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Title:
DETERMINATION OF EQUILIBRIUM CONSTANTS IN SOLUTION BY MEANS OF MULTI-STEP KINETICS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/028889
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention discloses a method by means of which the determination of equilibrium constants in solution is possible by means of multi-step kinetics. The equilibrium constant is determined from the free analyte concentration and the initial concentrations by way of the law of mass action.

Inventors:
TRUTNAU HANS-HEINRICH (DE)
Application Number:
PCT/EP2009/059041
Publication Date:
March 18, 2010
Filing Date:
July 15, 2009
Export Citation:
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Assignee:
KINOMICS GMBH (DE)
TRUTNAU HANS-HEINRICH (DE)
International Classes:
G01N33/543; G01N33/557
Domestic Patent References:
WO2001057520A22001-08-09
Foreign References:
Other References:
TANG YIJUN ET AL: "Nonregeneration protocol for surface plasmon resonance: study of high-affinity interaction with high-density biosensors.", ANALYTICAL CHEMISTRY 15 MAR 2006, vol. 78, no. 6, 15 March 2006 (2006-03-15), pages 1841 - 1848, XP002552516, ISSN: 0003-2700
TRUTNAU ET AL: "New multi-step kinetics using common affinity biosensors saves time and sample at full access to kinetics and concentration", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 124, no. 1, 25 June 2006 (2006-06-25), pages 191 - 195, XP005480509, ISSN: 0168-1656
KARLSSON R ET AL: "Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 349, no. 1, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 136 - 147, XP024941980, ISSN: 0003-2697, [retrieved on 20060201]
None
Attorney, Agent or Firm:
REICHERT, WERNER F. (DE)
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Claims:
Ansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten in Lösung mittels Multi- Schritt-Kinetik, die der nachfolgenden Analyse dieser Reaktion zeitlich vorausgegangen ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• dass mehrere verschiedenartige Ausgangssubstanzen in einer vorgelagerten Gleichgewichtsreaktion miteinander in Kontakt gebracht werden;

• dass die Konzentrationen von Gemischen aus den verschiedenartigen Aus- gangssubstanzen frei gewählt werden;

• dass Lösungen zur Bestimmung der Gleichgewichtsreaktion anschließend in beliebiger Reihenfolge, mittels Multi-Schritt-Kinetik und ohne Regenerationsschritte zwischen den einzelnen Lösungen der vermessenen Gleichgewichtsreaktionen, damit ihre jeweilige initiale Rate oder andere Messgrößen analy- siert werden;

• dass die freie Gleichgewichtskonzentration von einer oder mehreren Ausgangssubstanzen über ihre jeweilige initiale Rate oder andere Messgrößen ermittelt wird; und

• dass die Gleichgewichtskonstante über das MWG aus der freien Gleichge- Wichtskonzentration und der Ausgangskonzentrationen von einer oder mehreren Ausgangssubstanzen ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der verschiedenartigen Ausgangssubstanzen der vorgelagerten Gleichgewichtsre- aktion zwei ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Gemische aus den verschiedenartigen Ausgangssubstanzen aus Gemischen von Analyt und Inhibitor/Kompetitor bestehen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die anderen Messgrößen der Exponent oder die Gleichgewichtsendlage sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungen zur Bestimmung der Gleichgewichtsreaktion in der Reihenfolge steigender Ausgangskonzentration einer ihrer Ausgangssubstanzen mittels der Multi-Schritt-Kinetik und ohne Regenerationsschritte zwischen den einzelnen Lösungen vermessenen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Referenzmessung vorgesehen wird, die als Vergleich herangezogen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Umrechnung der Ausgangskonzentrationen in reale Gleichgewichtskonzentrationen unter Verwen- düng der Gleichgewichtskonstanten mittels quadratischer Gleichung durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Analyten gleich der Konzentration des Inhibitors ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Analyten ungleich der Konzentration des Inhibitors ist.

Description:
BESTIMMUNG VON GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN IN LÖSUNG MITTELS

MULTI-SCHRITT-KINETIK

[0001] Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten in Lösung mittels Multi-Schritt-Kinetik (MSK). Die Erfindung findet bei der in biochemischen Laboratorien durchgeführten Bestimmung von (z.B. Dissoziations- oder Assoziations-) Gleichgewichtskonstanten reversibler Gleichgewichtsreaktionen, insbesondere der entsprechenden Konstanten von solchen Gleichgewichtsreaktionen, die der eigentli- chen Analyse (z.B. unter Verwendung eines Affinitätsbiosensors) vorgelagert sind, Verwendung.

[0002] In den biochemisch geprägten Lebenswissenschaften ("Life Sciences") wird eine Vielzahl von lebenswichtigen Aktivitäten (z.B. Signalübertragungen etc.) untersucht, die zumeist über reversible Gleichgewichtsreaktionen (zwischen zwei oder mehr Ausgangssubstanzen unter Bildung eines oder mehrerer Produkte) verlaufen, die durch Gleichgewichtskonstanten gekennzeichnet sind, die wiederum das spezifische Konzentrationsverhältnis zwischen Ausgangssubstanzen und Produkten beschreiben. Diese Konstanten können sowohl kinetisch (über ihren zeitlichen Verlauf zu ihrem Gleichgewicht) als auch thermodynamisch (über ihren Gleichgewichtsendzustand) mit verschiedenen Methoden bestimmt und charakterisiert werden, was häufig unter dem Begriff biomolekulare Interaktions-Analytik (BIA) zusammengefasst wird.

Die hier beschriebene Erfindung vereinfacht und verbessert diese Bestimmung.

[0003] Die Bestimmung z.B. der sogenannten Dissoziationsgleichgewichtskonstanten (K 0 ) bzw. der reziproken Assoziationsgleichgewichtskonstanten (kurz "Affinitätskon- stante", K A ) einer reversiblen Gleichgewichtsreaktion (z.B. zwischen zwei hauptsächlichen Ausgangssubstanzen, genannt Ligand "L" und Analyt "A", unter reversibler Bildung des Komplexes "LA", kurz: L + A ≠= LA) ist Gegenstand täglicher Laborpraxis in der Biochemie und kann z.B. mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Radio-Immuno-Assay (RIA) durchgeführt werden. Die schon ältere, konventionel- Ie Bestimmung solcher Konstanten, u.a. mittels ELISA oder RIA, ist häufig aufwendig und führt aus verschiedenen Gründen nur zu Näherungswerten, da z.B. im ELISA die Bestimmung nicht in Lösung, sondern an einer Festphase und außerdem nicht oder nur grob zeitaufgelöst durchgeführt wird. Ferner gilt RIA entsorgungstechnisch als problematisch, da z.B. bei RIA radioaktive Isotope eingesetzt werden.

[0004] Eine solche direkte Analyse der Reaktion ist auch mittels MSK offenbart, die bereits in der EP 1 259 810 B1 unter Schutz gestellt worden ist. Unter Einsatz eines Affinitätsbiosensors wird L auf der Sensoroberfläche des Biosensors immobilisiert. A wird nacheinander in wechselnden Konzentrationen mit L auf der Sensoroberfläche in Kontakt gebracht, ohne dass zwischen den verschiedenen Analyt-Kontakten die Sensoroberfläche regeneriert, d.h. auf "Null" gebracht, wird, über die Zeit die Bildungsgeschwindigkeit von LA gemessen wird und abschließend die aufgezeichneten Bildungs- geschwindigkeitskurven hinsichtlich Kinetik und Gleichgewichtskonstante ausgewertet werden. Dieser direkte Assay mittels Multi-Schritt-Kinetik (MSK) ist Stand der Technik - ebenso wie eine entsprechende traditionelle sequenzielle (SEQ) Analytik mittels Biosensoren (wie z.B. Biacore-Geräte, inzwischen vertrieben von GE Healthcare, Uppsa- Ia, Schweden): SEQ bedeutet, dass sich nach dem Kontakt bzw. der Analyse jeder einzelnen Analyt-Lösung eine Regenerations- und eine Wasch-Phase anschließt, um das Biosensor-Signal vor der Analyse der nächsten Analyt-Lösung wieder auf "Null", d.h. auf die sogenannte Basislinie, zu bringen, was sehr zeit- und materialaufwendig ist und weitere Nachteile in sich birgt. Gemeinsam ist diesen Biosensor-Techniken der Vorteil, dass sie den zeitlichen Reaktionsverlauf (d.h. dessen Kinetik) hoch aufgelöst verfolgen können und dass damit die Gleichgewichtskonstante der Reaktion nicht nur thermodynamisch, sondern auch kinetisch bestimmt werden kann. Als Nachteil wird jedoch angesehen, dass auch bei dieser Art von Biosensor-Assay die Reaktion (weil L immobilisiert ist) an einer Festphase und nicht in Lösung verfolgt wird.

[0005] Ein Sonderfall der Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten ist die Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki), mit der die reversible Inhibition eines Analyten (A) durch einen Inhibitor (I) im Gleichgewicht über das Massenwirkungsgesetz (MWG) quantitativ beschrieben wird, was nachfolgend näher erläutert werden soll. Von der Sache her ist K\ nichts anderes als K 0 , wobei I anstelle von L verwendet wird. Deshalb könnte I auf der Sensoroberfläche immobilisiert, mit A in Kontakt gebracht und bestimmt werden - was aber nicht immer praktikabel ist, weil z.B. eine Vielzahl von Inhibitoren in ihrer Wirkung auf A untersucht werden sollen und daher für jeden Inhibitor eine neue, teure Sensoroberfläche präpariert werden müsste. Daher wurde nach dem Stand der Technik auf verschiedene Weise (siehe Zitate von Karlsson und Nieba) vorgeschlagen, die Inhibitions-Reaktionen zwischen A und I den eigentlichen Biosensor- Messungen gesondert und zwar in eigenständigen Reaktionslösungen vorausgehen zu lassen, um erst danach das eingestellte Inhibitions-Gleichgewicht der jeweiligen Reak- tionslösung mit einem geeigneten L auf der Sensoroberfläche zu analysieren (auch genannt Inhibition in Solution Assay, ISA). Bei diesen Analysen vorgelagerter Gleichgewichte wurde auf verschiedene (aber teils aufwendige, teils fehlerträchtige) Weise versucht, aus den Messdaten entweder direkt oder über die eingeschränkt richtig ermittelte, freie Gleichgewichtskonzentration von A, c Θq (A), auf den K r Wert zu schließen.

[0006] Karlsson (1994 und 2000) offenbart verschiede Varianten des Inhibition in Solution Assays, die alle durch die folgenden Nachteile gekennzeichnet sind:

(a) SEQ-Ansatz mit Regenerations/Wasch-Phasen zwischen den Analyt-Kontakten;

(b) konstante Analyt-Ausgangskonzentration Co(A), was u.U. bei hoher Inhibitor- Ausgangskonzentration C 0 (I) eine praktisch vollständige Inhibierung von A bewirken kann und demzufolge eine praktisch nicht mehr messbare c Θq (A) erzeugt;

(c) extrem hohe, aber im Grunde unnötige, Immobilisierungsdichte von L (verursacht Massentransportlimitation);

(d) durch eine einfache Ausgleichsgerade, die durch den Beginn einer wenn auch nur schwach gekrümmten Kurve gelegt wird, werden verfälschte und lediglich relative initiale Raten (als absolutes Maß für c Θq (A) unzureichend) erhalten, die zudem mehrfach korrigiert werden; in einem Fall ergaben unkorrigierte Werte eine bessere Übereinstimmung mit methodisch alternativ erhaltenen Werten als korrigierte Werte;

(e) mathematisch extrem komplexe Auswertungsverfahren, denen Biologen und Bio- Chemiker in üblichen Life Sciences Labors nur selten folgen werden;

(f) fehlerhafte Angaben in den Publikationen, die z.T. schwer oder nicht nachvollziehbar sind (z.B. positive statt negative Exponenten in Werten zu Konzentrationsangaben).

[0007] Nieba (1996) offenbart einen sogenannten "Competition Assay" mit folgenden Nachteilen:

(a) SEQ-Ansatz mit Regenerations/Wasch-Phasen zwischen den Analyt-Kontakten;

(b) konstante Analyt-Ausgangskonzentration C 0 (A), was u.U. bei hoher Inhibitor- Ausgangskonzentration C 0 (I) eine praktisch vollständige Inhibierung von A bewirken kann (und bewirkt!) und demzufolge eine praktisch nicht mehr zuverlässig messbare c Θq (A) erzeugt; Anmerkung - auch der umgekehrte Fall, konstante Inhibitor- Ausgangskonzentration C 0 (I), kann prinzipiell einen ähnlich negativen Effekt erzeugen; (c) als Maß für c Θq (A) in den Inhibitions-Reaktionslösungen wird der (eingestandener- maßen nicht generell gültige) gefittete Assoziationsexponent der Bindung von A an L herangezogen; Anmerkung - dieser Exponent ist in der Tat und definitiv nicht direkt proportional zu c Θq (A).

[0008] Die deutsche Patentanmeldung DE 100 05 301 A1 offenbart MSK und setzt eine bekannte Analyt-Startkonzentration C 0 (A) voraus mit der Möglichkeit, dem Analy- ten u.a. Kompetitoren oder Inhibitoren zuzusetzen. Dies erfolgt aber nicht in Hinblick auf eine Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion. Ebenso besteht die Möglichkeit, dass die Kurven-Auswertungen zu einer Bestimmung unbekannter Analyt-Konzentrationen von Proben herangezogen werden, aber ebenso nicht in Hinblick auf eine Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion. Der Inhalt dieser Patentanmeldung soll ebenso Bestandteil der Beschreibung sein.

[0009] Das europäische Patent EP 1 259 810 B1 offenbart MSK und die ein- bzw. mehrmalige Ermittlung der unbekannten Analyt-Startkonzentration C 0 (A) bzw. c o,ι (A). Dies erfolgt aber nicht in Hinblick auf eine Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion. Es handelt sich hier lediglich um die Konzentrationsbestimmung unbekannter Proben. Auch der Inhalt des Patents soll ebenso Bestandteil der Beschreibung sein.

[0010] Die Anmeldungen WO 2004/109284 A1 , US 2005/0014179 A1 und US 2005/0019933 A1 reklamieren einen MSK-ähnlichen Ansatz, der in der Praxis inzwischen als Single-Cycle Kinetics (SCK) bezeichnet wird. Hier wird aber weder Bezug auf eine Konzentrationsbestimmung unbekannter Proben noch auf eine Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion Bezug genommen.

[001 1] Ein Softwareprogramm zur Auswertung von Biosensordaten, die unter MSK- Bedingungen aufgenommen wurden, existiert als Prototyp seit Sommer 2005 und ist inzwischen (auch als kostenlose Testversion) für Anwender von Biacore-Geräten kom- merziell von Kinomics GmbH (www.kinomics.com) erhältlich. Das Programm ist hinsichtlich der Anzahl, Dauer und Konzentration der Analyt-Kontakte praktisch unlimitiert und wertet die Biosensordaten jedes einzelnen Analyt-Kontaktes detailliert (z.B. in Hinblick auf initiale Raten) aus. Das Programm ist damit in der Lage, nach Aufnahme einer Vergleichs-Standardverdünnungsreihe, zur Prüfung der Analytkonzentration einer entsprechenden Verdünnungsreihe einer unbekannten Probe eingesetzt zu werden.

[0012] Die Software von GE Healthcare für den MSK-ähnlichen SCK-Ansatz existiert inzwischen in zwei Versionen. Eine erste, sehr stark limitierte Version für Alt-Geräte liefert bei der Daten-Auswertung lediglich ein General-Ergebnis, aber keinerlei getrennte Einzel-Ergebnisse für die aufeinander folgenden Analyt-Kontakte. Damit sind eine Konzentrationsbestimmung der einzelnen Analyt-Kontakte und eine weitergehende Auswertung in Hinblick auf eine Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion ausgeschlossen (und auch nicht vorgesehen). Eine entsprechen- de Auswertungsmöglichkeit enthält auch eine neuere, weniger limitierte SCK-Software- Version für jüngere Geräte nicht.

[0013] Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfach handhabbaren Verfahrens zur Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion mittels MSK.

[0014] Die obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst.

[0015] Verfahren zur Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten in Lösung mittels Multi-Schritt-Kinetik (MSK), die der nachfolgenden Analyse dieser Reaktion zeitlich vorausgegangen ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• dass mehrere verschiedenartige Ausgangssubstanzen in einer vorgelagerten

Gleichgewichtsreaktion miteinander in Kontakt gebracht werden;

• dass die Konzentrationen von Gemischen aus den verschiedenartigen Ausgangssubstanzen frei gewählt werden;

• dass Lösungen zur Bestimmung der Gleichgewichtsreaktion anschließend in beliebiger Reihenfolge, mittels Multi-Schritt-Kinetik und ohne Regenerationsschritte zwischen den einzelnen Lösungen der vermessenen Gleichgewichtsre- aktionen, damit ihre jeweilige initiale Rate oder andere Messgrößen analysiert werden;

• dass die freie Gleichgewichtskonzentration von einer oder mehreren Ausgangssubstanzen über ihre jeweilige initiale Rate oder andere Messgrößen ermittelt wird; und

• dass die Gleichgewichtskonstante über das MWG aus der freien Gleichgewichtskonzentration und der Ausgangskonzentrationen von einer oder mehreren Ausgangssubstanzen ermittelt wird.

[0017] Die Anzahl der verschiedenartigen Ausgangssubstanzen der vorgelagerten Gleichgewichtsreaktion ist dabei zwei. Die Gemische aus den verschiedenartigen Ausgangssubstanzen bestehen aus Gemischen von Analyt und Inhibitor/Kompetitor.

[0018] Die anderen Messgrößen sind der Exponent oder die Gleichgewichtsendlage.

[0019] Die Lösungen wird zur Bestimmung der Gleichgewichtsreaktion in der Reihenfolge steigender Ausgangskonzentration einer ihrer Ausgangssubstanzen mittels der Multi-Schritt-Kinetik und ohne Regenerationsschritte zwischen den einzelnen Lösungen vermessenen. Eine Referenzmessung wird vorgesehen, die als Vergleich herangezogen wird.

[0020] Eine Umrechnung der Ausgangskonzentrationen in reale Gleichgewichtskonzentrationen unter Verwendung der Gleichgewichtskonstanten wird mittels quadrati- scher Gleichung durchgeführt.

[0021] Im Folgenden sollen Ausführungsbeispiele die Erfindung und ihre Vorteile anhand der beigefügten Figur näher erläutern.

[0022] Figur 1 zeigt beispielhaft die berechnete initiale Rate nicht inhibierter und inhibierter Analyt-Lösungen, die gegen die Analyt-Ausgangskonzentration C 0 (A) aufgetra- gen sind.

[0023] Ausgehend von einer Reihe von vorgelagerten z.B. Inhibitions-Reaktionen mit beliebigen, vorzugsweise aber jeweils gleichen Ausgangskonzentrationen C 0 (A) und C 0 (I) und bei Bedarf gefolgt von nicht inhibierten Analyt-Lösungen als internem Vergleichsstandard wird ein Inhibition in Solution Assay nach MSK-Prinzip gegen L auf der Sensoroberfläche durchgeführt, worauf mit einem nicht-linearen Fitting der initialen Raten die tatsächliche freie Gleichgewichtskonzentration von A, c Θq (A), und/oder die von I, c Θq (l), in Lösung ermittelt wird und daraus über das MWG die Gleichgewichtskonstante der vorgelagerten Reaktion (die Gleichgewichtskonzentration des reversibel gebildeten Analyt-Inhibitor-Komplexes, c Θq (AI), ergibt sich dabei aus der Differenz zwischen Ausgangs- und Gleichgewichtskonzentration von A bzw. I). Laut MWG gilt:

Ki = c Θq (A) * c e q(l) / c e q(AI) = konstant.

[0024] Da damit alle Konzentrationen der beteiligten Reaktionspartner bekannt sind, kann hieraus für jede der Inhibitions-Reaktionen die Gleichgewichtskonstante ermittelt werden und daraus deren zuverlässiger, arithmetischer Mittelwert samt Standardabweichung.

[0025] Figur 1 zeigt beispielhaft die berechnete initiale Rate nicht inhibierter Analyt- Lösungen, welche durch Punkte dargestellt sind und die entsprechende Referenz bilden. Die initiale Rate inhibierter Analyt-Lösungen, die durch Kreise dargestellt sind, sind gegen die Analyt-Ausgangskonzentration Co(A) aufgetragen, wobei eine 1 :1- Inhibition zwischen A und I mit jeweils gleich hoher Ausgangskonzentration C 0 (A) und C 0 (I) vorgegeben ist. Die sich aus den initialen Raten der inhibierten Analyt-Lösungen über die Referenz ergebenden Gleichgewichtskonzentrationen c Θq (A) liefern über das MWG einen Mittelwert von K \ = 5 * 10 "7 mol/L für das vorgelagerte Gleichgewicht.

[0026] Ausgehend von einer Reihe von vorgelagerten Inhibitions-Reaktionen mit jeweils gleichen Ausgangskonzentrationen C 0 (A) und C 0 (I) und gefolgt von nicht inhibierten Analyt-Lösungen als internem Vergleichsstandard wird ein Inhibition in Solution Assay nach MSK-Prinzip gegen L auf der Sensoroberfläche durchgeführt. Anschließend wird mit einem nicht-linearen Fitting der initialen Raten die tatsächliche freie Gleichgewichtskonzentration von A, c Θq (A), und damit die von I, c Θq (l), in Lösung ermittelt und daraus über das MWG die Gleichgewichtskonstante der vorgelagerten Reaktion bestimmt. Die Gleichgewichtskonzentration des reversibel gebildeten Analyt- Inhibitor-Komplexes, c Θq (AI), ergibt sich dabei aus der Differenz zwischen Ausgangsund Gleichgewichtskonzentration von A bzw. I. [0027] Der vorzugsweise Einsatz von jeweils gleichen Ausgangskonzentrationen Co(A) und C 0 (I) und deren Vermessung gefolgt von nicht inhibierten Analyt-Lösungen hat mehrere Vorteile die hier am Beispiel einer 1 : 1-lnhibition zwischen A und I erläutert werden sollen.

[0028] Wie oben geschildert, kann es, wenn c o (A) oder statt dessen c o (l) konstant gehalten und die jeweils andere Ausgangskonzentration variiert wird, zu einer so starken Inhibition kommen, dass die verbleibende extrem geringe c Θq (A) zu einem praktisch im Geräterauschen verschwindenden Messergebnis führt. Dies kann bei gleichen C 0 (A) und C 0 (I) prinzipiell nicht der Fall sein und bedeutet, dass eine niedrige C 0 (A) nur gering gedämpft wird, so dass sie fast nicht inhibiert erscheint. Auch eine höhere C 0 (A) wird üblicherweise nur zu ca. 50 bis 80 % gedämpft und ist also noch sicher messbar.

[0029] Abhängig von der, bei Bedarf in einem Vorversuch abzuschätzenden, Inhibition zwischen A und I können die Konzentrationen der nicht inhibierten Analyt-

Vergleichslösungen so gewählt werden, dass deren Messergebnisse (für die folgende Auswertung vorteilhaft) noch sicher über denjenigen der inhibierten höheren C 0 (A) liegen.

[0030] Die abschließende Vermessung nicht inhibierter Analyt-Vergleichslösungen in derselben MSK-Analyse ist zwar nicht zwingend notwendig, hat aber die Vorteile, dass einerseits, falls L auf der Sensoroberfläche von Analyse zu Analyse neu präpariert werden muss, eventuell unterschiedliche Belegungsdichten von L auf der Sensoroberfläche herausreferenziert werden und dass andererseits, aus praktischen Anschau- ungsgründen heraus, inhibierte und nicht inhibierte Analyt-Lösungen gemeinsam in einer Graphik direkt miteinander verglichen werden können.

[0031] Die MSK-Software von Kinomics GmbH ermöglicht, dass z.B. die initialen Raten aller vermessenen Analyt-Lösungen graphisch gegen deren Ausgangskonzentration C 0 (A) aufgetragen wird. Dabei kann man auswahlsweise z.B. nur die Raten der nicht inhibierten Analyt-Vergleichslösungen linear fitten. Idealerweise sollte sich hieraus eine Gerade ergeben, da die initiale Rate direkt proportional zur tatsächlichen Analyt- Konzentration ist und damit ein valides Maß für diese ist. Alle Raten der Inhibitions- Reaktionen - zwar mitberechnet und mitangezeigt, aber nicht mitgefittet - werden nun (weil sie zwar gegen ihren Co(A)-Wert aufgetragen sind, aber aufgrund ihres nach Inhibition erniedrigten c Θq (A)-Wertes gedämpft sind) unterhalb der Referenzgeraden liegen.

[0032] Dieser im obigen Absatz genannte Vorteil ist in praktischer Hinsicht einer der nützlichsten der vorliegenden Erfindung. Mit einem Blick auf die in Figur 1 gezeigte Graphik wird in anschaulicher Weise quantitativ klar, wo die Gleichgewichtskonstante liegt. Diejenige inhibierte Ausgangskonzentration C 0 (A), hier 1 10 "6 mol L "1 , die im Vergleich zur nicht inhibierten Referenzgeraden eben gerade die halbe initiale Rate (25 statt 50 RU s "1 ) liefert, repräsentiert mit der ihrer Rate entsprechenden tatsächlichen Analyt-Konzentration c Θq (A) = 0,5 10 "6 mol L "1 gemäß MWG exakt den K, = 0,5 10 "6 mol L- 1 .

[0033] Mit anderen Worten, schon aus der bloßen visuellen Inspektion der Graphik lässt sich das Ausmaß der Inhibition abschätzen - "starke" Inhibitoren liegen mit einer 50 %-igen Reduzierung der initialen Rate (d.h. 50 %-igen Inhibition der Analyt- Konzentration entsprechend ihres KpWertes) links in der Graphik, "schwache" Inhibitoren dagegen rechts.

[0034] Anhand der internen Referenzgeraden, wie in der abgebildeten Graphik der Figur 1 zu erkennen ist, kann durch ihre Steigung von der gemessenen initialen Rate inhibierter Analyt-Lösungen auf deren Konzentration geschlossen werden. Laut der oben erwähnten MWG-Beziehung lässt sich die Gleichgewichtskonstante einer vorgelagerten Reaktion beliebiger Art, wie z.B. der erläuterten 1 :1-lnhibition, ermitteln.

[0035] Aus den nicht-linear gefitteten initialen Raten kann, wie oben gezeigt, auf einfache Weise die tatsächliche freie Gleichgewichtskonzentration von A, c eq (A), und letztlich der KpWert ermittelt werden - sei es manuell, mit einem einfachen (z.B. Excel-) Makro oder einer entsprechenden Erweiterung der bereits bestehenden MSK- Software.

[0036] Der oben erwähnte Mittelwert des Kr Wertes kann außerdem, über eine quadratische Gleichung, auch automatisiert, zur Korrektur der in der o.g. Graphik aufgetragenen, ausgänglichen c o (A)-Werte in die realen c Θq (A)-Werte herangezogen werden. Dabei bleiben die Messwert-Streuungen erhalten. Im Idealfall sollten dann die initialen Raten der inhibierten und nicht inhibierten Analyt-Lösungen, eingedenk ihrer Messwert- Streuungen, auf einer Geraden liegen.

[0037] Die vorzugsweise gleich hohen Ausgangskonzentrationen C 0 (A) und C 0 (I) kön- nen beliebig unterschiedlich eingesetzt werden. Bei bekanntem K D -Wert des Gleichgewichtes zwischen L und A sind weitere vorzugsweise Ausgangskonzentrationen: c o (A) gleichbleibend = K 0 bei wechselnder c o (l), da dann eine nicht inhibierte C 0 (A) bei der MSK-Analyse als Gleichgewichtsendlage gerade die halbmaximale Sättigung von L auf der Sensoroberfläche liefert.

[0038] Die Komponenten der vorgelagerten Gleichgewichts-Reaktion können beliebig sein, z.B. A und I, A und mehrere verschiedene I, A und L, gegebenenfalls unter Zusatz weiterer Substanzen, die die Reaktion im vorgelagerten Gleichgewicht und/oder die Reaktion während der MSK-Analyse beeinflussen können. Das Reaktionsverhältnis der Ausgangssubstanzen des vorgelagerten Gleichgewichts ist dabei nicht auf ein Verhältnis von 1 :1 beschränkt, sondern kann beliebig ungleich dein. Die MSK-Analyse ist nicht auf die Detektion von A beschränkt, sondern kann sich gleichzeitig oder statt dessen auf eine oder mehrere Komponenten des vorgelagerten Gleichgewichts beziehen.

[0039] Die Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten einer vorgelagerten Reaktion im Rahmen der MSK-Analyse ist nicht auf die Auswertung der initialen Raten der Analyt- Lösungen beschränkt, sondern kann auch durch Auswertung anderer Messgrößen (z.B. Exponenten oder Gleichgewichtsendlagen oder Kombinationen von Messgrößen) erfolgen, die beim Fitting der Bildungsgeschwindigkeitskurven (das sind die einzelnen Assoziations- und Dissoziations-Kurven in MSK) erhalten werden.

[0040] Die MSK-Software von Kinomics GmbH detektiert darüber hinaus schon jetzt solche Analyt-Kontakte quantitativ, die z.B. aufgrund von sogenannten Massentrans- portlimitationen (MTL) per se gedämpft verlaufen (weil z.B. der Analyt schneller von L auf der Sensoroberfläche gebunden wird als er von der Biosensor-Pumpmechanik nachgeliefert wird), wodurch sich die Messdaten nicht mehr entsprechend der geforderten Linearität verhalten. Solcherlei gerätespezifische Artefakte können aufgrund ihrer Detektierbarkeit durch die MSK-Software identifiziert werden und bestimmte Mess-Parameter dementsprechend angepasst werden bzw. bestimmte Konzentrationsbereiche von A und/oder I von der Analyse ausgeschlossen werden.

[0041] Prinzipiell können darüber hinaus aber auch direkt die Rohdaten (z.B. initiale Rate vs. C 0 (A) oder vs. c Θq (A) oder auch andere graphische Messgrößen- Darstellungen) mit entsprechenden vordefinierten Algorithmen in Hinblick auf die zu bestimmende Gleichgewichtskonstante ausgewertet werden.

[0042] Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch für einen Fachmann vorstellbar, dass Abwandlungen oder Änderungen der Erfindung gemacht werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.