Einzelanalyterfassung mittels magnetischer Durchflussmessung Die vorliegende Erfindung betrifft die magnetische Durch ^¬ flussmessung von magnetisch markierten Analyten, insbesondere die magnetische Durchflusszytometrie .

Im der magnetischen Durchflusszytometrie werden bislang zwei Ansätze zur Einzelzelldetektion verfolgt, bei denen das Prob ^¬ lem der eindeutigen Trennung von zwei direkt aufeinanderfolgenden Zellen folgendermaßen umgangen wird:

Wie beispielsweise aus Loureiro et al . , "Journal of Applied Physics", 2011, 109, 07B311 bekannt, werden superparamagne- tisch markierte Zellanalyten von einem magnetoresistiven Sensor erfasst. Durch den Verzicht auf eine Anreicherung der markierten Zellen sind diese zwar nicht sehr hoch konzentriert, jedoch führt dies gleichermaßen zu einer sehr geringen Wiederfindungsrate, d.h. dass nur ein geringer Prozentsatz der markierten Zellen überhaupt vom magnetoresistiven Sensor erfasst werden kann.

Alternativ wird im Stand der Technik mit verdünnten Proben gearbeitet. Mit der Verminderung der Konzentration einer

Zellsuspension in Kombination mit einer Anreicherung der magnetisch markierten Zellen vergrößert sich der Abstand und die Zellen können einzeln über den Sensor geführt werden, jedoch ergibt sich daraus sehr nachteilig eine unerwünschte Verlän- gerung der Messzeit.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Einzelzellde ^¬ tektion mit hoher Wiederfindungsrate und kurzer Messzeit an ^¬ zugeben .

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Das erfindungsgemäße Verfahren zur magnetischen Durchfluss ^¬ messung eines Analyten umfasst die folgenden Schritte:

Zunächst erfolgt die magnetische Markierung von Analyten in einer Probe. Dann wird ein Fluss der Analyte erzeugt, welcher die Analyte über eine Sensoranordnung führt, wobei der Fluss der Analyten dabei zumindest über ein magnetoresistives Bau ^¬ teil geführt wird. Außerdem wird ein magnetisches Gradienten ^¬ feld erzeugt, mittels welchem die markierten Analyte über dem magnetoresistiven Bauteil angereichert werden, und es wird ein homogenes Magnetfeldes erzeugt, welches so zum magnetore ^¬ sistiven Bauteil verläuft, dass das homogene Magnetfeld nicht vom magnetoresistiven Bauteil erfasst wird. Mittels der Sensoranordnung mit dem zumindest einen magnetoresistiven Bau- teil erfolgt die Erfassung einzelner markierter Analyte. Die magnetische Markierung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren dabei derart vorgenommen, dass die markierten Analyte je ein magnetisches Streufeld in dem homogenen Magnetfeld her ^¬ vorrufen, dessen erfassbare Maxima in einem Abstand vom Ana- lytmittelpunkt liegen, der kleiner ist als der hydrodynamische Analytradius .

Zur Erzeugung des magnetischen Gradientenfeldes sowie des ho ^¬ mogenen Magnetfeldes wird insbesondere nur eine magnetische Einheit benötigt, die eine doppelte Funktion erfüllt. In wei ^¬ terem Abstand von der magnetischen Einheit erzeugt diese das Gradientenfeld zur Anreicherung der magnetisch markierten Analyte. Nahe an der magnetischen Einheit verlaufen die Mag ^¬ netfeldlinien jedoch homogen. Die magnetische Einheit ist da- bei so zum Sensor, d.h. dem magnetoresistiven Bauteil angeordnet, dass das homogene Feld in eine Richtung verläuft, in der der Sensor nicht sensitiv ist. Das heißt zum Beispiel, dass das homogene Magnetfeld in z-Richtung verläuft, während der Sensor in x-Richtung, senkrecht dazu, sensitiv ist.

Das durch die magnetische Markierung eines Analyten im homo ^¬ genen Magnetfeld hervorgerufene Streufeld wird durch das magnetoresistive Bauteil erfasst. Insbesondere wird die x- Komponente dieses Streufeldes gemessen, wobei die x-Richtung als die Durchflussrichtung definiert ist, d.h. die Richtung des Streufeldes, die parallel zur Oberfläche des magnetore- sistiven Bauteils liegt. Diese erfassbaren Streufeldmaxima legen also einen Abstand vom Analytmittelpunkt fest, welcher im Folgenden auch magnetischer Radius genannt wird. Durch die magnetische Markierung von Analyten, beispielsweise Zellana- lyten, oder auch Beads können diese einen magnetischen Durchmesser aufweisen, der geringer ist als der optische oder hyd- rodynamische Durchmesser, was heißt, dass das maximale Streu ^¬ feld in x-Richtung innerhalb des Analytumfanges liegt. Da ^¬ durch und durch die Detektion der x-Komponente eben dieses Streufeldes, beispielsweise mit einem magnetoresistiven Bau ^¬ element, welches in dieser horizontalen x-Richtung sensitiv ist, kann die Detektion von zwei unmittelbar aufeinanderfol ^¬ genden Zellen als zwei Einzelevents getrennt erfolgen.

Dies hat also den Vorteil, auch bei hohen Zellkonzentratio ^¬ nen, in denen die Analyten in kleinstmöglichem Abstand vor- liegen, diese einzeln zu detektieren, also auch wirklich sogenannte Einzelevents auflösen zu können. Durch die geeignete magnetische Markierung wird also das Streufeld eines markier ^¬ ten Analyten insbesondere in einem vertikalen externen Magnetfeld so beeinflusst, dass eine hohe Wiederfindungsrate der magnetischen Einzelanalytdetektion gewährleistet ist.

Die Sensoranordnung kann insbesondere mindestens ein aber auch mehrere magnetoresistive Bauteile, d.h. z.B. Einzelwi ^¬ derstände aufweisen. Vorzugsweise weist die Sensoranordnung magnetoresistive Einzelwiderstände auf, die etwa in einer

Wheatstone ' sehen Messbrücke verschaltet sind. Wie aus der Pa ^¬ tentanmeldung DE 10 2010 040 391.1 bekannt ist, können da ^¬ durch besonders vorteilhaft charakteristische Signalverläufe generiert werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die magnetische Markierung mit magnetischen Na- nobeads, insbesondere superparamagnetischen Nanobeads vorge- nommen. Die Nanobeads weisen insbesondere hydrodynamische Durchmesser zwischen 10 nm und 500 nm auf. Je nach zu markierenden Analyten, beispielsweise je nach Zellsorte, bestimmt deren Oberfläche und/oder Epitopenanzahl , welche Größe und Art der Markierung besonders vorteilhaft ist. Die kleinen Na ^¬ nobeads zwischen 10 nm und 500 nm Durchmesser haben den Vorteil, dass damit Belegungsdichten auf der Analytoberflache zwischen 10 % und 90 % erreicht werden können, welche eine Verlagerung des Streufeldmaximums in das Innere des Analyten erzielen. Insbesondere wird ein Analyt, z.B. eine Zelle, so markiert, dass das Maximum der x-Komponente des Streufeldes sich zwischen 50 % und 90 % des Zellradius vom Zellmittel ^¬ punkt entfernt befindet. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die magnetische Markierung mit Nano ^¬ beads vorgenommen, welche das Material Magnetit oder das Ma ^¬ terial Maghemit aufweisen. Insbesondere weisen die zur Mar ^¬ kierung verwendeten Nanobeads ein Material auf, dessen Sätti- gungsmagnetisierung in etwa zwischen 80 und 90 emu/g beträgt.

Der Materialanteil an den Nanobeads ist dabei insbesondere so gewählt, dass die Sättigungsmagnetisierung der Magnetbeads in etwa zwischen 10 (A-m ² )/kg und 60 (A-m ² )/kg beträgt.

Beispielsweise kann mit einer derart geeigneten magnetischen Markierung bei Zellen mit durchschnittlich 12 ym Durchmesser ein Streufeldmaximum in x-Richtung bei einem Abstand vom Zellmittelpunkt von durchschnittlich 4 ym hervorgerufen wer- den. Dies ist ein besonders vorteilhafter verringerter magnetischer Radius, der gewährleistet, dass die so markierten Zellen in einem externen vertikalen Magnetfeld einzeln er- fasst werden können, auch wenn diese in direktem Kontakt zueinander über die Sensoranordnung fließen.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren die einzelnen markierten Analyte mittels des magnetischen Gradientenfeldes über dem magnetore- sistiven Bauteil angereichert, so dass sie dort lokal in ho ^¬ her Konzentration vorliegen. Ausgehend von Probenkonzentrationen zwischen 0,1 und 10 ⁴ Analyten pro Mikroliter wird die Konzentration durch die Anreicherung auf das zwischen

lOOfache bis zu lOOOOfache erhöht. Dies hat den Vorteil einer sehr hohen Widerfindungsrate, da nur ein verschwindend gerin ^¬ ger Anteil an zu detektierenden Analyten nicht nahe genug am Sensor vorbeigeführt wird, um von diesem erfasst zu werden. Gleichzeitig birgt die hohe Konzentration, bei der auch die einzelnen Analyte in direktem Kontakt miteinander stehen können, nicht den Nachteil, dass diese als Einzelevent gezählt werden, sondern aufgrund des verringerten magnetischen Radius der letztendlich von der magnetoresistiven Sensoranordnung erfasst wird, auch bei direktem Kontakt der Zellen noch ge- trennt werden können. Das Verfahren birgt also gleichzeitig die Vorteile einer hohen Widerfindungsrate des Messsystems, auch bei zwei direkt aufeinander folgenden Zellen und den Vorteil eine Messung an einer Suspension vornehmen zu können, in der die zu detektierenden Analyte in sehr hoher Konzentra- tion vorliegen. Bewirkt die magnetische Markierung, dass das Streufeldmaximum innerhalb der Zelle liegt, wird also eine Messung von zwei direkt aufeinanderfolgenden markierten Analyten als zwei Einzelevents möglich. Insbesondere überfließen also bei dem Verfahren die einzelnen Analyte das magnetore- sistive Bauteil in direktem Kontakt miteinander.

Zur Anreicherung der magnetisch markierten Analyte kann neben dem magnetischen Gradientenfeld, welches insbesondere durch einen Permanentmagneten hervorgerufen werden kann, noch zu- sätzlich eine magnetophoretische Anreicherung der magnetisch markierten Analyte erfolgen. Eine vorteilhafte magnetophore ^¬ tische Anreicherung ist beispielsweise aus der Patentanmel ^¬ dung DE 10 2009 0477 801.9 bekannt. Dabei wird zur magneti ^¬ schen Durchflusszytometrie ein System für einen gezielten Transport magnetisch markierter Zellen in einem strömenden Medium angegeben. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die Durchflussgeschwindigkeit so ein ^¬ gestellt, dass die Analyte mit konstanter Geschwindigkeit über das magnetoresistive Bauteil geführt werden. Insbesonde- re wird die Durchflussgeschwindigkeit so eingestellt, dass die Analyte, welche insbesondere Zellen sind, über dem magne ^¬ toresistiven Bauteil abrollen. Dabei werden sie insbesondere bei Kontakt mit der Kanalwand, an oder in der vorzugsweise das magnetoresistive Bauteil angeordnet ist, in Rotation ver- setzt und rollen an der Wand und damit über dem magnetore ^¬ sistiven Bauteil ab. Bei dem magnetoresistiven Bauteil oder beispielsweise den mehreren magnetoresistiven Brückenelementen handelt es sich insbesondere um GMR-Sensoren (giant magneto resistance) .

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 5 der ange ^¬ hängten Zeichnung beschrieben. Figur 1 zeigt eine Seitenansicht der magnetischen Einheit 22 zur Erzeugung des Gradientenfeldes sowie des homogenen Mag ^¬ netfeldes 220, welches mit Pfeilen senkrecht zur magnetischen Einheit 22 eingezeichnet ist. Die magnetische Markierung des Analyten 1 bewirkt ein magnetisches Streufeld des Analyten 24, dessen Magnetfeldlinienverlauf um den Analyten 1 herum gezeigt ist. Der Analyt 1 ist im Querschnitt als Kreis darge ^¬ stellt. Der Pfeil 40, von links nach rechts in der Figur 1 weisend, zeigt die Flussrichtung des Analyten 1 an. Die mag ^¬ netische Einheit 22 befindet sich beispielsweise unterhalb eines Durchflusskanals für eine Analytprobe, welche bei ^¬ spielsweise eine Zellprobe ist.

Die doppelte Funktion der magnetischen Einheit 22 kann z.B. folgendermaßen beschrieben werden: Das Gradientenfeld, er- zeugt vom externen Magneten 22 zieht die superparamagnetisch markierten Zellen 1 an die Sensoroberfläche 20. Dort liegen die Zellen 1 stochastisch verteilt vor. Im Fluss 40 werden die Zellen 1 z.B. mit Hilfe von Nickelstreifen magnotophore- tisch über die magnetoresistiven Sensoren 20 geführt. Direkt über dem Sensor 20 wird ein im Wesentlichen homogenes Feld 220 generiert, welches, wie in Figur 1 gezeigt, nur in z- Richtung verläuft. So ein vertikales Feld 220 sieht der Sen- sor 20 nicht, denn er ist nur in x-Richtung sensitiv. In Figur 1 sieht man also beispielsweise eine superparamagnetisch markierte Zelle 1, die das Feld 220 in ihrer Umgebung ver ^¬ zerrt. Die x-Komponente dieses Streufeldes 24 ist das Feld, das mit dem Sensor 20 erfasst wird. In der Vorrichtung wird also die Inhomogenität des Magneten 22 ausgenutzt, der das externe Feld generiert. Dabei handelt es sich z.B. um einen NeFeB Magneten. Je nach Qualität des Magneten 22 variiert der homogenen Bereich 220 nahe am Magneten 22. Genau dieser Bereich wird unter dem Sensor 20 platziert. Das Gradientenfeld, für die Anreicherung benötigt wird ist dann gegeben durch die Inhomogenität des Magnetfeldes außerhalb des homogenen Be ^¬ reichs 220.

Die Figur 2 zeigt ein Diagramm mit einer Verteilungsfunktion N und quadratisch eingezeichneten Messpunkten. Dabei wurde gemessen, wie viele Analyte 1, welche beispielsweise Zellen sind, ein Streufeld 24 aufweisen, dessen Maximum in x- Richtung, welche von den Sensoren detektiert wird, einen gewissen Abstand Δχ vom Zentrum des Analyten beträgt. Dieser Abstand Δχ ist in ym angegeben.

In der Figur 3 ist wiederum die Darstellung des Permanentmagneten 22 und des durch den Permanentmagneten 22 erzeugten homogenen Magnetfeldes 220 dargestellt. Die Zelle 1 weist einen optischen oder hydrodynamischen Durchmesser r _opt auf, aber auch einen sogenannten magnetischen Durchmesser r _mag , welcher insbesondere kleiner ist als der optische Durchmesser r _opt , d.h. der innerhalb der Zelle 1 liegt. Dieser kleinere Durch ^¬ messer liegt daran, dass die maximale Streufeldkomponente in x-Richtung, die von den Magnetsensoren 20 erfasst wird, an einer Position der Zelle liegt, welche sich innerhalb der Zelle 1 befindet. D.h. auch wenn die magnetischen Marker auf der Oberfläche der Zelle 1 sitzen, ist das durch die magneti- sehe Markierung erzeugte Streufeld 24 nicht nur außerhalb, sondern auch innerhalb der Zelle 1 zu finden und sogar dessen Maximum in x-Richtung. Die Figur 4 zeigt schematisch den Messaufbau, sozusagen einen Ausschnitt aus einer Mikrofluidik mit einem Durchflusskanal. Der Kanalboden 11 weist zumindest einen Magnetsensor 20 auf und unterhalb des Kanalbodens 11 ist die magnetische Einheit 22 zur Erzeugung des Gradientenfeldes sowie des homogenen Magnetfeldes 220 angebracht. Der Magnetsensor 20 weist insbe ^¬ sondere eine Länge X20 in Durchflussrichtung 40 auf. Der ers ^¬ te maximale Messausschlag passiert jedoch nicht in dem Mo ^¬ ment, in dem die Zelle 1 mit ihrem optischen oder hydrodyna ^¬ mischen Durchmesser r _op t den Sensor 20 erreicht, sondern wie durch eine gestrichelte Linie angezeigt, erst wenn das in der Zelle 1 verlaufende magnetische Streufeld 24 sein Maximum der x-Komponente über den Rand des Sensors 20 schiebt. Diese Stelle markiert den magnetischen Radius r _mag , welcher insbesondere kleiner ist als der optische Radius r _op t der Zelle 1. Hat die Zelle 1 den Magnetsensor 20 überstrichen, wird ein zweiter maximaler Messausschlag in die andere Magnetfeldrichtung registriert.

Die Figur 5 schließlich zeigt wie sich das über einen Zeit- räum aufgenommene magnetoresistive Signal von mehreren auf ^¬ einanderfolgenden Zellen 1 verhält. Für den Fall, dass der magnetische Durchmesser r _mag mit dem optischen oder tatsächlichen Zellendurchmesser r _op t der Zelle 1 zusammenfällt, würde bei Überstreichen von zwei aneinanderliegenden Zellen 1 wie oben in der Figur 5 gezeigt, ein erster positiver Messausschlag, verursacht durch die erste den Sensor 20 überstrei ^¬ chende Zelle 1, und ein zweiter negativer Messausschlag, ver ^¬ ursacht durch das Ende der zweiten Zelle 1, detektiert wer ^¬ den. Da aber nun der magnetische Durchmesser innerhalb der Zelle 1 liegt, sind die Messausschläge, die mit dem Maximum der x-Komponente des Streufeldes 24 einer Zelle 1 zusammen ^¬ hängen soweit voneinander getrennt Ati, dass jede Zelle 1 ein vollständiges Messsignal von zwei Messausschlägen hervorruft, wie im unteren Diagramm der Figur 5 gezeigt. Der zeitliche Abstand der Messausschläge At eines Zellsignals korreliert mit dem magnetischen Durchmesser 2-r _mag einer magnetisch markierten Zelle 1. In der Figur 5 ist auch wieder das homogene Magnetfeld 220 in z-Richtung eingezeichnet. Der Abstand der Zellen 1 zum Kanalboden 11 ist mit Z20 markiert. Die Zellen 1 überstreichen den Magnetsensor 20 in Durchflussrichtung 40.