Bestimmung der Aktivität von Proteasen

Gegenstand der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung desselben zur Bestimmung der Aktivität wenigstens einer Protease in einer flüssigen Messprobe, welche neben der wenigstens einen Protease, deren Aktivität zu bestimmen ist, gegebenenfalls wenigstens einen zu der Protease korrespondierenden Proteaseinhibitor enthält.

Hintergrund der Erfindung

Zur Bestimmung der Konzentration von Enzymen in Gewebehomogenaten oder in Körperflüssigkeiten, zum Beispiel im Blutserum, stehen enzymatische Tests und immunologische Tests (zum Beispiel ELISA) zur Verfügung.

In der vorhandenen medizinischen Literatur wird berichtet, dass beim Tumorwachstum, bei der Tumorinvasion und bei der Bildung von Metastasen lysosomale Proteasen beteiligt sind, wie z.

B. die Cysteinproteasen Cathepsin B, H, L. Dabei konnte gezeigt werden, dass z. B. Cathepsin

B von Tumorzellen in die Plasmamembran und in den extrazellulären Raum freigesetzt wird, wo diese Proteasen am Abbau und der Auflösung der extrazellulären Matrix mitwirken.

Da erhöhte Proteaseaktivitäten in von Tumoren befallenen Geweben und in Körperflüssigkeiten (Blut, Urin, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit etc.) bei Tumorpatienten auftreten, die unter den verschiedensten Arten von Krebs leiden, könnten solche Proteasen als Tumormarker sehr effektiv sein, um einerseits Diagnose und Prognose solcher Krankheiten zu erleichtern und andererseits als mögliche Ansatzpunkte für ein therapeutisches Eingreifen zu dienen. So wird z. B. Cathepsin B (Cysteinprotease) in der Literatur als Tumormarker diskutiert (Cancer Research 2005, 65 (19), Oct. 1/2005, S. 8608 ff. Kopitz et al.)

Eine zuverlässige Messung des Gehalts solcher Enzyme im Gewebe und in Körperflüssigkeiten ist sehr wünschenswert.

Prinzipiell stehen zur Bestimmung der Konzentration von Enzymen in biologischen Proben immunologische Verfahren (z. B. ELISA) und enzymatische Aktivitätsmessungen zur Verfügung.

Aus Clinical Cancer Research Vol. 3,1815-1822, Oct. 1997 (Kos et al) ist z. B. bekannt, Cathepsin B mit Hilfe des Elisa-Verfahrens (immunologisch) zu bestimmen.

Die hier betrachteten Enzyme, die Proteasen, zeichnen sich durch zwei Eigenschaften aus, die bei ihrer Konzentrationsbestimmung zu berücksichtigen sind:

1. Proteasen kommen in biologischen Proben gewöhnlich immer zusammen mit ihren Vor- stufen, den Proenzymen, vor.

2. Proteasen sind in biologischen Proben durch körpereigene Inhibitoren ganz oder teilweise inhibiert.

Wie eigene Versuche mit Blutserum zeigen, ist dort vor der eigentlichen Aktivitätsmessung eine Deinhibierung vorzunehmen, wenn man z. B. die Aktivität von Cathepsin B in der Probe ermitteln soll.

Die immunologische Gehaltsbestimmung solcher Proteasen misst in der Probe auf Grund der Methode an sich immer nur die Summe aus aktivem Enzym, inhibiertem Enzym, denaturiertem Enzym und Proenzym.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen, die die enzymatische Aktivitätsm essung betreffen, kann man hingegen die Werte von aktivem und inhibiertem Enzym separat messen, sofern in der biologischen Probe beide Enzymformen nebeneinander vorliegen.

Aus der EP 0 776 374 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Enzymaktivität in biologischen Proben wie Gewebehomogenaten bekannt, wobei beispielhaft einem Ca- thepsin körpereigene Inhibitoren, die zur Superfamilie der Cystatine gehören, affinitäts- chromatographisch entzogen werden, indem man eine biologische Probe über eine Affinitätschro- matographiesäule mit kovalent an Sepharose gebundenem Papain laufen lässt. Papain, bei dem es sich ebenfalls um eine Cysteinprotease handelt, besitzt eine höhere Bindungsaffinität zu Cystatinen als die Cathepsine, weshalb das Papain dem Cathepsin den Inhibitor entzieht.

In immunologischen Tests, wie dem ELISA, werden die in einer Probe vorhandenen Enzyme spezi- fisch mittels Antikörpern nachgewiesen. Der immunologische Test ist zwar in der Regel sensitiver als der enzymatische Test, jedoch unterscheiden die Antikörper, z. B. bei den Cystein-Proteasen, nicht zwischen aktivem Enzym, durch Inhibitoren gehemmtem Enzym, Proenzym und denaturiertem Enzym. Da es bei der Bestimmung von Enzymen in biologischen Proben in der Regel auf die von den Enzymen bereitgestellte Aktivität ankommt, weil diese letztendlich biologische Vorgänge auslöst oder katalysiert, ist der Aussagegehalt vieler immunologischer Tests, welche die vorgenannten Bestimmungsergebnisse liefern, für die medizinische Analytik und Diagnostik mangelhaft.

Aus der Literatur sind Cathepsin-Aktivitätsmessungen mit einem fluorogenen Substrat (AMC) bekannt, und zwar aus Gewebeproben (Homogenaten).

Jedoch liegen auch Messungen über Cathepsin-Aktivität mit AMC in Körperflüssigkeit (Cerebrospi- nale Flüssigkeit) vor.

In beiden Fällen wird über Messungen ohne Inhibitorentzug mit Z-Arg-Arg-AMC als flourogenem Substrat berichtet.

Die Angaben in der o. g. Literatur belegen, dass die Autoren meinen, in den Gewebeproben und Körperflüssigkeiten das gesamte Cathepsin gemessen zu haben.

Im Falle von Gewebeproben aber lässt sich die Gesamtmenge aus aktivem und inhibiertem Enzym enzymatisch nur nach vorheriger Deinhibierung messen.

Weitere Literaturstellen berichten von Messungen der Enzymaktivitat im Blutserum

Skrzydlewska, E et al , " Evaluation of Serum Cathepsine B and D in Relation to chnicopathological Staging of colorectar Cancer ", World J Gastroenterol 2005, 11 (27), Seiten 4225 - 4229, beschrei- ben die enzymatische Bestimmung von Cathepsin B im Blutserum, wobei die enzymatische Abspaltung von p-Nιtroanιlιn (pNA) aus Bz-DL-Argιnιn-pNA als Maß für die Enzymaktivitat mit Hilfe einer optischen Messmethode bestimmt wird

Siewinski, M et al , "A compaπson of Cysteine peptidase activity and their Inhibitors in the blood serum of pregnant women", Pakistan Journal of Medical Sciences, 2004, 20 (4), Seiten 381 - 384, beschreiben Arbeiten zur fluoπmetrischen Bestimmung der Enzymaktivitat von Cathepsin B Dabei wird das Fluorogen AMC (7-Amιno-4-methyl-cumaπn) aus dem Substrat Z-Arg-Arg-AMC abgespaltet

In beiden Fallen wurden jedoch keine Kontrollen mit spezifischen Inhibitoren durchgeführt, die zeigen wurden, dass die gemessene Freisetzung des Fluorophors tatsächlich von einer Cysteinprotea- se bzw von Cathepsin B herrührt Es fand auch jeweils keine Entfernung von Inhibitoren vor der Messung statt

In eigenen Kontrollversuchen mit dem Einsatz des für die Cysteinproteasen spezifischen Inhibitors E64 und des für Cathepsin B spezifischen Inhibitors CA-074 (beide Inhibitoren sind synthetisch hergestellt und kauflich) wurde festgestellt, dass man in Blutseren von Tumorpatienten und gesunden Probanden nur nach vorheriger Deinhibierung eine dem Cathepsin B zukommende Proteaseaktivitat messen kann, dass also alles im Blutserum befindliche Cathepsin B durch Cysteinproteaseinhibito- ren gehemmt ist

Gewebeproben als Ausgangsmaterial zur Bestimmung der Proteaseaktivitat haben jedoch den Nachteil, dass man sie erst bei einer Operation oder durch Biopsie erhalt, was eine beschwerliche Methode der Probengewinnung für die Tumorfruherkeπnung ist Gewebeproben werden ublicher- weise erst in einem Stadium entnommen, wenn eine Tumorerkrankung bereits diagnostiziert wurde oder zumindest Hinweise darauf eine Erkrankung vermuten lassen Es wäre daher wünschenswert, ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der Proteasen in einer leicht zuganglichen biologischen Probe, wie Blut, Urin oder Sputum zu erhalten Es hat sich jedoch gezeigt, dass viele Proteasen, die als Marker (insbesondere Tumormarker) in Frage kommen, im Blut durch entsprechende Inhibitoren gehemmt vorliegen

Aufgabe

Die Aufgabe der Erfindung bestand somit dann, ein Verfahren und praxisgerechte Vorrichtungen zur Durchfuhrung desselben bereitzustellen, mit dem sich auf einfache Weise (und bereits in einem fru- hen Stadium einer relevanten Krankheit mit größerer Genauigkeit als beim Stand der Technik, jedenfalls mit ausreichender Genauigkeit) die Konzentration von Proteasen in biologischen Proben und Flüssigkeiten, insbesondere im Blutserum, zuverlässig bestimmen lasst, wobei die Bestimmung auch solche Proteasen umfassen soll, die durch Bindung körpereigener (endogener) Inhibitoren gehemmt sind Dabei werden denaturierte Formen und Vorlauferstufen der Proteasen nicht erfasst

Lösung

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelost durch die in Anspruch 1

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität wenigstens einer Protease in einer flussigen Messprobe, welche neben der wenigstens einen Protease, deren Aktivität zu bestimmen ist, gegebenenfalls wenigstens einen zu der Protease korrespondierenden Proteaseinhibitor enthalt, mit den Stufen, in denen man der Protease in der Messprobe den Proteaseinhibitor entzieht, indem man die Messprobe mit einem Tragermaterial in Kontakt bringt, an welchem eine Inhibitorbindesubstanz kovalent oder adsorptiv gebunden ist, die eine höhere Affinitat / Bindungsstarke zu dem Proteaseinhibitor besitzt als die Protease selbst, das Tragermatenal mit daran gebundenem Proteaseinhibitor von der Messprobe separiert, der Messprobe ein Substrat für die wenigstens eine Protease, deren Aktivität zu bestimmen ist, zugibt und die proteolytische Umsetzung des Substrates durch die Protease erfasst,

sowie in den mit dem Anspruch 1 verbundenen Ansprüchen 11 und 12 angegebenen Merkmalen

In einer Ausfuhrungsform der Erfindung ist die wenigstens eine Protease aus der Familie der

Cathepsine ausgewählt, vorzugsweise unter Cathepsinen B, H, K, L und / oder S Besonders bevorzugt ist die wenigstens eine Protease Cathepsin B

Die Bestimmung von Cathepsin B ist aus medizinischer Sicht von besonderer Bedeutung, da eine erhöhte Konzentration an Cathepsin B im Blut als Tumormarker in der Literatur bereits diskutiert wird (s oben ¹ )

In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist die flussige Messprobe eine Blutprobe, Blutplasma oder Blutserum Besonders bevorzugt ist die flussige Messprobe Blutserum In einer alternativen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist die flussige Messprobe Urin oder Sputum

In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens umfaßt das Substrat für die wenigstens eine Protease eine Di- oder Oligopeptidsequenz, an deren C-Termιnus direkt oder über einen Linker ein Fluorogen gebunden ist, welches von der Protease abgespalten wird Das Fluoro- gen wird in dem Verfahren bei der proteolytischen Reaktion vorzugsweise von der Di- oder Oligopeptidsequenz abgespalten

Ein Beispiel für eine Dipeptidsequenz, welche von der Cysteinprotease Cathepsin B spezifisch er- kannt und gespalten wird, ist Arg-Arg Als Substrat eignet sich somit zum Beispiel Z-Arg-Arg-AMC, wobei Z eine Schutzgruppe darstellt, die an den N-Termιnus der Peptid-Sequenz gebunden ist

Es ist erfindungsgemaß besonders bevorzugt, wenn das ungespaltene Substrat, welches die Dioder Oligopeptidsequenz und das Fluorogen umfasst, ein Maximum der Fluoreszenz-Emissions- Wellenlange besitzt, das sich von dem Maximum der Fluoreszenz-Emissions-Wellenlange des durch die Protease bei der proteolytischen Reaktion abgespaltenen Fluorogens um wenigstens 20 nm, vorzugsweise wenigstens 40 nm oder wenigstens 60 nm oder wenigstens 80 nm, besonders bevorzugt wenigstens 100 nm unterscheidet (Falls das Emissionsspektrum kein ausgeprägtes Maximum aufweist, kann ein (z B statistisch) repräsentativer Wert des Emissionsspektrums auch alternativ gelten)

Sind die Wellenlangen bzw die Wellenlangenmaxima der Fluoreszenz-Emission des ungespaltenen Substrats und des abgespaltenen Fluorogens gleich oder liegen sie eng beieinander, so werden bei der Messung sowohl die Eigenfluoreszenz des ungespaltenen Substrats als auch die Fluoreszenz- Emission des abgespaltenen Fluorogens erfaßt Solche Substrate und Fluorophore mit gleichen

Fluoreszenz-Emissions-Wellenlangen sind aus dem Stand der Technik bekannt Bei diesen Substraten ist eine Messung trotz der übereinstimmenden Fluoreszenz-Emissions-Wellenlangen möglich, wenn die Intensität der Fluoreszenz-Emission des Fluorogens gegenüber derjenigen des ungespaltenen Substrats bei gleicher oder ähnlicher Wellenlange deutlich starker ist (Die Verstärkung des Signals wird dann im Vergleich zu einer enzymfreien Negativkontrolle als ein Maß für die Enzymak- tivitat ausgewertet) Ein Nachteil solcher Substrate besteht dann, dass ein signifikantes Ergebnis erst bei starker enzymatischer Aktivität und somit einer sehr deutlichen Erhöhung der Fluoreszenz- Emission gemessen werden kann, da das Signal bei geringer enzymatischer Aktivität häufig zu

schwach ist und sich nicht ausreichend stark von der Grundfluoreszenz des ungespaltenen Substrats unterscheidet. Das Signal geht im Hintergrundrauschen unter oder hebt sich zumindest nicht aussagekräftig davon ab.

Eine Verschiebung der Detektionswellenlänge der Fluoreszenz-Emission zwischen dem Substrat und dem abgespaltenen Fluorogen hat den besonderen Vorteil, dass bei dieser Wellenlänge im wesentlichen nur das von dem Substrat abgespaltene Fluorophor und damit nur eine tatsächlich stattgefundene enzymatische Reaktion erfaßt wird. Je weiter die Emissionswellenlänge des abgespaltenen Fluorophors von der Fluoreszenz-Emissions-Wellenlänge des Substrates entfernt ist, desto empfindlicher kann die Bestimmung der Proteaseaktivität sein. Erst nach Zugabe des Substrats beginnt eine zeitlineare Zunahme der Konzentration des abgespaltenen Fluorogens.

Bei der Enzymaktivitätsmessung von Proteasen mit dem AMC-Substrat im Blutserum kommt nun noch der erschwerende Umstand hinzu, dass das Blutserum selbst bei der Detektionswellenlänge von 460 nm für das enzymatisch abgespaltene AMC-Fluorogen eine starke Eigenfluoreszenz aufweist.

Aus eigenen Versuchen zur Bestimmung der Aktivität von Cathepsin B im Blutserum in Mikroti- terplatten mit Hilfe eines Fluoreszenzreaders mit dem AMC-Substrat geht hervor, dass sich in der vorgegebenen Messzeit bei 460 nm kein Messsignal aus der bei dieser Wellenlänge vorhandenen Hintergrundfluoreszenz abhebt, die sich aus der Eigenfluoreszenz des Blutserums und der Eigenfluoreszenz des AMC-Substrats zusammensetzt, die wiederum teilweise durch das Blutserum ge- quencht ist.

überraschenderweise jedoch ergibt sich, dass mit dem AFC-Substrat bei 508 nm ein mit dem Fortgang der enzymatischen Reaktion linear ansteigendes Messsignal vorhanden ist, das der Fluoreszenzemission des bei der enzymatischen Reaktion abgespaltenen AFC-Fluorogens zuzuordnen ist.

Bei der Wellenlänge von 508 nm für die Fluoreszenzemission des AFC-Fluorogens ist die Eigenfluo- reszenz des Serums weitaus geringer als bei 460 nm, und die Eigenfluoreszenz des AFC-Substrats ist bei 508 nm Null.

So erweist sich unter diesen Messbedingungen das AFC-Substrat zur Aktivitätsmessung von Cathepsin B im Blutserum als mindestens 10 mal empfindlicher als das AMC-Substrat und macht die Aktivitätsmessung von Cathepsin in Blutserum jedenfalls im Fluoreszensreader erst möglich.

Ein deshalb erfindungsgemäß besonders bevorzugt eingesetztes Substrat ist Z-Arg-Arg-AFC, bei dem das Fluorogen 7-Amino-4-Trifluormethylcumarin (AFC) (handelsüblich erhältlich) ist.

Bissell, E R et al , „Synthesis and Chemistry of 7-Amιno-4-(tπfluormethyl)-coumaπn and its Amino Acids and Peptide Derivatives", J Org Chem 1980, 45, Seiten 2283 - 2287, beschreiben die Synthese des fluorogenen Substrates AFC (7-Amιno-4-tπfluormethylcumaπn)

Beispielsweise eignet sich für die Bestimmung der Konzentration der Cysteinprotease Cathepsin B ein Substrat aus dem Dipeptid Arg-Arg, an dessen C-Termιnus das Fluorophor 7-Amιno-4- Tπfluormethylcumaπn kovalent gebunden ist Das Dipeptid Arg-Arg ist in dem Substrat am N- Terminus mit einer Schutzgruppe Z versehen Dieses Substrat wird hierin nachfolgend auch als Z- RR-AFC bezeichnet Das Substrat Z-RR-AFC besitzt eine Fluoreszenz-Emissions-Wellenlange von etwa 400 nm, wogegen die Fluoreszenz-Emissions-Wellenlange des reinen Fluorophors AFC bei 505 nm hegt

Des Weiteren ist die Verwendung des Fluorophors 7-Amιno-4-Methycumaπn (AMC) bekannt, wel- ches für die Aktivitatsmessung von Cathepsin B ebenfalls in Verbindung mit dem Dipeptid Arg-Arg als Substrat eingesetzt werden kann (Z-RR-AMC) Dieses Substrat hat jedoch den oben beschriebenen Nachteil, dass die Fluoreszenz-Emissions-Wellenlangen sowohl des Substrats Z-RR-AMC als auch des freien Fluorogens AMC bei der gleichen Wellenlange von etwa 460 nm liegen Eine Diskriminierung zwischen ungespaltenem Substrat und gespaltenem Fluorophor ist in diesem Fall da- her nur über die Signahntensitat möglich, nicht jedoch über die Emissionswellenlange Die Empfindlichkeit der Messung ist für manche Falle bei vorausgehender Deinhibierung aber doch ausreichend, vor allem, wenn Messproben von größerer Enzymkonzentration (z B Gewebeproben) oder von größerem Volumen vorliegen Die Verwendung eines Fluoπmeters (mit 90° Winkel zwischen anregender und emittierter Strahlung) kann bei Einsatz von AMC zusätzlich - wegen höherer Empfind- lichkeit gegenüber der Detektion in Durchsicht (Fluoreszenzreader) - vorteilhaft sein

Aus der EP 0776 374 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Deinhibierung der Protease einer flussigen Messprobe bekannt Dabei wird die flussige Messprobe durch eine Durchflusssaule geschickt, in der sich ein Sepharose-Gel befindet, an das die Inhibitorbindesubstanz kovalent gebun- den ist Bei dieser kontinuierlichen Affinitatschromatographie geht der Inhibitor des Enzyminhibitor- komplexes in der Messprobe auf die Inhibitorbindesubstanz über und aus der Säule wird die Messprobe mit Inhibitor-freiem Enzym eluiert, das dann der Aktivitatsmessung zugeführt wird

Da Agarose-Gel weniger Protein unspezifisch adsorbiert als Sepharose-Gel, bringt die Verwendung von Agarose-Gel bei dieser affinitatschromatographischen Inhibitorabtrennung einen wesentlichen Vorteil bezüglich der Nachweisempfindlichkeit des anschließend in seiner Aktivität zu messenden deinhibierten Enzyms

Ein weiterer großer Vorteil bringt aber der Ersatz des Sepharose- bzw Agarose-Gels durch ein festes Tragermateπal, auf welchem die Inhibitorbindesubstanz kovalent oder nicht-kovalent (adsorptiv) gebunden ist Die Verwendung einer Folie oder einer Membran als Tragermateπal für die Inhibitor- bindesubstanz hat den entscheidenden Vorteil, dass das feste Tragermateπal einfach zu handhaben und anzuwenden ist Das feste Tragermateπal in der Form einer Folie oder einer Membran kann mit der flussigen Messprobe einfach durch Eintauchen des Tragermateπals in die Probe in Kontakt gebracht werden, ohne dass aufwandige Apparaturen und Aufbauten, wie beispielsweise eine Durchflusssaule oder ähnliches, erforderlich sind

Nach erfolgter Demhibierung kann dann das feste Tragermateπal mit der Inhibitorbindesubstanz, auf die der Inhibitor übergegangen ist, aus der Messprobe herausgezogen werden

Die Inhibitorbindesubstanz kann dabei kovalent oder adsorptiv an das feste Tragermaterial gebunden sein Die Verwendung eines Tragermateπals, an dem die Inhibitorbindesubstanz kovalent daran gebunden ist, ist besonders vorteilhaft, da in diesem Fall beim Kontakt des festen Tragermateπals mit der flussigen Messprobe die Gefahr ausgeschlossen ist, dass sich Inhibitorbindesubstanz von dem festen Tragermateπal lost, in die Messprobe gelangt und das Messergebnis verfälscht

Das Tragermateπal kann jedes Material sein, welches geeignet ist, eine Inhibitorbindesubstanz, die üblicherweise ein Peptid oder ein Protein ist, ausreichend fest kovalent oder adsorptiv zu binden

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung umfasst das Tragermateπal Nylon oder Nitrozellulose oder ist daraus hergestellt Entsprechende Nylon- oder Nitrozellulosefolien oder - membrane, an welche sich Substanzen, insbesondere Peptide oder Proteine kovalent oder nicht- kovalent binden lassen, sind handelsüblich erhältlich

Die Inhibitorbindesubstanz ist für die zu bestimmende Protease und insbesondere für den oder die in der Messprobe vorhandenen Inhibitoren speziell auszuwählen und kann hier nicht abschließend festgelegt werden Für die Familie der Cystemproteasen gilt Ihre Inhibitoren binden an die pflanzli- che Protease Papain mit höherer Affinität und Bindungsstarke als Cathepsin B, was auch durch eigene Versuche bestätigt wurde

Somit kann der Inhibitorentzug aus der Messprobe auf einfache Weise sowohl in einem klinischen Labor in Mikrotiterplatten, aber auch direkt in der Arztpraxis (im Blutserum) ohne großen Aufwand durchgeführt werden

Der Inhibitorentzug aus der Messprobe kann somit auf einfache Weise sowohl in einem klinischen Labor, aber auch direkt in der Arztpraxis ohne großen Aufwand durchgeführt werden Besonders

bevorzugt ist es, wenn die Inhibitorbindesubstanz kovalent an das Tragermatenal gebunden ist Beim Inkontaktbπngen des festen Tragermateπals mit der flussigen Messprobe ist dann die Gefahr ausgeschlossen, dass sich die Inhibitorbindesubstanz von dem festen Tragermatenal lost und in die Messprobe gelangt und darin das Messergebnis verfalschen kann Das Tragermatenal kann jedes Material sein, welches geeignet ist, eine Inhibitorbindesubstanz, welche üblicherweise ein Oligopeptid oder ein Protein ist, ausreichend fest kovalent oder adsorptiv zu binden

Die Inhibitorbindesubstanz ist für die zu bestimmende Protease und insbesondere den oder die in der Messprobe vorhandenen Inhibitor speziell auszuwählen und kann hier nicht abschließend fest- gelegt werden Für die Familie der Cysteinproteasen gilt Ihre Inhibitoren binden an die Pflanzenpro- tease Papain mit höherer Affinitat und Bindungsstarke als Cathepsin B

Die Erfindung wird nachfolgend anhand spezifischer Beispiele und Vergleichsversuche weiter beschrieben und naher erläutert Die Begriffe Fluorophor und Fluorogen sollen gleiche Bedeutung ha- ben

Beispiele:

Die Erfindung wird anhand von Beispielen und Untersuchungen mit der lysosomalen Cystein- Protease Cathepsin B im Blut bzw im Blutserum weiter erläutert

Ergebnisse der Messungen:

a Messung der katalytischen Aktivität von Cathepsin B

a 1 Einfuhrung

Die Aktivitatsmessung von Cathepsin B beruht auf der Spaltung eines Dipeptid-Substrats

Z-Arg-Arg-Fluorophor -> Z-Arg-Arg + Fluorophor

(Z = Schutzgruppe, Arg = basische Aminosäure Arginin)

Für die empfindliche Messung der Aktivität von Cathepsin B wurden Fluoreszenz-Methoden mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren eingesetzt, nämlich AMC (Biomol) und AFC (Biovision)

Das freie AMC fluoresziert bei der gleichen Wellenlange wie das Substrat, aber mit höherer Fluoreszenzausbeute Daher kommt es bei der katalytischen Spaltung zu einer Zunahme der Fluoreszenz

Die auf AFC beruhende Methode hat eine erhöhte Sensitivitat Die erhöhte Sensitivitat beruht auf der Verschiebung der Fluoreszenz des freien Fluorophors zu einer längeren Wellenlange gegenüber der Wellenlange des Substrats Dadurch kann die Fluoreszenz des Substrats aus der Messung eli- miniert und eine geringere "Hintergrundfluoreszenz" erreicht werden

Als Sensitivitat der Aktivitatsmessung wird allgemein ein Wert definiert, der ein mehrfaches der Differenz darstellt, also

Z mal (Messwert - Hintergrundswert)

Der Messwert muss vom Hintergrundwert "signifikant" unterschiedlich sein

a 2 Aktivitatsmessung

Die Fluoreszenzmessungen wurden auf 96-well Mikrotiterplatten mit Hilfe von Fluoreszenzreadern (für Messungen mit AMC, Anregung bei 355nm, Fluoreszenz bei 450 nm) (für Messungen mit AFC, Anregung bei 400 nm, Fluoreszenz bei 508 nm) durchgeführt

Bei der AMC-Methode erfolgten die Testreaktionen direkt bei Raumtemperatur auf der Microtiterplat- te, die vorher durch Inkubation mit Albumin desensitiviert worden waren, um eine Bindung von Proteinen an den Kunststoff zu vermeiden

Bei der AFC-Methode wurde der Ansatz zur Aktivitatsbestimmung in Reaktionsgefaßen bei 37°C durchgeführt Der Inhalt des Reaktionsgefaßes wurde unmittelbar vor der Messung der Fluoreszenz in die Microtiterplatte überfuhrt

a 3 Lineantat der Fluoreszenz der freien Fluorogene AMC und AFC in Abhängigkeit von der Konzentration

Ergebnis Die Fluoreszenzen von AMC und AFC waren mit den verwendeten Testansat- zen/lnstrumenten linear (r ² = 0 9999)

a 4 Lineantat der Aktivität von gereinigtem Cathepsin B in Abhängigkeit von der Enzymkonzentrati- on mit beiden Substraten

Ergebnis Die Bestimmungen Aktivitäten von gereinigtem Cathepsin B waren linear abhangig von der eingesetzten Enzymkonzentration

a 5 Lineaπtat der Aktivitatsbestimmung in Abhängigkeit von der Messzeit

Ergebnis Die Freisetzung des Fluorophors vom Substrat war gemäß Messungen bis 90 min in zwei Testansatzen linear

b Vorhandensein von Inhibitoren von Cathepsin B in humanem Serum

Das Vorhandensein von Inhibitoren von Cathepsin B in humanen Seren ohne spezifische pathologi- sehe Befunde wurde mit Hilfe von gereinigtem Cathepsin B überprüft

Ergebnis Die scheinbare Aktivität von gereinigtem Cathepsin B nahm in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von ("normalem") humanem Serum stark ab (bis auf <40% in Gegenwart von 10% Serum, s Fig 2a)

Eine Abnahme von 30-35% bei 10% Serum war auf eine "Fluoreszenz-Unterdrückung" (fluorescence quenching) durch die Eigenabsorption/Lichtzerstreuung des Serums bedingt, was durch den Em- fluss von Serum auf die Fluoreszenz des freien AMC nachgewiesen wurde (s Fig 2b)

Für Untersuchungen in Abwesenheit von Serum war das AMC System jedoch nützlich

c Hemmung von Cathepsin B durch Cystatin A

Die Hemmung von Cathepsin B durch den bekannten Inhibitor Cystatin A wurde in vitro mit zwei unterschiedlichen Cathepsin B Konzentrationen untersucht

Ergebnis Die Hemmung durch Cystatin A war nur wenig abhangig von der Cathepsin B Konzentration (Fig 3)

d Untersuchung einer Aufhebung der Hemmung von Cathepsin B durch Cystatin A mittels Behandlung mit immobilisiertem Papain

Immobilisiertes Papain (kovalent gebunden an quervernetzte 6% Agarose-Spharen, beladen mit Papain

Vorbehandlung Ein äquivalent der Suspension wurde mit 5-10 äquivalenten Testpuffer 5 Mal gewaschen, wobei der überstand durch Zentπfugation abgetrennt wurde Nach dem letzten Waschen wurde das Sediment sorgfaltig mit Fließpapier getrocknet und auf das ursprungliche Suspensionsvo-

lumen mit Testpuffer aufgefüllt

Anmerkung Es ist grundsätzlich zu unterscheiden zwischen der hier zunächst beschriebenen Pa- painbehandlung von reinem Cathepsin B und der spater durchgeführten Behandlung von Serumpro- ben, die auf Raumtemperatur und auf kurze Zeit angelegt war

d 1 Durchfuhrung der Behandlung

Die 50% Papain-Agarose Suspension wurde in entsprechenden Volumina in Polypropylenrohrchen gegeben, die feste Phase abzentπfugiert und der überstand sorgfaltig mit Pipette und Fließpapier abgenommen Zur immobilisierten Phase wurden 160μl Enzymlosung gegeben und inkubiert

Der Ansatz wurde zentπfugiert, ein überstand wurde abgenommen und in den Test (entweder auf eine behandelte Mikrotiterplatte oder in 0 5 ml Rohrchen) überfuhrt Zu diesem überstand wurde ein Volumen einer Puffer-Substralosung gegeben und 120 min inkubiert, gefolgt von der Messung im Fluoπmeter

d 2 Zeitabhangigkeit der Stabilität von Cathepsin B in Gegenwart von Papain

Die Stabilität von Cathepsin B in Gegenwart von immobilisiertem Papain wurde über einen Zeitraum von 120 min bei 4°C untersucht (Fig 4)

Folgerung Die Behandlung von Cathepsin B sollte mit einer möglichst kleinen Menge an immobilisiertem Papain über einen möglichst kurzen Zeitraum durchgeführt werden

d 3 Aufhebung der Hemmung von Cathepsin B durch Cystatin A durch Behandlung mit immobilisiertem Papain

Die Aufhebung der Hemmung von Cathepsin B durch den definierten Inhibitor Cystatin A wurde bei steigenden Konzentrationen an immobilisiertem Papain in 2 unabhängigen Experimenten (5 und 10 ng Cathepsin B pro Ansatz, jeweils mit Doppelbestimmungen) bei 700 nM Cystatin A untersucht Die Hemmung war bei dieser Konzentration an Inhibitor >95%

In beiden Experimenten wurde in Gegenwart von 10Oμl sedimentiertem Gel/Versuch (entsprechend 200μl an Suspension wie auf der Grafik aufgetragen) eine vollständige Aufhebung der Hemmung erreicht (Fig 5)

Folgerung Die Hemmung von Cathepsin B durch den definierten Inhibitor Cystatin A ist durch Behandlung mit geeigneten Mengen an immobilisiertem Papain aufhebbar

e Hemmung von Cathepsin B durch Komponenten des Serums und Aufhebung der Hemmung durch Behandlung mit immobilisiertem Papain

e 1 Korrelation der Fluoreszenz mit der Cathepsin B-Konzentration in Abwesenheit bzw Gegenwart von normalem Humanserum

In Abwesenheit von Serum steigt das Testsignal von exogenem Cathepsin B ungefähr linear mit der zugesetzten Menge von Cathepsin B an (Fig 6) In Gegenwart von Serum (Anteil entweder 50% oder 25% des Testvolumens) ist zwar ebenfalls eine lineare Abhängigkeit zu beobachten Die Steigung betragt jedoch nur ca 25% derjenigen in Abwesenheit von Serum beobachteten

Es tritt also bei niedrigen Cathepsin B Konzentrationen eine deutliche Hemmung der Aktivität durch Serum auf

e 2 Aufhebung der Hemmung der Cathepsin B Aktivität im Serum durch Behandlung mit immobilisiertem Papain

Die mit dem AFC Testsystem messbare „spontane" Proteaseaktivitat im Serum war 0 12 +/- 0 02 nmol mm ¹ ml ¹ ohne Vorbehandlung Sie stieg nach 15 min Inkubation mit immobilisiertem Papain um einen Faktor von 1 9 +/- 0 4 auf einen mittleren Wert von 0 23 +/- 0 03 an Wurden den Ansätzen eine niedere Cathepsinaktivitat von ca 0 5 nmol min ¹ ml ¹ an (sie wurde also weitestgehend gehemmt) Nach Papainbehandlung war jedoch die nominelle Aktivität mit 0 52 nmol min ¹ ml ¹ voll messbar

Das Serum enthalt Bestandteile, welche sowohl endogene Cathepsin B ähnliche Proteasen als auch exogen zugesetztes Cathepsin B hemmen Diese hemmenden Komponenten werden dem Serum durch Papainbehandlung entzogen

e 3 Wirkung des Cystein-Protease Hemmers E64 bzw des Cathepsin B Inhibitors auf die spontane bzw reaktivierte Protease Aktivität

Durch die Verwendung des unspezifischen Inhibitors E64 für Cysteinproteasen bzw des Cathepsin B Inhibitors CA-074 sollte die Natur der als Cathepsin B Aktivität bestimmten Proteasen nachgewie- sen werden

Untersucht wurden die enzymatischen Aktivitäten von Cathepsin B in geringer Konzentration und von zwei "normalen" humanen Seren mit und ohne Vorbehandlung mit immobilisiertem Papain (Fig

7)

Die 15-mιnutige Vorbehandlung führte zu ca 15% Verringerung der authentischen Cathepsin B Aktivität, wie dies auch in den anderen vergleichbaren Experimenten gesehen wurde Durch beide Hemmstoffe wurde die Cathepsin B Aktivität (mit und ohne Vorbehandlung) vollständig gehemmt (Der Hintergrund Wert der Fluoreszenz wurde in der Abbildung nicht von den Messwerten abgezogen, um eine objektive Einschätzung der Messempfindhchkeit zu erlauben

In beiden Seren wurde ohne Vorbehandlung eine geringe proteolytische Aktivität gemessen Diese Aktivitäten wurden weder durch E64 noch durch CA074 gehemmt Sie sind also nicht auf Cathepsin B und aller Wahrscheinlichkeit nach auch nicht auf andere Cystein-Proteasen zurück zu fuhren

Die Vorbehandlung mit immobilisiertem Papain führte bei beiden Seren zu einem Anstieg der Pro- tease-Aktivitat Sowohl E64 als auch CA074 reduzierten diese Aktivität auf den Wert, der in den nicht vorbehandelten Proben gemessen wurde

Folgerung

Ohne Vorbehandlung (α h Deinhibierung) mit immobilisiertem Papain war in beiden Seren keine Cathepsin B Aktivität nachweisbar

e 4 Zeitabhangigkeit der Einwirkung von immobilisiertem Papain auf die Cathepsin B Aktivität des Serums

Mit dem Ziel, die Methodik der Vorbehandlung mit immobilisiertem Papain zu vereinfachen wurde die Zeitabhangigkeit der Aktivierung der Cathepsinaktivitat im Serum bei Raumtemperatur untersucht Der Verlauf der gemessenen Aktivitäten (die Hintergrundswerte wurden abgezogen) ist in Fig 8 dargestellt Der Wert beim Zeitpunkt 0 min entspricht der Messung ohne Vorbehandlung Der Wert bei 5 min stellt den kürzesten Zeitwert dar, den die Prozeduren Inkubation (d h Zugabe der Probe zum immobiliisertem Papain), Zentnfugation und Probenentnahme im Routinebetrieb erfordern durf- ten Zu diesem Zeitpunkt ist die gemessene Aktivität optimal

Folgerung Die Aktivierung von Cathepsin B im Serum ist ein sehr rascher Prozess

Figuren

Fig 1

Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzzunahme beim fluoπmetrischen Aktivitatstest von Cathepsin B mit der AMC Methode Cathepsin B (gereinigt aus der Milz vom Rind 10 unιts/ml) wurde in einer Ver-

dunnung von -1/5000 in den Test eingesetzt Die Kurven entsprechen zwei unabhängigen Testserien mit geringfügig unterschiedlichen Enzymaktivitaten

Fig 2 Messung (a) der Cathepsin B Aktivität mit dem AMC Testsystem und (b) der AMC Fluoreszenz in

Gegenwart von Serum

Die Messwerte wurden um die durch das AMC-Substrat und durch das Serum bedingten Hintergrund Fluoreszenzen korrigiert Die Verdünnung des bovinen Cathepsins B in den Tests betrug

1/5000

Fig 3

Hemmung der Aktivität von Cathepsin B durch steigende Konzentrationen an Cystatin A

Die Messungen wurden mit der AMC Methode durchgeführt Die Cythepsin B Verdünnung in den

Tests betrug 1/2500

Fig 4

Zeitliche Abhängigkeit der Inaktivierung von Cathepsin B durch Behandlung mit immobilisiertem

Papain

Die Messungen wurden mit der AMC Methode durchgeführt Die Cythepsin B Verdünnung in den Tests betrug 1/2500

Fig 5

Aufhebung der Hemmung von Cathepsin B durch Cystatin A durch steigende Mengen an immobilisiertem Papain Die Tests wurden mit der AFC Methode durchgeführt

Fig 6

Bestimmung der Aktivität von exogen zugesetztem Cathepsin B in Abwesenheit (schwarze Punkte) bzw Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Konzentrationen an humanem Serum Die Tests wurden mit der AFC Methode durchgeführt

Fig 7

Wirkung der Inhibitoren E64 und CA074 auf die Aktivität von gereinigtem Cathepsin B bzw die Pro- teaseaktivitaten von Seren mit und ohne Behandlung mit immobilisiertem Papain Die Messungen wurden mit der AFC Methode durchgeführt

Fig 8

Zeitlicher Verlauf der Wirkung der Behandlung mit immobilisiertem Papain auf die Proteaseaktivitat

von humanem Serum

Die Messungen wurden mit der AFC Methode durchgeführt Die Punkte sind die Mittelwerte von zwei Messserien

Für die Durchfuhrung der Aktivitatsmessung von Proteasen nach dem erfindungsgemaßen Verfahren im medizinischen Alltag (Praxis oder Klinikum) werden im Folgenden einige vorteilhafte Vorrichtungen beschrieben

Aus dem Stand der Technik WO 97/00969 ist es bekannt, die Enzymaktivitat solcher Enzyme, die in der Probe durch Inhibitoren vorwiegend inhibiert sind, dadurch zu messen, dass die Messprobe zuvor über eine Durchfluss- oder Durchlaufsaule gegeben wird, auf weicher der Probe die Inhibitoren entzogen werden, die das Enzym inhibieren Danach wird das inhibi- torfreie Enzym in eine Messzelle gegeben, in der nach Zugabe eines geeigneten Substrats die Aktivität des Enzyms gemessen wird, z B durch den Anstieg der Konzentration mindestens eines Spaltprodukts dieses Substrats über der Zeit

Solche Vorrichtungen sind in der Praxis vor allem vorteilhaft, wenn AFC als Fluorogen verwendet wird, denn das Emissionsspektrum des abgespalteten Fluorogens ist dann weiter in den langwelligen Bereich verschoben, sodass die Fluoreszenz des abgespaltenen Fluorogens in einem Wellenlangenbereich beobachtet werden kann, in dem andere Lumineszenzen aus der zu untersuchenden Losung das Messergebnis nicht mehr stören Gattungsgemaße Vorrichtungen und auch Vorrichtungen der nachfolgend beschriebenen Art sind in dieser Kombination vorteilhaft für die Praxis

Darüber hinaus lasst sich durch den Einsatz des Bypasses aus zwei Aktivitatsmessungen, nam- lich aus der Aktivitatsmessung der Probe nach der Passage durch die Säule und aus der Aktivitatsmessung der Probe nach Passage der Probe durch den Bypass neben der Gesamtaktivitat des Enzyms in der Probe auch die Konzentration des Inhibitors bestimmen

Die Figur 9 zeigt ein erstes einfaches Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung

Dabei ist eine austauschbare Affinitats-Chromatographiesaule 1 von einem Thermostaten 2 umgeben, der mindestens ein Peltierelement aufweist Die Säule 1 besteht im wesentlichen aus einem räumlichen Zylinder, der mit poröser Substanz, dem Tragermaterial, ausgefuttert ist, an den eine Inhibitorbindesubstanz gebunden ist In die obere öffnung 3 der Säule 1 , an deren unterem Ende zweckmaßigerweise ein Sperrventil 6 angebracht ist, ragt die Spitze 8 einer aus-

tauschbaren Spritze 4, welche in einem Raum 5 die Messprobe mit dem Enzym-Inhibitor- Komplex enthalt

Das Volumen 5 wird mit ausgedruckter Spritze 4 faktisch zu Null, und der Inhalt entleert sich in die Säule 1 , in der sich ein (vorzugsweise fest gepackter) Trager befindet

Ein Elutionspuffer vom ca 100-10 ³ fachen Volumen der Messprobe wird danach mittels einer zweiten Spritze 7 ganz oder teilweise in die Säule 1 eingebracht

Eine erste Vorgehensweise ist folgende Man belasst die Messprobe mit einem Teil des Eluti- onspuffers in der Säule 1 bei wohldefinierter Temperatur (z B ca 4° C) für eine bestimmte Inkubationszeit, in der Praxis ca 10-18 min Insbesondere 15 min durften optimal sein Danach wird durch weitere Zugabe von Elutionspuffer mit Hilfe der Spritze 7 das freie Enzym eluiert und die Elutionslosung fließt bei offenem Sperrventil 6 nach unten in Modul B gemäß Fig 9

Bei der ersten Methode ist das Ventil 6 zunächst offen, bis der Saulenpuffer in die Säule 1 teilweise eingelaufen ist bzw bis die Messprobe auf der Saulenlange verteilt ist Solange kann auch ein Volumen, das bei der Messung nicht berücksichtigt werden soll, abfließen (z B wie in Fig 10 beschrieben über den Kanal 28) Nach der Inkubationszeit wird zur Elution dieses Ventil 6 geöffnet, dann jedoch wieder geschlossen, damit ein Restvolumen nicht die Messung verschlechtert Auch dieses Restvolumen kann über den Kanal 28 entsorgt werden

Eine zweite alternative Maßnahme besteht dann, dass die Messprobe mit Hilfe des zugegebenen Saulenpuffers von oben nach unten durch die Säule wandert mit einer Geschwindigkeit die gewährleistet, dass auf diesem Weg der Inhibitor von allen in der Messprobe enthaltenen En- zym-lnhibitorkomplexen auf die auf der Säule immobilisierte Substanz übergeht, die den Inhibitor starker bindet als es das Enzym tut Das ist quasi eine Wanderungsinkubation Dadurch wird das freie Enzym eluiert und die Elutionslosung fließt nach unten in das Modul B gemäß Fig 9

Auch hier wird ein Verwerfungsvolumen anfangs (wie in Fig 10 mittels Kanal 28 beschrieben) entsorgt, ebenso geschieht dies nach dem Durchlauf des quasi optimalen Messvolumens

Das Modul A in Fig 9 stellt also eine Vorrichtung für den Inhibitorentzug dar, die sich im wesentlichen räumlich über der Messbox Modul B befindet, wobei der Durchlauf von der Säule 1 in das Modul B gemäß der Fig 9 mittels Rohr- oder Schlauchleitung durch einen Deckel 11 hindurch in eine Fluoreszenzkuvette 10 zustande kommt (Der Deckel ist geschwärzt zur Absorpti-

on des durch die Messprobe gelangten Laserlichts) Das freie Enzym spaltet gemäß Enzymas- say als proteolytisches Enzym aus dem in die Kuvette 10 gegebenen Substrat ein Fragment ab, das in freier Form fluoresziert Aus dem zeitlichen Anstieg dieser Fluoreszenzintensitat lasst sich die Enzymaktivitat des freigesetzten Enzyms bei definierter Temperatur (welche mit Hilfe von Peltierelementen 19 eingestellt wird) bestimmen In der unteren Messbox (Modul B) befindet sich eine Laserdiode 13 zur Anregung dieser Fluoreszenz Die Laserdiode emittiert zweck- maßigerweise Licht der Wellenlange, die dem Excitationsmaximum des fluoreszierenden Substratfragments entspricht Das emittierte Fluoreszenzlicht 14 wird senkrecht zur Einstrahlrichtung mit Hilfe einer Fotodiode 17 detektiert Kantenfilter 15 und Interferenzfilter 16 filtern nahezu alles Streulicht, das vom Anregungslicht stammt, aus und lassen nur Fluoreszenzlicht auf die Fotodiode 17 fallen

Die Temperierung der Affimtatschromatographiesaule 1 im Modul A erfolgt bei 3-20° C, vorzugsweise bei 4-5° C, da mit der Bindung des Inhibitors an das Affinitats- Chromatographiesaulen-Mateπal das proteolytische Enzym freigesetzt wird, das sich selbst verdauen kann, d h bei höheren Temperaturen greift ein proteolytisches Enzymmolekul das andere an

Die Messung der Enzymaktivitat in Modul B erfolgt temperiert bei 37° C (für humanmedizinische Zwecke), (wozu eine Zusatzeinrichtung für die Konstanthaltung der Temperatur zweckmaßiger- weise wiederum mittels Peltierelementen dienlich ist Thermostat 19)

Im einfachsten Fall ist auch die Kuvette 10 als Wegwerfartikel ausgestaltet (Sie kann vorher gefüllt sein mit Messpuffer und den Ingredientien gemäß Enzymassay) Jedoch kann auch eine Zufuhr dieser Mischung direkt in die Kuvette 10 erfolgen, oder u U im Kanal 9 mittels zusätzlichem Ventil und Pumpe, je nach Bedarf auch noch mit einem Messpuffer geeigneter Art versetzt Nach Abschluss der Elution wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe von Substrat gestartet Diese kann z B , wie in Fig 10 dargestellt, aus einem Substratbehalter 18 über das Ventil 26 erfolgen, oder wie gemäß Fig 9, über eine nicht dargestellte Spritze durch den Ab- schlussdeckel 1 1 hindurch eingebracht werden

Die Teile 1 , 5, 4, 10 können als (billige) Wegwerfartikel ausgestaltet sein Der Vorteil der austauschbaren Teile liegt darin, dass keinerlei Bestandteile einer Probe eines Patienten mit einer anderen Probe eines anderen Patienten zusammenkommen können' Man muss sich vor Augen halten, dass die Korperflussigkeit des Patienten als Messprobe auf die Säule 1 gegeben wird und vor allem nur der Enzym-Inhibitor bei der Elution auf der Säule bleibt, es ist aber nicht klar,

ob auch andere Bestandteile auf der Säule noch zurückbleiben Auf jeden Fall enthalt die Messprobe in der Fluoreszenzkuvette 10 nicht nur das freie Enzym, sondern auch den größten Teil der anderen Bestandteile der ursprünglichen Korperflussigkeit Ein weiterer Vorteil dieses Konzepts besteht darin, dass komplizierte mechanische Teile wie Ventile/ Pumpen entfallen

Die Verdünnung des Eluats mit Messpuffer kann für ein gutes Messergebnis sehr vorteilhaft, evtl notwendig sein Die Kombination von Laserdiode und/oder Fotodiode direkt an der Messkuvette fuhrt zu einer hohen Nachweisgrenze Im einfachsten Fall der Fig 9 kann man auch so verfahren Die Elution aus der Säule 1 des Moduls A erfolgt gleich mit dem (im Uber- schuss beigegebenen) Substrat im Messpuffer, und zwar so, dass jedes Enzym-Molekul ein Substrat-Molekül binden kann (Substratsattigung)

In Fig 10 ist eine gegenüber der Fig 9 in der Funktion erweiterte und quasi halbautomatisierba- re Vorrichtung dargestellt, jedoch kann auch die Säule 1 wie oben für Fig 9 mit den zwei Methoden betrieben werden Daher sind vor und nach der Säule 1 Mehrweg-Ventile 22, 26 vorgesehen Teile derselben können auch mit einer Anordnung der Fig 9 kombiniert werden

In Fig 10 ist ebenfalls eine Affinitatschromatographiesaule 1 , welche von einer temperierbaren Einheit 6 (z B Peltierelement) umgeben vorzugsweise auf 4° C eingestellt ist Im Inneren der Säule ist fest gepacktes Material, an welche eine Substanz gebunden ist, die eine höhere Affinitat zu den Inhibitoren aufweist als ein hier interessierender Enzyminhibitorkomplex der Messprobe, z B ist an das Sepharosegel als Packungsmaterial Papain als Substanz gebunden, und die Messprobe enthalt z B den Enzym-Inhibitorkomplex von Cathepsin B Nach Emlass der Messprobe aus einem Behalter über einen Tubus 23, welcher über ein Ventil 22 (durch einen Drehpfeil gekennzeichnet) geschieht, wird aus dem Zufluss 24, wobei das Ventil 22 umgestellt wird, ein Saulenpuffer in die Säule 1 gelassen

Der Tubus 23 kann ein Wegwerfteil sein oder/und als Zufluss aus einem Behalter dienen, der für weitere Messungen benutzt werden kann Der Kanal 24 kann als eine weitere austauschbare 2 Spritze als Wegwerfteil aus Kunststoff mit einer bestimmten Dosis Volumen, die im allgemeinen das Vielfache vom Volumen der Messprobe betragt, ausgestattet sein, oder er kann einfach ein Saulenpufferreservoir sein oder zu einem solchen fuhren, wobei bei der entspre- chenden Stellung des Ventils 22 in den Eingang der Säule 1 der Durchfluss für den Saulenpuffer freigegeben wird

Die Pumpe 25 ist nach dem Ventil 22 angeordnet, um bei Bedarf einen beliebigen Druck (also auch O) zum optimalen Durchlauf durch die Säule zu erzeugen Das Ventil 22 kann auch so gestellt sein, dass die Messprobe und/oder der Saulenpuffer eine Bypass-Leitung 27 zum unte- ren Ausgang der Durchflusssaule 1 oder zum Ventil 26 fuhrt Am Ausgang der Säule 1 ist dieses weitere Ventil 26 vorgesehen (wiederum mit einem Drehpfeil angedeutet), und zwar auch für folgenden Zweck Wenn die Messprobe durch die Säule 1 lauft, wird ein erster Teil des Volumens verworfen und im Ausgang 28 entsorgt Sodann wird das Drehventil umgestellt auf Durchflussπchtung 30 zur Messbox B hin, denn dieses weitere Volumen ist dann besser geeig- net für eine genaue Messung Der Rest der Elutionsflussigkett wird dann wieder zum Ausgang 28 hin abgeleitet

Für die Ermittlung des Verwerfungsvolumens wird die Verdünnung der Probe nach dem Durchlauf durch die Säule 1 ermittelt Eventuell muss man eine einfache Vorrichtung vorsehen zur Bestimmung des Volumens, das verworfen und über den Kanal 28 abgeleitet wird, daraus lasst sich dann das Volumen der eluierten Messprobe mit dem freien Enzym bestimmen als Differenz zu dem über 24 aufgetragenen Elu-tionspuffer

Nach Durchfluss durch den Kanal 30 in einen (z B kubusformigen oder quaderförmigen) Be- halter 10 lauft die Messprobe, deren Enzym von Inhibitoren befreit ist, in diesen Behalter 10, welcher zuvor mit Messpuffer und Ingredientien gemäß Enzym-assay versehen wurde Zum Start der Enzym-Reaktion wird die optimale Dosis von Substrat zugegeben aus Vorratsbehalter 18

Der Behalter 10 kann ebenfalls für einfachste Bedurfnisse als Wegwerfartikel ausgestaltet sein, indem der Kubus 1O z B aus Kunststoff besteht

Er kann eine Fluoreszenzkuvette sein, wobei im Modul B eine Laserdiode 33 vorgesehen ist, die eine Wellenlange λ = 400 nm aufweist

Diese Laserstrahlung aus 33 ist etwa senkrecht zur Fallrichtung, d h etwa 90° zur Einflussrichtung vom Kanal 29 oder 30 Senkrecht dazu (vom Betrachter aus nach rechts im Winkel von 90°) ist als Reaktion des Spaltprodukts eine Fluoreszenzstrahlung 34 dargestellt, die auf einen Kantenfilter 15, parallel dazu einen Interferenzfilter 16, und weiter parallel dazu auf eine Fotodi- ode 17 trifft, die an ihrem Ausgang die Intensität der Fluoreszenzstrahlung zu messen gestattet

(wie in Fig 1) Die Strahlungen 34, 35 liegen also in einer Ebene, die vorzugsweise senkrecht zur Fallrichtung ist

Unterhalb der Fluoreszenzkuvette 10 ist ein Magnetruhrgerat 44 um die Achse 45 rotierend an- gedeutet, das die Mischung möglichst homogen machen soll Fluoreszenz beginnt sofort, nachdem die Partikel der Messprobe auf Substratteile treffen, die Intensität ist proportional der Konzentration des Spaltprodukts und dieses wiederum ist ein proportionales Maß für die Enzymak- tivitat

Die Messkurve für die emittierte Fluoreszenzintensitat in Fig 13 geht nach einer Anfangsphase in eine Gerade über, und sobald der Kurvenverlauf geradlinig ist, wird deren Anstieg festgestellt und man hat das gewünschte Ergebnis dl/dt Die Fig 13 ist für alle anderen Figuren repräsentativ

Im einfachsten Fall ist das Modul A eine Wegwerf-Chromatographiesaule, in welche oben eine erste Einmalspritze mit der Messprobe eingeführt wird, danach eine 2 Spritze mit dem Saulen- puffer, der Ausgang 9 kann unmittelbar über das Ventil 6 mit der Messbox 10 verbunden werden, wobei diese dann auch eine (wie beschrieben) aufbereitete, billige Wegwerf packung ist Das Modul B, auf jeden Fall die Messbox 10, sollte temperiert werden, wozu um die Messbox 10 herum ein weiteres Peltier-element 16 in unmittelbarer Umgebung vorgesehen ist (Das muss für humanmedizinische Anwendung zweckmaßigerweise auf 37° C eingestellt sein) Alternativ kann also ein Substratbehalter 18 vorgesehen sein, der einen direkten Kanal zur Box 10 hin aufweist Vorzugsweise erfolgt die Zufuhr zur Box 10 jedoch aus dem Substratbehalter indirekt über den Kanal 9 bzw 29 bzw 30

Im einfachsten Fall ist Modul B eine mit Messpuffer und weiteren Ingredientien, wie z B ein nicht ionisches Tensid und Dithiothreitol oder Cystein, aufbereitete billige Wegwerfpackung

Das Ventil ist dann unerlasslich, wenn man die Messprobe im Durchflussverfahren aus der Sau- Ie eluiert, denn dann wird man einen ersten Teil des Eluats verwerfen Es ist aber auch dann unerlasslich, wenn man die Probe auf der Säule eine Zeit lang inkubiert, denn dazu muss man nach dem Auftragen der Probe auf die Säule danach einen gewissen Teil des Saulenpuffers in die Säule lassen und unten auslassen, dadurch sickert die Messprobe in die Säule ein und die Enzym-Inhibitorkomplexe der Messprobe finden so möglichst alle Kontakt mit der auf der Säule immobilisierten Substanz, die den Inhibitor besser bindet,

Wahrend in der Anordnung gemäß Fig 9 die Laserstrahlung 14 und das emittierte und detek- tierte Fluoreszenzhcht parallel oder in der Zeichnungsebene bzw Schnittebene von Modul A verlaufen, liegen diese Strahlungen 34, 35 in Fig 10 in einer Ebene senkrecht zur Schnittebene von Modul A, d h im allgemeinen senkrecht zur Fallrichtung oder Durchflussrichtung in Teil 1

Dadurch ist unterhalb der Messkuvette 10 bzw des Moduls B ein Mischer zur Homogenisierung für den Inhalt der Kuvette 10 räumlich geschickt und für einfache Handhabung vorteilhaft angeordnet, z B als magnetisches Ruhrwerk 44, 45

In diesen Figurenbeschreibungen sind identische Ziffern für gleich wirkende oder identische Teile verwendet Außerdem wird Modul A als ebenes Schnittbild dargestellt, wahrend Modul B in räumlicher Darstellung gezeigt ist

Fig 11 stellt eine weitere selbständige Variante der Erfindung dar, bei der Modul A entfallt und die Messfunktion komplett in Modul B verlagert ist Die Messkuvette ist quasi als Messtopf 100 ausgebildet, der einen (wie schon beschrieben) geschwärzten Abschluss 111 aufweist, welcher vorzugsweise Offnungen für (insbesondere automatisierbare) Zufuhr der notwendigen Substanzen aufweist Hierbei wird das Affinitatschromatographieadsorbens (z B Papain + Tragermate- nal) als Gel bereits mit Messpuffer zusammen mit den übrigen Ingredientien des Enzymassays in den Messtopf gegeben, der z B wieder als Fluoreszenzkuvette ausgestattet ist Nach Zugabe der biologischen Messprobe wird bei der für die Inkubation optimalen Temperatur von z B 5° C, welche mittels Peltierelementen gehalten wird, die optimale Zeit lang inkubiert und dabei sozusagen in situ das vom Inhibitor freie Enzym in der Fluoreszenzkuvette freigesetzt Danach wird dieses Gemisch auf die für den Enzymassay notwendige Temperatur, (die für humanmedi- zinische Zwecke 37° C betragt), gebracht und nach Erreichen dieser Temperatur das fluoroge- ne Substrat zugespritzt, sodass die Fluoreszenzintensitat und damit die Enzymaktivitat des freien proteolytischen Enzyms gemessen werden kann (s Fig 13)

Das Verfahren, das gemäß Fig 11 arbeitet, sieht also an ortsfester Stelle (im Messtopf 100 Mo- dul B) vor, dass zuerst die Inkubation bei niedrigerer Temperatur geschieht, sodann die Temperatur hochgefahren wird (z B 37 ° C), und dann das Substrat zugegeben wird

Fig 12 stellt eine noch weitere selbststandige Variante der Erfindung dar, bei der Modul A entfallt und die Messfunktion komplett in Modul B verlagert ist, in welcher sich die Messprobe be- findet Die Messkuvette ist wie in Fig 11 quasi als Messtopf 100 ausgebildet Hierbei wird das Affinitatschromatographieadsorbens (z B Papain + festes Tragermateπal) auf einem festen

Einsatz 71 in Richtung des Pfeils 72/70 in die Messprobe im Messtopf eingetaucht, der z. B. wieder als Fluoreszenzküvette ausgestattet ist. Nach der für die Inkubation (Deinhibition) optimalen Zeit wird der feste Einsatz in Richtung Pfeil 73 entfernt. Danach wird die Messprobe auf die für den Enzymassay notwendige Temperatur, (die für humanmedizinische Zwecke 37 ⁰ C beträgt), gebracht und nach Erreichen dieser Temperatur das fluorogene Substrat zugegeben, zugespritzt, sodass die Zunahme der Fluoreszenzintensität und damit die Enzymaktivität des freien proteolytischen Enzyms gemessen werden kann (s. Fig. 13).

Das Verfahren, das gemäß Fig. 12 arbeitet, sieht also an ortsfester Stelle (im Messtopf 100 Mo- dul B) vor, dass zuerst die Inkubation bei niedrigerer Temperatur geschieht, sodann die Temperatur hochgefahren wird (z. B. 37 ⁰ C), und dann das Substrat zugegeben wird.