Domaine technique

L'invention concerne le domaine de l'analyse de préparations biologiques à des fins de diagnostic médical. Plus précisément, elle se rapporte à un dispositif de capture de particules biologiques, notamment de cellules, en suspension dans un milieu liquide, et en particulier dans un échantillon biologique.

L'invention concerne également un procédé de capture de telles particules biologiques, ainsi qu'un appareil permettant la mise en œuvre de ce procédé.

Etat de la technique Un dispositif pour la capture de particules biologiques est décrit dans WO 2010/012941. Ce dispositif comporte un tube fermé par une membrane filtrante. Un bloc absorbant est placé à l'intérieur du tube. Lorsque le tube est plongé dans un milieu liquide, l'absorption d'eau par le bloc absorbant permet de contrôler le flux entrant dans le tube à travers la membrane filtrante. Des particules biologiques sont alors retenues sur la membrane filtrante.

La membrane filtrante est ensuite appliquée sur une lame et un flux sortant est produit à travers la membrane filtrante afin de reporter un échantillon de cellules, initialement retenues sur la surface extérieure de la membrane filtrante, sur ladite lame. La couche cellulaire reportée sur la lame permet avantageusement la réalisation d'une analyse cytologique fiable.

Une analyse cytologique permet notamment la détection de modifications à l'origine ou associées à des maladies pouvant affecter le pronostic vital, notamment la détection d'états cancéreux ou précancéreux comme les cancers du sein, des voies urinaires, de l'utérus, etc.

Le contrôle du flux entrant à travers la membrane filtrante permet de retenir un nombre de cellules suffisant pour obtenir un échantillon cellulaire statistiquement représentatif de la population cellulaire dans le milieu liquide. Il évite également d'obtenir, sur la membrane filtrante, un nombre de cellules trop élevé, ce qui conduirait à l'obtention d'un échantillon cellulaire dans lequel les cellules forment des amas et/ou des empilements, c'est-à-dire un échantillon à partir duquel l'analyse cytologique ultérieure ne serait pas optimale. En particulier, lorsque les cellules forment des amas et/ou des empilements, il existe un risque significatif que des cellules d'intérêt soient inaccessibles à l'analyse cytologique.

Il existe un besoin permanent pour améliorer encore la fiabilité de la capture des cellules.

Un but de l'invention est de répondre à ce besoin. Résumé de l'invention

Selon l'invention, on atteint ce but au moyen d'un dispositif de capture de particules biologiques en suspension dans un milieu liquide, le dispositif comportant :

un récipient débouchant par une ouverture inférieure, de préférence un tube d'axe X débouchant, de préférence suivant l'axe X, à des extrémités inférieure et supérieure par des ouvertures inférieure et supérieure, respectivement ;

une membrane filtrante fixée sur le récipient de manière à obturer l'ouverture inférieure ; et

à l'intérieur du récipient :

un tampon en une mousse poreuse présentant une face plane reposant sur la membrane filtrante ;

un bloc absorbant reposant sur le tampon et apte à absorber dudit milieu liquide lorsqu'il est en contact avec ledit milieu liquide, de préférence apte à gonfler sous l'effet d'un contact avec ledit milieu liquide, de préférence hydrophile; et un ressort entravant l'expansion et/ou le déplacement du bloc absorbant à l'écart de l'ouverture inférieure du récipient, et en particulier vers une extrémité supérieure du récipient, notamment lorsque le récipient est un dit tube.

De manière surprenante, l'inventeur a constaté que l'interposition d'un tel tampon entre le bloc absorbant et la membrane filtrante améliore remarquablement l'homogénéité de la couche de particules biologiques retenues sur ladite membrane filtrante. Le report de ces particules biologiques sur un substrat d'analyse, par exemple sur une lame, conduit avantageusement à un échantillon plus homogène, ce qui conduit à une analyse plus fiable.

Sans être lié par une théorie, l'inventeur explique ce résultat par la capacité de la mousse du tampon à se déformer pour compenser la déformation du bloc absorbant. Cette déformation ne modifie donc pas sensiblement la distribution de la pression exercée sur la face du tampon en appui sur la membrane filtrante, qui reste uniforme sur toute la zone d'appui du tampon sur la membrane filtrante.

Un dispositif de capture selon l'invention présente de préférence une ou plusieurs des caractéristiques optionnelles suivantes :

- l'épaisseur du tampon, mesurée le long de l'axe X, est supérieure à 1 mm et inférieure à 4 mm ;

- le matériau du tampon est de préférence du polyuréthane ;

- le tampon présente une face inférieure de forme complémentaire à la face supérieure de la membrane filtrante ;

- le tampon est en contact avec plus de 80% d'une face supérieure de la membrane filtrante ;

- le dispositif comporte de préférence une butée entravant le déplacement du ressort à l'écart de l'ouverture inférieure du récipient, et en particulier, lorsque le récipient est un dit tube, vers l'ouverture supérieure du tube ;

- le ressort est un bloc de mousse élastique ;

- le bloc de mousse est conformé de manière que, dans une position dans laquelle il est logé à l'intérieur du récipient, il soit compressé par la paroi latérale du récipient

- la taille moyenne des pores de la membrane filtrante est supérieure à un micron et/ou inférieure à 25 microns, et/ou le bloc absorbant est constitué en un matériau hydrophile ;

- le récipient est un tube d'axe X débouchant, à des extrémités inférieure et supérieure, par des ouvertures inférieure et supérieure, respectivement ;

- la différence entre les plus grandes dimensions transversales de l'ouverture supérieure du tube d'une part et du tampon d'autre part est supérieure à 0,2 mm et inférieure à 4 mm.

L'invention concerne aussi un procédé pour capturer des particules biologiques en suspension dans un milieu liquide au moyen d'un dispositif de capture selon l'invention, ledit procédé comportant les étapes suivantes :

i) immersion de la membrane filtrante du récipient dans le milieu liquide, de préférence en maintenant émergée l'extrémité supérieure dudit récipient ; ii) maintien du récipient en position (dans la position au moins partiellement immergée obtenue à l'issue de l'étape i)), dans une position immobile ou, de préférence, oscillante autour de l'axe X lorsque le récipient est un dit tube, afin de mettre les particules biologiques en suspension homogène au sein du milieu liquide, pendant une durée suffisante pour retenir sur la membrane filtrante des particules contenues dans le flux de milieu liquide entrant dans le récipient et généré par l'absorption dudit milieu liquide par le bloc absorbant ;

iii) extraction du récipient hors du milieu liquide et, optionnellement, application de la membrane filtrante sur un substrat d'analyse.

L'invention concerne également un appareil d'analyse comportant :

- un portoir de flacons ;

- un support de récipients de dispositifs de capture selon l'invention;

- de préférence, un porte-doigts ;

- de préférence, un portoir de substrats d'analyse ;

- un mécanisme configuré pour

lorsque l'appareil d'analyse comporte un porte-doigts, introduire des doigts du porte-doigts dans des récipients de dispositifs de capture selon l'invention respectifs disposés sur le support de récipients, de manière à constituer un portoir de récipients,

introduire les membranes filtrantes des récipients disposés sur le support de récipients dans des flacons respectifs disposés sur le portoir de flacons, et pour extraire lesdits récipients hors desdits flacons respectifs, et

de préférence appliquer les membranes filtrantes des récipients sur des substrats d'analyse respectifs, de préférence disposés sur le portoir de substrats d'analyse.

Un appareil d'analyse selon l'invention présente de préférence une ou plusieurs des caractéristiques optionnelles suivantes :

- lorsque l'appareil d'analyse comporte un porte-doigts, chaque doigt est de préférence percé d'une lumière, ladite lumière débouchant par des ouvertures inférieure et supérieure en communication de fluide avec le volume intérieur d'un récipient respectif, après constitution du portoir de récipients, et avec le volume intérieur d'un soufflet, respectivement ;

- l'appareil d'analyse comportant un vérin configuré de manière à sélectivement presser ledit soufflet afin d'augmenter la pression à l'intérieur dudit récipient ;

- après constitution du portoir de récipients, chaque doigt présente une extrémité inférieure en contact avec un ressort d'un dit dispositif de capture.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'un échantillon destiné à une analyse biologique, en particulier cyto logique, ledit procédé comportant les étapes suivantes : a) obtention d'au moins un flacon contenant un milieu liquide contenant des particules biologiques et, de préférence, disposition dudit flacon dans un portoir de flacons ; b) de préférence, indépendamment de l'étape a), disposition d'un dispositif de capture selon l'invention sur un support de récipients ;

c) après l'étape b), lorsque l'appareil d'analyse comporte au moins un doigt, introduction dudit doigt, de préférence d'un doigt d'un porte-doigts, par une ouverture supérieure du récipient du dispositif, le doigt étant de préférence conformé de manière que, dans la position d'introduction maximale du doigt dans le récipient, le tampon contenu dans le récipient soit en contact sur la membrane filtrante fixée sur ledit récipient ;

d) introduction de la membrane filtrante du récipient dans ledit flacon et maintien du récipient en position pendant une durée suffisante pour que le bloc absorbant absorbe dudit milieu liquide entrant à l'intérieur du récipient à travers la membrane filtrante ;

e) extraction du récipient hors du flacon ;

f) récupération de particules biologiques retenues sur la membrane filtrante, de préférence par application de la membrane filtrante sur un substrat d'analyse après une période d'attente supérieure à 5 s, puis, de préférence, augmentation de la pression à l'intérieur du récipient de manière à créer un flux de milieu liquide sortant du récipient à travers la membrane filtrante.

Le procédé de préparation peut en particulier être mis en œuvre au moyen d'un appareil d'analyse selon l'invention. Définitions

Dans le cadre général où le dispositif de capture comporte un « récipient », les adjectifs "supérieur" et "inférieur" ne sont pas limitatifs. Dans le cadre où le récipient est un tube d'axe X, ils sont définis en référence à une position d'un dispositif, dans laquelle l'axe X du tube est sensiblement vertical (comme sur la figure 1). Sauf indication contraire, "axial" fait référence à l'axe X du tube.

Sauf indication contraire, par "transversal", on entend une orientation perpendiculaire à l'axe X du tube.

Par "particules biologiques", on entend une particule non soluble dans un milieu liquide aqueux et susceptible d'être contenue dans un matériel biologique prélevé du corps d'un organisme vivant multicellulaire, animal ou végétal, en particulier un organisme vivant multicellulaire animal, notamment un mammifère, y compris l'homme. Les microfragments tissulaires, les micro -organismes, les cellules vivantes, les cellules mortes, les corps cellulaires anucléés tels que les érythrocytes et les plaquettes (thrombocytes), les fragments, les débris cellulaires, ainsi que les cristaux éventuels et les corps étrangers solides légers sont des exemples de particules biologiques. Les substances protéiques non solubles, telles que la pectine ou les substances protéiques dérivées de la fïbronectine, par exemple les substances protéiques dérivées de la fïbronectine fœtale, qui représentent un paramètre clinique indiquant un risque d'accouchement prématuré, sont d'autres exemples de particules biologiques.

La "capacité de gonflement" d'un bloc absorbant est le rapport entre le volume de ce bloc après gonflement maximal par absorption de milieu liquide et son volume initial à sec.

Sauf indication contraire, les verbes "comporter", "comprendre" ou "présenter" doivent être interprétés de manière large et non limitative.

Brève description des figures

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore à la lecture de la description détaillée qui va suivre et à l'examen du dessin annexé dans lequel :

la figure 1 représente un exemple d'un dispositif de capture selon l'invention, dans un plan de coupe longitudinale médian ;

les figures 2 et 3 représentent des détails de la figure 1 ; la figure 4 (4a-4i) illustre schématiquement les différentes étapes d'un procédé de préparation selon l'invention, dans un mode de réalisation mettant en œuvre un appareil d'analyse selon l'invention ;

les figures 5 et 6 représentent des deuxième et troisième modes de réalisation particuliers d'un dispositif de capture selon l'invention ; et

la figure 7 illustre, schématiquement, un appareil selon l'invention.

Description détaillée

La figure 1 représente un dispositif de capture 10 comportant un récipient sous la forme d'un tube 12 d'axe X, une membrane filtrante 14, un tampon 16, un bloc absorbant 18 et un ressort 20.

Tube

Le tube 12 présente une portion cylindrique 22, de préférence de section transversale circulaire, terminée, à l'extrémité supérieure du tube 12, par un rebord 24, de préférence annulaire. Dans un mode de réalisation préféré, le rebord 24 est interrompu, définissant ainsi des oreilles.

La longueur du tube est de préférence supérieure à 5 cm et/ou inférieure à 10 cm. La plus grande dimension transversale de la portion cylindrique 22 est de préférence supérieure à 1 cm et/ou inférieure à 4 cm. L'épaisseur de la paroi latérale définissant la portion cylindrique 22 est de préférence supérieure à 1 mm et/ou inférieure à 5 mm, de préférence inférieure à 3 mm.

Le tube 12 débouche, à ses extrémités supérieure et inférieure, par des ouvertures supérieure et inférieure, référencées 26s et 26i, respectivement.

De préférence, le tube est en matière plastique, par exemple en chlorure de polyvynile, en polystyrène ou en polyéthylène.

Le tube 12 peut comporter une ou plusieurs des caractéristiques du tube référencé " 101" décrit dans WO 2010/012941.

Le tube peut être du type de ceux couramment utilisés dans les systèmes automatisés de traitement d'échantillons biologiques pour l'analyse cytologique. Membrane filtrante

La membrane filtrante 14 est fixée sur le chant 28 du tube 12 qui définit l'ouverture inférieure 26i, de manière à obturer complètement ladite ouverture inférieure. De préférence, la membrane filtrante est collée, soudée par laser ou thermosoudée sur ledit chant.

Toutes les membranes filtrantes connues pour la filtration cellulaire dans le domaine de la cytologie, et en particulier les membranes filtrantes en polyester ou en polycarbonate, par exemple les membranes filtrantes commercialisées par la société MILLIPORE (BILLERICA, MA, Etats-Unis) ou par la société WHATAM GE HEALTHCARE (VERSAILLES, France), peuvent être utilisées.

Une membrane filtrante de la société IT4IP (Belgique) peut être également utilisée.

La taille moyenne des pores de la membrane filtrante est adaptée à l'application visée. De préférence, la taille moyenne des pores de la membrane filtrante est supérieure à un micron, supérieure à 3 μιη, ou supérieure à 5 μιη, et/ou inférieure à 200 microns, inférieure à 150 microns, inférieure à 100 microns, inférieure à 50 microns, ou inférieure à 25 microns.

Dans un mode de réalisation, elle est supérieure à 1,5 micron et/ou inférieure à 2,5 microns, de préférence d'environ 2 microns. La membrane filtrante peut être notamment la membrane référencée 7060-2511 commercialisée par la société WHATAM GE HEALTHCARE. Avantageusement, la totalité des particules biologiques d'intérêt pour une analyse cytologique peut être prélevée au moyen d'une telle membrane filtrante, quelle que soit la nature ou l'origine tissulaire du milieu liquide.

Dans un autre mode de réalisation, la membrane filtrante présente une taille moyenne de pores supérieure à 3 μιη, de préférence supérieure à 5 μιη et/ou inférieure à 10 μιη, de préférence inférieure à 8 μιη, de préférence inférieure à 7 μιη. La membrane filtrante peut être alors en particulier une membrane filtrante référencée TMTT-02500 commercialisée par la société MILLIPORE ou référencée TTT-B02500 commercialisée par la société MILLIPORE, ou une membrane filtrante Cyclopore® PC telle que les membranes 5 μιη référencées 7060-2513 ou 7060-4713, 8 μιη, référencées 7060-2514 ou 7060-4714 ou 10 μιη, référencées 7060-2515 ou 7060-4715. De telles membranes peuvent être en particulier utilisées pour ne retenir que des cellules de grandes tailles, par exemple du type des cellules épithéliales résultant d'un prélèvement ou d'un frottis cervico -vaginal.

Tampon

Le tampon 16, aussi appelé « tampon adaptateur (TA) », est de préférence constitué en une mousse perméable au milieu liquide. Le milieu liquide entrant dans le tube à travers la membrane filtrante peut ainsi atteindre rapidement le bloc absorbant.

Le tampon 16 présente une porosité ouverte facilitant sa traversée par le milieu liquide.

De préférence, le tampon est configuré de manière que son volume reste sensiblement constant lorsqu'il est en contact avec de l'eau, et plus généralement avec le liquide ayant traversé la membrane filtrante.

De préférence, le tampon 16 présente une face inférieure 16i de forme sensiblement complémentaire à la face supérieure 14s de la membrane filtrante 14. De préférence, les faces 16i et 14s sont sensiblement planes, de préférence sensiblement transversales.

De préférence, le tampon 16 est en contact avec plus de 80%, de préférence plus de 90%, de préférence plus de 95%, de préférence sensiblement 100% de la face supérieure 14s de la membrane filtrante 14 (exposée vers l'intérieur du tube 12).

De préférence, le tampon 16 présente une forme cylindrique d'axe X. De préférence, la surface latérale du tampon 16 est sensiblement complémentaire à la surface intérieure 121 du tube 12. De préférence, le tampon présente des dimensions adaptées pour qu'il puisse être déplacé librement dans le tube. L'assemblage du dispositif en est facilité.

Avantageusement, lors de l'assemblage, le tampon, introduit par l'ouverture supérieure du tube 12, peut être ainsi glissé, par gravité, le long du tube, jusqu'à entrer en butée avec la membrane filtrante. De préférence, la différence entre les plus grandes dimensions transversales de l'ouverture supérieure du tube d'une part et du tampon d'autre part est supérieure à 0,2 mm, supérieure à 0,5 mm, de préférence supérieure à 0,8 mm et/ou inférieure à 4 mm, de préférence inférieure à 3 mm, de préférence inférieure à 2,5 mm. L'épaisseur du tampon, mesurée le long de l'axe X, est de préférence constante, et de préférence supérieure à 1 mm, de préférence supérieure à 1,5 mm et/ou de préférence inférieure à 4 mm, de préférence inférieure à 3 mm, de préférence inférieure à 2,5 mm. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec une épaisseur de 2 mm. Bloc absorbant

Le bloc absorbant 18 peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques du bloc de matériau absorbant décrit dans WO 2010/012941.

De préférence, le bloc absorbant 18 présente une forme cylindrique d'axe X, de préférence de section circulaire, de préférence sensiblement complémentaire à la surface intérieure 121 du tube 12. De préférence, il présente des dimensions adaptées pour qu'il puisse être déplacé sensiblement librement à l'intérieur du tube. L'assemblage du dispositif en est facilité.

Avantageusement, lors de l'assemblage, le bloc absorbant, introduit par l'ouverture supérieure du tube 12, peut être ainsi glissé, par gravité, le long du tube, jusqu'à entrer en butée avec le tampon 16.

De préférence, la différence entre les plus grandes dimensions transversales de l'ouverture supérieure du tube d'une part et du bloc absorbant d'autre part est supérieure à 0,2 mm, supérieure à 0,5 mm, de préférence supérieure à 0,8 mm et/ou inférieure à 4 mm, de préférence inférieure à 3 mm, de préférence inférieure à 2,5 mm. L'épaisseur du bloc absorbant, mesurée selon la direction de l'axe X, est de préférence supérieure à 5 mm, supérieure à 8 mm, supérieure à 9 mm et/ou inférieure à 30 mm, inférieure à 20 mm, de préférence inférieure à 15 mm, de préférence inférieure à 12 mm.

De préférence, le bloc absorbant 18 présente une face inférieure 18i de forme sensiblement complémentaire à la face supérieure 16s du tampon 16. De préférence, les faces 16s et 18i sont sensiblement planes, de préférence sensiblement transversales.

Le bloc absorbant 18 comporte, de préférence est constitué en un matériau qui gonfle sous l'effet d'un contact avec un milieu liquide.

De préférence, le bloc absorbant est constitué en un matériau hydrophile qui gonfle lorsque mis en contact avec un milieu liquide aqueux, en particulier avec de l'eau. De préférence, ce matériau comporte, de préférence est constitué de viscose, de préférence de viscose compressée. Dans un mode de réalisation préféré, le bloc absorbant 18 est constitué d'un empilement de feuilles de viscose, de préférence de feuilles de viscose non tissées, l'empilement desdites feuilles ayant été compressé. La viscose présente l'avantage d'une bonne capacité d'absorption d'eau, mais aussi d'une bonne capacité de gonflement sous l'effet de cette absorption.

De préférence, le bloc absorbant présente une capacité de gonflement supérieure à 2, de préférence supérieure à 3, de préférence supérieure à 4. Une telle capacité de gonflement peut être notamment obtenue avec de la viscose.

Le bloc absorbant 18 peut également comporter, voire être constitué, d'un agent super absorbant, bien connu de l'homme du métier, par exemple du type hydrogel. L'agent super absorbant peut être en particulier un polymère du type polyacrylate de sodium réticulé, qui peut être obtenu par une réaction de polymérisation d'un acide acrylique mélangé à de l'hydroxyde de sodium en présence d'un agent initiateur de polymérisation, un copolymère de poly-acrylamide, un copolymère d'anhydride maléique d'éthylène, une carboxyméthyl cellulose réticulée, un copolymère d'alcool polyvinylique ou un oxyde de polyéthylène réticulé.

Dans un mode réalisation, la capacité de gonflement est supérieure à 10, supérieure à 15, de préférence supérieure à 20, voire supérieure à 30. Une telle capacité de gonflement est notamment possible avec du polyacrylate de sodium réticulé, dont la capacité de gonflement peut atteindre 60.

Ressort

Le ressort 20, ou « tampon ressort (TR) » a pour fonction

- d'entraver, sans bloquer, l'expansion du bloc absorbant et son déplacement vers l'ouverture supérieure du tube, ce qui limite la déformation de la membrane filtrante, et

- de maintenir en contact permanent le bloc absorbant et le tampon, mais aussi le tampon et la membrane filtrante.

L'élasticité du ressort est de préférence suffisante pour compenser un allongement du bloc absorbant, selon l'axe X, de plus de 5%, de préférence de plus de 10%, voire de plus de 15%. Dans un mode de réalisation préféré, le ressort 20 comporte un bloc de mousse 30 disposé sur la face supérieure 18s du bloc absorbant 18.

Le bloc de mousse peut présenter la forme d'un parallélépipède rectangle, par exemple d'un cube, dont la plus grande dimension peut être supérieure à 1 cm, supérieure à 1,5 cm, supérieure à 2 cm et/ou inférieure à 4 cm, ou inférieure à 3 cm.

L'élasticité du bloc de mousse est de préférence telle qu'elle permet d'en réduire le volume d'un facteur supérieur à 2, de préférence supérieur à 4, de préférence supérieur à 6, de préférence supérieur à 8, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, par compression manuelle, par exemple entre l'index et le pouce.

L'élasticité et le volume du bloc de mousse sont de préférence déterminés pour que la déformation du bloc de mousse puisse compenser élastiquement l'augmentation de volume du bloc absorbant lors de son gonflement.

La mousse du bloc de mousse 30 peut être à base de polyols et d'isocyanates. Il peut être en en polyuréthane. Il peut être en particulier en RICHLUX HIGH RESILIENCE HR50065, RG50030 ou RG50036, commercialisé par la société CARPENTER BELGIUM NV (Belgique).

Pour que le ressort, et en particulier la mousse, puisse exercer son effet de ressort, son déplacement vers l'ouverture supérieure du tube doit être entravé, voire bloqué. Comme on le verra plus en détail, cette entrave du ressort peut notamment résulter de l'appui d'un doigt introduit dans le tube par son ouverture supérieure, ou de l'appui du ressort sur une butée du tube.

De préférence, le bloc de mousse s'étend, à l'intérieur du tube, sur une hauteur, mesurée le long de l'axe X, inférieure à 4 cm, de préférence inférieure à 3 cm, de préférence inférieure à 2,5 cm.

Dans un mode de réalisation, le bloc de mousse est conformé de manière à frotter sur la surface intérieure 121 de la paroi latérale du tube. Dans un mode de réalisation, la plus grande dimension dans une coupe transversale du bloc de mousse, mesurée alors que le bloc de mousse est sorti du tube, est légèrement supérieure au diamètre intérieur du tube, par exemple supérieure de 0,2 mm, supérieure de 0,5 mm, ou supérieure de 1 mm audit diamètre. Pour être introduit dans le tube, le bloc de mousse doit donc être légèrement comprimé latéralement. Avantageusement, la nécessité de devoir comprimer latéralement le bloc de mousse pour l'introduire dans le tube facilite le maintien, dans le tube, du tampon 16 et du bloc absorbant 18. Avantageusement, le frottement du bloc de mousse entrave son déplacement lors de l'expansion du bloc absorbant.

Dans un mode de réalisation, pour entraver le déplacement du bloc de mousse 30, en complément ou en remplacement dudit frottement, une butée est disposée au-dessus du bloc de mousse 30. Cette butée peut être intégrée dans le dispositif ou être rapportée au moment où le dispositif doit être utilisé, comme le doigt décrit ci-après.

Dans un mode de réalisation préféré, le bloc de mousse 30 présente une face inférieure 30i sensiblement complémentaire à la face supérieure 18s du bloc absorbant, de préférence sensiblement plane, de préférence sensiblement transversale.

La forme du bloc de mousse 30 n'est pas limitative. En particulier, l'aire de la surface latérale 301 du bloc de mousse 30 qui est en contact avec la surface intérieure du tube 12 n'est pas limitative et peut être avantageusement modifiée en fonction de l'effet de ressort souhaité.

Le ressort 20 peut également comprendre, voire être constitué par d'autres moyens élastiques qu'un bloc de mousse, par exemple peut comporter un ressort hélicoïdal dont une extrémité inférieure est en appui sur le bloc absorbant 18 et l'extrémité opposée est immobilisée par rapport au tube, au moins provisoirement, par exemple par une butée fixée sur le tube.

Appareil d'analyse

Un dispositif de capture peut être avantageusement utilisé avec un appareil d'analyse 48 selon l'invention, illustré sur la figure 7. Un appareil d'analyse 48 comporte un portoir de flacons 50, un portoir de récipients, en l'occurrence un portoir de tubes 52, constitué par assemblage d'un support de récipients, en l'occurrence un support de tubes 60, et d'un porte-doigts 70 optionnel, optionnellement un portoir de substrat d'analyse 81 et un mécanisme 55 pour déplacer ces différents éléments les uns par rapport aux autres pour exécuter les étapes a) à f). Le mécanisme 55 de l'appareil d'analyse 48 n'est pas limitatif, pourvu qu'il permette de déplacer, les uns par rapport aux autres, le portoir de flacons 50, le support de tubes 60, le porte-doigts 70, puis le portoir de tubes 52 résultant de l'assemblage du support de tubes et du porte-doigts 70, et le portoir de substrats d'analyse 81. La réalisation d'un tel mécanisme ne pose pas de difficultés particulières.

De préférence, un appareil selon l'invention comporte encore un automate 57 adapté pour commander le mécanisme 55 afin que les différentes étapes du procédé puissent s'enchaîner sans intervention humaine.

Le portoir de flacons 50 présente de préférence la forme d'une plaque percée d'un ou plusieurs orifices pour flacon 54 configurés pour recevoir chacun un flacon 56 contenant du milieu liquide chargé de particules biologiques à capturer.

Le portoir de flacons 50 comporte de préférence plus d'un, de préférence plus de deux, de préférence plus de cinq, de préférence plus de dix orifices pour flacon 54 adaptés pour retenir chacun un flacon 56 dans une position sensiblement verticale. A cet effet, le flacon 56 comporte de préférence un rebord annulaire qui l'empêche de traverser l'orifice pour flacon 54 dans lequel il est disposé.

Le portoir de tubes 52 comporte de préférence un support de tubes 60, de préférence sous la forme d'une plaque percée d'un ou plusieurs orifices pour tube 62 configurés pour recevoir chacun un dispositif de capture selon l'invention. En particulier, chaque orifice pour tube 62 peut être conformé de manière à laisser passer la portion cylindrique 22 du tube 12 d'un dispositif, tout en empêchant le passage du rebord 24.

Le nombre d'orifices pour tube 62 du support de tubes 60 est de préférence identique au nombre d'orifices pour flacon 54 du portoir de flacons.

De préférence, le portoir de tubes 52 comporte encore des moyens pour immobiliser chaque dispositif de capture sur le support de tubes 60, par exemple des mâchoires solidaires du support de tubes et venant serrer les tubes suspendus dans leurs orifices de tube respectifs.

Le porte-doigts 70 présente un ou plusieurs doigts 72 ou « poussoirs » aptes à être introduits dans des tubes disposés sur le portoir de tubes. De préférence, chaque doigt présente, extérieurement, la forme générale d'une tige sensiblement rectiligne.

La longueur d'un doigt est de préférence supérieure à 1 cm, à 2 cm, à 5 cm.

Les doigts font saillie d'une base 73, par exemple sous la forme d'une plaque, à laquelle ils sont de préférence rigidement fixés. L'introduction de tous les doigts dans les tubes respectifs, à l'étape c), peut être ainsi avantageusement simultanée.

Le porte-doigts 70 comporte autant de doigts qu'il y a d'orifices pour tube 62 sur le support de tubes 60. Après introduction d'un doigt dans un tube, comme représenté sur la figure 4c, le doigt s'étend sensiblement selon l'axe X. De préférence, chaque doigt 72 est percé d'une lumière longitudinale 74 débouchant par des ouvertures inférieure 74i et supérieure 74s vers le bloc de mousse 30 et dans le volume intérieur d'un soufflet 76. L'actionnement du soufflet, c'est-à-dire sa compression de manière à en réduire le volume permet ainsi d'insuffler le gaz contenu dans le soufflet, de préférence de l'air, à l'intérieur de la lumière longitudinale 74, et donc sur le bloc de mousse 30.

En position d'introduction maximale d'un doigt 72 dans un tube 12, comme représenté sur la figure 1, l'extrémité inférieure du doigt est de préférence en contact avec la face supérieure 30s du bloc de mousse 30, dans une position qui garantit que le tampon est en contact avec la membrane filtrante. Avant utilisation du dispositif de capture, les différents composants à l'intérieur du tube ont en effet pu se déplacer, par exemple pendant leur transport. Si ces composants ne sont plus dans la position de service représentée sur la figure 1, l'introduction du doigt les repoussent vers la membrane filtrante jusqu'à positionner le bloc de mousse en contact avec le bloc absorbant, le bloc absorbant en contact avec le tampon, et le tampon en contact avec la membrane filtrante (figure 1).

Avantageusement, le doigt 72 peut également servir de butée pour limiter le déplacement du bloc de mousse 30 vers l'ouverture supérieure du tube lors de l'expansion du bloc absorbant.

De préférence, le soufflet 76 est pourvu d'un évent 77 autorisant une évacuation d'air limitée lorsqu'une pression est exercée sur le soufflet 76 afin d'en réduire le volume intérieur. L'évent 77 permet également à l'intérieur du tube 12 d'être toujours à la pression atmosphérique pendant le gonflement du bloc absorbant 18.

Le soufflet, qui présente de préférence la forme d'une tétine ou d'une ventouse, est de préférence fixé sur le porte-doigts, et de préférence sur la surface supérieure du porte- doigts 70, par exemple au moyen de rivets.

Fonctionnement

Le fonctionnement du dispositif de capture selon l'invention est décrit dans le cadre du procédé de préparation selon l'invention.

L'étape a) est illustrée sur la figure 4d. Le flacon 56 peut être en particulier un flacon couramment utilisé pour le conditionnement des prélèvements de cellules ou de tissus à des fins d'analyses biologiques, y compris d'analyses cyto logiques ou histo logiques.

Le milieu liquide 88 contenu dans le flacon peut consister en un milieu liquide aqueux tamponné contenant un agent de fixation des cellules ou des corps cellulaires en suspension. En tant qu'agent fixateur, on peut citer notamment les mélanges à base d'alcool, par exemple l'agent commercialisé sous la marque SEDFIX® par la société SURGIPATH ou celui commercialisé sous la marque PRESERVCYT® par la société HOLOGIC ou commercialisé sous la marque EASYFIX® par la société VWR. En particulier, lorsque l'analyse cytologique doit être réalisée à partir de cellules vivantes, le milieu liquide peut consister en un milieu tampon salin, de préférence en un milieu de culture cellulaire approprié. Le milieu liquide peut encore consister en un fluide corporel naturel tel que le sang, l'urine, ou toute sécrétion physiologique naturelle ou pathologique comme une ascite, un épanchement, un kyste ou encore un écoulement.

A l'étape b), les tubes d'un ensemble de dispositifs de capture 10 selon l'invention sont disposés dans les orifices pour tube 62 d'un support de tubes 60, comme illustré sur la figure 4a. Les dispositifs de capture sont au moins disposés dans les orifices pour tube 62 qui, lors du rapprochement du portoir de tubes et du portoir de flacons, seront en regard des flacons disposés dans les orifices pour flacon, comme représenté sur la figure 4e. A l'étape c), les doigts sont disposés en regard des orifices pour tube 62 de manière à pouvoir être introduits dans les tubes des dispositifs de capture disposés dans les orifices pour tube 62, comme représenté sur la figure 4b.

Les doigts 72 sont ensuite introduits chacun dans un tube correspondant (figure 4b) jusqu'à ce que le porte-doigts 70 entre en butée sur le support de tubes 60. L'ensemble constitué par le support de tubes 60 et le porte-doigts 70 constitue un portoir de tubes 52 qui, de préférence, n'est plus désolidarisé jusqu'à la fin de la dernière étape du procédé (figure 4c).

A l'étape d), le portoir de tubes est disposé de manière que les tubes qu'il porte soient en regard des ouvertures supérieures des flacons 56 afin de pouvoir être introduits dans lesdits flacons (figure 4e). La profondeur de pénétration des tubes dans les flacons est déterminée de manière que la membrane filtrante 14, le tampon 16 et au moins une partie du bloc filtrant 18 de chaque tube soient sous la surface supérieure du milieu liquide contenu dans les flacons 56. Par pression hydrostatique, du milieu liquide pénètre donc à l'intérieur du tube, à travers la paroi filtrante 14, puis mouille le bloc absorbant 18. L'appareil représenté est prévu pour le traitement simultané de trois flacons de prélèvement. Le fonctionnement de l'appareil est cependant le même quel que soit le flacon considéré. Dans la suite de la description, ce fonctionnement n'est donc décrit que pour un seul flacon.

Comme l'illustrent les figures 4f et 4g, le bloc filtrant 18 contenu dans le tube introduit dans ce flacon absorbe une partie du milieu liquide ayant pénétré dans le tube 12 et gonfle. En particulier, le gonflement du bloc absorbant 18 conduit à son expansion vers l'ouverture supérieure du tube, à l'encontre du bloc de mousse 30, et vers la membrane filtrante 14, à l'encontre du tampon 16 et de la membrane filtrante 14. La présence du bloc absorbant assure un flux entrant minimal, notamment par la force de tension superficielle résultant des caractéristiques d'énergie de surface du bloc absorbant et de l'action mécanique d'aspiration résultant de l'expansion du bloc absorbant.

Le doigt 72 s'oppose au déplacement du bloc de mousse 30 vers l'ouverture supérieure du tube et contraint donc ce dernier à se contracter. L'élasticité du bloc de mousse 30 permet avantageusement de maintenir le bloc absorbant 18 contre le tampon 16 et le tampon 16 contre la membrane filtrante 14. Le tampon 16 permet une bonne répartition de la pression exercée par le bloc absorbant 18 et assure un flux entrant sensiblement homogène à travers la membrane filtrante 14.

Lors du passage du milieu liquide à travers la membrane filtrante 14, les particules biologiques sont retenues sur la face inférieure 14i de la membrane filtrante 14. L'uniformité du flux du milieu liquide à travers la membrane filtrante assure avantageusement une distribution homogène des particules biologiques sur la face inférieure 14i.

Le tube est maintenu dans le flacon pendant une durée déterminée en fonction de la quantité de particules biologiques à fixer sur la membrane 14 filtrante (figure 4g). Le maintien dans la position partiellement immergée dure de préférence plus de 5 secondes et/ou moins de 10 minutes. De préférence, cette durée est adaptée à la nature du milieu liquide, et en particulier à la concentration des particules biologiques dans le milieu liquide, à la densité de particules biologiques souhaitée sur la membrane filtrante et à la capacité d'absorption du bloc absorbant. Le portoir de tubes est ensuite écarté du portoir de flacons, comme représenté sur la figure 4h, de manière à extraire complètement le tube hors du flacon.

Les particules biologiques sont alors récupérées pour constituer un échantillon adapté pour être observé, notamment afin de réaliser une analyse cytologique.

Dans un mode de réalisation préféré, la surface inférieure 14i de la membrane filtrante est appliquée sur un substrat d'analyse 80, comme représenté sur la figure 4i.

Préalablement à cette application, le tube est de préférence maintenu hors du flacon et sans contact avec le substrat d'analyse pendant une période d'attente de préférence supérieure à 5 s, de préférence supérieure à 30 s, de préférence supérieure à 1 minute, et de préférence inférieure à 5 minutes, de préférence inférieure à 3 minutes, de préférence inférieure à 2 minutes. Cette période d'attente est de préférence déterminée pour que le bloc absorbant absorbe le milieu liquide résiduel présent dans le tube et qui est « libre », c'est-à-dire qui n'est pas contenu dans le tampon ni dans le bloc absorbant.

Le substrat d'analyse 80 peut être en particulier une lame porte-objets. De préférence, le substrat d'analyse 80 est disposé sur un portoir de substrats 81, le portoir de substrats étant de préférence configuré pour recevoir autant de substrats d'analyse que le support de tubes 60 peut recevoir de tubes.

De préférence, l'appareil d'analyse comporte des moyens pour générer un flux de milieu liquide sortant des tubes quand les membranes filtrantes sont appliquées sur des substrats d'analyse respectifs.

Plus précisément, une pression est exercée sur le soufflet 76 (flèches sur la figure 4i) afin d'exercer une surpression d'une courte durée. De préférence, la déformation du soufflet est effectuée au moyen d'un actionneur 78 sous la forme d'un vérin dont la tige vient appuyer rapidement sur ledit soufflet. Cette surpression crée un flux de milieu liquide hors du tube, à travers la membrane filtrante 14, ce qui conduit à décoller les particules biologiques de cette membrane. Les particules biologiques ainsi décollées sont ainsi reportées sur le substrat d'analyse 80.

De préférence, lorsque la tige du vérin se rétracte, le soufflet reprend élastiquement sa forme initiale.

Ce procédé de transfert des particules biologiques par réplique de la membrane filtrante est une méthode classiquement utilisée par les anatomopathologistes.

D'autres procédés de transfert sont possibles. En particulier, la membrane filtrante peut être simplement pressée contre le substrat d'analyse. L'échantillon peut être ensuite soumis à une ou plusieurs étapes de traitement préalable à son observation, par exemple une ou plusieurs étapes de coloration spécifique ou non spécifique, y compris des étapes de coloration MAY-GRÛMWALD GIESMA, coloration dite "Papanicolaou", coloration de Shorr, hématoxyline, éosine, etc.

Préalablement à leur observation, les particules biologiques transférées peuvent également subir une étape d'incubation en présence d'anticorps détectables spécifiques de marqueurs membranaires ou de marqueurs intracellulaires, et/ou un traitement par une technique de biochimie moléculaire, par exemple par une technique d'hybridation in situ avec des sondes nucléiques spécifiques ou une technique d'extraction d'AR et de quantification du niveau d'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt, ou une technique d'extraction d'ADN et de détection de mutation dans la séquence d'un ou plusieurs gènes d'intérêt. Dans un mode de réalisation, la membrane filtrante 14 est désolidarisée et l'ensemble constitué par la membrane filtrante et les particules biologiques retenues sont incluses dans de la paraffine ou une résine adaptée, ce qui est particulièrement utile pour récupérer des microfragments tissulaires à des fins d'analyse, en particulier pour la réalisation de coupes histologiques.

Le mode de réalisation du dispositif de capture illustré sur les figures 1 et 4 est particulièrement bien adapté à une automatisation.

L'invention n'est cependant pas limitée à ce mode de réalisation.

En particulier, comme représenté sur la figure 5, le dispositif de capture peut comprendre un piston 82, qui remplace le doigt 72 et l'actionneur 78. Toutes les étapes peuvent être réalisées manuellement, le piston étant activable à la main.

Ainsi, dans le mode de réalisation de la figure 5, le dispositif de capture comporte-t-il avantageusement les moyens pour décoller manuellement les particules biologiques de la membrane filtrante 14. Le piston 82 peut en particulier comporter une ou plusieurs des caractéristiques optionnelles du piston "104" décrit dans WO 2010/012941. Comme décrit dans WO 2010/012941, l'ouverture supérieure du tube 12 peut être également fermée par un bouchon comportant un orifice guidant le coulissement du piston 82 dans le tube.

Dans le mode de réalisation de la figure 6, le piston est remplacé par un soufflet 84, similaire au soufflet 76, et qui fonctionne de manière identique. Le soufflet 84 est cependant fixé sur le bord supérieur du tube.

Par ailleurs, une butée est prévue pour bloquer le bloc de mousse 30. La forme de cette butée n'est pas limitative. Elle peut être par exemple constituée par un tube intérieur 86 logé dans le tube 12, similaire au doigt 72, de préférence immobilisé par rapport au tube. Un rebord supérieur 88 du tube intérieur 86 peut être par exemple pris en sandwich entre le soufflet 84 et le tube 12, comme représenté.

Le dispositif de capture est ainsi autonome et peut être utilisé à la main.

Comme cela apparaît clairement à présent, l'invention fournit un dispositif de capture favorisant, grâce à la présence du tampon 16, une répartition homogène des particules biologiques retenues sur la membrane filtrante 14. La fiabilité des analyses effectuées à partir de ces particules biologiques en est améliorée.

Par ailleurs, l'invention fournit un appareil d'analyse permettant une automatisation des différentes étapes du procédé de préparation d'un échantillon observable, en particulier pour une analyse cytologique. Cet appareil permet avantageusement de multiplier les mesures effectuées.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits en détail et/ou illustrés, fournis à des fins illustratives seulement. En particulier, le récipient n'est pas limité à un tube. Toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour un tube peuvent donc être appliquées à une autre forme de récipient, hormis celles qui sont spécifiques à une forme tubulaire. La membrane filtrante n'est pas nécessairement fixée à une extrémité inférieure du récipient, même si cela est préféré.

Le récipient peut présenter des dimensions quelconques et une structure quelconque, pourvu qu'il soit conformé pour que le ressort entrave l'expansion et/ou le déplacement du bloc absorbant.

Dans un mode de réalisation, le ressort peut être intégré dans la paroi du récipient, la paroi du récipient étant de préférence déformable élastiquement pour entraver l'expansion et/ou le déplacement du bloc absorbant. Par exemple, tout ou partie de la paroi du récipient peut être constituée par un film déformable élastiquement et tendu de manière à exercer un appui élastique sur le bloc absorbant.

Dans un mode de réalisation, le récipient ne comporte pas d'ouverture supérieure. La paroi du récipient définit alors avec la membrane filtrante une chambre fermée, ne communiquant de préférence avec l'extérieur que par l'intermédiaire de la membrane filtrante. La paroi du récipient peut être rigide ou souple.

Enfin, l'invention n'est pas limitée à un domaine d'application particulier. Elle peut être par exemple également être utilisée pour la recherche de la légionellose.