L'invention trouve des applications dans les domaines de la chimie et de la biologie. En particulier, le dispositif peut tre mis à profit dans des procédés d'amplification chimique ou de réaction de polymérase de type PCR (Polymerase Chain Reaction) pour 1'analyse de matériau génétique (ADN).

Etat de la technique antérieure On connaît actuellement des systèmes macroscopiques d'analyse chimique ou biologique utilisant des plaques de titrage. Ces plaques comportent des cuvettes dans lesquelles on mélange des échantillons et des réactifs par pipetage (à la pipette). Pour permettre les réactions chimiques ou biologiques, les plaques sont successivement chauffées à des températures de consigne par des étuvages successifs, puis sont refroidies.

Avec de tels systèmes, l'apport des réactifs est une opération longue et complexe, notamment en raison d'un apport successif de chaque réactif. De plus, l'inertie thermique de chauffage et de refroidissement des plaques de titrage s'avère trop importante et allonge le temps d'analyse.

On connaît par ailleurs, des équipements d'analyse chimique et/ou biochimique qui se présentent sous forme de structures complètes incorporant les

moyens de chauffage nécessaires à l'analyse. Des systèmes de connexion par tuyauterie permettent d'amener les échantillons et les réactifs dans la structure.

L'utilisation de ces équipements implique cependant des opérations complexes et fastidieuses de connexion pour l'amenée des fluides, analytes et réactifs, ainsi que des opérations de connexion électrique pour l'alimentation en énergie des moyens de chauffage. En raison de la spécificité des analyses, il est nécessaire de renouveler les opérations de connexion lors de chaque nouvelle utilisation de l'équipement.

Les équipements présentent en outre un coût de fabrication élevé.

Une illustration plus complète des techniques et équipements dans le domaine de l'analyse biochimique est donnée par les documents (1) et (2) dont les références sont précisées à la fin de la présente description.

Exposé de l'invention L'invention a pour but de proposer un dispositif d'analyse biologique et/ou chimique ne présentant pas les limitations évoquées ci-dessus.

Un autre but est de réduire les temps de chauffage, de refroidissement et de permettre un contrôle en température précis et sélectif des composants à analyser au cours des différentes phases de réaction.

Un but de l'invention est encore de proposer un tel dispositif pouvant tre adapté rapidement à

différents types de produits à analyser et ne nécessitant pas d'opérations de connexion complexes.

L'invention a aussi pour but de proposer un dispositif avec un support d'analyse, de très faible coût, pouvant tre à usage unique, qui peut tre jeté et remplacé après chaque utilisation, ou après un nombre limité d'utilisations. On envisage par exemple d'effectuer un millier d'analyses séquentielles avec un dispositif avant de le jeter.

Pour atteindre ces buts, l'invention a plus précisément pour objet un dispositif d'analyse chimique et/ou biologique comprenant un support d'analyse avec au moins une cuvette d'entrée pour recueillir un échantillon, au moins une cuvette de sortie pour délivrer ledit échantillon, au moins un canal interne traversant le support pour relier la cuvette d'entrée à la cuvette de sortie, et au moins un réservoir à réactif, relié à chaque canal respectivement entre une cuvette d'entrée et une cuvette de sortie, dans lequel la cuvette d'entrée, la cuvette de sortie et le réservoir débouchent sur une première face du support d'analyse.

Le dispositif peut en particulier comporter une pluralité de cuvettes d'entrée et une pluralité correspondante de cuvettes de sortie, chaque cuvette d'entrée étant respectivement reliée à une cuvette de sortie associée, au moyen d'un canal.

La mise en place des liquides à analyser dans les cuvettes d'entrée et/ou des réactifs dans les réservoirs correspondants peut avoir lieu par micropipetage (à la micropipette).

Selon un autre mode d'utilisation, la mise en place des liquides à analyser dans les cuvettes

d'entrée et/ou des réactifs dans les réservoirs correspondants peut avoir lieu par des moyens étanches d'amenée de fluides tels qu'un bouchon déposé sur le réservoir ou la cuvette et relié à une seringue ou à une citerne sous pression.

La mise en place des liquides et/ou des réactifs peut tre obtenue par une combinaison des deux modes décrits précédemment.

Pour des supports avec un grand nombre de cuvettes et/ou de réservoirs, l'apport des liquides à analyser et/ou des réactifs peut tre automatisé au moyen d'un robot de distribution (dispense) à haute résolution. Par ailleurs, les analyses séquentielles supposant le remplacement dans le temps d'au moins un réactif par un autre peuvent tre automatisées par l'introduction séquentielle dans le réservoir correspondant de plusieurs réactifs distincts. Entre deux réactifs distincts un liquide tampon neutre peut, ou non, tre introduit dans le réservoir.

Selon un aspect particulier de l'invention, le ou les canaux internes peu (ven) t tre prévu (s) pour s'étendre à proximité d'au moins une deuxième face du support d'analyse de façon à n'tre séparé de ladite deuxième face que par une paroi mince. Dans une réalisation particulière la paroi mince peut présenter une épaisseur inférieure à 100 um.

De façon plus précise, la paroi est choisie suffisamment mince pour permettre un échange thermique avec des sources thermiques externes au support d'analyse.

En particulier, la paroi séparant les canaux de la deuxième face peut tre choisie plus mince qu'une paroi séparant les canaux entre eux ou des cuvettes.

Selon un autre aspect de l'invention, la face des canaux opposée à la paroi mince peut présenter une barrière thermique, celle-ci pouvant tre réalisée par une couche de matériau peu conducteur thermique et/ou une structuration du substrat permettant de localiser sur les canaux une cavité remplie d'air ou d'un gaz peu caloporteur.

Cette barrière thermique permet d'uniformiser la température dans les canaux.

Selon un autre aspect de l'invention, le dispositif peut comporter en outre un support thermique indépendant du support d'analyse, le support thermique présentant une face d'échange thermique avec au moins une source thermique, et ledit support thermique pouvant tre rapporté de façon amovible sur le support d'analyse afin de mettre en contact la face d'échange thermique avec la deuxième face du support d'analyse.

Le caractère séparé du support d'analyse et du support thermique permet de concevoir des supports d'analyse sans propres moyens de chauffage ou de refroidissement. Cette caractéristique permet de réduire par conséquent dans des proportions importantes le coût du support d'analyse. Ainsi, ce support peut tre du type à utilisation unique ou à plusieurs utilisations, c'est-à-dire tre jeté après une ou plusieurs utilisations. On entend par utilisation la réalisation séquentielle d'un nombre d'analyses voisin par exemple de 1000.

La face d'échange thermique peut comporter une ou plusieurs zones thermostatées équipées chacune d'au moins une source thermique. Les zones thermostatées coïncident avec au moins une zone du support d'analyse

située en aval d'un raccord entre un réservoir à réactif et un canal.

En associant une zone thermostatée du support thermique avec une zone correspondante du support d'analyse située respectivement au voisinage, par exemple en aval, de chaque réservoir à réactif, il est possible de contrôler et d'adapter sélectivement la température du liquide à analyser en fonction de chaque réactif utilisé.

Le terme aval utilisé ici s'entend par rapport à une direction d'écoulement des liquides à analyser depuis les cuvettes d'entrée jusqu'aux cuvettes de sortie.

Les sources thermiques peuvent comporter une ou plusieurs résistances électriques chauffantes thermostatées.

A titre alternatif ou complémentaire les sources thermiques peuvent comporter également un ou plusieurs canaux traversés par un fluide caloporteur.

Ce fluide peut tre utilisé pour chauffer ou refroidir localement le support d'analyse.

Dans une réalisation particulière du support d'analyse, celui-ci peut comporter un premier substrat présentant des ouvertures traversantes qui forment respectivement les cuvettes et réservoirs, et un deuxième substrat, collé au premier substrat, le deuxième substrat présentant des rainures, recouvertes par le premier substrat pour former des canaux, et coïncidant respectivement avec les ouvertures traversantes.

Cette structure particulièrement simple permet de réduire les coûts de fabrication des supports d'analyse.

La fabrication du support peut avoir lieu, conformément à l'invention, selon un procédé comprenant les étapes successives suivantes : -formation, dans un premier substrat, d'ouvertures traversantes, lesdites ouvertures correspondant respectivement à des cuvettes d'entrée ou de sortie, ou à des réservoirs de réactif, -formation dans un deuxième substrat de rainures selon un motif permettant de relier entre elles au moins deux ouvertures du premier substrat, -collage du premier substrat sur le deuxième substrat de façon à recouvrir les rainures, -amincissement du deuxième substrat, après le collage, en préservant une épaisseur de substrat supérieure à une profondeur maximale des rainures.

Selon un mode de réalisation particulier, le premier substrat peut présenter deux couches thermiquement peu conductrices, épaisses par exemple de quelques microns.

Selon un second mode particulier de réalisation, le premier substrat peut présenter au moins une ouverture non traversante de façon à créer au moins une cavité d'isolation thermique.

L'invention concerne également un procédé de mise en oeuvre d'un dispositif d'analyse tel que décrit ci-dessus, selon lequel on met en contact le support d'analyse avec le support thermique pendant une phase d'analyse de durée déterminée, au moins un échantillon à analyser et au moins un réactif étant introduits dans le support d'analyse préalablement à la phase d'analyse ou pendant la phase d'analyse, puis, après la phase d'analyse, on retire le support d'analyse du support thermique.

Au terme de 1'analyse, le support d'analyse peut tre réutilisé.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, en référence aux figures des dessins annexés. Cette description est donnée à titre purement illustratif et non limitatif.

Brève description des figures -La figure 1A est une coupe schématique simplifiée d'un support d'analyse conforme à l'invention.

-La figure 1B montre le support d'analyse de la figure 1A équipé de moyens de remplissage de réservoirs à réactifs.

-La figure 2 est un éclaté en perspective montrant de façon plus précise la structure du support d'analyse.

-La figure 3 est une vue en perspective simplifiée d'un support d'analyse conforme à la figure 2 et d'un support thermique.

-La figure 4 est une coupe longitudinale schématique du support d'analyse mis en place sur le support thermique.

-La figure 5 est une vue en plan d'une partie d'un support d'analyse conforme à l'invention, constituant une variante par rapport aux figures 1 à 4.

-La figure 6 est une coupe transversale simplifiée d'un support d'analyse incluant une partie conforme à la figure 5.

-La figure 7 est une coupe transversale simplifiée d'un support d'analyse incluant une partie

conforme à la figure 5 et constituant une variante par rapport à la figure 6.

-Les figures 8,9,10 et 11 sont des coupes longitudinales schématiques de substrats lors d'étapes successives de fabrication d'un support d'analyse conforme à l'invention.

-La figure 12 est une coupe transversale d'un support d'analyse et d'un support thermique conforme à l'invention et illustrant une réalisation particulière du support thermique.

Description détaillée de modes de mise en oeuvre de 1'invention Dans la description qui suit, des parties identiques, similaires ou équivalentes des figures sont repérées avec les mmes références numériques afin d'en faciliter la lecture.

La figure 1 est une coupe d'un support d'analyse 100 conforme à l'invention.

Sur cette figure, est représentée une cuvette d'entrée 102 formée pour l'essentiel par une ouverture traversante pratiquée dans un substrat 100a du support, au voisinage de l'une de ses extrémités. De la mme façon, une cuvette de sortie 104 est pratiquée au voisinage d'une deuxième extrémité. Les cuvettes 102, 104 débouchent en une première face 106 du support 100.

Un canal interne 108 relie les cuvettes d'entrée et de sortie.

Le canal 108 se présente sous la forme d'une rainure gravée dans un second substrat 100b collé au premier substrat de sorte que ce dernier recouvre la rainure.

On observe que la profondeur de la rainure est pratiquement égale à l'épaisseur du deuxième substrat 100b, de sorte que seul une mince paroi 110 sépare le canal 108 d'une deuxième face 112 du support d'analyse 100.

Dans l'exemple illustré, le support 100 est de forme générale parallélépipédique et les première et deuxième faces sont les faces principales opposées et parallèles.

La figure représente également en coupe des réservoirs de réactif 120a, 120b, 120c agencés entre les cuvettes d'entrée 102 et de sortie 104. Les réservoirs débouchent également sur la première face 106 du support d'analyse 100. Des raccords ou passages 122a sont prévus pour relier chacun des réservoirs au canal 108.

Pour des raisons de simplification, les passages 122a sont représentés dans le plan de la figure, de sorte que les réservoirs ne se distinguent pas des cuvettes d'entrée et de sortie sur la figure 1.

Le liquide à analyser peut tre introduit dans les cuvettes d'entrée au moyen d'une pipette.

Les réservoirs des réactifs peuvent tre remplis de la mme façon.

Dans le cas de l'analyse séquentielle mettant en oeuvre de façon successive des réactifs différents, dans le cas également où les réactifs doivent tre conservés à une température bien contrôlée avant usage, il est préférable d'utiliser des réservoirs de petits volumes alimentés par un système de type pousse- seringue tel que représenté à la figure 1B.

La figure 1B montre un support d'analyse conforme à la figure 1A dont les réservoirs 120a, 120b

et 120c sont respectivement associés à des moyens d'amenée de fluide 150a, 150b et 150c.

Ces moyens comportent des bouchons, ou capuchons d'alimentation 152a, 152b, 152c appliqués de façon étanche au-dessus des réservoirs et reliés à des pousse-seringues 154a, 154b et 154c qui contiennent des réactifs. Les capuchons peuvent tre collés à la surface du support d'analyse ou serrés contre la surface, en utilisant un joint d'étanchéité.

Les références 156a, 156b et 156c désignent respectivement des capteurs de pressions ménagés sur des conduites reliant les pousse-seringues aux capuchons 152a, 152b et 152c, ; de façon à contrôler la pression et/ou le débit des réactifs.

Bien que non représenté,, un système d'alimentation semblable peut également équiper les cuvettes d'entrée.

Comme le montrent les figures 1A et 1B, les cuvettes d'entrée et les réservoirs sont soumis à la pression atmosphérique, ou à une pression fixée par le système d'alimentation, tandis qu'une ligne à vide 124 est appliquée aux cuvettes de sortie.

Un premier remplissage spontané du support d'analyse peut tre effectué avec un solvant polaire (tel que de l'alcool) suivi d'un solvant nominal afin d'éviter la formation de bulles. Ce remplissage met à profit un effet de capillarité dans les canaux.

Après ce premier remplissage, les analytes et réactifs sont ajoutés.

Le produit d'analyse arrivant aux cuvettes de sortie peut y tre prélevé également au moyen de pipettes.

La figure 2 montre de façon plus précise et de façon séparée les deux substrats 100a et 100b qui forment le support d'analyse.

On observe que le support d'analyse comporte une pluralité de cuvettes d'entrée 102 et une pluralité de cuvettes de sortie 104.

Les cuvettes ont la forme d'ouvertures traversantes pratiquées dans le premier substrat 100a.

Ces ouvertures présentent une forme évasée en V, formant un entonnoir.

Par ailleurs, dans 1'exemple de la figure 2, chaque cuvette d'entrée 102 est individuellement reliée à une cuvette de sortie 104 par un canal 108.

Le support d'analyse comprend trois réservoirs à réactif 120a, 120b, 120c.

Dans cet exemple, chaque réservoir est commun à plusieurs canaux 108 auxquels il est relié au moyen de raccords 122a, 122b. La référence 122a désigne plus précisément des perçages du premier substrat 110a reliant un réservoir à des embranchements 122b correspondants, pratiqués dans le deuxième substrat 110b et connectés respectivement aux canaux. (Bien entendu, des réservoirs peuvent également tre individualisés pour les différents canaux).

Les quantités de liquides (liquides à analyser, et réactifs) qui se mélangent au croisement des embranchements 122b et des canaux 108 dépendent de la taille respective de ces embranchements et des canaux 108.

La figure 3 montre un support d'analyse 100, conforme à celui de la figure 2, dont les substrats 100a et 100b sont définitivement collés.

Le support d'analyse est représenté au-dessus d'un support thermique 200 correspondant.

Le support thermique 200 présente une face d'échange thermique 212 tournée vers la deuxième face 112 du support d'analyse 100, au voisinage de laquelle se trouvent les canaux. La face d'échange thermique 212 du support thermique 200 et la deuxième face 112 du support d'analyse sont destinées à tre mises en contact.

La face d'échange thermique 212 présente trois zones thermostatées 220a, 220b, 220c équipées chacune d'une ou de plusieurs sources thermiques (non représentées).

Les trois zones thermostatées 220a, 220b, 220c sont disposées de façon à coïncider avec des portions de canaux du support d'analyse situés au voisinage respectivement des réservoirs 120a, 120b, 120c, ou plus précisément des embranchements apportant les réactifs.

Le fluide dans le canal 122b peut traverser une seule fois chaque zone thermique ou plusieurs fois grâce à des motifs de canal adaptés comme représenté figure 5 décrite ultérieurement.

La figure 4 est une coupe schématique du support d'analyse reporté sur le support thermique permettant de représenter de façon plus détaillée les zones thermostatées.

Pour des raisons de clarté de la figure, le support d'analyse et le support thermique sont représentés avec un léger espacement. Ces supports sont cependant en contact.

Comme indiqué ci-dessus, les zones thermostatées peuvent comporter plusieurs sources thermiques. Ceci est le cas de la zone thermostatée

220a. Celle-ci comporte une première source thermique 230 formée de résistances électriques, telles que par exemple des microrésistances en platine. Elle comporte également deux sources 232 et 234 sous la forme de canaux traversés par des fluides caloporteurs.

Dans le cas d'une analyse de type PCR, les résistances électriques de la première source 230 peuvent tre portées à une température de 94°C, le fluide caloporteur de la deuxième source thermique 232 à une température de 55°C et le fluide caloporteur de la troisième source thermique 234 à une température de 72°C.

Ces températures correspondent respectivement à des étapes de dénaturation, d'hybridation et d'élongation d'ADN (cf. document (1)) Les sources thermiques peuvent tre miniaturisées de sorte que le support thermique présente une résolution thermique submillimétrique (inférieure au millimètre).

La figure 5 est une vue de dessus d'une partie d'un premier substrat 100a d'un support d'analyse et montre une variante de réalisation d'un canal 108.

Le canal 108 est replié selon un motif géométrique répété.

Sur la figure, on a représenté également en trait discontinu la position de sources thermiques d'une zone thermostatée 200, d'un support thermique pouvant tre associé au support d'analyse. On observe que, grâce au motif géométrique du canal, un liquide à analyser peut, en parcourant différents tronçons du motif, tre mis en contact thermique de façon séquentielle avec différentes sources thermiques de la zone thermostatée.

Les figure 6 et 7 présentent deux variantes de réalisation du dispositif permettant d'améliorer l'uniformité de la température dans les canaux en isolant leur face supérieure, c'est-à-dire la face opposée à ladite deuxième face 112 du support d'analyse. Une première solution représentée à la figure 6 consiste à réaliser dans la partie supérieure 100a du support d'hybridation une cavité 160 (débouchante ou non). Cette cavité coïncide avec au moins une partie de canal 108. Une seconde solution, représentée à la figure 7, consiste à mettre en place entre les parties supérieure et inférieure 100a, 100b du support d'analyse une couche 100c de matériau faiblement conducteur de la chaleur. Il est possible également d'utiliser un substrat supérieur équipé d'une couche 100c d'un matériau isolant thermique.

Les figures 8 à 11, décrites ci-après, donnent un exemple de procédé de réalisation d'un support d'analyse tel que décrit précédemment.

Dans une première plaque de substrat 100a, par exemple en silicium, on pratique, comme le montre la figure 8, des ouvertures traversantes. Ces ouvertures constituent les cuvettes ou les réservoirs 102,104, 120a, 120b, 120c. Les ouvertures gravées par voie chimique sont réalisées avec des flancs inclinés par gravure chimique anisotrope par exemple (KOH) de façon à leur conférer une forme évasée. L'emplacement des ouvertures est défini par un masque de gravure (non représenté) en coïncidence avec le motif des rainures.

Le perçage de la couche 100c de matériau isolant thermique, par exemple Si02 dans le cas de la variante proposée figure 7, peut tre effectué, par exemple, par gravure CHF3 par voie sèche, la dimension de la

perforation étant définie par un masque de gravure ou en utilisant les parois du trou créé par voie chimique comme masque.

La figure 9 montre la gravure de rainures, formant les canaux 108, dans un deuxième substrat 100b par exemple de silicium. La gravure est effectuée à travers un masque de gravure (non représenté) présentant un motif correspondant aux canaux souhaités.

Il s'agit, par exemple, d'une gravure chimique (KOH).

La profondeur des rainures est par exemple de l'ordre de 100pm pour un substrat 100b d'une épaisseur de 250 à 450um.

Il peut s'agir aussi d'une gravure sèche SG6 permettant de réaliser des rainures plus profondes que larges par exemple 100umx20um.

Une troisième étape représentée à la figure 10 comprend le scellement des premier et deuxième substrats 100a et 100b, de manière à mettre en communication les cuvettes ou réservoirs 102,104, 120a, 120b, 120c, avec les canaux (rainures) 108 correspondants. Le scellement a lieu, par exemple, par collage direct (moléculaire) des deux substrats.

Lors de cette opération, les rainures 108 du deuxième substrat 100b sont recouvertes par le premier substrat 100a pour former les canaux.

Une dernière étape, représentée à la figure 11, comprend l'amincissement du deuxième substrat 100b de façon à ne préserver entre le canal 108 et la surface extérieure 112 qu'une mince paroi 110.

Cette paroi 110 présente une épaisseur de l'ordre de l0um de façon à favoriser les échanges thermiques.

L'amincissement est réalisé par gravure et/ou par polissage mécanochimique.

Une pluralité de supports d'analyse conformes à l'invention peuvent tre fabriqués simultanément et collectivement selon le procédé ci-dessus dans deux tranches de silicium (correspondant aux premier et deuxième substrats).

Dans ce cas, le procédé est complété par un découpage des tranches à la scie pour individualiser les supports d'analyse.

La figure 12 montre une réalisation particulière du support thermique 200 d'un dispositif d'analyse conforme à l'invention.

Le support thermique 200 comprend pour l'essentiel un socle 202 sur lequel sont disposés un ou plusieurs barreaux thermostatés. Dans 1'exemple de la figure, le support thermique comprend trois barreaux thermostatés 320a, 320b, 320c qui forment respectivement trois zones thermostatées.

Tout ou partie des barreaux peuvent tre noyés dans un matériau isolant thermique. Dans 1'exemple de la figure deux barreaux 320b et 320c sont entourés par un matériau isolant thermique solide, tandis que le premier barreau 320a est laissé en contact libre avec l'air ambiant sur ses faces latérales.

Chaque barreau est équipé de moyens de chauffage et/ou de refroidissement.

Le premier barreau 320a est équipé d'un canal 322a qui le parcourt et qui permet de le thermostater par circulation d'un fluide caloporteur.

Les autres barreaux 320b et 320c sont également équipés de tels canaux 322b et 322c. Les canaux sont respectivement reliés à des bains thermostatés avec des

systèmes de pompage (non représentés) pour faire circuler le fluide caloporteur.

La liaison entre les bains et les barreaux peut avoir lieu au moyen de connexion hydrauliques non représentées.

Les canaux peuvent tre du type circulaire, comme le montrent les figures, mais peuvent également tre pourvus de systèmes d'ailettes pour optimiser les échanges thermiques.

Des éléments chauffants complémentaires peuvent tre intégrés dans les barreaux. A titre d'illustration, le troisième barreau 320c est équipé d'une résistance électrique 330. La résistance électrique est utilisée ici comme"source chaude" tandis que le fluide caloporteur est utilisé comme "source froide".

Le deuxième barreau 320b comporte un élément 340 de mesure de la température, tel qu'une résistance, utilisé pour asservir, par exemple, la température du bain thermostaté associé.

La référence 100 désigne de façon générale un support d'analyse amovible disposé sur le support thermique de façon à tre en contact avec les barreaux thermostatés. La description détaillée d'un tel support n'est pas répétée ici. On peut se reporter à ce sujet aux explications données en référence aux figures précédentes. Le support d'analyse 100 peut tre simplement posé sur le support thermique 200. Il peut également tre pressé contre le support thermique au moyen d'une bride ou d'un système d'aspiration non représentés.

Comme les moyens destinés au contrôle de température, c'est-à-dire en particulier les bains

thermostatés et les barreaux thermostatés, sont solidaires du support thermique ou en connexion fluidique avec le support thermique, et comme le support d'analyse est amovible, il est possible de réaliser ce dernier de façon simple et peu coûteuse.

DOCUMENTS CITES (1) Martin U. Kopp, et al., "Chemical Amplification : continuous-Flow PCR on a chip", Science, vol. 280,15 May 1998, pages 1046-1048 (2) "Chip advance but cost contraints remain" dans Nature Biotechnology, vol. 16, juin 1998, page 509.