenant le traceur A H a été récupéré et purifié par chromatographie en phase inverse. Le poids moléculaire de ce traceur a été vérifié par spectrométrie de masse.

3) En parallèle, un second carbapénème-biotine non hydrolysé a été produit par un autre processus chimique. Il a été réalisé en couplant un alcyne-carbapénème et de la biotine couplée à un bras polyéthylène glycol (PEG) et d'une fonction azide (Biotin- dPEG®7-azide). Le produit résultant, est appelé traceur B NH.

4) Le carbapénème-biotine hydrolysé (traceur B H) a été obtenue par réaction enzymatique avec des billes couplées à KPC-2 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), qui est une β-lactamase recombinante. Pour se faire, 50 μl de la solution de Billes-KPC- 2 à 20 mg/ml ont été ajoutés à 1 ml d'une solution de traceur A NH à 2 mg/ml. Après une réaction de 16 heures à 25°C, les Billes-KPC-2 ont été éliminées grâce à un aimant. Le surnageant contenant le traceur B H a été récupéré et purifié par chromatographie en phase inverse. Le poids moléculaire de ce traceur a été vérifié par spectrométrie de masse. Production des carbapénèmes non-hydrolysé et hydrolysé

1) Le carbapénème non-hydrolysé utilisé pour la sélection des anticorps est le méropénème (Sigma-Aldrich). Le méropénème non hydrolysé a été purifié par chromatographie en phase inverse sur un gradient eau/acétonitrile de 0 à 20% (pic isolé à 7.8% d'acétonitrile).

2) Le méropénème hydrolysé a été également obtenu par réaction enzymatique avec des billes couplées à KPC-2. La masse moléculaire de la molécule obtenue a été vérifiée par spectrométrie de masse,

3) La même procédure a été réalisée sur les quatre autres carbapénèmes que sont l'ertapénème, le tébipénème, le doripénème et l'imipénème.

4) Les composés décrits sur la Figure 8 ont été utilisés.

C. Production et sélection des anticorps d’intérêt

Quatre souris ont été immunisées avec l'immunogène A. Pour ce faire, des injections par voie sous-cutanée de 50μg d'immunogène A/souris ont été réalisées toutes les trois semaines pendant trois mois (4 immunisations au total). Après 3 mois de repos pour les souris et afin de sélectionner les souris présentant la meilleure réponse immunitaire, leurs anticorps ont été analysés avec un premier test. Dans ce test, les anticorps murins prélevés au cours du protocole d'immunisation ont été capturés par un premier anticorps antianticorps murin (AffïniPure Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) ; Jackson Immunoresearch LABORATORIES) immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration, en réalisant une incubation de 4 heures à température ambiante sous agitation douce. Après lavage, 100μL à 50ng/ml de traceur A NH ont été ajoutés dans chaque puits et une incubation à 4°C pendant une nuit est effectué. Après lavage, 100 μL de streptavidine-G4 à 1 UE/mL ont été ajoutés pour révéler la présence du traceur A NH et donc la présence d'anticorps anti-carbapénème non hydrolysé. L'activité de l'acétylcholinestérase (G4) a été mesurée par la méthode d'Ellman (Ellman et al., 1961). Le milieu d'Ellman comprend un mélange de 7,5 10-4 M iodure d'acétylthiocholine (substrat enzymatique) et de 2,5 10-4 M 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) (réactif pour la mesure colorimétrique du thiol) dans un tampon phosphate 0.1 M, pH 7,4. L'activité enzymatique a été exprimée en unités d'Ellman (UE). Une UE est définie comme la quantité d'enzyme produisant une augmentation de l'absorbance d'une unité pendant 1 min dans 1 ml de milieu, pour une longueur de trajet optique de 1 cm : elle correspond à environ 8 ng d'enzyme.

Après une heure d'incubation à température ambiante et après lavage, 200 μL de réactif de milieu d'Ellman sont ajoutés dans les puits. Après une heure, l'intensité des signaux est mesurée. L'intensité des signaux obtenus lors de ce test est alors proportionnelle à la quantité d'anticorps spécifiques du traceur A NH. Les souris ayant la meilleure réponse immunitaire (plus grande concentration en anticorps spécifiques) ont reçu de nouvelles injections intraveineuses d'immunogène A: 50μg de produit/souris, une fois par jour pendant trois jours. Après deux jours de repos, elles ont été sacrifiées et leurs splénocytes (cellules de la rate) ont été hybridés avec des cellules de myélome murin NSI afin d'obtenir des hybridomes.

A l'issue de la fusion, l'ensemble des cellules a été réparti dans les puits de 10 plaques de microtitration. Après une semaine, la présence d'anticorps reconnaissant le traceur A NH dans chaque puits a été analysée en utilisant le test 1 (figure 6). Ce test a permis de sélectionner et conserver les cellules de 93 puits produisant des anticorps anti- carbapénème non hydrolysé. Afin d'affiner cette sélection et ne garder que les hybridomes produisant des anticorps spécifiques du méropénème non hydrolysé, les surnageants de culture des puits sélectionnés ont été analysés à l'aide de 4 tests différents (figure 6) :

Test 1 : Dans ce test, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Une incubation est réalisée pendant 4 heures à température ambiante sous agitation. Après lavage, du traceur A NH- biotine est ajouté dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine- G4 est ajoutée pour révéler la présence du traceur A NH et donc d'anticorps anti- carbapénème non hydrolysé.

Test 2 : Dans ce test, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Une incubation est réalisée pendant 4 heures à température ambiante sous agitation. Après lavage, du traceur A H est ajouté dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence du traceur A H et donc la présence d'anticorps anti-carbapénème hydrolysé.

Test 3 : Dans ce test, du traceur A NH est mis en compétition avec du méropénème non hydrolysé vis-à-vis de la reconnaissance par les anticorps spécifiques présents dans les surnageants de culture. Pour se faire, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Une incubation est réalisée pendant 4 heures à température ambiante sous agitation. Après lavage, du traceur A NH et du méropénème non hydrolysé sont ajoutés dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence du traceur A NH.

Test 4 : Dans ce test, du traceur A NH est mis en compétition avec du méropénème hydrolysé à la même concentration que le méropénème non hydrolysé utilisé dans le test 3, vis-à-vis de la reconnaissance par les anticorps spécifiques présents dans les surnageants de culture. Pour se faire, les anticorps présents dans les surnageants de culture sont capturés par un premier anticorps anti-anticorps murin immobilisé sur la paroi de puits d'une plaque de microtitration. Une incubation est réalisée pendant 4 heures à température ambiante sous agitation. Après lavage, du traceur A NH et du méropénème hydrolysé sont ajoutés dans chaque puits. Après une incubation à 4°C pendant une nuit et après lavage, de la streptavidine-G4 est ajoutée pour révéler la présence du traceur A NH.

Pour les tests 1 et 2, l'apparition d'un signal dans les puits indique la présence d'anticorps anti-carbapénème non hydrolysé et anti-carbapénème hydrolysé respectivement (cf. Figure 9).

Pour les tests 3 et 4, une baisse des signaux proportionnelle à la concentration en inhibiteur révèle la présence d'anticorps reconnaissant l'inhibiteur : méropénème non hydrolysé (test 3) ou méropénème hydrolysé (test 4). Ces tests permettent d'évaluer la spécificité relative des anticorps pour le méropénème non hydrolysé et le méropénème hydrolysé. Ainsi, si la baisse du signal est similaire pour les deux formes de méropénème les anticorps possèdent la même affinité pour ces deux molécules. Si la baisse du signal est plus faible pour l'une des deux formes de méropénème, alors l'anticorps possède une affinité plus faible pour cette forme (cf. Figure 9).

Les puits pour lesquels est obtenu un signal pour le test 1 et pas de signal pour le test 2, une baisse du signal la plus importante du signal pour le test 3 et pas de baisse du signal pour le test 4 ont été sélectionnés. A la fin du processus de sélection, 20 hybridomes ont été conservés pour produire des anticorps monoclonaux.

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