La présente invention se rapporte au domaine de la cristallisation des macromolécules chargées en solution.

L'obtention de cristaux de diverses macromolécules est une étape importante pour la caractérisation des conformations de ces macromolécules, caractérisation qui est classiquement réalisée par diffraction des rayons X sur les cristaux.

II existe un besoin dans l'état de la technique pour l'obtention de cristaux de macromolécules de taille suffisante permettant l'obtention d'une haute résolution par diffraction des rayons X. Pour les macromolécules chargées en solution qui contiennent une pluralité de groupes ioniques et polaires, comme les protéines, les acides nucléiques, les composés hydrocarbonés et les virus, qui sont en général très difficiles à cristalliser, il a été proposé de favoriser la formation d'un réseau cristallin périodique de bonne qualité en agissant sur ces macromolécules chargées par l'application d'un champ électrique externe adéquat.

Le brevet US N°5, 525,198 délivré le 11 Juin 1996, décrit un dispositif de cristallisation ayant la forme d'un cylindre qui est complètement rempli par la solution contenant la macromolécule à cristalliser.

Dans ce dispositif, la solution est séparée des deux électrodes par deux couches de matériau diélectrique. Les deux électrodes, utilisées comme anode et cathode, sont placées respectivement à chacune des extrémités de l'enceinte cylindrique. Le champ appliqué à la solution est destiné à orienter les macromolécules.

L'obtention d'une figure de diffraction atteste de l'ordonnancement de ces molécules dans le champ. Les auteurs qualifient leur système de "masse cristalline"électrorhéologique. La transformation état désordonné/état ordonné est réversible. En effet, lorsque l'application du champ électrique est interrompue le système perd son état ordonné. Une manière de conserver cette"masse cristalline"sans champ électrique est de la cryogéniser avant de couper le champ électrique. L'échantillon est

alors beaucoup plus maniable pour réaliser des expériences de diffraction.

Un autre procédé de cristallisation utilisé dans l'état de la technique est basé sur le principe de la diffusion de vapeur. Une goutte de faible volume contenant la protéine, le tampon et l'agent précipitant, est déposée sur une lamelle (dans le cas de la technique de la goutte suspendue). Cette lamelle est retournée et scellée sur un réservoir contenant un volume très supérieur du même tampon et de l'agent précipitant nettement plus concentré que dans la goutte. Le système retourne à l'équilibre des concentrations par diffusion de vapeur conduisant à une déshydratation de la goutte et donc à un accroissement de la concentration en protéine pouvant mener à une cristallisation.

Un autre procédé de cristallisation utilisé dans l'état de la technique est basé sur la méthode « batch ». Dans cette méthode la macromolécule à cristalliser est placée dans une enceinte fermée. Les concentrations en macromolécule et en agent précipitant restent donc constantes dans la solution au cours du temps. Les concentrations choisies doivent donc conduire à une nucléation spontanée.

L'article de TALEB et al. (1999-Journal of Crystal growth, 200, pp 575-582) décrit un dispositif de cristallisation de protéines dans un champ électrique externe. Cet article décrit un dispositif de cristallisation constitué d'une chambre cylindrique étanche à l'air dont l'extrémité supérieure est fermée par un couvercle amovible. Sur la surface interne du couvercle amovible est disposée une goutte d'un volume de 8 pi de la solution contenant la macromolécule à cristalliser. La base de la chambre cylindrique forme un réservoir contenant un volume de 500p1 de la solution de l'agent précipitant.

Deux plaques métalliques utilisées comme électrodes sont placées respectivement sous la base de la chambre cylindrique (anode ou cathode) et au-dessus du couvercle amovible (cathode ou anode) afin de placer la goutte de solution à cristalliser dans un champ électrique externe.

Avec ce dispositif, TALEB et al. (1999) ont obtenu des cristaux de lysozyme de blanc d'oeuf de poule en appliquant une tension de 5000

volts entre les deux plaques d'électrodes situées à une distance de 2,5 cm l'une de l'autre, de part et d'autre de la chambre cylindrique de cristallisation.

TALEB et al. (1999) ont montré que le champ électrique externe, lorsqu'il est appliqué à une solution d'une macromolécule à cristalliser à l'aide d'un dispositif de goutte assise, permet d'augmenter la taille des cristaux de lysozyme, cristaux qui sont autrement plus nombreux et de taille plus réduite en l'absence du champ électrique externe.

Toutefois, le dispositif de Taleb et al. ne permet pas la création de cristaux de macromolécules dans les conditions dans lesquelles aucun cristal n'est formé en l'absence de champ électrique.

SOMMAIRE DE L'INVENTION II est fourni selon l'invention un nouveau dispositif de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, qui met en oeuvre un champ électrique externe, non uniforme, et dont les caractéristiques techniques permettent l'obtention de cristaux de macromolécules chargées. Le dispositif de cristallisation selon l'invention permet la formation de cristaux de macromolécules chargées à partir de solutions de cristallisation pour lesquelles aucun cristal n'a pu être formé sans champ électrique pour des solutions identiques.

Selon l'invention, on a montré que lorsque la cristallisation du lysozyme était possible, les résultats étaient améliorés considérablement lorsque un champ électrique non uniforme, mais possédant au contraire une valeur maximale en un point, était appliqué sur la goutte de cristallisation. Cette caractéristique de création d'un gradient de champ électrique dans un espace limité peut être défini par le modèle électrostatique simplifié suivant : Une charge électrique Q régulièrement distribuée sur une spire circulaire de rayon R crée dans tout l'espace un champ électrique de symétrie cylindrique ayant le même axe que celui de la spire. Le champ est maximum sur l'axe de la spire et sa valeur dépend du rayon R de la spire et de la distance h entre le plan de la spire et le point où est créé le

champ électrique. Ce champ électrique peut être calculé selon la formule suivante : E= kQ h/(R2+h2)3/2 Dans laquelle : -E est la valeur du champ électrique exprimée en Vm~1 - k est la constante de la force de Coulomb, k=1/4##0=9. 109 Nm2C- 2où #0 est la permittivité du vide (so=1/36s109 dans le système SI) -Q est la valeur de la charge électrique, exprimée en Coulombs (C) - h exprimé en mètre, est la distance entre le plan de la spire et le point où est créé le champ électrique - R exprimé en mètre, représente le rayon de la spire.

Le potentiel électrique correspondant est calculé par la formule : V=kQ/ (R 2+h 2) 112 le rapport champ électrique/potentiel électrique est calculé selon la formule : EI V =h/(R2sh2) Ce rapport donne une relation indépendante de la charge Q entre E et V.

Cette relation peut alors s'exprimer à l'aide des seules mesures de h et de R.

Sur l'axe de la spire, pour le point de cote h=R ##2 le champ est maximum maximorum. Dans ce cas, le rapport EIV est (EN) max=12/3R.

II s'agit du point, ou cote, pour lequel la valeur du champ électrique est maximale, dans l'axe de la goutte à cristalliser.

Selon l'invention, des cristaux de macromolécules chargées sont obtenus grâce à un dispositif de cristallisation dont les caractéristiques techniques permettent de créer un champ électrique non uniforme de

symétrie cylindrique dont le maximum est appliqué sur l'axe de la goutte de cristallisation.

L'invention a pour objet un dispositif de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, comprenant : (i) une chambre cylindrique interne (1) à axe de révolution, dont la partie inférieure fermée constitue un réservoir isolant et dont la partie supérieure ouverte est rendue étanche à l'air par un couvercle mobile (2) en matériau isolant ; (ii) un support isolant (9) dont l'une des surfaces est destinée à recevoir un volume désiré de la solution contenant ladite macromolécule, sous la forme d'une goutte ou d'un disque, ledit support isolant étant placé au sein de la chambre cylindrique interne (1) ; (iii) deux électrodes (4) et (5), anode ou cathode, placées respectivement au-dessus du couvercle (2) et autour de la chambre cylindrique interne (1), caractérisé en ce que : (a) l'électrode (5), cathode ou anode, entourant la chambre cylindrique interne (1), constitue une chambre cylindrique externe (3), dont l'axe de révolution est identique à l'axe de révolution de la chambre interne (1) ; (b) l'électrode (4), anode ou cathode, placée au-dessus du couvercle (2), est constituée d'un cylindre de faible diamètre, qui est coaxial à l'axe de révolution de la chambre cylindrique externe (3) L'invention est également relative à un appareil de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de dispositifs tels que définis ci-dessus.

L'invention a aussi pour objet un procédé de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) placer, dans une enceinte étanche à l'air, une goutte d'un volume prédéterminé de solution contenant ladite macromolécule dont au moins une partie de la surface est en contact avec un support isolant, dans un champ électrique externe non uniforme de symétrie cylindrique coaxiale à l'axe de la goutte, et dont la valeur de champ est maximale sur l'axe de la goutte. b) récupérer le ou les cristaux de ladite macromolécule.

DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 illustre une coupe verticale d'un mode de réalisation du dispositif de cristallisation selon l'invention, dans lequel le support isolant (9) sur la surface duquel est placée la goutte de macromolécule à cristalliser est constitué du couvercle mobile (2). Il s'agit d'une mise en oeuvre de la technique dite à « goutte suspendue ».

La ficlure 2 représente une coupe transversale du dispositif de cristallisation selon l'invention dans le mode de réalisation dans lequel le support isolant est un support interne (9) dont la surface est destinée à recevoir le volume désiré de la solution à cristalliser, sous forme d'une goutte. Ce support forme un plan (10), parallèle au plan (11) formé par la surface interne du couvercle (2). II s'agit de la mise en oeuvre de la technique dite à « goutte assise »..

La figure 3 illustre une coupe transversale du dispositif de cristallisation selon l'invention dans lequel le support isolant (9) est un support interne (9) dont la surface est destinée à recevoir le volume désiré de la solution à cristalliser et forme un plan (10), parallèle au plan (11) formé par la surface interne du couvercle (2) ; les plans (10) et (11) étant, l'un par rapport à l'autre, à une distance telle que la solution à cristalliser est en contact simultanément avec la surface interne du couvercle (2). II s'agit du mode de réalisation de la technique dite à « goutte sandwich ».

La figure 4 illustre un mode de réalisation d'un appareil de cristallisation selon l'invention, qui comprend une pluralité de dispositifs illustrés dans l'une des figures 1 à 3 précédentes.

En bas de la figure 4, on représente le schéma de l'électrode (5) doté d'une pluralité de chambres cylindriques externes (3).

Au milieu de la figure 4, on représente le dispositif comprenant une pluralité de chambres cylindriques internes (1).

Le couvercle (2) représenté dans les figures 1 à 3 n'est pas représenté sur la figure 4. Il s'agit d'une plaque en matériel isolant et transparent pour permettre l'observation à l'aide d'un microscope ou d'une loupe binoculaire, par exemple en verre organique ou minéral, qui

vient s'apposer au-dessus du dispositif afin d'obturer l'extrémité supérieure ouverte de la pluralité des chambres cylindriques internes (1).

En haut de la figure, on représente un support contenant une pluralité d'électrodes (4), de type tubulaire à faible section, qui viennent en contact avec le support isolant (2) qui n'est pas représenté sur la figure.

La figure 5 illustre les résultats d'essais de cristallisation de la péroxyrédoxine de Poplar trichorpa en utilisant le dispositif de cristallisation de l'invention. Les essais ont été réalisés respectivement : (i) sans champ électrique (fig. 5a) (ii) avec un champ créé par une tension continue de 15.000 V (fig. 5b et 5c). L'électrode 4 a été soit cathode (fig. 5b), soit anode (fig. 5c). La température était de 20°C. Le champ électrique a été appliqué pendant deux semaines. L'examen des photographies des gouttes de la figure 5 montre qu'elles présentent un très léger précipité qui ne semble pas du tout cristallin dans la première boite (fig. 5a). La deuxième boite montre des précipités cristallins avec la formation de gros cristaux allongés dans deux des gouttes (fig. 5b, en haut à droite et en bas à gauche). La troisième boite montre également des précipités granuleux susceptibles de conduire à des cristaux (fig. 5c).

La figure 6 illustre un système de cristallisation dans lequel 12 appareils de cristallisation contenant chacun 24 dispositifs de cristallisation sont électriquement reliés entre eux. Les électrodes (4), d'une part, et les électrodes (5), d'autre part, sont reliées deux à deux.

Chaque paire de deux électrodes est reliée en parallèle à un bus électrique. Dans ce dispositif toutes les électrodes (4) sont au même potentiel et toutes les électrodes (5) sont au même potentiel. La différence de potentiel entre les électrodes (4) et (5) est celle du générateur.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION.

Il est montré selon l'invention que le processus de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution pouvait être modulé par

l'application d'un champ électrique externe non uniforme centré sur l'axe de la goutte contenant la macromolécule à cristalliser.

Selon l'invention, il a été mis au point un dispositif de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, utilisable dans des techniques de cristallisation dites à goutte suspendue, goutte assise aussi bien que à goutte sandwich, dont les moyens permettent de soumettre la solution cristallisée dans les conditions de champ électrique externe non uniforme exposées précédemment.

L'invention a donc pour objet un dispositif de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, comprenant : (i) une chambre cylindrique interne (1) à axe de révolution, dont la partie inférieure est fermée et constitue un réservoir isolant et dont la partie supérieure est ouverte, et qui est rendue étanche à l'air par un couvercle mobile (2) en matériau isolant ; (ici) un support isolant (9), dont l'une des surfaces est destinée à recevoir un volume désiré de la solution contenant ladite macromolécule sous la forme d'une goutte ou d'un disque, ledit support isolant étant placé au sein de la chambre cylindrique interne (1) ; (qui) deux électrodes (4) et (5), placées respectivement au-dessus du couvercle (2) et autour de la chambre cylindrique interne (1), les axes de ces deux électrodes étant coaxiaux avec celui de la chambre interne (1), caractérisé en ce que : (a) l'électrode (5), cathode ou anode, entourant la chambre cylindrique interne (1) constitue une chambre cylindrique externe (3), dont l'axe de révolution est identique à l'axe de révolution de la chambre interne (1) ; (b) l'électrode (4), anode ou cathode, placée au-dessus du couvercle (2) est constituée d'un cylindre de faible diamètre, qui est coaxial à l'axe de révolution de la chambre cylindrique externe (3) Par « matériau isolant », on entend selon l'invention un matériau qui ne conduit pas l'électricité, ayant une valeur de résistance électrique du même ordre de grandeur que celle d'un verre minéral ou organique ou encore dune matière plastique isolante telle que le plexiglassTM.

De préférence, un matériau « isolant » ou un matériau « diélectrique » selon l'invention consiste en un matériau possédant une

valeur de résistivité au moins égale à 107 Qm. Un matériau isolant ou diélectrique selon l'invention peut posséder une valeur de résistivité allant jusqu'à 1014 Q m, et même aller au-delà de cette valeur. A titre illustratif la valeur de résistivité du verre est comprise généralement entre 101° et 1014 Qm ; la valeur de résistivité du polystyrène est comprise généralement entre 107 et 1011 Qm.

La force du champ électrique externe en un point donné de la goutte de solution à cristalliser dépend de la combinaison de : (a) la différence de potentiel entre chacune des électrodes (4) et (5), c'est-à-dire la tension fournie par un générateur électrique aux bornes duquel sont placées les électrodes (4) et (5) ; et (b) la distance entre le plan (6) formé par la partie supérieure de la paroi de la chambre cylindrique externe (3) et le plan (7), parallèle au plan (6), formé par l'extrémité inférieure de l'électrode (4).

Dans le dispositif décrit, et selon la symétrie cylindrique, l'intensité du champ électrique est maximale sur l'axe des cylindres. La distance entre l'extrémité de l'électrode tubulaire (4) et le plan constitué par le haut de l'électrode cylindrique (3) est calculée de façon à obtenir le maximum de l'intensité du champ à l'intersection de l'axe de symétrie des chambres avec la partie inférieure du couvercle (2).

A titre illustratif, cette distance est de 7 mm dans le dispositif décrit dans les figures et les exemples, et a été calculée de telle sorte que le champ E soit maximum maximorum sur l'axe au niveau de l'électrode tubulaire (4). Dans ce cas, h='R/l2 =0,707 R. (R est le rayon d'une chambre cylindrique externe (3) de l'électrode (5) ; dans l'exemple : R=1 cm).

Dans les modes de réalisation du dispositif de cristallisation représentés dans les figures 1 à 4, dans lesquels chaque chambre cylindrique interne (1) est constituée par un puits d'une plaque de type Linbro, (commercialisée chez Hampton Research, 27632 EI Lazo Road, Suite 100, Laguna Niguel, CA 92677-3913 et Molecular Dimensions, Ltd.

61-63 Dudley street, Luton, Beds. LU2 ONP, par exemple) il a été déterminé que la distance entre le plan (6) et le plan (7) devait être comprise entre 6,5 mm et 7,5 mm, cette distance étant de préférence de 7 mm. Cette dernière distance calculée à partir d'un modèle

électrostatique simplifié, donne suivant l'axe de ce système, un champ électrique maximum à l'intersection de l'axe des électrodes et de la surface de la partie inférieure du couvercle (2).

La chambre cylindrique interne (1) est fabriquée dans un matériau isolant électrique, comme le matériel commercialisé par la société Hampton par exemple. Cette chambre cylindrique interne (1), qui est fermée à sa base, constitue une partie réservoir dans lequel peut être placé un volume prédéterminé de liquide tamponné contenant les agents précipitants Le couvercle mobile (2) est fabriqué dans un matériau isolant, par exemple un verre organique. Le couvercle mobile (2) est de préférence transparent.

Selon un aspect particulier, l'électrode (4) est solidaire d'un support d'électrode (8) placé au-dessus du couvercle mobile (2).

Les deux électrodes (4) et (5) sont constituées d'un matériau bon conducteur électrique de préférence en cuivre, en laiton ou en aluminium. De manière tout à fait préférée, l'électrode (4) est en cuivre et l'électrode (5) est en aluminium.

Afin de créer un champ électrique centré sur l'axe de la goutte, l'électrode (4) possède un faible diamètre ou section. Dans tous les cas, le diamètre de l'électrode (4) est inférieur au diamètre de la goutte de solution à cristalliser, pour tous les modes de réalisation du dispositif définis dans la présente description. Avantageusement, le diamètre de l'électrode (4) est inférieur à 5 mm, ce diamètre est de préférence inférieur à 3mm, et est de manière tout à fait préférée inférieur à 2 mm, par exemple d'environ 1 mm.

Pour la mise en oeuvre du procédé de cristallisation selon l'invention, les électrodes (4) et (5) sont reliées à un générateur électrique, continu dont la tension peut varier de 0 à 30000 volts. Plus la différence de potentiel entre les électrodes (4) et (5) est grande, plus le champ électrique externe auquel est soumis la goutte de solution à cristalliser sera grand et plus les processus de cristallisation du dispositif seront modifiés.

Le dispositif de cristallisation selon l'invention constitue un système particulièrement aisé à mettre en oeuvre, ne nécessitant pas de

manipulations longues et complexes, contrairement aux systèmes décrits par Taleb et al. (1999,2000).

En utilisant le dispositif de cristallisation ci-dessus pour cristalliser la molécule de lysozyme de blanc d'oeuf de poule, le demandeur à observé des résultats améliorés par rapport à ceux obtenus des dispositifs antérieurs, à savoir : (i) les cristaux obtenus avaient une taille significativement plus grande que celle des cristaux obtenus en l'absence de champ électrique (ii) l'obtention des cristaux était plus rapide qu'en l'absence d'un champ électrique ce qui est une caractéristique très avantageuse puisque de nombreuses macromolécules, en particulier les macromolécules biologiques comme les acides ribonucléiques ou les protéines, se dégradent rapidement au cours du temps ; (iii) que le dispositif ci-dessus permettait de contrôler, dans de nombreux cas, le taux de nucléation préalable à la cristallisation, ce qui constitue un avantage important car il détermine le nombre final de cristaux obtenus De plus, dans le cas d'une protéine étudiée et de structure inconnue (peroxyrédoxine), des cristaux ont été obtenus avec ce dispositif alors qu'aucun cristal n'était formé avec les dispositifs sans champ électrique. La figure 5 illustre ce résultat.

Le dispositif de cristallisation selon l'invention constitue un système particulièrement aisé à mettre en oeuvre, ne nécessitant pas de manipulations longues et complexes. En particulier, dans le mode de réalisation du dispositif représenté dans les figures, les électrodes (4) forment un ensemble rigide avec le couvercle amovible (8) de la boite Linbro. Ces électrodes traversent le couvercle dans l'axe des 24 puits. La pluralité des électrodes (5) est incluse dans un rectangle de matériau conducteur massif (cuivre laiton ou aluminium), ce rectangle perforé de 24 trous permet aux 24 puits de la boite Linbro de s'encastrer dans le matériau formant une série de 24 électrodes.

L'électrode (4), anode ou cathode, est constituée d'un cylindre de faible section, coaxial à l'axe de révolution de la chambre cylindrique externe (3). Le faible diamètre de l'électrode (4) permet la création d'un gradient de champ électrique dans l'espace où sera positionnée la goutte

de solution à cristalliser. Cette caractéristique permet la création d'un champ électrique de symétrie cylindrique très intense dans l'axe du système, donc dans l'axe du volume de solution à cristalliser. De plus, le maximum maximorum du champ électrique externe appliqué, est obtenu au niveau de la partie inférieure du couvercle (2).

L'électrode (5), cathode ou anode, est placée à la base de la chambre cylindrique interne (1) et constitue elle-même une chambre cylindrique externe (3), dont l'axe de révolution est identique à l'axe de révolution de la chambre interne (1). La goutte de solution à cristalliser et les électrodes (4) et (5) ont le même axe de symétrie.

Selon un mode de réalisation particulier du dispositif de cristallisation selon l'invention, l'électrode (4) est solidaire d'un support d'électrode (8) qui est placé au-dessus du couvercle mobile (2). Le support d'électrode (8) est constitué par le couvercle mobile, par exemple le couvercle mobile de la boite Linbro (Hampton Researchet Molecular Dimensions, Ltd).

Le dispositif de cristallisation « en procédé batch ou en procédé diffusion de vapeur » selon l'invention est adapté pour mettre en oeuvre indifféremment des techniques de cristallisation dites « à goutte suspendue », des techniques de cristallisation dites « à goutte assise » ou encore des techniques de cristallisation dits « à goutte sandwich ».

Selon un premier mode de réalisation du dispositif de cristallisation, tel qu'illustré sur la figure 1, ledit dispositif est adapté à un procédé de cristallisation à « goutte suspendue ». Dans ce mode de réalisation particulier du dispositif, le support isolant dont la surface interne est destinée à recevoir, sous la forme d'une goutte, le volume désiré de la solution contenant la macromolécule à cristalliser, est constitué du couvercle mobile (2). Dans ce mode de réalisation, la surface supérieure de la goutte est en contact avec le support isolant (9), qui est constitué du couvercle mobile (2). La surface inférieure de la goutte, de forme hémisphérique, est coaxiale aux électrodes (4) et (5) cylindriques.

Selon un second mode de réalisation du dispositif de cristallisation, celui-ci est adapté à la mise en oeuvre d'un procédé de cristallisation à « goutte assise » tel que représenté sur la figure 2. Dans ce second mode de réalisation du dispositif, le support isolant (9) destiné à recevoir,

sous la forme d'une goutte, un volume désiré de la solution contenant la macromolécule à cristalliser, se présente sous la forme d'un support interne (9) en matériau diélectrique, de préférence transparent de façon à permettre l'observation in situ, par exemple en verre minéral ou organique ou encore dans un matériau à base de polymère, tel que le polystyrène ou le plexiglassTM. La géométrie du support interne (9) doit posséder un axe de symétrie confondu avec l'axe de l'électrode cylindrique (5). Ce support interne (9) doit posséder une surface formant un plan (10), parallèle au plan (11) formé par la surface interne du couvercle (2). De plus, les plans (10) et (11) doivent être, l'un par rapport à l'autre, à une distance telle que la goutte de solution contenant la macromolécule à cristalliser ne soit pas en contact avec la surface interne du couvercle (2). La distance entre la surface du support (9) et la face interne du couvercle (2) est de préférence comprise entre 2 et 5 mm pour un volume de solution à cristalliser de 1 owl.

Dans ce second mode de réalisation du dispositif de cristallisation de l'invention, la goutte de solution contenant la macromolécule à cristalliser possède sa surface inférieure en contact avec le support interne (9). Sa surface supérieure libre, de forme hémisphérique, est coaxiale à l'électrode (5).

Comme dans tous les modes de réalisation du dispositif de cristallisation de l'invention, l'axe de la goutte est coaxial simultanément à celui de l'électrode (4) et à celui de l'électrode (5).

Selon un troisième mode de réalisation du dispositif de cristallisation, adapté à la mise en oeuvre d'un procédé de cristallisation « à goutte sandwich », tel que représenté à la figure 3, le support isolant est un support interne (9), dont les caractéristiques sont identiques au support (9) du second mode de réalisation représenté sur la figure 2, et dont la surface destinée à recevoir, sous forme d'un disque de liquide, le volume désiré de la solution contenant la macromolécule à cristalliser, forme un plan (10), parallèle au plan (11) formé par la surface interne du couvercle (2), les plans (10) et (11) étant, l'un par rapport à l'autre à une distance telle que la solution à cristalliser est en contact simultanément avec la surface interne du couvercle (2).

Selon ce troisième mode de réalisation du dispositif de cristallisation, les surfaces supérieures et inférieures du disque de solution de cristallisation sont en contact respectivement avec la face interne du couvercle (2) et la face supérieure du support interne (9).

Lors de la mise en oeuvre du dispositif de cristallisation dans son troisième mode de réalisation représenté sur la figure 3, la solution contenant la macromolécule à cristalliser est placée de telle manière que son axe se confonde sensiblement avec l'axe de l'électrode (4). La surface libre du volume de solution pris en sandwich entre la face interne du couvercle (2) et la surface supérieure du support interne (9) formant le plan (10) est coaxiale aux électrodes (4) et (5).

Pour la mise en oeuvre du dispositif de cristallisation ci-dessus, dans un procédé de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, l'électrode (4) et l'électrode (5) sont chacune reliées respectivement à chacune des bornes d'un générateur de courant électrique continu et sont alors cathode ou anode pour l'électrode (4) et respectivement anode ou cathode pour l'électrode (5).

Afin de mettre en oeuvre un procédé de cristallisation à grande échelle, il est possible de faire fonctionner simultanément plusieurs dispositifs de cristallisation tels que définis ci-dessus.

L'invention a encore pour objet un appareil de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de dispositifs de cristallisation tels que définis précédemment dans la description.

La figure 4 représente une illustration d'un appareil de cristallisation selon l'invention comprenant 24 dispositifs de cristallisation tels que représentés sur l'une des figures 1 à 3.

Il est possible d'augmenter le nombre de dispositifs de cristallisation pouvant fonctionner simultanément à l'aide d'un seul générateur électrique continu en reliant tous les dispositifs de cristallisation entre eux selon un branchement électrique parallèle.

La figure 6 illustre un tel système de cristallisation comprenant une pluralité d'appareils de cristallisation, chaque appareil de cristallisation étant constitué de 24 dispositifs de cristallisation tels que décrits

précédemment. Un tel système de cristallisation fait également partie de l'invention.

L'invention a aussi pour objet un procédé de cristallisation d'une macromolécule chargée en solution, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) placer dans une enceinte étanche à l'air une goutte d'un volume prédéterminé de solution contenant ladite macromolécule dont au moins une partie de la surface est en contact avec un support isolant, dans un champ électrique externe non uniforme de symétrie cylindrique coaxiale avec l'axe de la goutte et dont la valeur de champ est maximale sur l'axe de la goutte. b) récupérer le ou les cristaux de ladite macromolécule.

De préférence, la macromolécule qui est cristallisée est une macromolécule biologique telle qu'une protéine, un peptide ou un acide nucléique (ARN ou ADN).

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de cristallisation selon l'invention est caractérisé en ce que le champ électrique, dans l'axe du système à la surface de ladite goutte, a une valeur proche de 106 Volts par mètre pour une tension d'entrée de 15KV.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : Fabrication d'un dispositif de cristallisation selon l'invention.

L'électrode (4) est constituée d'un fil de cuivre isolé de diamètre 1 mm. L'électrode (5) est en aluminium massif percé de 24 trous cylindriques de diamètre 20 mm dans lesquels viennent s'encastrer les 24 puits de la boite Linbro.

Le couvercle isolant (2) est constitué d'une lamelle de verre circulaire de diamètre 22 mm et de 0,2 mm d'épaisseur.

-Les boites Linbro utilisables peuvent être obtenues auprès des sociétés Hampton Research, 27632 El Lazo Road, Suite 100, Laguna Niguel, CA

92677-3913 et Molecular Dimensions, Ltd. 61-63 Dudley street, Luton, Beds. LU2 ONP - Générateur 30 kV de DEL Electronics Corp., Power Conversion Division, One commerce Park, Valhalla, NY 10595 ; modèle RLPS30-60R.

EXEMPLE 2 : Cristallisation de la péroxyrédoxine de Poplar trichorpa avec un dispositif de cristallisation selon l'invention.

La péroxyrédoxine de Poplar trichorpa a fait l'objet d'essais de cristallisation avec le dispositif décrit à l'exemple 1. Des gouttes de 4 pl ont été préparées en mélangeant 2 tl de protéine concentrée à 15 mg/ml dans un tampon Tris-HCI 0, 1 M (pH=8, 5) avec 2 pI de PEG 4K 30% et LiS04 0, 2M dissous dans le même tampon.

Le puits était constitué de 500 lit du même mélange PEG 4K 30% et LiS04 0,2M dissous dans le même tampon.

Trois boites Linbro contenant chacune douze telles gouttes suspendues ont été placées dans le même environnement à 20°C.

La première boite n'a été soumise à aucun champ électrique (fig.

5a).

La deuxième boite a été placée dans un champ électrique généré par une tension continue de 15. 000V avec l'électrode 4 comme cathode (fig. 5b).

La polarité a été inversé dans la troisième et l'électrode 4 a joué le rôle de l'anode (fig. 5c).

Le champ électrique a été appliqué pendant deux semaines et les résultats sont présentés sur la figure 5.

L'examen des photographies des gouttes montre que les gouttes présentent un très léger précipité qui ne semble pas du tout cristallin dans la première boite (fig. 5a).

La deuxième boite montre des précipités cristallins avec la formation de gros cristaux allongés dans deux des gouttes (fig. 5b).

La troisième boite montre également des précipités granuleux susceptibles de conduire à des cristaux (fig. 5c).

Cet exemple montre sans ambiguïté que le dispositif de cristallisation selon l'invention influe fortement sur la cristallisation des

macromolécules et peut même conduire à la formation de cristaux dans des conditions expérimentales où les méthodes conventionnelles ne permettent pas la formation de cristaux. Ce dispositif, outre son extrême facilité d'utilisation, est donc supérieur aux dispositifs de Taleb et al qui n'ont pas mis en évidence ce dernier résultat.