Titel

Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung mikrofluidischer Prozessschritte

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.

Stand der Technik

Die DE 102017204195 Al offenbart ein Verfahren zur Prozessierung von Viren und Bakterien einer Probe mit einer mikrofluidischen Vorrichtung. Hierbei wird die Probe über ein Rückhalteelement gespült, wobei die Viren und Bakterien aus der Probe auf dem Rückhalteelement fixiert werden, und in anschließenden Schritten wieder von diesem abgelöst werden.

Die DE 102018111834 Al bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung und auf ein Verfahren zur Nutzung derselben zur Trennung, Aufreinigung und Konzentration von Komponenten fluidischer Medien und insbesondere von Blutproben. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst ein poröses Funktionselement und ein mikrofluidisches Kanalsystem.

Die DE 102011005932 Al offenbart ein mikrofluidisches System mit einer Filterkammer mit regulierbarem Entlüftungskanal sowie ein Verfahren zum Filtern von Flüssigkeiten. Hierbei weist die Filterkammer einen Einlasskanal, einen Filter und einen Auslasskanal auf.

Die WO 00/06702 Al beschreibt ein Verfahren und ein Set zur Isolierung von Krebszellen aus einer Körperflüssigkeit mittels eines Siebs oder Membranfilters. Die Flüssigkeit wird durch das Sieb geführt, das die Krebszellen aufgrund ihrer Größe zurückhält. Die isolierten Zellen können dann im Anschluss an die Filtrierung untersucht und weiterverwendet werden. Für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise Tumorerkrankungen, sind die Separierung und Identifizierung verschiedener Probenbestandteile wie beispielsweise Zellen oder Zellagglomerate aus geeigneten Flüssigkeiten, sowie deren Kultivierung wichtige Schritte. Hierbei bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Analysevorgänge. Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in einem mikrofluidischen System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen die es zu meistern gilt, wie beispielsweise Separationsschritte zur effektiven Abtrennung relevanter Probenbestandteile aus verschiedenen Flüssigkeiten, Waschschritte und Austauschvorgänge von Flüssigkeiten.

Offenbarung der Erfindung

Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel sogenannte Tumor- Organoide zum Einsatz. Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor- Organoide sind somit 3D-Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Mittels Tumor- Organoiden können die Gegebenheiten in vivo gut repräsentiert werden.

Für die Herstellung von Organoiden bzw. Tumor-Organoiden werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung verwendet.

Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung der entnommenen Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärmaterial sowie die anschließende Expansion der entstandenen Tumor-Organoide. Bei der Expansion werden die Tumor-Organoide enzymatisch und/oder mechanisch in multizelluläre Fragmente oder einzelne Zellen dissoziiert.

Bei der Expansion von Zellagglomeraten wie beispielsweise von Organoiden, sind mehrere Separationsschritte zur Trennung der Zellagglomerate bzw. Agglomerat- Fragmente von verschiedenen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Kulturmedien, Enzymlösungen oder Waschpuffern mit anschließender Resuspension in weiteren Flüssigkeiten erforderlich. Im Labormaßstab werden hierfür die Gefäße gewechselt sowie Zentrifugationsschritte und visuell zu überwachende Pipettiervorgänge realisiert. Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.

Die vorliegende Erfindung adressiert Prozesse zur Expansion von Zellagglomeraten, wie beispielsweise Tumor-Organoiden, die für eine mikrofluidische Implementierung als sehr kritisch anzusehen sind, und beschreibt eine technische Lösung für die mikrofluidische Umsetzung der für die Expansion der Zellagglomerate relevanten Separationsschritte, Waschschritte und Austauschvorgänge von Flüssigkeiten.

Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem Rückhalteelement, insbesondere mit einem Mikrofilter und/oder einem Mikrosieb mit Poren sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den kennzeichnenden Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.

Dies beruht insbesondere darauf, dass die mikrofluidische Vorrichtung zumindest vier mikrofluidische Kanäle mit je einem fluidischen Anschluss umfasst, wobei ein erster mikrofluidischer Kanal und ein zweiter mikrofluidischer Kanal ein erstes Kanalsystem bilden, welches durch das Rückhalteelement hindurchführt und wobei ein dritter mikrofluidischer Kanal und ein vierter mikrofluidischer Kanal ein, insbesondere fluidisch mit dem ersten Kanalsystem verbundenes, zweites Kanalsystem bilden, welches entlang einer ersten Seite des Rückhalteelements führt.

Auf der Oberfläche des Rückhalteelements sind, insbesondere lebende, Bestandteile einer Probe, mit einem Durchmesser größer als der Porendurchmesser des Rückhalteelements, rückhaltbar. Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung eine Größenselektion bezüglich einer gewünschten Mindestgröße der zurückgehaltenen Probenbestandteile erfolgt. Probenbestandteile mit einem Durchmesser kleiner als der Porendurchmesser des Rückhalteelements können somit gezielt abgetrennt werden.

Eine Wiederablösung der auf der Oberfläche des Rückhalteelements angesammelten Probenbestandteile kann dadurch erschwert sein, dass die Probenbestandteile in die Poren des Rückhalteelements teilweise hineinragen und sich in den Poren festsetzen.

Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung ist es, dass diese eine verbesserte strömungsinduzierte Ablösung von auf der Oberfläche des Rückhalteelements angesammelten, insbesondere lebenden, Bestandteilen einer Probe erlaubt. Im zweiten Kanalsystem ist eine fluidische Strömung zwischen dem dritten fluidischen Anschluss und dem vierten fluidischen Anschluss entlang der ersten Seite des Rückhalteelements erzeugbar. Diese Strömung parallel zur Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements wirkt auf die in den Poren des Rückhalteelements festsitzenden Probenbestandteile ein und löst deren Verbindung mit dem Rückhalteelement. Auf diese Weise kann zudem ein Ablöseprozess, induziert durch eine Strömung zwischen dem zweiten fluidischen Anschluss und dem ersten fluidischen Anschluss durch das Rückhalteelement, unterstützt und verbessert werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet insbesondere bei der Überführung von, insbesondere lebenden, Probenbestandteilen von einem ersten Medium in ein zweites Medium Vorteile.

Der Ablöseprozesse erfolgt schneller und zuverlässiger im Vergleich zu Vorrichtungen ohne ein entsprechendes zweites Kanalsystem, durch welches eine Strömung parallel zur Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements erzeugbar ist. Separationsschritte, Waschschritte und Austauschvorgänge von Flüssigkeiten sind somit einfacher, zuverlässiger und schneller realisierbar im Vergleich zu herkömmlichen mikrofluidischen Ansätzen. Desweiteren vorteilhaft bei einem schnellen und zuverlässigen Ablöseprozess ist, dass weniger Puffer und Reagenzien benötigt und verbraucht werden, da die Zeitdauer bis zur Ablösung der rückgehaltenen Probenbestandteile kürzer ist.

Weiterhin vorteilhaft ist, dass die, insbesondere lebenden, Probenbestandteile hierbei viabel und kultivierbar bleiben.

Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.

Auch ist mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Automatisierung von Prozessschritten möglich, insbesondere von Separations- und Dissoziationsschritten, welche beispielsweise bei der Expansion von Tumor-Organoiden oder anderen Organoid-Typen erforderlich sind. Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.

„Unter dem Begriff „Probe“ kann im Sinne der vorliegenden Erfindung jegliche Art von Flüssigkeit mit, insbesondere lebenden, Probenbestandteilen verstanden werden. Beispiele hierfür sind Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Lymphe, Speichel oder Urin oder flüssige Stoffgemische, insbesondere Kulturmedien, Pufferlösungen oder Suspensionen.

Unter dem Begriff „Dissoziation“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine insbesondere induzierte Auflösung von Verbindungen zwischen Zellen eines Zellagglomerats und die dadurch entstehende Aufteilung des Zellagglomerats in multizelluläre Fragmente bzw. einzelne Zellen verstanden. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Es ist von Vorteil, wenn die Poren des Rückhalteelements einen Porendurchmesser von 50 - 1000 pm, bevorzugt von 75 - 500 pm, aufweisen. Derartige Porendurchmesser sind beispielsweise für die Rückhaltung von, insbesondere lebenden, Probenbestandteilen wie Zellagglomeraten, insbesondere Tumor-Organoiden auf dem Rückhalteelement besonders vorteilhaft. Der Durchtritt von Zellagglomeraten mit einem Durchmesser größer als der Durchmesser der Poren des Rückhalteelements wird verhindert. Zellagglomerate, Fragmente oder Zellen mit einem Durchmesser kleiner als der Durchmesser der Poren des Rückhalteelements können dieses passieren. Auf diese Weise wird eine Größenselektion erreicht wobei nur Zellagglomerate mit der gewünschten Mindestgröße erhalten werden, was für nachfolgende Prozessschritte von Vorteil ist.

Alternativ können die Poren des Rückhalteelements einen anderen, auf die jeweilige Anwendung angepassten Porendurchmesser aufweisen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Rückhalteelement ein Metall, insbesondere Gold, Kupfer, Edelstahl, Titan, Molybdän und/oder Aluminium.

Vorteilhaft bei der Verwendung von Metallen ist deren Robustheit und hohe Belastbarkeit, sowie Fertigbarkeit unterschiedlicher Porendurchmesser bzw. Porenformen. Gold zeichnet sich vorteilhaft durch seine hohe Korrosionsstabilität und Biokompatibilität aus. Aluminium bietet außerdem den Vorteil, dass es leicht und kostengünstig ist und zudem in großen Mengen verfügbar. Kupfer und Edelstahl sind vorteilhaft bezüglich ihrer Korrosionsbeständigkeit, was unter anderem eine hohe Lebensdauer mit sich bringt. Zudem ist Kupfer gut zu verarbeiten und auch bei niedrigen Temperaturen verformbar.

Alternativ oder zusätzlich umfasst das Rückhalteelement vorteilhafterweise Silizium, einen Kunststoff, eine Keramik und/oder einen Verbundwerkstoff.

Vorteilhaft bei der Verwendung eines Kunststoffs sind dessen geringes Gewicht und vielfältige Optionen der chemischen Zusammensetzung. Zudem können Bauteile aus Kunststoff sehr einfach und kostengünstig hergestellt und wiederverwertet werden.

Desweiteren ist es von Vorteil, wenn das Rückhalteelement eine einer Probe aussetzbare Fläche von 1-500 mm ² , und bevorzugt von 3-100 mm ² , aufweist.

Vorteilhaft hierbei ist, dass so eine möglichst vollflächige Anströmung des Rückhalteelements erfolgt. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die Dicke des Rückhalteelements 0,5-20 pm, und bevorzugt 1-15 pm. Vorteilhaft hierbei ist, dass sich bei einer derart gewählten Dicke des Rückhaltelements die Probenbestandteile weniger tief in den Poren des Rückhaltelements festsetzen und einfacher wieder vom Rückhaltelement entfernbar sind.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist das Rückhalteelement mittels Kleben, Umspritzen oder Laserschweißen in die mikrofluidische Vorrichtung integrierbar.

Vorteilhaft beim Kleben ist, dass dies schnell erfolgen kann und somit zeitsparend und zusätzlich die dichtende Funktion des Klebstoffes ausgenutzt werden kann.

Vorteilhaft beim Laserschweißen ist, dass aufgrund des geringen Wärmeeinflusses beim Laserschweißen und eines punktgenauen Energieeintrags kaum Gefügeveränderungen des Materials erfolgen, wodurch die Verbindung sehr stabil ist.

Vorteilhaft beim Umspritzen ist, dass die Integration des Rückhaltelements gleichzeitig mit der Spritzgussfertigung der mikrofluidischen Vorrichtung oder Komponenten davon erfolgen kann und kein zusätzlicher Prozessschritt erforderlich ist.

Zudem vorteilhaft ist es, wenn die mikrofluidischen Kanäle Abmessungen von 100 - 1000 pm, und bevorzugt 300 - 600 pm, aufweisen.

Unter dem Begriff Abmessung wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Höhe und/oder Breite der mikrofluidischen Kanäle verstanden.

Derartige Abmessungen der mikrofluidischen Kanäle sind geeignet, um vorteilhafte Strömungsverhältnisse innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung zu realisieren, insbesondere im Hinblick auf die Kontrolle der auftretenden Scherkräfte, die auf die Probenbestandteile einwirken, einen optimalen fluidischen Transport der Probenbestandteile in den mikrofluidischen Kanälen, eine möglichst vollflächigen Anströmung des Rückhalteelements und eine optimale fluidische Wiederablösung von Probenbestandteilen vom Rückhalteelement.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfassen die mikrofluidischen Kanäle ein Polymer, insbesondere ein Polycarbonat (PC), ein Polypropylen (PP), ein Polyethylen (PE), ein Cycloolefin-Polymer (COP), ein Cycloolefin-Copolymer COC), Polymethylmethacrylat (PMMA) und/oder Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer Wandstärke von 0,6 - 30 mm, und bevorzugt von 1 - 10 mm.

Vorteilhaft bei der Verwendung von Polyolefinen ist, dass diese gleichzeitig robust und flexibel sind und eine hohe mechanische und chemische Stabilität aufweisen. Von diesen weist beispielsweise PP eine hohe Zähigkeit, eine geringe Wasseraufnahme und Wasserdampfdurchlässigkeit, sowie eine hohe Beständigkeit gegen Chemikalien auf und ist zudem gut zu verarbeiten und kostengünstig.

PE weist eine geringe Wasseraufnahme auf, ist chemisch beständig sowie gut zu verarbeiten und kostengünstig.

Vorteilhaft bei der Verwendung eines COCs ist, dass es eine sehr hohe optische Transparenz aufweist, sowie chemisch inert und biokompatibel ist.

Desweiteren ist es vorteilhaft, wenn zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle schließbar ist, insbesondere mittels eines Ventils und/oder mittels einer Verformung des mikrofluidischen Kanals.

Zudem ist es vorteilhaft, wenn zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle individuell schließ- und öffenbar ist, sodass der Fluss durch die mikrofluidischen Kanäle individuell festlegbar ist. Auf diese Weise sind verschiedene Möglichkeiten des Durchflusses einer Probe durch die mikrofluidischen Kanäle einfach realisierbar.

Es ist vorteilhaft, wenn zumindest einer der Kanäle mittels eines Ventils schließbar ist. In einer Ausführungsform ist das Ventil innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet, insbesondere zwischen zwei fluidischen Anschlüssen, welche als Ein- bzw. Auslass dienen. In einer alternativen Ausführungsform ist das Ventil außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet.

Weiterhin alternativ oder zusätzlich ist zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle der mikrofluidischen Vorrichtung mittels einer Verformung schließbar. Unter einer Verformung kann beispielsweise eine Veränderung, insbesondere eine Verkleinerung, des Kanalquerschnitts verstanden werden. Hierzu ist der mikrofluidische Kanal beispielsweise innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere mittels eines bewegbaren Stößels, zudrückbar.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur mikrofluidischen Überführung von, insbesondere lebenden, Probenbestandteilen von einem ersten Medium in ein zweites Medium unter Verwendung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung mit nachfolgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit Probenbestandteilen einer Probe über den ersten fluidischen Anschluss als Einlass b) Fluidisches Fördern des ersten Mediums durch das Rückhalteelement über das erste Kanalsystem von einer ersten Seite des Rückhalteelements auf eine zweite Seite des Rückhalteelements, wobei die Probenbestandteile mit einem Durchmesser größer der Porendurchmesser des Rückhalteelements zurückgehalten werden.

Probenbestandteile mit einem Durchmesser kleiner der Porendurchmesser des Rückhalteelements können dieses passieren. c) Abführen des ersten Mediums ohne die rückgehaltenen Probenbestandteile über den zweiten fluidischen Anschluss als Auslass. d) Zuführen eines zweiten Mediums, in welches die auf dem Rückhalteelement rückgehaltenen Probenbestandteile überführt werden sollen, über den zweiten fluidischen Anschluss als Einlass und/oder über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss als Einlass e) Fluidisches Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal durch das Rückhalteelement von einer zweiten Seite des Rückhalteelements auf eine erste Seite des Rückhalteelements und/oder fluidsches Fördern des zweiten Mediums über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite des Rückhalteelements, wobei die rückgehaltenen Probenbestandteile vom Rückhalteelements abgelöst werden f) Abführen des zweiten Mediums mit den Probenbestandteilen über den ersten fluidischen Anschluss als Auslass und/oder über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss als Auslass

Ein derartiges Verfahren bietet den Vorteil einer erleichterten und verbesserten Überführung von insbesondere lebenden, Probenbestandteilen von einem ersten Medium in ein zweites Medium in einem mikrofluidischen System.

Vorteilhaft hierbei ist, dass ein derartiges mikrofluidisches Verfahren eine verbesserte strömungsinduzierte Ablösung von auf der Oberfläche des Rückhalteelements angesammelten, insbesondere lebenden, Bestandteilen einer Probe erlaubt. Im zweiten Kanalsystem wird eine fluidische Strömung zwischen dem dritten fluidischen Anschluss und dem vierten fluidischen Anschluss entlang der ersten Seite des Rückhalteelements erzeugt. Diese Strömung parallel zur Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements wirkt auf die in den Poren des Rückhalteelements festsitzenden Probenbestandteile ein und löst deren Verbindung mit dem Rückhalteelement. Auf diese Weise kann zudem ein Ablöseprozess induziert durch eine Strömung zwischen dem zweiten fluidischen Anschluss und dem ersten fluidischen Anschluss durch das Rückhalteelement unterstützt und verbessert werden. Der Ablöseprozesse erfolgt schneller und zuverlässiger im Vergleich zu Verfahren ohne ein entsprechendes zweites Kanalsystem, welches eine Strömung parallel zur Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements erzeugt. Separationsschritte, Waschschritte und Austauschvorgänge von Flüssigkeiten sind somit einfacher, zuverlässiger und schneller realisierbar im Vergleich zu herkömmlichen mikrofluidischen Ansätzen.

Desweiteren vorteilhaft bei einem schnellen und zuverlässigen Ablöseprozess ist, dass weniger Puffer und Reagenzien benötigt und verbraucht werden, da die Zeitdauer bis zur Ablösung der rückgehaltenen Probenbestandteile kürzer ist.

Weiterhin vorteilhaft ist, dass die Probenbestandteile mittels des vorgeschlagenen Verfahrens viabel und kultivierbar bleiben und mittels der mikrofluidischen Vorrichtung weiter verarbeitbar sind.

Auch vorteilhaft ist, dass mittels des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Verfahrens eine Größenselektion bezüglich einer gewünschten Mindestgröße der zurückgehaltenen Probenbestandteile erfolgt. Probenbestandteile mit einem Durchmesser kleiner als der Porendurchmesser des Rückhalteelements können somit gezielt abgetrennt werden. Dadurch, dass die Prozessschritte schnell und zuverlässig innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.

Zudem ist mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Automatisierung von Prozessschritten möglich, insbesondere von Separations- und Dissoziationsschritten, welche beispielsweise bei der Expansion von Tumor-Organoiden oder anderen Organoid-Typen erforderlich sind. Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.

Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt in Schritt d) das Zuführen des zweiten Mediums über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss zeitgleich zum Zuführen des zweiten Mediums über den zweiten fluidischen Anschluss. Zudem oder alternativ erfolgt in Schritt e) das fluidischen Fördern des zweiten Mediums über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite des Rückhalteelements zeitgleich zum fluidischen Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal durch das Rückhalteelement von einer zweiten Seite des Rückhalteelements auf eine erste Seite des Rückhalteelements. Vorteilhaft hierbei ist, dass das Zuführen und/oder Fördern des zweiten Mediums durch das zweite Kanalsystem zur gleichen Zeit erfolgt wie das Zuführen und/oder Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal oder über das erste Kanalsystem. Auf diese Weise ist eine Wiederablösung der auf der Oberfläche des Rückhalteelements angesammelten Probenbestandteile verbessert. Die durch die fluidische Strömung im zweiten Kanalsystem entlang der Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements induzierte Kraft und die Kraft der fluidischen Strömung im ersten Kanalsystem zwischen dem zweiten fluidischen Anschluss und dem ersten fluidischen Anschluss durch das Rückhalteelement wirken gleichzeitig auf die in den Poren des Rückhalteelements festsitzenden Probenbestandteile ein und unterstützen sich gegenseitig bei der Ablösung dieser vom Rückhalteelement. Somit erfolgt der Ablöseprozess einfach, schnell und zuverlässig.

In einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform erfolgt in Schritt d) das Zuführen des zweiten Mediums über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss zeitversetzt zum Zuführen des zweiten Mediums über den zweiten fluidischen Anschluss. Zudem oder alternativ erfolgt in Schritt e) das fluidischen Fördern des zweiten Mediums über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite des Rückhalteelements zeitversetzt zum fluidischen Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal durch das Rückhalteelement von einer zweiten Seite des Rückhalteelements auf eine erste Seite des Rückhalteelements.

Auch in dieser Ausführungsform ist eine Wiederablösung der auf der Oberfläche des Rückhalteelements angesammelten Probenbestandteile verbessert. Die Kraft der fluidischen Strömung im zweiten Kanalsystem entlang der Oberfläche der ersten Seite des Rückhalteelements und die Kraft der fluidischen Strömung im ersten Kanalsystem zwischen dem zweiten fluidischen Anschluss und dem ersten fluidischen Anschluss durch das Rückhalteelement wirken zeitlich versetzt auf die in den Poren des Rückhalteelements festsitzenden Probenbestandteile ein. Hierbei wirkt auf die festsitzenden Probenbestandteile nacheinander eine Kraft von unten und eine seitliche Kraft von rechts und/oder links ein, wodurch die Probenbestandteile immer weiter gelockert werden, bis sie sich schließlich vom Rückhalteelement ablösen. Der Ablöseprozess erfolgt somit einfach, schnell und zuverlässig. In einer weiteren Ausführungsform erfolgen gleichzeitig mit Schritt c) und/oder nach Schritt c) folgende Waschschritte: c') Zuführen einer Pufferlösung oder eines ersten Mediums ohne Probenbestandteile über den ersten fluidischen Anschluss und/oder über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss als Einlass c") Fluidisches Fördern der Pufferlösung oder des ersten Mediums ohne Probenbestandteile über das erste Kanalsystem durch das

Rückhalteelement von einer ersten Seite des Rückhalteelements auf eine zweite Seite des Rückhalteelements und/oder über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite des Rückhalteelements

Vorteilhaft hierbei ist, dass somit Waschschritte ins mikrofluidische System integrierbar und somit automatisiert durchführbar sind und nicht händisch ausgeführt werden müssen.

In einer zusätzlichen oder alternativen Ausführungsform erfolgen gleichzeitig mit Schritt c) und/oder nach Schritt c) oder nach Schritt c") folgende Schritte: c'") Zuführen einer Enzymlösung zur Dissoziation der rückgehaltenen Probenbestandteile und/oder eines Lysepuffers zur Lyse der rückgehaltenen Probenbestandteile und/oder einer Färbereagenz zum Anfärben der rückgehaltenen Probenbestandteile über den ersten fluidischen Anschluss als Einlass und/oder über den dritten oder vierten fluidischen Anschluss als Einlass. c"") Fluidisches Fördern der Enzymlösung und/oder des Lysepuffers und/oder der Färbereagenz durch das Rückhalteelement über das erste Kanalsystem von einer ersten Seite des Rückhalteelements auf eine zweite Seite des Rückhalteelements und/oder über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite des Rückhalteelements.

Vorteilhaft bei der Zuführung und fluidischen Förderung einer Enzymlösung ist, dass auf diese Weise enzymatische Verfahrensschritte ins mikrofluidische System integrierbar und automatisiert durchführbar sind. Zur enzymatischen Dissoziation von Zellagglomeraten, insbesondere Tumor-Organoiden oder anderen Organoiden wird beispielsweise eine Enzymlösung eingesetzt.

Vorteilhaft bei der Zuführung und fluidischen Förderung eines Lysepuffers zur Lyse der rückgehaltenen Probenbestandteile, insbesondere der Zellen oder Zellagglomerate ist, dass diese so direkt auf dem Rückhalteelement lysiert werden können für eine nachfolgende molekulare Analyse, was Arbeitszeit und zusätzliche Arbeitsschritte erspart. Weiterhin vorteilhaft ist, dass Verfahrensschritte zur Lyse ins mikrofluidische System integrierbar und automatisiert durchführbar sind.

Vorteilhaft bei der Zuführung und fluidischen Förderung einer Färbereagenz zum Anfärben der rückgehaltenen Probenbestandteile ist, dass auf diese Weise zusätzliche Analyseschritte, wie zum Beispiel immunozytochemische Färbeschritte ins mikrofluidische System integrierbar und automatisiert durchführbar sind. So sind beispielsweise auch sequenzielle Färbemethoden und Waschschritte durchführbar, wie beispielsweise eine Tod/Lebend-Färbung oder eine Anfärbung von Oberflächenproteinen, wie beispielsweise dem Oberflächenprotein EpCAM (epitheliales Zelladhäsionsmolekül, engl. epithelial cell adhesion molecule).

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können der mikrofluidischen Vorrichtung auch sequenziell mehrere Medien mit insbesondere lebenden Probenbestandteilen, insbesondere Suspensionen mit Zellagglomeraten wie beispielsweise Tumor-Organoiden, zugeführt und durch diese gefördert werden. Die Probenbestandteile mit einem Durchmesser größer der Porendurchmesser des Rückhalteelements werden dann durch das Rückhalteelement zurückgehalten und mittels des erfindungsgemäß beschriebenen Verfahrens gemeinsam in ein zweites Medium überführt oder auf dem Rückhalteelement für nachfolgende Analysen akkumuliert.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform folgt auf Schritt f) folgender Spülschritt: g) Durchspülen von zumindest zwei der mikrofluidischen Kanäle mit einem Spülmittel, sodass das Spülmittel durch das Rückhalteelement hindurch und/oder entlang der ersten Seite des Rückhalteelements geführt wird.

Vorteilhaft hierbei ist, dass in den zumindest zwei mikrofluidischen Kanälen der mikrofluidischen Vorrichtung sowie auf dem Rückhalteelement verbliebene Medien- und Probenreste durch das Spülmittel entfernt werden und die mikrofluidische Vorrichtung gereinigt wird. Hierbei können auf dem Rückhalteelement verbliebene oder in der mikrofluidischen Vorrichtung verbliebende Probenbestandteile, wie beispielsweise Zellen oder Zellagglomerate, lysiert werden, um so beispielsweise vom Rückhalteelement entfernt zu werden und vollständig aus der mikrofluidischen Vorrichtung herausgespült zu werden. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform liegt die Flussrate der durch die mikrofluidischen Kanäle geführten Medien zwischen 0,01 pl/s und 200 pl/s, und bevorzugt zwischen 0,2 pl/s und 5 pl/s, und die Flussrate ist konstant oder variierend, insbesondere pulsierend.

Vorteilhaft hierbei ist, dass eine derartige Flussrate ausreichend hoch eingestellt ist, um die vom Rückhalteelement zurückgehaltenen Probenbestandteile von diesem abzulösen. Durch eine variierend eingestellte Flussrate kann der Ablöseprozess weiter unterstützt und optimiert werden. Besonders vorteilhaft ist es hierbei eine pulsierende Flussrate zu wählen oder einen singulären bzw. mehrfachen Strömungs- bzw. Druckpuls zu generieren. Auf diese Weise werden in den Poren des Rückhalteelements festsitzende Probenbestandteile besonders effizient von diesem abgelöst.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor in Schritt e) die Förderrichtung des zweiten Mediums temporär zu wechseln durch aufeinanderfolgendes Vorwärts- und Rückwärtsfördern des zweiten Mediums.

Hierdurch werden in den Poren des Rückhalteelements festsitzende Probenbestandteile besonders effizient von diesem abgelöst. Zudem ist eine Kombination mit den vorhergehend genannten Flussmodulationen ebenso möglich, wie beispielsweise dem aufeinanderfolgenden Vorwärts- und Rückwärtsfördern in Kombination mit einer pulsierend eingestellten Flussrate.

Es ist desweiteren eine kombinierte Modulation der Strömungen zwischen dem ersten, zweiten, dritten und vierten fluidischen Anschluss möglich.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgt das Zu- und Abführen der Medien, Puffer und Reagenzien und/oder das fluidische Fördern der Medien, Puffer und Reagenzien durch zumindest eine mikrofluidische Pumpeinheit. Bei der mikrofluidischen Pumpeinheit kann es sich beispielsweise um zumindest eine druckbetriebene Elastomermembran-Pumpe handeln. Die Komponenten der Elastomermembran-Pumpe sind beispielsweise Thermoplastischen Elastomere (TPE) wie Polyurethan (TPU) oder Styrol- Blockcopolymer (TPS). Die Dicke der Polymermembran kann dabei 50 pm bis 500 pm, und bevorzugt 80 pm bis 300 pm, und besonders bevorzugt 100 pm umfassen.

Vorteilhaft bei einer mikrofluidischen Pumpeinheit ist, dass die komplexe und aufwändige fluidische Verbindung der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer externen Pumpe entfällt. Auf diese Weise können die fluidischen Zu-, Abführ- und Förderprozesse einfach und unkompliziert realisiert werden und die mikrofluidische Vorrichtung platzsparend, portabel und mobil ausgeführt werden. Desweiteren ist die zumindest eine mikrofluidische Pumpeinheiten für die umzusetzenden fluidischen Vorgänge und Abläufe geeignet funktional auslegbar und betreibbar.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der mikrofluidischen Pumpeinheit wird ein Volumenstrom durch eine Pumpkammer mit Einlass- und Auslassventil und/oder durch mindestens drei aktive Pumpelemente, welche in einer peristaltischen Sequenz aktiviert werden, erzeugt.

Die Flussrate wird hierbei durch die Größe der aktiven Pumpelemente, durch die Membraneigenschaften, sowie der Ansteuerungsfrequenz eingestellt. Weiterhin können auch mehrere Pumpeinheiten in Richtung verschiedener fluidischer Anschlüsse integriert werden oder der Volumenstrom wird durch geeignet platzierte Ventile eingestellt.

In einer alternativen Ausführung können beispielsweise auch eine Spritzenpumpe oder eine peristaltische Pumpe eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann die mikrofluidische Pumpeinheit außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet sein. Die mikrofluidische Pumpeinheit ist dann beispielsweise als Modul ausgestaltet, welches eine weitere mikrofluidische Vorrichtung bildet.

In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die, insbesondere lebenden, Probenbestandteile Zellen oder Zellagglomerate, insbesondere Tumor-Organoide. Alternativ oder zusätzlich sind die, insbesondere lebenden, Probenbestandteile von einer Gelstruktur umschlossene Zellen oder Zellagglomerate, insbesondere Tumor-Organoide. Weiterhin alternativ oder zusätzlich sind die Probenbestandteile Tumorfragmente, Nukleinsäuren, Proteine und/oder Kügelchen (engl.: beads, microspheres). Solche Kügelchen haben beispielsweise eine Trägerfunktion und können insbesondere zur magnetischen Separation verwendet werden. Desweiteren kann deren Oberfläche beispielsweise funktionalisiert werden, insbesondere mit Antikörpern.

Vorteilhaft bei der Verwendung von lebenden Probenbestandteilen wie beispielsweise von Zellen oder Zellen im Verbund wie Zellagglomeraten, insbesondere Tumor-Organoiden, ist, dass die Viabilität dieser gut erhalten bleibt und somit weitere Kultivierungs- und Prozessschritte möglich sind. Dies gilt auch für Zellen oder Zellagglomerate, insbesondere Tumor-Organoide, welche von einer Gelstruktur umschlossen sind. Die Gelstruktur kann beispielsweise eine extrazelluläre Matrix sein, wie beispielsweise ein Hydrogel. Die relevanten Eigenschaften des Rückhalteelements können angepasst und auf die zurückzuhaltenden Probenbestandteile, beispielsweise Zellen oder Zellagglomerate, ausgelegt werden. Das Rückhalteelement wird dabei hinsichtlich des Porendurchmessers, Porosität, Porenform, Filterfläche, Filterdicke sowie Filtermaterial geeignet gewählt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer Seitenansicht mit einem Rückhalteelement und vier mikrofluidischen Kanälen mit je einem fluidischen Anschluss,

Fig. 2: die schematische Darstellung einer Draufsicht auf die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung gemäß Figur 1, und

Fig. 3: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße Kartusche in einer Seitenansicht umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung gemäß der Figuren 1 und 2.

Ausführungsformen der Erfindung

In Figur 1 ist eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 mit einem Rückhalteelement 7 und vier mikrofluidischen Kanälen 1, 2, 3, 4 gezeigt. Das Rückhalteelement 7 ist insbesondere ein Mikrofilter und/oder ein Mikrosieb mit Poren. Die Poren des Rückhalteelements 7 weisen beispielsweise einen Porendurchmesser von 50- 1000 pm, und bevorzugt von 75-500 pm, auf. Das Rückhalteelement 7 umfasst beispielsweise ein Metall, insbesondere Gold, Kupfer, Edelstahl, Titan, Molybdän und/oder Aluminium. Alternativ umfasst das Rückhalteelement 7 beispielsweise Silizium, einen Kunststoff, eine Keramik und/oder einen Verbundwerkstoff. Das Rückhalteelement 7 weist beispielsweise eine einer Probe aussetzbare Fläche von 1-500 mm ² auf. Desweiteren weist das Rückhalteelement 7 beispielsweise eine Dicke von 0,5-20 pm, und bevorzugt von 1-15 pm, auf.

Das Rückhalteelement 7 ist beispielsweise mittels Kleben, Umspritzen oder Laserschweißen in die mikrofluidische Vorrichtung 10 integrierbar.

Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen ersten mikrofluidischen Kanal 1 mit einem ersten fluidischen Anschluss la, einen zweiten mikrofluidischen Kanal 2 mit einem zweiten fluidischen Anschluss 2a, einen dritten mikrofluidischen Kanal 3 mit einem dritten fluidischen Anschluss 3a und einen vierten mikrofluidischen Kanal 4 mit einem vierten fluidischen Anschluss 4a. Das Rückhalteelement 7 weist eine erste Seite 7a auf, welche dem ersten mikrofluidischen Kanal 1 zugewandt ist und eine zweite Seite 7b, welche dem zweiten mikrofluidischen Kanal zugewandt ist.

Der erste mikrofluidische Kanal 1 und der zweite mikrofluidische Kanal 2 bilden ein erstes Kanalsystem, welches durch das Rückhalteelement 7 hindurchführt. Der dritte mikrofluidische Kanal 3 und der vierter mikrofluidische Kanal 4 bilden ein, insbesondere fluidisch mit dem ersten Kanalsystem verbundenes, zweites Kanalsystem, welches entlang einer ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 führt. Die mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 umfassen beispielsweise Abmessungen von 100 - 1000 pm, und bevorzugt von 300 - 600 pm. Desweiteren umfassen die mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 beispielsweise ein Polymer, insbesondere ein Polycarbonat (PC), ein Polypropylen (PP), ein Polyethylen (PE), ein Cycloolefin-Polymer (COP), ein Cycloolefin-Copolymer COC), Polymethylmethacrylat (PMMA) und/oder Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer Wandstärke von 0,6 - 30 mm, und bevorzugt von 1 - 10 mm.

In einer in Figur 1 dargestellten Ausführungsform bilden die Kanalsysteme oberhalb der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 und/oder unterhalb der zweiten Seite 7b des Rückhalteelements 7 eine Kavität aus. In die Kavität oberhalb der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 münden beispielsweise der erste, der dritte und der vierte mikrofluidische Kanal 1, 3, 4. In die Kavität unterhalb der zweiten Seite 7b des Rückhalteelements 7 mündet beispielsweise der zweite mikrofluidische Kanal 2.

In einer in Figur 1 nicht dargestellten vorteilhaften Ausführungsform ist zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 schließbar, insbesondere mittels eines Ventils und/oder mittels einer Verformung des mikrofluidischen Kanals 1, 2, 3, 4. In einer Ausführungsform ist das Ventil beispielsweise innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung 10 angeordnet, insbesondere in unmittelbarer Nähe des Rückhalteelements 7. In einer alternativen Ausführungsform ist das Ventil außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung 10 angeordnet. Weiterhin alternativ oder zusätzlich ist zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 der mikrofluidischen Vorrichtung 10 mittels einer Verformung schließbar. Hierzu ist der mikrofluidische Kanal 1, 2, 3, 4 beispielsweise innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung 10, insbesondere mittels eines bewegbaren Stößels, zudrückbar. Die Aktuierung des Stößels kann beispielsweise piezoelektrisch, pneumatisch oder hydraulisch erfolgen. Desweiteren ist auch ein motorbetriebener Stößel einsetzbar.

Desweiteren ist die mikrofluidische Vorrichtung 10 ausgebildet, ein Verfahren durchzuführen zur mikrofluidischen Überführung von, insbesondere lebenden, Probenbestandteilen von einem ersten Medium in ein zweites Medium.

Im Folgenden wird dieses beispielhaft für die Überführung von Tumor-Organoiden von einem ersten Medium in ein zweites Medium beschrieben.

Die Tumor-Organoide sind in einem ersten flüssigen Medium suspendiert. Das erste Medium wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über einen ersten fluidischen Anschluss la, welcher hier als Einlass dient, zugeführt und fluidisch durch das Rückhalteelement 7 über das erste Kanalsystem von einer ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 auf eine zweite Seite 7b des Rückhalteelements 7 gefördert. Tumor-Organoide mit einem größeren Durchmesser als der Porendurchmesser des Rückhalteelements 7 werden von diesem auf der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 zurückgehalten. Tumor-Organoide mit einem kleineren Durchmesser als der Porendurchmesser des Rückhalteelements 7 sowie andere sich in dem ersten Medium befindliche Probenbestandteile, wie beispielsweise Zellen oder Fragmente, mit einem kleineren Durchmesser als der Porendurchmesser des Rückhalteelements 7, können dieses passieren. Das erste Medium ohne die vom Rückhalteelement 7 rückgehaltenen Tumor-Organoide wird über einen zweiten fluidischen Anschluss 2a, welcher hier als Auslass dient, abgeführt.

Alternativ wird das erste Medium der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den dritten fluidischen Anschluss 3a oder über den vierten fluidischen Anschluss 4a, welche hier je als Einlass dienen, zugeführt und fluidisch durch das Rückhalteelement 7 von einer ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 auf eine zweite Seite 7b des Rückhalteelements 7 gefördert und entsprechend über den zweiten fluidischen Anschluss 2a, welcher hier als Auslass dient, abgeführt.

Gleichzeitig mit dem Abführen des ersten Mediums oder nach dem Schritt des Abführens des ersten Mediums erfolgt ein optionaler Waschschritt. Hierbei wird eine Pufferlösung oder das erste Medium ohne Tumor-Organoide über den ersten fluidischen Anschluss la als Einlass zugeführt und fluidisch über das erste Kanalsystem durch das Rückhalteelement 7 von einer ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 auf eine zweite Seite 7b des Rückhalteelements 7 gefördert und über den zweiten fluidischen Anschluss 2a, welcher hier als Auslass dient, abgeführt. Alternativ oder zusätzlich wird, insbesondere gleichzeitig, eine Pufferlösung oder das erste Medium ohne Tumor-Organoide über den dritten 3a oder über den vierten fluidischen Anschluss 4a als Einlass zugeführt und fluidisch über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 gefördert und über den vierten fluidischen Anschluss 4a oder über den dritten fluidischen Anschluss 3a, welcher hier als Auslass dient, abgeführt. Alternativ kann die über den dritten 3a oder über den vierten fluidischen Anschluss 4a zugeführte Pufferlösung oder das erste Medium ohne Tumor- Organoide auch über den zweiten fluidischen Anschluss 2a, welcher hier als Auslass dient, abgeführt werden.

Im nächsten Schritt erfolgt das Zuführen eines zweiten Mediums, in welches die auf dem Rückhalteelement 7 zurückgehaltenen Tumor-Organoide überführt bzw. suspendiert werden sollen, über den zweiten fluidischen Anschluss 2a, welche hier als Einlass dient und Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal 2 durch das Rückhalteelement 7 von einer zweiten Seite 7b des Rückhalteelements 7 auf eine erste Seite 7a des Rückhalteelements 7 bis sich alle bzw. möglichst viele Tumor-Organoide vom Rückhalteelement 7 gelöst haben und somit in das zweite Medium übergegangen sind. Anschließend wird das zweite Medium mit den Tumor-Organoiden über den ersten fluidischen Anschluss la, welche hier als Auslass dient, abgeführt. Alternativ wird das zweite Medium mit den Tumor-Organoide über den dritten fluidischen Anschluss 3a oder über den vierten fluidischen Anschluss 4a oder über eine Kombination der fluidischen Anschlüsse la, 3a, 4a, welche hier als Auslass dienen, abgeführt.

Alternativ oder zusätzlich zum Zuführen des zweiten Mediums über den zweiten fluidischen Anschluss 2a und zum Fördern des zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Kanal 2 wird das zweite Medium, in welches die auf dem Rückhalteelement 7 zurückgehaltenen Tumor-Organoide überführt bzw. suspendiert werden sollen über den dritten fluidischen Anschluss 3a oder über den vierten fluidischen Anschluss 4a als Einlass zugeführt und über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 gefördert. Hierbei werden die zurückgehaltenen Tumor-Organoide von der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 abgelöst und gehen in das zweite Medium über. Anschließend wird das zweite Medium mit den Tumor-Organoiden über den dritten fluidischen Anschluss 3a bzw. über den vierten fluidischen Anschluss 4a, welche hier als Auslass dienen, abgeführt. Das Zuführen des zweiten Mediums über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a erfolgt hierbei beispielsweise zeitgleich zum Zuführen des zweiten Mediums über den zweiten fluidischen Anschluss 2a und/oder das fluidische Fördern des zweiten Mediums über das zweite Kanalsystem erfolgt zeitgleich zum fluidischen Fördern des zweiten Mediums über das erste Kanalsystem. Alternativ kann hierbei auch das dem zweiten fluidischen Anschluss 2a zugeführte zweite Medium durch das Rückhalteelement 7 geführt werden und über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a wieder abgeführt werden.

Alternativ erfolgt das Zuführen des zweiten Mediums über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a zeitversetzt zum Zuführen des zweiten Mediums über den zweiten fluidischen Anschluss 2a und/oder das fluidische Fördern des zweiten Mediums über das zweite Kanalsystem erfolgt zeitversetzt zum fluidischen Fördern des zweiten Mediums über das erste Kanalsystem. Alternativ kann hierbei auch das dem zweiten fluidischen Anschluss 2a zugeführte zweite Medium durch das Rückhalteelement 7 geführt werden und über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a wieder abgeführt werden.

Auf diese Weise werden Tumor-Organoide mit einem gewünschten Mindestdurchmesser vom ersten in das zweite Medium überführt. Durch die Querströmung in dem zweiten Kanalsystem zwischen dem dritten fluidischen Anschluss 3a und dem vierten fluidischen Anschluss 4a, wird die Ablösung der Tumor-Organoide vom Rückhalteelement 7 unterstützt und verbessert.

Optional erfolgt gleichzeitig oder nach dem Schritt des Abführens des ersten Mediums ohne Tumor-Organoide und/oder gleichzeitig mit dem oben beschriebenen Waschschritt oder nach jenem Waschschritt das Zuführen einer Enzymlösung zur Dissoziation der rückgehaltenen Tumor-Organoide und/oder eines Lysepuffers zur Lyse der rückgehaltenen Tumor-Organoide und/oder einer Färbereagenz zum Anfärben der rückgehaltenen Tumor- Organoide über den ersten fluidischen Anschluss la als Einlass und/oder über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a als Einlass sowie das fluidische Fördern der Enzymlösung und/oder des Lysepuffers und/oder der Färbereagenz durch das Rückhalteelement 7 über das erste Kanalsystem von einer ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 auf eine zweite Seite 7b des Rückhalteelements 7 und/oder über das zweite Kanalsystem entlang der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 oder über andere Kombinationen der mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4. Die Enzymlösung und/oder der Lysepuffer und/oder das Färbereagenz werden schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss 2a und/oder über den dritten 3a oder vierten fluidischen Anschluss 4a abgeführt. Weiterhin optional erfolgt nach Beendigung der beschriebenen Verfahrensschritte ein Spülschritt zur Reinigung der mikrofluidischen Vorrichtung 10. Hierbei erfolgt das Durchspülen von zumindest zwei mikrofluidischen Kanälen 1, 2, 3, 4 mit einem Spülmittel, sodass das Spülmittel durch das Rückhalteelement 7 hindurch und/oder entlang der ersten Seite 7a des Rückhalteelements 7 geführt wird.

Die Flussrate der durch die mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 geführten Medien, Puffer und Reagenzien liegt beispielsweise zwischen 0,01 pl/s und 200 pl/s, und bevorzugt zwischen 0,2 pl/s und 5 pl/s. Hierbei ist die Flussrate konstant oder variierend, insbesondere pulsierend.

Die Strömung zwischen den fluidischen Anschlüssen la, 2a, 3a, 4a kann beispielsweise auch moduliert werden, indem die Förderrichtung des zweiten Mediums temporär gewechselt wird durch aufeinanderfolgendes Vorwärts- und Rückwärtsfördern des zweiten Mediums. Auch ist eine kombinierte Modulation der Strömungen zwischen dem ersten la, dem zweiten 2a, dem dritten 3a und dem vierten fluidischen Anschluss 4a möglich.

Das Zu- und Abführen der Medien, Puffer und Reagenzien und/oder das fluidische Fördern der Medien, Puffer und Reagenzien erfolgt beispielsweise durch zumindest eine mikrofluidische Pumpeinheit und insbesondere durch zumindest eine druckbetriebene Elastomermembran-Pumpe.

Ein Volumenstrom wird beispielsweise durch eine Pumpkammer mit Einlass- und Auslassventil und/oder durch mindestens drei aktive Pumpelemente, welche in einer peristaltischen Sequenz aktiviert werden, erzeugt.

In Figur 2 ist eine Draufsicht auf die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß Figur 1 dargestellt mit einer vorteilhaften Anordnung der mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4.

Das erste Kanalsystem wird durch den ersten mikrofluidischen Kanal 1 und den zweiten mikrofluidischen Kanal 2 gebildet. Der zweite mikrofluidische Kanal 2 verläuft in versetzter Ebene in die gleiche Richtung wie der erste mikrofluidische Kanal 1. Das zweite Kanalsystem wird durch den dritten mikrofluidischen Kanal 3 und den vierten mikrofluidischen Kanal 4 gebildet, und verläuft in eine Richtung 90° versetzt zum ersten Kanalsystem. Hierbei verläuft der vierte mikrofluidische Kanal 4 in die gleiche Richtung wie der dritte mikrofluidische Kanal 3.

Durch diese Anordnung der mikrofluidischen Kanäle 1, 2, 3, 4 ist ein optimaler Fluss durch die mikrofluidische Vorrichtung 10 gewährleistet. Figur 3 zeigt einen Querschnitt durch eine erfindungsgemäße, insbesondere mikrofluidische, Kartusche 100, welche eine mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß Fig. 1 umfasst.