DISPOSITIF D'ALIQUOTAGE ET DE FILTRAGE DU SANG

L'invention porte sur un dispositif d'aliquotage et de filtrage du sang. Plus particulièrement, le dispositif de l'invention permet d'aliquoter, filtrer et dispenser des faibles quantités (microlitres) de sang. Des nombreuses techniques d'analyse biomédicale nécessitent la filtration d'une faible quantité de sang pour séparer le plasma à analyser des cellules sanguines (globules rouges et blanc essentiellement). Une méthode connue pour effectuer un tel filtrage consiste à remplir de sang entier un contenant (tel qu'un cône de pipette ou un capillaire) ayant un volume donné, puis dispenser le contenu sur un filtre pour effectuer la séparation et récupérer le plasma séparé des composantes solides du sang. Il faut donc deux étapes distinctes - trois si on considère également le prélèvement du sang du corps du patient.

La société KABE Labortechnik commercialise des microtubes, à l'extérieur desquels fait saillie un conduit capillaire de volume calibré (voir une brochure à l'adresse Internet : http://www.kabe- labortechnik.de/download/kapillarblut_en.pdf). Pour prélever un volume déterminé de sang (de l'ordre de 100 μl) à l'aide d'un tel dispositif et le déposer sur un filtre on procède comme suit. Premièrement, on pique le doigt d'un patient avec une lancette, et on fait sortir une gouttelette de sang ; ensuite, on approche de la gouttelette l'extrémité du conduit capillaire, maintenu en position horizontale. Le tube se remplit progressivement en fonction du débit capillaire. Une fois rempli, le microtube est amené en position verticale pour vider le conduit capillaire sur un filtre, le vidage étant assisté par des légers chocs ou des vibrations.

L'opération est relativement complexe et ne permet pas d'éviter tout risque de contamination du ou par le sang. En outre, les forces capillaires retiennent environ 25% du liquide dans le conduit, ce qui affecte la précision de l'aliquotage. II est également possible de remplacer le microtube par une poire de pipette, de manière à permettre le vidage du conduit capillaire par application d'une surpression. Cette solution permet un vidage plus complet,

et donc un aliquotage plus précis, mais les autres inconvénients du dispositif demeurent.

L'invention vise à résoudre au moins certains des inconvénients de l'art antérieur. Le dispositif de l'invention permet un aliquotage précis du sang et une dispense sensiblement complète vers un filtre, qui s'effectue de manière automatique, par capillarité.

Conformément à l'invention, ces résultats sont obtenus par un dispositif d'aliquotage et de filtrage du sang selon la revendication 1. Un tel dispositif comporte un élément de collecte de sang ; un conduit capillaire présentant une force de capillarité supérieure à celle dudit élément de collecte et en communication fluidique avec lui ; et un élément de dispense présentant une force de capillarité supérieure à celle du conduit capillaire et en communication fluidique avec lui ; ledit élément de dispense comportant un dispositif de filtrage pour séparer des globules sanguins du plasma.

Des modes de réalisation particuliers de l'invention constituent l'objet des revendications dépendantes.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les fonctions d'aliquotage, dispense et filtrage, voire également de prélèvement, peuvent être intégrées dans un même dispositif planaire de structure très simple.

Plusieurs applications du dispositif de l'invention peuvent être envisagées.

Selon une première application, ledit dispositif de filtrage peut être adapté pour se saturer en globules après le filtrage d'un volume de sang dépendant du taux d'hématocrite du dit sang mais, en tout cas, inférieur à la contenance dudit élément de collecte et dudit conduit capillaire ; des repères visuels étant prévus, permettant d'estimer par simple inspection le volume de liquide présent dans ledit conduit capillaire. De cette manière, le taux d'hématocrite dudit sang peut être déterminé à partir de l'estimation du volume de sang restant dans le conduit capillaire après saturation du dispositif de filtrage.

Selon une deuxième application de l'invention, le dispositif peut comporter également, en aval dudit dispositif de filtrage, un élément détachable en matériau absorbant le plasma sanguin et apte à conserver, après séchage, les protéines contenues dans ledit plasma. De cette manière, un échantillon de plasma peut être prélevé directement par le patient, à son domicile. Après désolidarisation du dispositif et séchage, l'élément absorbant peut être envoyé par la poste à un laboratoire pour que soit effectué une analyse des protéines du plasma qui y sont conservées.

D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : les figures 1 et 2, respectivement, une vue en plan et en coupe de la section d'aliquotage et dispense du sang d'un dispositif selon un premier mode de réalisation de l'invention ; - la figure 3, une vue en coupe de la section d'aliquotage et dispense du sang d'un dispositif selon un deuxième mode de réalisation de l'invention ; les figures 4A à 4E, le remplissage de la section d'aliquotage et dispense du sang des figures 1 et 2 ; - les figures 4F à 41, le vidage de cette même section ; et la figure 5, l'application d'un dispositif de l'invention à la mesure du taux d'hématocrite d'un échantillon de sang.

La section d'aliquotage et dispense du sang des figures 1 et 2 présente une structure planaire et est réalisée, par exemple par moulage ou usinage, à partir d'un élément 100 en matière plastique dure ou souple. Un plastique mou tel que du polydimethylsiloxane (PDMS) ou une silicone est particulièrement préféré pour la mise en oeuvre de l'invention de même qu'un plastique moulable ou usinable transparent et de préférence hydrophile.

Sur une surface dite supérieure 101 de l'élément 100 sont formés : un puits ou cuvette 1 , destiné à la collecte du sang entier à aliquoter et filtrer, et un conduit capillaire 2 fermé, en communication fluidique avec le puits 1. Un capot doit être disposé au-dessus du conduit 2.

A son extrémité éloignée du puits 1 , le conduit 2 débauche dans un trou 30 qui traverse l'élément 100. Sur la surface dite inférieure 102 de cet élément, se trouve une membrane filtrante 3, typiquement en papier.

Au-dessous de cette membrane peut se trouver un élément absorbant 4, dont la fonction sera expliquée plus loin.

Le volume interne de l'élément de collecte 1 et du conduit capillaire déterminent, ensemble, la quantité de sang qui peut être dispensée. Ce volume est généralement compris entre 10 μl et 1 ml, et de préférence entre 50 μl et 500 μl. Il est préférable, pour optimiser la précision de l'aliquotage, que le volume du conduit 2 soit largement supérieur par rapport à celui du puits 1 : pour cette raison ledit conduit peut être enroulé en spirale ou agencé en serpentin. Globalement, le dispositif a des dimensions de l'ordre des centimètres. Plus précisément, le puits de collecte 1 peut avoir un diamètre de l'ordre de 1 - 10 mm, et le conduit capillaire présenter une section de quelques mm ² d'aire de plusieurs centimètres de longueurs ; par exemple on peut envisager un conduit de section rectangulaire 0,5 x 2 mm, avec une longueur de 7,5 cm, soit un volume interne de 75 μl.

Le conduit capillaire 2 et/ou le puits 1 peuvent contenir, avant utilisation, divers composés liquides, en gel ou séchés tels que des agents anticoagulants pour le sang tel que l'acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) ₁ des agents agglutinants de globules tels que la lectine, ou des agents provocant la coagulation tels que la prothrombine. Il est particulièrement avantageux que les parois internes du conduit 2 soient induites d'un gel qui rend lesdites parois hydrophiles et qui relâche progressivement un anticoagulant lors du remplissage du capillaire, pour empêcher ainsi tout début de coagulation.

Comme le montrent les figures 4A à 4E, des gouttelettes d'un sang S peuvent être déposées une par une dans le puits 1 , le remplissant progressivement. Quand le puits 1 est suffisamment rempli, le sang S commence à pénétrer dans le conduit 2, et y est aspiré par capillarité. Lorsque le conduit 2 est complètement rempli, le sang S atteint la membrane filtrante 3 par l'intermédiaire du trou 30, et est aspiré par cette dernière, qui

présente une force de capillarité sensiblement plus grande de celle du conduit 2. A ce point, on arrête de déposer des gouttelettes dans le puits 1. Comme le volume du puits 1 et du conduit 2 sont calibrés, la quantité de liquide à l'intérieur du dispositif est connue de manière précise : il y a donc aliquotage. L'aspiration du sang S par la membrane filtrante 3 se poursuit, jusqu'au vidage complet du dispositif (figures 4F à 4I) : il y a donc dispense de la quantité aliquotée de sang.

La membrane filtrante 3 est adaptée pour retenir les cellules sanguines et laisser passer le plasma. Ce dernier peut donc être collecté en aval de ladite membrane.

En particulier, le plasma sanguin peut être collecté par un élément absorbant 4 en contact avec la membrane filtrante 3 et détachable du dispositif. L'élément absorbant 4, s'imbibe de plasma, puis il est séparé et séché. A ce point, il peut être envoyé à un laboratoire pour l'analyse biochimique des protéines qui y restent stockées : cette application est décrite en détail dans la demande de brevet en France FR 07 07709 déposée le 2 novembre 2007.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la membrane filtrante 3 peut être dimensionnée de manière à se saturer en globules sanguins avant le vidage complet du dispositif. La quantité exacte de sang qui peut traverser le filtre avant que tous les pores de ce dernier ne soient obstrués par les cellules sanguines (globules rouges, blancs, plaquettes) dépend de son taux d'hématocrite. Ce taux peut donc être estimé en mesurant la quantité du liquide qui reste à l'intérieur du dispositif après le vidage partiel de ce dernier. Cette mesure peut être réalisée de manière approximative à l'aide de repères visuels (traits R1 - R4 sur la figure 5) dont est pourvu le dispositif. On comprend que dans ce cas l'élément planaire 100 doit être transparent.

Selon encore un autre mode de réalisation, le plasma peut être récolté dans un bac disposé en aval du filtre 3.

Un réseau de micropiliers peut également constituer un élément de dispense adapté à la mise en œuvre de l'invention. Par exemple,

il peut s'agir de micropiliers en silicium, ayant une section carrée de 50 μm x 50 μm, une séparation également de 50 μm et une hauteur de 200 μm. Ces micropiliers peuvent être induits de substances chimiques adaptées (par exemple liaison anticorps-antigènes, streptavidin) pour réaliser un prétraitement du sang comme par exemple capter des analytes (Arn, protéines) qui pourront ensuite être détectées à travers le dispositif ou collectée pour analyse.

La figure 3 montre une variante particulièrement avantageuse du dispositif de l'invention, comportant un élément de collecte 10 constitué par une matrice de microaiguilles 11 , de préférence creuses, et par un réservoir 12 intégré à l'élément planaire 100 et disposé au-dessous de ladite matrice.

Les microaiguilles 11 sont adaptées pour traverser la peau d'un patient, par exemple au niveau de l'extrémité d'un doigt, et extraire une faible quantité de sang ; elles doivent donc avoir une longueur d'au moins 200 μm, et de préférence de 1 à 2 mm, pour pénétrer dans le derme. De cette manière on minimise le risque d'infection pour le patient et de contamination de l'échantillon prélevé. De plus, l'extraction du sang, son aliquotage et sa dispense sont effectués par une opération unique. De préférence, une région de collage 50, par exemple en forme d'anneau, entoure l'élément de collecte. Dans le cas d'un prélèvement sanguin, le patient appuie son doigt au niveau dudit élément de collecte, le cas échéant après s'être piqué avec une lancette (si le dispositif ne comporte pas de microaiguilles). La région collante 50 permet la formation d'un joint étanche entre le doigt et le dispositif, évitant toute dispersion de sang et les risques biologiques connexes ainsi qu'un contact prolongé entre le sang et l'air, susceptible d'accélérer la coagulation). Le patient garde son doigt sur le dispositif pendant toute la phase de remplissage. Lorsque le conduit 2 est plein, il enlève le doit, ce qui permet un vidage rapide du dispositif par capillarité : en effet, tant que le doigt est présent, le vidage est ralenti et limité au débit d'écoulement du sang, alors que lorsque le doigt est enlevé le débit est contrôlé par la force de capillarité en sortie du dispositif. Le joint collant

n'empêche pas le massage du doigt qui aide à l'extraction du sang. L'élément de collecte peut également comporter de piliers plus ou moins souples qui aident à masser localement le doigt facilitant ainsi l'écoulement du sang du doigt vers le dispositif.