Titre : Dispositif pour le comptage et la différenciation de particules d’un flux d’échantillon

La présente invention se rapporte au comptage et à la différenciation des particules d’un flux d’échantillon respectivement par des mesures électriques et optiques.

La cytométrie en flux (souvent désignée par l’acronyme CMF) est une technique permettant de compter automatiquement des particules en suspension dans un liquide. Cette technique permet également de mesurer les caractéristiques de chaque particule, par exemple la taille, la forme et la complexité. Le liquide à analyser est mis en flux dans un dispositif - appelé cytomètre - de manière à faire passer les particules une à une dans un faisceau lumineux émis, par exemple, par une source laser, une source de lumière halogène ou des diodes électroluminescentes. Une injection sous pression est généralement utilisée pour mettre le liquide en mouvement.

Le liquide à analyser est généralement un liquide biologique voire organique, par exemple un liquide cérébrospinal, un liquide pleural, un liquide prélevé lors d’une ponction de moelle osseuse ou encore un liquide synovial.

L’hématologie est une des applications les plus remarquables de la cytométrie en flux. Le liquide à analyser est alors un échantillon de sang - qui peut être un sang total ou non - et les particules sont des cellules sanguines, à savoir des leucocytes (ou globules blancs), des érythrocytes (ou globules rouges) ou des thrombocytes (ou plaquettes).

Des détecteurs sont utilisés pour recevoir les signaux optiques émis par les particules par diffusion, réflexion ou réfraction de lumière. Ces signaux optiques sont ensuite exploités pour déterminer les caractéristiques de chaque particule détectée. Parmi les signaux optiques, la lumière diffusée aux petits angles (connue sous l’acronyme anglophone FSC pour « Forward Scatter >>) permet de déterminer la taille des particules. La lumière diffusée à 90° (connue sous l’acronyme anglophone SSC pour « Side Scatter >>) renseigne sur la structure interne et la granularité des particules. Enfin, la fluorescence émise par les particules est particulièrement utile pour les différencier.

En hématologie, la mesure de fluorescence permet de mettre en évidence des colorants fluorescents utilisés comme marqueurs de cellules sanguines. Il est par exemple connu de coupler un fluorochrome - aussi appelé fluorophore - à une sonde nucléique, à un ligand ou à un anticorps spécifique d’une certaine classe cellulaire pour repérer les cellules sanguines de cette classe.

Il est également connu de marquer les acides nucléiques intracytoplasmiques - ARN ou ADN - des cellules sanguines à l'aide de colorants fluorescents, par exemple les cyanines asymétriques et en particulier le Thiazole Orange.

Concernant le comptage des particules, la plupart des cytomètres exploite des mesures électriques, et plus précisément des mesures d’impédance ou de résistivité. Comme expliqué dans le brevet européen EP 0 425 381 B1 , le cytomètre comprend à cet effet des électrodes de mesure situées de part et d’autre d’un orifice. Les électrodes sont alimentées en énergie électrique et génèrent ainsi un courant électrique circulant d’une électrode à l’autre. Lorsqu’une particule passe par l’orifice, elle provoque une variation ponctuelle de la résistivité du milieu situé entre les électrodes, ce qui se traduit par une impulsion en tension proportionnelle au volume de la particule. La détection de ces impulsions permet alors de compter les particules.

Il a été constaté que la température a un impact direct sur les mesures réalisées par le cytomètre, que ce soit la mesure de la fluorescence ou de la résistivité. En particulier, il est préférable que le liquide soit analysé avec une variation de température aussi faible que possible pour compenser l’instabilité naturelle du fluorochrome. Ainsi, l’intensité de la fluorescence peut varier de près de 5% par degré Celsius. Pour éviter ces variations de température, il est connu de l’art antérieur de contrôler celle-ci en plaçant le cytomètre tout entier, y compris donc les électrodes de mesures et les composants nécessaires aux mesures optiques, à savoir la source lumineuse, les détecteurs et les optiques éventuelles, dans une enceinte ou un caisson thermostaté. Le maintien d’une température stable est également possible en utilisant un échangeur thermique basé sur le principe de l’effet Peltier. Malheureusement, de telles solutions augmentent significativement l’encombrement et le coût de l’installation comprenant le cytomètre.

La présente invention vient améliorer la situation.

A ce titre, l’invention concerne un dispositif pour le comptage et la différenciation de particules d’un flux d’échantillon comprenant :

- une embase chauffante au sein de laquelle sont ménagés un conduit d’injection d’un flux d’échantillon et un conduit d’injection d’un flux de manchonnage, et

- une cellule de mesure comprenant une cuve optique agencée pour être traversée selon une direction de circulation par un flux d’échantillon provenant de l’embase chauffante et manchonné au moins par le flux de manchonnage, une source lumineuse agencée pour éclairer, selon une direction optique sensiblement orthogonale à la direction de circulation, le flux d’échantillon manchonné traversant la cuve optique, un détecteur agencé pour recevoir un signal de fluorescence émis par une particule du flux d’échantillon manchonné après absorption de la lumière émise par la source lumineuse, et un conduit d’évacuation du flux d’échantillon manchonné communiquant avec la cuve optique.

Le dispositif est agencé pour différencier des particules du flux d’échantillon au moins par une mesure de fluorescence réalisée par le détecteur à partir de chaque signal de fluorescence reçu et pour compter les particules par une mesure de résistivité réalisée par une paire d’électrodes de mesure formée par l’embase chauffante et le conduit d’évacuation entre lesquels circule un courant électrique auquel les particules du flux d’échantillon sont propres à opposer une résistance. Avantageusement, le dispositif comprend en outre un isolateur électrique connecté au conduit d’évacuation pour l’isolation de la cellule de mesure.

L’isolateur électrique est par exemple une cage de Faraday délimitant un espace intérieur au sein duquel est reçu le conduit d’évacuation.

L’isolateur électrique peut être relié à la masse ou à une électrode de garde.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, l’embase chauffante est formée d’une pièce fabriquée à partir d’un alliage métallique inoxydable.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, l’embase chauffante comprend une résistance électrique agencée pour convertir de l’énergie électrique en énergie thermique par effet Joule.

Avantageusement, la cellule de mesure comprend en outre un circuit de contrôle thermique agencé pour asservir la température de l’embase chauffante à une température de consigne aux fins de maintien d’une température sensiblement constante au sein de la cellule de mesure.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, la cellule de mesure comprend en outre une pièce intermédiaire intercalée entre l’embase chauffante et la cuve optique. La pièce intermédiaire présente une cavité sur laquelle débouchent le conduit d’injection du flux d’échantillon et le conduit d’injection du flux de manchonnage et au sein de laquelle le flux d’échantillon est destiné à être manchonné par le flux de manchonnage injecté dans le conduit d’injection. La cavité communique avec la cuve optique.

Un conduit supplémentaire d’injection d’un flux de manchonnage peut être ménagé dans la pièce intermédiaire pour un manchonnage supplémentaire du flux d’échantillon.

Avantageusement, une portion du conduit supplémentaire d’injection d’un flux de manchonnage est logée au sein de l’isolateur électrique.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, la source lumineuse est une source laser. Dans un ou plusieurs modes de réalisation, le détecteur est un photomultiplicateur.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, le conduit d’évacuation est fabriqué à partir d’un matériau comprenant du platine.

Typiquement, l’embase chauffante forme une cathode et le conduit d’évacuation forme une anode.

Dans un ou plusieurs modes de réalisation, un orifice est ménagé pour permettre l’entrée du flux d’échantillon manchonné dans la cuve optique. L’orifice est dimensionné de sorte que le passage d’une particule génère une augmentation de la résistivité du milieu situé entre les électrodes de mesure se traduisant par une variation de la tension au niveau des électrodes de mesure.

D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés sur lesquels :

[Fig. 1 ] illustre une vue en coupe d’un dispositif pour le comptage et la différenciation de particules d’un flux d’échantillon selon l’invention, et

[Fig. 2] illustre schématiquement des circuits de préparation et de traitement associés au dispositif de la [Fig. 1],

La [Fig. 1 ] illustre un dispositif 1 pour le comptage et la différenciation de particules d’un flux d’échantillon.

Selon le principe de la cytométrie en flux, le dispositif 1 est agencé pour recevoir un flux d’échantillon au sein duquel des particules sont en suspension.

Dans la suite de la description, on considère le cas dans lequel le dispositif 1 est destiné à un domaine d’application particulier : l’hématologie. L’homme du métier comprend toutefois que le dispositif 1 peut également être utilisé pour analyser d’autres liquides biologiques.

Le flux d’échantillon est ainsi assimilable à un échantillon de sang comprenant des cellules sanguines telles que des leucocytes (ou globules blancs), des érythrocytes (ou globules rouges) ou des thrombocytes (ou plaquettes). En particulier, le flux d’échantillon peut être qualifié de sang total lorsqu’il comprend l’ensemble des cellules sanguines listées précédemment. L’analyse des lignées des cellules sanguines est dénommée hémogramme ou numération formule sanguine (souvent désignée par l’acronyme NFS). Les anomalies éventuelles détectées peuvent permettre à un professionnel de santé de diagnostiquer certaines pathologies telles qu’une anémie ou un cancer.

Toutes ces cellules sanguines sont issues d’une même cellule souche située dans la moelle osseuse et appelée hémocytoblaste. Ces cellules souches se différencient ensuite en plusieurs sous-populations.

Dans le cas des cellules hématopoïétiques, l'homme du métier sait que l'analyse de la cellule permet la discrimination des principales lignées cellulaires incluant les leucocytes, les érythrocytes et les thrombocytes. La lignée des leucocytes est elle-même subdivisée en plusieurs catégories telles que, par exemple, les lymphocytes, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles. Normalement, l’échantillon de sang est composé de cellules matures, c’est-à-dire des cellules qui ne se divisent plus.

Pour chacun des types cellulaires, les différents niveaux de maturation sont connus. Ainsi, les premières cellules de la lignée érythrocytaire sont appelées proérythroblastes. Par divisions cellulaires successives, cette lignée se poursuit avec les érythroblastes basophiles, les érythroblastes polychromatophiles de type I puis de type II. Ces derniers évoluent en érythroblastes acidophiles, puis en réticulocytes après l'expulsion du noyau.

Ce sont ces réticulocytes qui, après perte totale de l’ARN résiduel, se différencient dans le sang en érythrocytes.

Les leucocytes sont issus de la moelle osseuse sous la forme préalable de myéloblastes. La lignée leucocytaire se poursuit avec les progranulocytes qui évoluent ensuite en granulocytes basophiles, éosinophiles ou neutrophiles. D'abord non segmentés, les noyaux vont connaître des segmentations au fur et à mesure de la maturation des cellules.

Les myéloblastes sont également à l'origine de la lignée monocytaire qui aboutit aux monoblastes, aux promonocytes puis aux monocytes qui passent dans le sang périphérique. La cellule souche pluripotente dont est originaire le myéloblaste donne également naissance à la lignée lymphocytaire par une différenciation sous forme de cellule souche lymphoïde dont une partie de la lignée - lignée des lymphocytes T - poursuit sa maturation dans le thymus et les ganglions, tandis que l'autre partie reste dans la moelle osseuse pour engendrer la lignée des lymphocytes B. Ces lymphocytes B, une fois activés sous la forme de plasmocytes, produisent des anticorps pour combattre les antigènes pathogènes.

Enfin, les thrombocytes proviennent des mégacaryoblastes, eux-mêmes issus du progéniteur myéloïde dont est originaire le myéloblaste, qui, une fois arrivés au stade ultime de leur maturation que sont les mégacaryocytes thrombocytogènes, produisent des plaquettes par délitement de leurs cytoplasmes. Les plaquettes jeunes - plaquettes réticulées - contiennent une charge en ARN qui est le reliquat de leur cellule d’origine.

Le dispositif 1 est agencé pour compter des cellules sanguines de ce flux d’échantillon à partir de mesures de résistivité et pour différencier ces cellules sanguines à partir de mesures optiques, et notamment de mesures de fluorescence.

Le dispositif 1 comprend une embase chauffante 3, une cellule de mesure 5 et éventuellement un isolateur électrique 7.

L’embase chauffante 3 forme généralement un support du dispositif 1 . Ainsi, lors de son utilisation, le dispositif 1 peut reposer sur l’embase chauffante 3 qui présente par exemple une surface plane pour garantir la stabilité du dispositif 1 .

Dans le contexte de l’invention, l’embase chauffante 3 est agencée pour remplir au moins les trois fonctions détaillées ci-après.

La première fonction de l’embase chauffante 3 est d’assurer l’injection, dans le dispositif 1 , d’un flux d’échantillon et d’un flux de manchonnage.

À cette fin, et comme illustré sur la [Fig. 1 ], un conduit d’injection 9 d’un flux d’échantillon et un conduit d’injection 1 1 d’un flux de manchonnage sont ménagés dans l’embase chauffante 3. Le conduit d’injection 9 est agencé pour recevoir un flux d’échantillon et en guider l’écoulement au sein du dispositif 1. Le conduit d’injection 9 présente au moins une ouverture à l’extérieur du dispositif 1 pour pouvoir y injecter le flux d’échantillon. Une telle injection est typiquement réalisée sous pression pour mettre le flux d’échantillon en mouvement. L’injection sous pression est avantageuse lorsque le flux d’échantillon s’écoule, dans une partie au moins du conduit d’injection 9, selon un sens opposé à la gravité.

Le conduit d’injection 11 est agencé pour recevoir un flux de manchonnage et en guider l’écoulement au sein du dispositif 1 . De même que le conduit d’injection 9, le conduit d’injection 1 1 présente au moins une ouverture à l’extérieur du dispositif 1 pour pouvoir y injecter le flux de manchonnage. Là encore, le flux de manchonnage peut être injecté sous pression.

Le flux de manchonnage - parfois appelé liquide de manchonnage - permet de réaliser un gainage hydrodynamique du flux d’échantillon. Le gainage hydrodynamique a une double utilité : tout d’abord, le flux de manchonnage encercle le flux d’échantillon et le guide à la sortie du conduit d’injection 9 ; ensuite, le flux de manchonnage enserre le flux d’échantillon pour l’étirer et en réduire le diamètre.

La deuxième fonction de l’embase chauffante 3 est d’augmenter la température de la cellule de mesure 5, notamment en chauffant le flux d’échantillon et le flux de manchonnage.

Pour ce faire, l’embase chauffante 3 comprend par exemple une résistance électrique 13 - ou résister - agencée pour convertir de l’énergie électrique en énergie thermique par effet Joule. On comprend que l’embase chauffante 3 est alors associée à une source d’alimentation en énergie électrique (non représentée sur la [Fig. 1]) pour alimenter la résistance électrique 13 et augmenter ainsi la température de l’embase chauffante 3 jusqu’à atteindre la température souhaitée. À titre d’exemple, la résistance électrique 13 présente une résistance de l’ordre de 20 ohms (Q).

D’autres moyens de chauffage connus peuvent évidemment être utilisés pour augmenter la température de l’embase chauffante 3. D’une manière générale, l’embase chauffante 3 est agencée pour augmenter sa température et, par transfert thermique, celle de la cellule de mesure 5.

Les inventeurs ont constaté que la température et ses variations ont un impact sur les mesures réalisées par le dispositif 1 , que ce soit les mesures de résistivité ou de fluorescence. L’intensité de la fluorescence peut ainsi varier de près de 5% par degré Celsius (°C) tandis que la résistivité augmente, respectivement diminue, quand la température augmente, respectivement diminue.

Comme illustré sur la [Fig. 1 ], l’embase chauffante 3 est positionnée au contact de la cellule de mesure 5. Une telle compacité permet à l’embase chauffante 3 d’être au plus près des mesures réalisées. L’embase chauffante 3 affecte ainsi directement la température à laquelle sont relevées les mesures de résistivité et de fluorescence non seulement par le chauffage du flux d’échantillon et du flux de manchonnage, mais aussi par l’augmentation locale de la température à proximité immédiate de la cellule de mesure 5.

L’embase chauffante 3 est ainsi agencée pour réaliser un chauffage ciblé contrairement, par exemple, à l’enceinte ou au caisson thermostaté utilisé dans l’art antérieur et qui impose une température à l’ensemble du cytomètre sans distinction. Par ailleurs, l’embase chauffante 3 permet de réduire drastiquement l’encombrement par rapport à l’enceinte ou au caisson thermostaté.

À titre d’exemple, l’embase chauffante 3 peut atteindre et maintenir une température sensiblement égale à 35 °C.

Il doit être noté que, d’une manière générale, l’important est d’avoir une température suffisamment stable pour limiter la variation des mesures de résistivité et de fluorescence. Toutefois, les inventeurs ont constaté qu’une telle stabilité est plus facile à atteindre en élevant la température de la cellule de mesure 5, notamment par rapport à la température du dispositif 1 .

Par conséquent, l’embase chauffante 3 est agencée pour augmenter la température de la cellule de mesure 5 pour atteindre une température strictement supérieure à celle - c’est-à-dire la température moyenne - du dispositif 1 , et pour maintenir sensiblement constante la température ainsi atteinte par la cellule de mesure 5. Par « sensiblement constante >>, on entend ici que, idéalement, la température atteinte par la cellule de mesure 5 grâce à l’embase chauffante 3 est maintenue constante. Toutefois, en pratique, il n’est pas toujours possible de maintenir une température parfaitement constante, de sorte que la température réellement maintenue peut s’éloigner de près de 5% de la température visée.

Enfin, la troisième fonction de l’embase chauffante 3 est de former une électrode pour la mesure de la résistivité. Plus précisément, l’embase chauffante 3 constitue une cathode.

À cet effet, l’embase chauffante 3 peut être formée d’une pièce fabriquée à partir d’un alliage métallique inoxydable, par exemple de l’acier. À titre d’exemple, l’inox 316, qui a la particularité de comprendre du molybdène, peut être utilisé pour conférer à l’embase chauffante 3 les propriétés d’une cathode.

Le principe général de la mesure de la résistivité et de la contribution de l’embase chauffante 3 à cette mesure sera détaillé ci-après en référence à la description de la cellule de mesure 5.

La cellule de mesure 5 est agencée pour réaliser des mesures de résistivité et de fluorescence au sein du dispositif 1 . Comme mentionné précédemment, les mesures de résistivité permettent généralement de compter les cellules sanguines tandis que les mesures de fluorescence, éventuellement couplées à d’autres mesures optiques, permettent de les différencier.

Il est à noter que les mesures de résistivité peuvent aussi être utilisées pour différencier les cellules sanguines. En particulier, les mesures de résistivité permettent de distinguer, au sein de la lignée leucocytaire, les granulocytes, les monocytes et les lymphocytes. La combinaison des mesures de résistivité et des mesures optiques permet de distinguer plus sûrement les différentes populations cellulaires.

La cellule de mesure 5 comprend une pièce intermédiaire 15 optionnelle, une cuve optique 17, un module d’émission lumineuse 19, un module de réception lumineuse 21 et un conduit d’évacuation 23.

La pièce intermédiaire 15 est agencée pour être intercalée entre l’embase chauffante 3 et la cuve optique 17. Avantageusement, par souci de compacité, la pièce intermédiaire 15 est, d’une part, en contact avec l’embase chauffante 3 - et même dans le prolongement de celle-ci -, et, d’autre part, en contact avec la cuve optique 17. Par souci de simplification de la conception du dispositif 1 , l’embase chauffante 3 et la pièce intermédiaire 15 peuvent former une pièce d’un seul tenant. Par ailleurs, la pièce intermédiaire 15 et la cuve optique 17 peuvent être fabriquées de manière à être solidaires l’une de l’autre.

La pièce intermédiaire 15 présente une cavité 25 sur laquelle débouchent le conduit d’injection 9 et le conduit d’injection 1 1 . Par conséquent, le flux d’échantillon est destiné à être manchonné au sein de la cavité 25 par le flux de manchonnage injecté dans le conduit d’injection 11 .

La cavité 25 présente avantageusement la forme générale d’un cône pour faciliter le gainage du flux d’échantillon. En d’autres termes et comme illustré sur la [Fig. 1 ], les dimensions de la cavité 25 se réduisent à mesure que le flux d’échantillon manchonné se rapproche de la cuve optique 17.

Par ailleurs, la cavité 25 communique avec la cuve optique 17 par l’orifice 27. L’orifice 27 est ménagé dans le dispositif 1 pour permettre l’entrée du flux d’échantillon manchonné dans la cuve optique 17. L’orifice 27 est donc dimensionné de manière à autoriser le passage des cellules sanguines du flux d’échantillon manchonné. On comprend ici que l’intérêt du flux de manchonnage injecté dans le conduit d’injection 1 1 est de centrer, gainer et étirer le flux d’échantillon par rapport à l’orifice 27 et de faciliter le passage l’une après l’autre des cellules sanguines dans l’orifice 27 à un débit satisfaisant.

C’est au niveau de l’orifice 27 - qui peut être qualifié d’orifice de comptage - que sont comptées les cellules sanguines du flux d’échantillon par une mesure de résistivité.

Comme illustré sur la [Fig. 1], un conduit supplémentaire 29 d’injection d’un flux de manchonnage peut être ménagé dans la pièce intermédiaire 15 pour réaliser un gainage hydrodynamique supplémentaire du flux d’échantillon.

Le conduit supplémentaire 29 est comparable au conduit d’injection 1 1 . Ainsi, le conduit supplémentaire 29 est agencé pour recevoir un flux de manchonnage et en guider l’écoulement au sein du dispositif 1. Le conduit supplémentaire 29 présente au moins une ouverture à l’extérieur du dispositif 1 pour pouvoir y injecter, par exemple sous pression, le flux de manchonnage.

Plus exactement, le conduit supplémentaire 29 débouche sur une chambre annulaire 31 ménagée dans la pièce intermédiaire 15 et communiquant avec la cuve optique 17. Alors que le premier manchonnage, obtenu en injectant un flux de manchonnage dans le conduit d’injection 11 , permet de centrer et d’affiner le flux d’échantillon pour le comptage des cellules sanguines au niveau de l’orifice 27, le deuxième manchonnage permet de renforcer le guidage du flux d’échantillon manchonné au sein de la cuve optique 17. Le deuxième manchonnage permet par ailleurs d’éviter le phénomène de recirculation, c’est- à-dire un nouveau passage d’une cellule sanguine par le point de mesure optique, c’est-à-dire l’intersection de la direction de circulation X et de la direction optique Y sur la [Fig. 1 ].

Il convient de noter que la pièce intermédiaire 15 est accessoire. En effet, la sortie du conduit d’injection 9 peut coïncider avec l’orifice 27 de sorte que le flux d’échantillon injecté est conduit directement à la cuve optique 27. Dans un tel cas, le flux de manchonnage injecté dans le conduit d’injection 1 1 permet de réaliser le gainage hydrodynamique du flux d’échantillon dans la cuve optique 17 pour les besoins de la mesure de fluorescence. On comprend alors qu’un manchonnage supplémentaire n’est pas nécessaire. Il est également possible de prévoir la pièce intermédiaire 15 sans le conduit d’injection 29. Dans ce cas particulier, le flux de manchonnage injecté dans le conduit d’injection 1 1 permet de réaliser le gainage hydrodynamique du flux d’échantillon dans la cavité 25. Un tel manchonnage contribue à la fois à la mesure de résistivité au niveau de l’orifice 27 et à la mesure de fluorescence au sein de la cuve optique 17.

La cuve optique 17 est agencée pour être traversée selon une direction de circulation X par le flux d’échantillon provenant de l’embase chauffante 3 soit indirectement, en présence de la pièce intermédiaire 15, soit directement, en l’absence de la pièce intermédiaire 15.

Le manchonnage du flux d’échantillon réalisé au niveau de la cuve optique 17 permet de centrer, étirer et guider le flux d’échantillon de sorte que les cellules sanguines circulent l’une après l’autre le long de la direction de circulation X depuis l’orifice 27 jusqu’au conduit d’évacuation 23.

La cuve optique 17 est agencée en outre pour autoriser le passage de la lumière. En effet, la cuve optique 17 est disposée, au sein de la cellule de mesure 5, entre le module d’émission lumineuse 19 et le module de réception lumineuse 21. La cuve optique 17 est ainsi délimitée par des parois fabriquées dans un matériau transparent, par exemple du verre.

Le module d’émission lumineuse 19 est agencé pour émettre de la lumière en direction de la cuve optique 17, et notamment du flux d’échantillon manchonné circulant dans la cuve optique 17.

Dans le mode de réalisation illustré sur la [FIG. 1 ], le module d’émission lumineuse 19 comprend une source lumineuse 33 et une optique de mise en forme 35.

La source lumineuse 33 est agencée pour éclairer, selon une direction optique Y sensiblement orthogonale à la direction de circulation X, le flux d’échantillon manchonné traversant la cuve optique 17. Par « sensiblement orthogonale », on entend ici que, idéalement, la direction de circulation X et la direction optique Y forment un angle de 90°. Toutefois, en pratique, il n’est pas toujours possible d’obtenir exactement un angle de 90°, de sorte que l’angle réellement obtenu peut s’éloigner de près de 5% d’un angle de 90°.

Typiquement, la source lumineuse 33 est agencée pour émettre un faisceau lumineux selon la direction optique Y.

Avantageusement, la source lumineuse 33 est une source laser. Une source laser comprend typiquement une diode laser agencée pour émettre une lumière monochromatique cohérente. Par exemple, la source lumineuse 33 est une source laser bleu, auquel cas la diode laser émet une lumière dont la longueur d’onde est comprise entre 380 et 500 nanomètres (nm). En particulier, il est possible d’utiliser une diode laser de la marque OSRAM (marque enregistrée) émettant à 488 nm. Une telle diode laser a une puissance de l’ordre de 50 milliwatts (mW). L’optique de mise en forme 35 est agencée pour faire converger les rayons du faisceau lumineux émis par la source lumineuse 33 en un point de passage des cellules sanguines du flux d’échantillon manchonné. Un tel point de passage peut être repéré sur la [Fig. 1 ] par l’intersection de la direction de circulation X et de la direction optique Y.

L’optique de mise en forme 35 est particulièrement utile lorsque le faisceau lumineux est large et que les rayons qui le composent sont émis par la source lumineuse 33 dans des directions différentes. L’optique de mise en forme 35 présente un intérêt moindre lorsque la source lumineuse 33 est une source laser et que le faisceaux lumineux émis est étroit avec des rayons lumineux sensiblement parallèles entre eux. L’optique de mise en forme 35 est optionnelle.

L’optique de mise en forme 35 peut comprendre une lentille sphérique, présentant une distance focale de l’ordre de 75 millimètres (mm). Par exemple, l’optique de mise en forme 35 est formée par un doublet achromatique de la marque THORLABS (marque enregistrée) correspondant à la référence AC127- 075-A.

Avantageusement, l’optique de mise en forme 35 est positionnée de sorte que la direction de circulation X est comprise dans le plan focal objet de l’optique de mise en forme 35.

Les cellules sanguines du flux d’échantillon manchonné circulent dans la cuve optique 17 de l’orifice 27 au conduit d’évacuation 23 le long de la direction de circulation X. Les cellules sanguines sont éclairées par la source lumineuse 33 en un point correspondant à l’intersection de la direction de circulation X et de la direction optique Y. Du fait du manchonnage, les cellules sanguines sont éclairées l’une après l’autre.

Chaque cellule sanguine éclairée par la source lumineuse 33 émet alors un signal de fluorescence. On qualifie de « signal de fluorescence » l’émission lumineuse d’une cellule sanguine ou, plus précisément, d’un fluorochrome couplé à une sonde nucléique, à un ligand ou à un anticorps pour se lier spécifiquement à la cellule sanguine. Cette émission lumineuse résulte de l’excitation des électrons du fluorochrome provoquée par l’absorption de photons de la lumière émise par la source lumineuse 33.

Avantageusement, plusieurs fluorochromes peuvent être utilisés pour marquer différents types de cellules sanguines et ainsi les différencier. Il est aussi possible d’utiliser des colorants fluorescents.

Parmi les marqueurs fluorescents connus, il est possible d’utiliser par exemple le 4’,6-diamidino-2-phénylindole (plus connu sous l’acronyme DAPI), le Thiazole Orange, la phycoérythrine, la gamme de fluorochromes Alexa Fluor produits par la société Molecular Probes (marque déposée) ou encore l’iodure de propidium.

Le module de réception lumineuse 21 est agencé pour recevoir un signal de fluorescence émis par une cellule sanguine du flux d’échantillon manchonné après absorption de la lumière émise par la source lumineuse 33.

Dans l’exemple illustré sur la [Fig. 1 ], le module de réception lumineuse 21 comprend une optique de focalisation 37, un diaphragme 39 et un détecteur 41 .

L’optique de focalisation 37 est agencée pour focaliser le signal de fluorescence émis par chaque cellule sanguine sur le détecteur 41 .

L’optique de focalisation 37 comprend par exemple un doublet de lentilles.

Le diaphragme 39 est agencé pour réaliser un filtrage spatial du signal de fluorescence. Le diaphragme 39 est plus précisément un diaphragme d’ouverture permettant de limiter le passage des rayons lumineux autres que le signal de fluorescence jusqu’au détecteur 41 .

Le détecteur 41 est agencé pour réaliser une mesure de fluorescence à partir de chaque signal de fluorescence reçu. En particulier, le détecteur 41 est agencé pour convertir chaque signal de fluorescence reçu en un signal électrique. Le signal électrique est représentatif du fluorochrome émetteur du signal de fluorescence et donc de la nature de la cellule sanguine à laquelle le fluorochrome est lié.

On comprend ici que le détecteur 41 réalise une mesure de fluorescence pour chaque cellule sanguine du flux d’échantillon manchonné qui, en réponse à l’absorption de la lumière émise par la source lumineuse 33, émet un signal de fluorescence en direction du module de réception lumineuse 21 .

Avantageusement, le détecteur 41 est un photomultiplicateur - aussi appelé tube photomultiplicateur (plus connu sous l’acronyme anglophone PMT pour « photomultiplier tube >>). Un photomultiplicateur présente l’avantage d’avoir un gain élevé, de l’ordre de 10 ⁶ , ce qui est particulièrement approprié pour la détection d’un signal de fluorescence qui est, en général, assez faible. Il est possible d’utiliser par exemple un photomultiplicateur en silicium (plus connu sous l’acronyme anglophone SiPM pour « silicon photomultiplier »).

La description du dispositif 1 , et plus précisément de la cellule de mesure 5, se focalise sur la mesure de la fluorescence. Toutefois, il doit être noté que d’autres signaux optiques peuvent être analysés. À titre d’exemples, la lumière diffusée aux petits angles - ou FSC pour « Forward Scatter » - permet de déterminer la taille des cellules sanguines tandis que la lumière diffusée à 90°- ou SSC pour « Side Scatter » - renseigne sur la forme, la structure interne et la granularité des cellules sanguines.

La cellule de mesure 5 peut ainsi comprendre des détecteurs dédiés à l’analyse de signaux optiques autres que le signal de fluorescence. Il est notamment connu d’utiliser des miroirs dichroïques pour décomposer les signaux optiques et les rediriger vers les détecteurs appropriés. On comprend que, contrairement à ce que suggère la [Fig. 1 ], le module de réception lumineuse 21 ne se trouve pas nécessairement dans l’axe optique Y.

Par conséquent, l’homme du métier comprend que le mode de réalisation illustré sur la [Fig. 1 ] n’est pas limitatif et que la cellule de mesure 5 peut comprendre un ou plusieurs modules d’émission lumineuse supplémentaires et un ou plusieurs modules de réception lumineuse supplémentaires pour effectuer des mesures optiques autres que la mesure de fluorescence. De telles mesures sont par exemple des mesures de diffusion aux petits angles, des mesures de diffusion à 90°, des mesures d’extinction et des mesures de diffusion aux grands angles. Ces mesures optiques sont complémentaires de la mesure de fluorescence et permettent de collecter des informations concernant les caractéristiques des cellules sanguines. De telles informations permettent notamment d’améliorer la différenciation des cellules sanguines.

D’un point de vue structurel, il est également possible, plutôt que d’ajouter un ou plusieurs modules d’émission lumineuse et un ou plusieurs modules de réception lumineuse, d’équiper le module d’émission lumineuse 19 d’une ou plusieurs sources lumineuses supplémentaires - qui peuvent d’ailleurs être des sources laser - et des optiques nécessaires ; et d’équiper le module de réception lumineuse 21 d’un ou plusieurs détecteurs supplémentaires - qui peuvent d’ailleurs être des photomultiplicateurs - et des optiques nécessaires.

Il doit donc être noté ici que le dispositif 1 est agencé pour différencier les cellules sanguines au moins par une mesure de fluorescence mais que celle-ci peut être complétée par des mesures optiques telles que celles mentionnées précédemment et que, le cas échéant, la cellule de mesure 5 comprend les moyens nécessaires à cette fin. À titre d’exemple, la demande de brevet internationale WO 2021/144545 A1 décrit des canons d’émission et des canons de réception permettant de réaliser des mesures de diffusion aux petits angles, des mesures de diffusion à 90°, des mesures d’extinction et des mesures de diffusion aux grands angles.

Enfin, le conduit d’évacuation 23 communique avec la cuve optique 17 et est agencé pour évacuer le flux d’échantillon manchonné.

Par ailleurs, le conduit d’évacuation 23 est agencé en outre pour former une électrode pour la mesure de la résistivité. Plus précisément, le conduit d’évacuation 23 constitue une anode. À cet effet, le conduit d’évacuation 23 peut être fabriqué à partir d’un matériau comprenant du platine.

On comprend donc que l’embase chauffante 3 et le conduit d’évacuation 23 forment une paire d’électrodes de mesure agencée pour réaliser une mesure de résistivité. Pour ce faire, on applique un courant électrique aux bornes des électrodes de mesure, à savoir la cathode formée par l’embase chauffante 3 et l’anode formée par le conduit d’évacuation 23. Un courant électrique circule alors entre l’embase chauffante 3 et le conduit d’évacuation 23, et passe par l’orifice 27. Par conséquent, le passage d’une cellule sanguine du flux d’échantillon par l’orifice 27 génère une augmentation ponctuelle de la résistivité du milieu situé entre les électrodes de mesure se traduisant par une impulsion en tension proportionnelle au volume de la cellule sanguine.

D’une manière équivalente, la grandeur mesurée par la paire d’électrodes de mesure peut être une impédance.

Par ailleurs, la cellule de mesure 5 peut aussi comprendre un circuit de contrôle thermique (non représenté sur la [Fig. 1 ]) couplé à l’embase chauffante 3 et agencé pour asservir la température de l’embase chauffante 3 à une température de consigne.

En effet, comme expliqué précédemment, la température a un impact sur la résistivité et la fluorescence. Il est donc particulièrement avantageux de maintenir la cellule de mesure 5 à une température sensiblement constante pour obtenir des valeurs fiables pour la résistivité et l’intensité de fluorescence.

Un tel circuit de contrôle thermique prend par exemple la forme d’une boucle d’asservissement avec, en entrées, une température de consigne et la température mesurée au niveau de la cellule de mesure 5. Le circuit de contrôle thermique peut inclure un ou plusieurs capteurs de températures pour mesurer la température.

En plus de la température mesurée au niveau de la cellule de mesure 5, le circuit de contrôle thermique peut également recevoir en entrée la température du dispositif 1 et non pas seulement de la cellule de mesure 5. La température du dispositif 1 a en effet un impact sur la température de la cellule de mesure et il peut donc être avantageux d’en tenir compte. La température du dispositif 1 , et donc de la cellule de mesure 5, peut aussi dépendre de la température du laboratoire où est installé le dispositif 1. Typiquement, le circuit de contrôle thermique peut donc inclure un capteur de température de la cellule de mesure 5, mais aussi un capteur de température du dispositif 1 voire un capteur de température du laboratoire.

Enfin, l’isolateur électrique 7 est agencé pour protéger la cellule de mesure 5 des champs électromagnétiques. Pour ce faire, l’isolateur électrique 7 est connecté au conduit d’évacuation 23. Une telle isolation de la cellule de mesure 5 permet de limiter les perturbations de la mesure de résistivité et d’obtenir un meilleur rapport signal sur bruit (plus connu sous l’acronyme anglophone SNR pour « signal-to-noise ratio >>).

L’isolateur électrique 7 est par exemple une cage de Faraday délimitant un espace intérieur au sein duquel est reçu le conduit d’évacuation 23.

Dans l’exemple illustré sur la [Fig. 1 ], l’isolateur électrique 7 est relié à la masse. Par ailleurs, des raccords électriques de l’isolateur électrique 7 peuvent aussi bien être reliés à la masse qu’à une électrode de garde.

En effet, le conduit d’évacuation 23 peut adopter le comportement d’un fil électrique pendant l’utilisation du dispositif 1 et ainsi perturber les mesures de résistivité. L’isolateur électrique 7 permet d’éviter de telles perturbations.

Par ailleurs, dans le mode de réalisation particulier dans lequel la cellule de mesure 5 comprend la pièce intermédiaire 15 et dans lequel un conduit supplémentaire 29 d’injection d’un flux de manchonnage est ménagé dans la pièce intermédiaire 15, une portion du conduit supplémentaire 29 peut-être logée au sein de l’isolateur électrique 7. On comprend ici que le conduit supplémentaire 29 comprend une partie, visible sur la [Fig. 1 ], ménagée au sein de la pièce intermédiaire 15 et une partie, non représentée sur la [Fig. 1 ], à l’extérieur de la pièce intermédiaire 15 et dont au moins une portion est logée au sein de l’isolateur électrique 7.

De même que le conduit d’évacuation 23, le conduit supplémentaire 29 peut en effet adopter le comportement d’un fil électrique et ainsi perturber les mesures de résistivité. Là encore, l’isolateur électrique 7 permet d’éviter de telles perturbations.

La [Fig. 2] illustre schématiquement des circuits de préparation et de traitement associés au dispositif 1 .

Un ensemble de distribution hydraulique 43 est agencé pour alimenter le dispositif 1 en flux d’échantillon et de manchonnage.

En particulier, l’ensemble de distribution hydraulique 43 peut comprendre une unité de stockage d’échantillons de sang au sein de laquelle plusieurs opérations de préparation peuvent être mises en œuvre avant l’injection d’un flux d’échantillon dans le conduit d’injection 9 du dispositif 1. Par exemple, un ou plusieurs fluorochromes respectivement couplés à une sonde nucléique, à un ligand ou à un anticorps peuvent être mélangés avec des échantillons de sang pour favoriser la liaison de chaque fluorochrome avec une cellule sanguine selon le type de celle-ci.

Comme expliqué précédemment, l’utilisation de fluorochromes permet de différencier les cellules sanguines à partir d’un signal de fluorescence émis par chaque cellule sanguine à destination du module de réception lumineuse 21 après absorption de la lumière émise par la source lumineuse 33.

Par ailleurs, il convient de rappeler ici que le dispositif 1 peut être utilisé pour analyser des liquides biologiques voire organiques autres que des échantillons de sang. Par conséquent, l’ensemble de distribution hydraulique peut comprendre une unité de stockage d’un liquide cérébrospinal, d’un liquide pleural, d’un liquide prélevé lors d’une ponction de moelle osseuse ou encore d’un liquide synovial. Une « unité de stockage » désigne ici, de manière générale, tout contenant ou récipient apte à stocker un liquide biologique en vue d’alimenter le dispositif 1 avec un flux d’échantillon de ce liquide. L’unité de stockage peut par exemple être un tube à échantillon ou un tube de prélèvement de sang.

Un circuit de traitement 45 des mesures de résistivité est agencé pour recevoir l’impulsion en tension générée par le passage de chaque cellule sanguine par l’orifice 27 du dispositif 1 .

En effet, comme expliqué précédemment, le passage d’une cellule sanguine par l’orifice 27 provoque une augmentation ponctuelle de la résistivité du milieu situé entre les électrodes de mesure, à savoir l’embase chauffante 3 et le conduit d’évacuation 23.

Le circuit de traitement 45 est donc agencé pour détecter chaque impulsion en tension et compter les cellules sanguines du flux d’échantillon. À cette fin, le circuit de traitement 45 comprend par exemple un voltmètre branché aux bornes des électrodes de mesure pour mesurer la tension entre la cathode - donc l’embase chauffante 3 - et l’anode - donc le conduit d’évacuation 23. Le circuit de traitement 45 peut également comprendre une carte d’amplification de tension - aussi appelée amplificateur de tension - pour élever la tension mesurée aux bornes des électrodes de mesure et ainsi faciliter la détection d’une impulsion.

La sortie du circuit de traitement 45 est typiquement un nombre de cellules sanguines détectées et comptées.

Un circuit de traitement 47 des mesures optiques est agencé pour recevoir au moins les mesures de fluorescence réalisées par le détecteur 41 .

Plus précisément, le circuit de traitement 47 est agencé pour recevoir chaque signal électrique généré par le détecteur 41 à partir d’un signal de fluorescence reçu en provenance d’une cellule sanguine. Le signal électrique reçu par le circuit de traitement 47 est caractéristique de la mesure de fluorescence et donc du type de la cellule sanguine.

Les mesures de fluorescence du détecteur 41 permettent ainsi au circuit de traitement 47 de différencier plusieurs types de cellules sanguines, par exemple : lymphocyte, monocyte, granulocyte neutrophile, granulocyte éosinophile, granulocyte basophile ou encore érythroblaste. D’une manière générale, le circuit de traitement 47 peut être agencé pour différencier les différentes cellules des lignées leucocytaires, érythrocytaires et thrombocytaires détaillées précédemment.

La sortie du circuit de traitement 47 est typiquement le type d’une cellule sanguine détectée, voire la répartition des cellules sanguines en fonction de leur type.

Comme expliqué précédemment, des mesures optiques autres que la mesure de fluorescence peuvent être réalisées pour identifier les caractéristiques des cellules sanguines et les différencier, notamment des mesures de diffusion aux petits angles, des mesures de diffusion à 90°, des mesures d’extinction et des mesures de diffusion aux grands angles. Le circuit de traitement 47 peut, le cas échéant, être agencé pour recevoir des mesures optiques supplémentaires réalisées par d’autres détecteurs que le détecteur 41 , que de tels détecteurs soient compris dans le module de réception lumineuse 21 ou dans d’autres modules de réception lumineuse non représentés sur la [Fig. 1],

Enfin, un écran 49 est agencé pour recevoir les sorties du circuit de traitement 45 et du circuit de traitement 47 et pour rendre accessibles à un utilisateur, par exemple un professionnel de santé, les résultats du comptage et de la différenciation.

L’écran 49 est ainsi agencé pour afficher le nombre de cellules sanguines comptées et la répartition de ces cellules sanguines par types. L’écran 49 peut également être couplé à des moyens d’impression sur papier des résultats. Dans l’exemple illustré sur la [Fig. 2], l’ensemble de distribution hydraulique 43, le circuit de traitement 45, le circuit de traitement 47 et l’écran 49 sont distincts du dispositif 1. Toutefois, tout ou partie de ces éléments peut être intégré au dispositif 1 . En particulier, le circuit de traitement 45 et le circuit de traitement 47 peuvent éventuellement être considérés comme faisant partie de la cellule de mesure 5.