Beschreibung

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen im Schüttelbetrieb sowie ein Verfahren zu ihrer Anwendung. Sie ist insbesondere anwendbar für Kultivierungsprozesse mit hohem Sauerstoffbedarf oder für Kulturen mit hohen Ansprüchen bezüglich der Ausbildung eines Gasphasengleichgewichts mit der Umgebung. Die Erfindung findet vorteilhafte Anwendung in Kultivierungsprozessen mit passiver Begasung, deren Durchmischung durch Schütteln erreicht wird, insbesondere aber nicht ausschließlich auf dem Gebiet der Schüttelkolbenkultivierungen.

Die Kultivierung von Zellen erfolgt in verschiedensten Vorrichtungen, welche die Aufbewahrung und Durchmischung der Kulturflüssigkeit 2 sowie die Einstellung von Kultivierungsbedingungen vornehmen. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Zusammensetzung der Gasphase, aus der die Kulturflüssigkeit 2 mit Sauerstoff versorgt wird, oder über die physiologisch relevante Gase wie CO2 ausgetauscht werden.

Die Aufrechterhaltung einer bestimmten Gasphasenzusammensetzung ist kritisch für den Erfolg jedes Kultivierungsprozesses. So kann z.B. nur bei hinreichend hoher Sauerstoffkonzentration in der Gasphase derjenige Sauerstoffpartialdruck in der Kulturflüssigkeit 2 gehalten werden, der notwendig ist, um vollständig aerobe Stoffwechselwege zu ermöglichen. Infolge der geringen Löslichkeit von Sauerstoff in wässrigen Phasen und dem kontinuierlichen Sauerstoffverbrauch atmender Zellen muss eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen geeignete Mittel zum kontinuierlichen Gasaustausch 10 bereitstellen.

Gleichzeitig muss dieser Gasaustausch 10 möglichst sterilitätserhaltend stattfinden, um eine Kontamination des Kultivierungsprozesses mit Fremdzellen zu unterbinden. Infolgedessen wird die Gasphase in der Kultivierungsvorrichtung häufig und je nach Sterilitätserfordernis über eine Sterilbarriere 5 von der äußeren Gasphase getrennt. Während in aktiv begasten Kultivierungsvorrichtungen wie Rührkesselfermentern sterilfiltrierte Gasgemische aktiv in die Kulturflüssigkeit 2 eingeleitet werden (z.B. mittels Druckluft als Blasensäule), erfolgt der Gasaustausch 10 in passiv begasten Kultivierungsvorrichtungen wie Schüttelkolben nur über langsame Diffusion und Konvektion zwischen dem Kopfraum 3 der Kultivierungsvorrichtung und ihrer Umgebungsgasphase 6. In passiv begasten Vorrichtungen kann es darum insbesondere bei der Kultivierung schnellwachsender, aerober Organismen zu Sauerstofflimitationen kommen, welche den Kultivierungsprozess verlangsamen sowie über die Bildung unerwünschter Metabolite oder Gärungsprodukte negativ beeinflussen. Verstärkt wird dieser Effekt in einigen Anwendungen durch Ein- oder Anbauten an die Kultivierungsvorrichtung, welche die Diffusion und Konvektion sowohl zwischen als auch innerhalb der Kopfraumgasphase 3 der Kultivierungsvorrichtung und der Umgebungsgasphase 6 behindern, insbesondere Sensoren und Sonden sowie Feeding- und Sampling-Systeme.

Stand der Technik

Dem Fachmann sind eine Vielzahl verschiedener aktiv begaster Kultivierungssysteme aus der Gruppe der Rührkesselfermenter bekannt, welche über sterilfiltrierte Gasgemische mit Regelung von Druck und Volumenstrom begast werden, wobei der Gasaustausch 10 zwischen einströmender Gasphase und Kulturflüssigkeit 2 hauptsächlich an den Grenzflächen der die Kulturflüssigkeit 2 durchperlenden Gasblasen stattfindet. Im Vergleich zu passiv begasten Vorrichtungen zur Kultivierung von Zellen sind aktive Kultivierungssysteme nachteilig deutlich komplexer in Aufbau, Handhabung, Betrieb und Wartung. Auf diese Vorrichtungen wird daher hier nicht weiter Bezug genommen.

Passiv begaste Vorrichtungen zur Kultivierung von Zellen basieren grundsätzlich auf dem Konzept eines Flüssigkeitsbehälters mit verschiedentlich verschließbarer Befüllungsöffnung nach oben, über welche auch der Gasaustausch 10 mit der Umgebungsgasphase 6 stattfindet, sodass die Begasung und die Handhabung der Kulturflüssigkeit 2 (Befüllung, Sampling, etc.) durch dieselbe Öffnung erfolgen. Die Durchmischung solcher Kultivierungsvorrichtungen erfolgt über die Bewegung der Vorrichtung im Zusammenspiel mit der Trägheit und Reibung der sich in der Vorrichtung befindenden Flüssig- und Gasphasen. Weit verbreitete Vorrichtungen, welche dieses Konzept implementieren sind insbesondere verschiedenste Kulturkolben und -flaschen sowie Multiwell-Plates. Die Durchmischung findet insbesondere auf Wipp-, Taumel oder Orbitalschüttlern statt, welche zudem als Inkubatoren ausgeführt sein können, um neben der Durchmischung auch noch definierte Temperatur-, Feuchtigkeits- und Umgebungsgasphasenbedingungen einzustellen.

Dem Fachmann sind verschiedene Verschlussmöglichkeiten solcher passiv begaster Kultivierungsvorrichtungen bekannt, welche sich insbesondere hinsichtlich ihrer Gaspermeabilität, Gasaustauschart (Diffusion und/oder Konvektion) und Eignung als Sterilbarriere 5 unterscheiden, beispielsweise Schraubverschlüsse mit oder ohne gaspermeabler Membran, Aluminiumsteckverschlüsse, Aluminiumfolie, Kunststofffolie, aufklebbare oder aufsteckbare gaspermeable Membranen, Wattestopfen, Glasstopfen, etc.

Nachteilig bezüglich der oben beschriebenen Kultivierungsvorrichtungen mit passiver Begasung ist die Lage und Ausrichtung der Vorrichtungsöffnung, über die der Gasaustausch 10 stattfindet. Die durch die Schüttelbewegung induzierte Bewegung der Flüssigkeit 2 in der Kultivierungsvorrichtung verursacht innerhalb des Kopfraums 3 der Vorrichtung eine Gasströmung. Infolge der Vorrichtungsgeometrie (insbesondere bei kolbenartigen Vorrichtungen), der weiten Entfernung zwischen der die Gasbewegung verursachenden Flüssigkeit 2 und der Vorrichtungsöffnung sowie der Ausrichtung der Öffnungsfläche parallel zum Vorrichtungsboden und damit parallel zur Hauptbewegungsfläche der Flüssigkeit ist die Bewegung und somit die lokale Durchmischung der Gasphase im Kopfraum 3 direkt vor der Vorrichtungsöffnung sehr schwach und zudem nahezu frei von Druckgradienten mit nennenswertem vertikalem Anteil in Bezug auf die Öffnungsfläche, sodass sowohl der Gasaustausch 10 innerhalb des öffnungsnahen Kopfraums 3 als auch der Gasaustausch 10 über die Vorrichtungsöffnung mit der Umgebungsgasphase 6 prädominant durch Diffusion ohne nennenswerten Druckgradient erfolgen muss und dementsprechend langsam ist. W0001987007293A1 beschreibt einen Schüttelkolben mit gasaustauschverbessernden Mitteln. Offenbart werden dabei auch Schikanen zur turbulenten Durchmischung des Kopfraums 3. Dies löst zwar das Problem der schlechten Durchmischung der Gasphase innerhalb des Kopfraums 3, die oben beschriebene nachteilige Lage, Ausrichtung und Ausführung der Gasaustausch-/Befüllungsöffnung bleibt jedoch bestehen.

DE000004415444C2 und EP000000905229A2 beschreiben Vorrichtungen zur Ermittlung und Überwachung des physiologischen Zustandes mikrobieller Kulturen anhand der Sauerstofftransferrate. Offenbart werden dabei auch Verfahren und Vorrichtung zur aktiven Begasung von Schüttelkolben als Kultivierungsvorrichtung, wobei die Begasung der Vorrichtung über separate, nach oben hin geöffnete Gasaustauschöffnungen 4 erfolgt. Die aktive Begasung löst das Problem des langsamen Gasaustauschs 10 sowohl innerhalb des öffnungsnahen Kopfraums 3 als auch über die Vorrichtungsöffnungen mit der Umgebungsgasphase 6, da die aktive Begasung zu einem effizienten konvektiven Gasaustausch 10 führt. Nachteilig erhöht die aktive Begasung jedoch die Komplexität und Handhabbarkeit der gesamten Kultivierungsvorrichtung, da die Schüttelkolben mit Schläuchen, Pumpen, Ventilen, etc. ausgestattet werden müssen.

Somit sind keinerlei Vorrichtungen zur Kultivierung von Zellen im Schüttelbetrieb bekannt, welche die Vorteile der passiven Begasung, insbesondere hinsichtlich geringer Komplexität sowie einfacher Handhabbarkeit und Wartbarkeit mit gleichzeitig optimalem Gasaustausch 10 zwischen Kopfraum- 3 und Umgebungsgasphase 6 sowie optimaler Gasdurchmischung innerhalb des Kopfraums 3 bieten.

Aufgabenstellung

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, mittels derer die Kultivierung von Zellen bei passiver Begasung im Schüttelbetrieb mit optimalem Gasaustausch 10 zwischen Kopfraum- 3 und Umgebungsgasphase 6 sowie optimaler Gasdurchmischung innerhalb des Kopfraums 3 erfolgen kann. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung nach Anspruch 1 sowie ein Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung nach Anspruch 10; bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüche sowie der Beschreibung.

Definitionen

Zur Sicherstellung der Klarheit einiger in der Beschreibung verwendeter Begriffe, werden diese nachfolgend und im Verlauf der Beschreibung definiert und erläutert.

Der Gasaustausch 10 bezeichnet den Übergang von gasförmigen Stoffen zwischen zwei Phasen, insbesondere zwischen der Umgebungsgasphase 6 und der Kopfraumgasphase 3, sowie zwischen der Kopfraumgasphase 3 und der Kulturflüssigkeit 2. Gasaustausch 10 erfolgt durch die Bewegung der auszutauschenden Stoffe, insbesondere durch Konvektion oder Diffusion. Bei aktivem Gasaustausch 10 erfolgt dieser mittels dafür vorgesehener Gasfördervorrichtungen und -verfahren, insbesondere durch Pumpen oder Überdrucksysteme, wobei das auszutauschende Gas üblicherweise durch Rohrleitungen oder Schläuche in die Vorrichtung oder die Kulturflüssigkeit 2 geführt wird. Der aktive Gasaustausch 10 ist direkt beispielsweise durch die Änderung des Volumenstroms über die Pumpendrehzahl regelbar. Bei passivem Gasaustausch 10 erfolgt dieser ohne dafür vorgesehene Gasfördervorrichtungen und -verfahren, sondern durch Ausnutzung gegebener Zustände, wie Umgebungsdruck und Aufbau und Bewegung der Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen. Der passive Gasaustausch 10 ist nicht direkt regelbar, sondern nur durch Veränderung der gegebenen Zustände, insbesondere aber nicht ausschließlich durch die Änderung der Temperatur, des Drucks oder der Zusammensetzung der Umgebungsgasphase 6, sowie durch Veränderungen des Aufbaus oder der Bewegung der Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen.

Der Kopfraum 3 umfasst das innere Volumen der Vorrichtung, welches nicht durch Kulturflüssigkeit 2 ausgefüllt ist. Im Kopfraum befindet sich erfindungsgemäß die Kopfraumgasphase 3, auf beide gemeinsam oder aber getrennt wird Bezug genommen als Kopfraum mit Kopfraumgasphase 3.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung befindet sich in einer Umgebung mit Umgebungsgasphase 6, auf beide gemeinsam oder aber getrennt wird Bezug genommen als Umgebung mit Umgebungsgasphase 6. Die Zusammensetzung der Umgebungsgasphase 6 entspricht entweder der natürlichen Umgebungsluft oder wird gezielt definiert, beispielsweise durch Gasmischstationen.

Der erfindungsgemäße Einsatz der Vorrichtung erfolgt im Schüttelbetrieb, insbesondere aber nicht ausschließlich durch Wipp-, Taumel- oder Orbitalschütteln. Erfindungsgemäß kann der Schüttelbetrieb sowohl kontinuierlich als auch mit Unterbrechungen erfolgen. Infolge der Schüttelbewegung hat die Vorrichtung zumindest zur Umgebung mit Umgebungsgasphase 6 eine Relativgeschwindigkeit entlang eines Geschwindigkeitsvektors, der hier Bewegungsvektor 9 genannt wird. Infolge von Beschleunigungen im Verlauf der Schüttelbewegung kann sich der Bewegungsvektor 9 über die Zeit insbesondere aber nicht ausschließlich hinsichtlich Richtung und Betrag ändern. Infolge der schüttelbedingten Relativbewegung der Vorrichtung zur Umgebung mit Umgebungsgasphase 6 wird die Vorrichtung von Gas umströmt, sodass sich je nach betrachtetem Punkt der Vorrichtung der Druck auf die Vorrichtung ändert und sich ein lokaler Umgebungsdruck 8 für jeden Punkt der umströmten Vorrichtung einstellt, welcher sich mit der Schüttelbewegung und dem Bewegungsvektor 9 ändern kann. Ähnliches gilt für die Bewegung der Kopfraumgasphase im Kopfraum 3, sodass sich auch hier für jeden betrachteten Punkt der umströmten Vorrichtung ein lokaler Kopfraumdruck 7 ergibt. An nicht verschlossenen oder gaspermeablen Öffnungen der Vorrichtung, insbesondere aber nicht ausschließlich an Gasaustauschöffnungen 4, kann die Differenz beziehungsweise der Druckgradient zwischen Kopfraumdruck 7 und Umgebungsdruck 8 einen konvektiven oder diffusiven Druckausgleich über mindestens einen Gasaustausch 10 hervorrufen. All dies gilt sowohl für Gesamtdrücke, als auch für die Partialdrücke einzelner Komponenten einer Phase.

Kulturflüssigkeiten 2, Flüssigkeiten oder Flüssigphasen im Sinne der Erfindung sind reine oder gemischte Substanzen, die keine Gase sind und fluidische Eigenschaften aufweisen. Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung sind somit insbesondere aber nicht ausschließlich flüssige reine Stoffe, Lösungen, Emulsionen, Dispersionen, Schlämme, Suspensionen und Schäume. Kulturflüssigkeiten 2 bestehen insbesondere aber nicht ausschließlich aus Nährmedium und Zellen.

Eine Gasaustauschöffnung 4 ist eine Öffnung in der Wand 1 der Vorrichtung, welche vornehmlich dem Zweck des Gasaustauschs 10 dient. Sie ist charakterisiert durch eine Öffnungsfläche, welche sich ergibt als kleinstmögliche, zum Verschluss der Öffnung geeignete Fläche. Die Öffnungsfläche kann gekrümmt sein und kann in jedem Punkt durch mindestens einen Normalenvektor beschrieben werden. Die Ausrichtung einer Öffnung oder Öffnungsfläche zum Bewegungsvektor 9 der Schüttelbewegung wird beschrieben durch den Winkel a, welcher sich als Schnittwinkel zwischen dem Bewegungsvektor b (9) und einem Normalenvektor n auf die Öffnungsfläche ergibt zu

.

a = arcsin

Je nach Krümmung der Öffnungsfläche kann sich der Winkel a von Punkt zu Punkt unterscheiden, da die Normalenvektoren einer gekrümmten Fläche nicht alle parallel sind.

Die Öffnungsfläche einer Gasaustauschöffnung 4 und ein Bewegungsvektor 9 gelten als nichtparallel angeordnet, wenn mindestens für einen Punkt auf der Öffnungsfläche der betrachteten Gasaustauschöffnung 4 gilt, dass der Winkel a größer ist als 0°.

Eine Sterilbarriere 5 ist eine gaspermeable Vorrichtung, welche insbesondere zur Vorbeugung, Reduktion oder vollständigen Unterbindung des Eindringens unerwünschter Zellen, Viren oder sonstiger Verschmutzungen in das Innere der erfindungsgemäßen Vorrichtung durch mindestens eine Gasaustauschöffnung 4 oder weitere Öffnung 11 eingesetzt wird. Erfindungsgemäße Sterilbarrieren 5 erlauben mindestens einen Gasaustausch 10 zwischen dem Kopfraum mit Kopfraumgasphase 3 und der Umgebung mit Umgebungsgasphase 6, insbesondere über Diffusion und/oder Konvektion. Sterilbarrieren 5 im Sinne der Erfindung sind insbesondere aber nicht ausschließlich Sterilfilter, poröse Membranen (z.B. PTFE, Zellulose, hydrophpil oder hydrophob, etc.), Wattestopfen oder -polster sowie offenporige Schäume aus Silikon, Polyurethan oder anderen Kunststoffen. Sterilbarrieren 5 im Sinne der Erfindung werden mit der Wand 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden, insbesondere aber nicht ausschließlich durch direktes Verkleben oder Verschweißen, sowie indirekt über geeignete Verschlusssysteme mit Schraub- oder Rastverschluss oder sonstige form- oder stoffschlüssige Verbindungen.

Lösung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen im Schüttelbetrieb, wobei die beanspruchte Vorrichtung über mindestens eine Gasaustauschöffnung 4 verfügt, deren Öffnungsfläche nichtparallel zum Bewegungsvektor 9 der Schüttelbewegung ausgerichtet ist. Diese Anordnung führt, hervorgerufen durch die Schüttelbewegung und das damit verbundene Umströmen der erfindungsgemäßen Vorrichtung durch die Umgebungsgasphase 6 außen und die Kopfraumgasphase 3 innen, zur Ausbildung eines sich in Abhängigkeit der Schüttelbewegung ändernden Druckgradienten zwischen der Kopfraumgasphase 3 und der Umgebungsgasphase 6, welcher vorteilhaft den Gasaustausch zwischen Kopfraum- 3 und Umgebungsgasphase 6 sowie die Gasdurchmischung innerhalb des Kopfraums 3 beeinflusst.

Sind Umgebung 6 und Kopfraum 3 konvektiv verbunden, so ruft dieser Druckgradient eine Kompensationsströmung hervor, welche je nach Richtung des Druckgradienten zum Einströmen von Gas aus der Umgebung 6 in den Kopfraum 3 der Vorrichtung oder zum Ausströmen von Gas aus dem Kopfraum 3 der Vorrichtung in die Umgebung 6 führt. Im Falle periodischer Schüttelbewegungen ergibt sich somit eine atmungsähnlich oszillierende Gasbewegung zwischen Kopfraum 3 und Umgebung 6, welche einerseits einen deutlich effizienteren Gasaustausch 10 ermöglicht als die aus dem Stand der Technik bekannten passiv begasten Kultivierungsvorrichtungen und andererseits die Durchmischung innerhalb des Kopfraums 3 verbessert.

Sind Umgebung 6 und Kopfraum 3 konvektiv voneinander getrennt, aber diffusiv verbunden, so geht mit der Differenz zwischen schüttelbewegungsbedingtem lokalem Umgebungs- 8 und/oder Kopfraumdruck 7 eine Erhöhung der Diffusionsgeschwindigkeit zwischen Umgebungs- 6 und Kopfraumgasphase 3 einher. Im Falle periodischer Schüttelbewegungen kommt es zu oszillierenden Diffusionsgeschwindigkeiten und -richtungen, welche einerseits einen effizienteren Gasaustausch 10 ermöglichen als die aus dem Stand der Technik bekannten passiv begasten Kultivierungsvorrichtungen und andererseits die Durchmischung innerhalb des Kopfraums 3 verbessern.

Erfindungsgemäß bildet sich der Druckgradient zwischen Umgebung 6 und Kopfraum 3 insbesondere entlang des Bewegungsvektors 9 der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Schüttelbetrieb. Insofern vergrößert sich der Druckgradient bei gleicher Gesamtfläche der Gasaustauschöffnung 4 mit steigendem Winkel a zwischen deren Öffnungsfläche und dem Bewegungsvektor 9 von 0° bis 90°. Bei gegebener Gesamtfläche der Gasaustauschöffnung 4 ist der erreichbare Druckgradient maximal, wenn der Bewegungsvektor 9 orthogonal zur Öffnungsfläche steht und minimal, wenn der Bewegungsvektor 9 parallel zur Öffnungsfläche steht, wobei letztere Anordnung dem aktuellen Stand der Technik entspricht.

Die Vorrichtung wird vorteilhaft in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Kultivierung von Zellen im Schüttelbetrieb eingesetzt. Dazu wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit Kulturflüssigkeit 2 befüllt. Über mindestens eine Gasaustauschöffnung 4 und/oder mindestens eine weitere Öffnung 11 stellt sich im Kopfraum eine Kopfraumgasphase 3 ein. Die befüllte erfindungsgemäße Vorrichtung wird auf oder in einem Schüttler und somit innerhalb einer Umgebung mit Umgebungsgasphase 6 positioniert. Im Schüttelbetrieb werden in der erfindungsgemäßen Vorrichtung nun Zellen kultiviert, wobei der Schüttelbetrieb dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens ein Bewegungsvektor 9 der Schüttelbewegung nichtparallel zur Öffnungsfläche mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 verläuft. Dadurch stellt das erfindungsgemäße Verfahren sicher, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung unter solchen Rahmenbedingungen angewendet wird, unter denen es zur Ausbildung mindestens eines sich in Abhängigkeit der Schüttelbewegung ändernden Druckgradienten zwischen der Kopfraumgasphase 3 der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer Umgebungsgasphase 6 kommt und vorteilhaft im Vergleich zum Stand der Technik der Gasaustausch 10 zwischen Kopfraum gasphase 3 und Umgebungsgasphase 6 sowie die Gasdurchmischung innerhalb der Kopfraumgasphase 3 verbessert werden.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist der Winkel a zwischen der Öffnungsfläche mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 und mindestens einem Bewegungsvektor 990°. In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung gilt für den Winkel a zwischen der Öffnungsfläche mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 und mindestens einem Bewegungsvektor 960°< a <90° oder 45°< a <90° oder 45°< a <60“oder 30°< a <90° oder 30°< a <60° oder 30°< a <45° oder 0°< a oder 15°< a oder 30°< a oder 45°< a oder 60°< a.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung mehrere Gasaustauschöffnungen 4, insbesondere aber nicht ausschließlich zwei, drei, vier, fünf oder sechs.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung mit mehreren Gasaustauschöffnungen 4 sind diese derart angeordnet, dass für jede in mindestens einem Zustand der Schüttelbewegung mindestens eine der oben genannten Bedingungen für den Winkel a zwischen ihrer Öffnungsfläche und mindestens einem Bewegungsvektor 9 gilt.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die Vorrichtung mit einer Vielzahl an Gasaustauschöffnungen 4 umgeben, sodass für nahezu jeden Zustand der Schüttelbewegung für mindestens eine dieser Gasaustauschöffnungen 4 mindestens eine der oben genannten Bedingungen für den Winkel a zwischen Öffnungsfläche und Bewegungsvektor 9 gilt.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist jede Gasaustauschöffnung 4 der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Steril barriere 5 verschlossen, welche das Eindringen fremder Zellen behindert oder vollständig unterbindet, jedoch für die auszutauschenden Gasphasenkomponenten permeabel ist. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung erlaubt mindestens eine Sterilbarriere 5 den Gasaustausch 10 über Konvektion und Diffusion. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung sind die Gasaustauschöffnungen 4 in einer gemeinsamen Ebene angeordnet, um die Stabilität der Vorrichtung während des Schütteins zu gewährleisten.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die Vorrichtung autoklavierbar oder bereits vorsterilisiert. In einigen Ausführungen der Erfindung können die Sterilbarrieren 5 gewechselt werden.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung neben mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 mindestens eine weitere Öffnung 11 , welche insbesondere aber nicht ausschließlich zum Befüllen und Entleeren der Vorrichtung, zum Probenziehen, zum Anbringen von Sonden und Sensoren oder zum Anbringen von Feeding- und Dispensiervorrichtungen geeignet ist. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfassen solche weiteren Öffnungen 11 ein Verschlusssystem zur Anbringung externer Vorrichtungen oder Verschlüsse 12, insbesondere aber nicht ausschließlich Verschlusssysteme mit Steck-, Rast-, Formschluss- oder Schraubmechanik.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung sind eine oder mehrere Gasaustauschöffnungen 4 von der Wand 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgesetzt und/oder mit einer inneren Spritzschutzwölbung 13 untersetzt, um das Austreten von Flüssigkeit infolge von Schüttei- oder Flandhabungsbewegungen sowie den Kontakt von Flüssigkeit mit gegebenenfalls vorhandenen Sterilbarrieren 5 zu verhindern. In einigen Ausführungsformen der Erfindung sind eine oder mehrere Gasaustauschöffnungen 4 in einer Flöhe über dem Boden der Vorrichtung angebracht, die mindestens zweimal so hoch ist wie die Flöhe der ungeschüttelten Kulturflüssigkeit 2 über dem Boden bei üblicher Befüllung, insbesondere aber nicht ausschließlich bei eine Befüllung der Vorrichtung mit 5% bis 20% ihres Nominalvolumens.

In einigen Ausführungsformen erfolgt der Gasaustausch 10 zwischen der Kopfraumgasphase 3 und der Umgebungsgasphase 6 unidirektional, in anderen Ausführungsformen bidirektional. In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kommen selektive Sterilbarrieren 5 zum Einsatz, welche nur einer oder mehreren bestimmten Gasphasenkomponenten den Gasaustausch 10 über die jeweilige Gasaustauschöffnung 4 ermöglichen.

In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Wand 1 aus Glas gefertigt. In anderen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Wand 1 aus Kunststoff hergestellt, insbesondere aber nicht ausschließlich mittels Spritz- oder Schleuderguss.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der Figuren und Ausführungsbeispiele näher erläutert. Auf Bezugszeichen in den Figuren, welche Komponenten der Erfindung bezeichnen, die bereits in der gleichen Figur oder aber in einer anderen Figur unter gleichen Umständen oder gleicher Darstellung verwendet wurden, wird teilweise verzichtet, um die Klarheit und Übersichtlichkeit der Figuren zu erhalten. Graphische Elemente ohne Bezugszeichen sind daher unter Beachtung der Bezugszeichenliste, der anderen Figuren, der bezeichneten Darstellungen innerhalb derselben Figur, der Musterung oder Strukturierung bereits bezeichneter graphischer Elemente sowie unter Flinzuziehung der gesamten Beschreibung und der Ansprüche zu interpretieren.

Ausführungsbeispiele und Figuren

Figur 1 , eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Figur 2, eine schematische Darstellung von Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben mit verschiedenen Gasaustauschöffnungen 4.

Figur 3, eine Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung als Schüttelkolben mit umlaufenden Gasaustauschöffnungen 4. Figur 4, eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit über weitere Öffnung 11 angeschlossenem Feeding-System.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Diese umfasst mindestens eine Wand 1 , welche den Innenraum der erfindungsgemäßen Vorrichtung umschließt. Im Innenraum der Vorrichtung befindet sich Kulturflüssigkeit 2 sowie über ihr der Kopfraum mit Kopfraumgasphase 3. Über mindestens eine Gasaustauschöffnung 4 steht die Kopfraumgasphase 3 mit der Umgebung mit Umgebungsgasphase 6 in Verbindung, sodass insbesondere aber nicht ausschließlich über Diffusion und/oder Konvektion von Gasphasenkomponenten mindestens ein Gasaustausch 10 zwischen der Kopfraum gasphase 3 und der Umgebungsgasphase 6 stattfinden kann. Jede Gasaustauschöffnung 4 kann über eine gaspermeable Sterilbarriere 5 verschlossen sein. Während der Kultivierung von Zellen wird die erfindungsgemäße Vorrichtung durch gelegentliches, periodisches oder kontinuierliches Schütteln durchmischt, wobei die Schüttelbewegung zu jedem Zeitpunkt über mindestens einen Bewegungsvektor 9 charakterisiert ist. Infolge der Schüttelbewegung baut sich über einer Gasaustauschöffnung 4 und insbesondere über einer Sterilbarriere 5 in Abhängigkeit des Winkels a zwischen der Öffnungsfläche der Gasaustauschöffnung 4 und dem Bewegungsvektor 9 ein Druckgradient zwischen lokalem Kopfraumdruck 7 und lokalem Umgebungsdruck 8 auf, welcher durch Ausgleichsströmung den konvektiven Gasaustausch 10 und durch Erhöhung der Konzentrationsdifferenz zwischen Kopfraum 3 und Umgebung 6 die diffusiven Gasaustausch 10 erhöht. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung zudem mindestens eine weitere Öffnung 11 , welche zumindest während der Kultivierung von Zellen verschlossen ist, insbesondere aber nicht ausschließlich mit einem geeigneten Verschluss 12.

Je nach Anordnung der Gasaustauschöffnungen 4 im Falle eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Gasaustauschöffnungen 4, bilden sich in mindestens einem Bewegungszustand bei gegebenem Bewegungsvektor 9 über verschiedenen Gasaustauschöffnungen 4 und/oder Sterilbarrieren 5 verschiedene Druckgradienten. Wie in Figur 1 exemplarisch dargestellt, führt dies auf der angeströmten Seite der Vorrichtung (Figur 1 , rechts) zu einem höheren lokalen Umgebungsdruck 8 im Vergleich zum lokalen Kopfraumdruck 7, sodass an dieser Gasaustauschöffnung 4 vornehmlich Umgebungsgasphasenkomponenten in den Kopfraum 3 der Vorrichtung einströmen (10, rechts), während auf der gegenüberliegenden Seite ein genau umgekehrter Druckgradient entsteht und dort (Figur 1 , linke Gasaustauschöffnung 4) vornehmlich Kopfraumgasphasenkomponenten in die Umgebung 6 der Vorrichtung ausströmen (10, links). Daraus ergibt sich einerseits eine vorteilhafte Erhöhung des gesamten Gasaustausches 10 zwischen Kopfraumgasphase 3 und Umgebungsgasphase 6, andererseits folgt aus diesen unterschiedlichen Druckgradienten eine verbesserte Durchmischung der Kopfraumgasphase 3 infolge einer zusätzlichen Querdiffusion/-konvektion innerhalb des Kopfraums 3 sowie deren Interaktion mit der Gasphasenbewegung, welche durch die Bewegung der Vorrichtung und der Kulturflüssigkeit 2 hervorgerufen wird.

Figur 2 zeigt in schematischer Darstellung drei Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben mit verschiedenen Gasaustauschöffnungen 4. Zu jeder Ausführungsform (A, B, C) sind jeweils ein Seitenschnitt (oberhalb der gestrichelten Linie) sowie eine Aufsicht (unterhalb der gestrichelten Linie) gegeben. Die Ausführungsformen in Figur 2 A-C umfassen zur Befüllung, Entleerung sowie zum Probenziehen, Feeding oder zur Durchführung sonstiger Eingriffe in den Kultivierungsprozess alle eine weitere Öffnung 11 , welche hier als klassische Kolbenöffnung ausgeführt ist und mit einem Deckel als Verschluss 12 verschlossen wird.

Die Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben umfasst bei typischen Nominalfüllvolumina bis 30% einen vergleichsweise großen, sich nach oben hin verjüngenden Kopfraum mit Kopfraumgasphase 3. Diese klassische Kopfraumgeometrie profitiert insbesondere in orbitalgeschütteltem Betrieb von den Vorteilen des erfindungsgemäßen passiven Gasaustauschs 10 über Gasaustauschöffnungen 4, deren Öffnungsfläche nichtparallel zum Bewegungsvektor 9 der Schüttelbewegung ausgerichtet ist. Im Gegensatz dazu verfügen Schüttelkolben nach dem Stand der Technik nur über eine einzige Öffnung nach oben hin, welche aufgrund ihrer vollständig oder während des Schüttelbetriebs überwiegend parallelen Ausrichtung zur Schüttelbewegung nur schlecht für den Gasaustausch 10 geeignet ist. Dies wird in Schüttelkolben nach dem Stand der Technik noch verstärkt durch die Verjüngung des Kolbens hin zur Öffnung, sodass im Orbitalschüttelbetrieb ein rotierender Gaswirbel im Kopfraum 3 des Kolbens entsteht, dessen Bewegungsvektoren ebenfalls eine Fläche aufspannen, die nachteilig parallel zur einzigen Öffnung des Schüttelkolbens nach Stand der Technik verläuft, sodass kein erfindungsgemäß vorteilhafter und den Gasaustausch 10 sowie die Durchmischung befördernder Druckgradient zwischen lokalem Kopfraumdruck 7 und lokalem Umgebungsdruck 8 über die Öffnung des Schüttelkolbens als Vorrichtung nach Stand der Technik entstehen und oszillieren kann.

Figur 2A zeigt eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben mit einer seitlichen Gasaustauschöffnung 4, deren Öffnungsfläche im dargestellten Bewegungszustand in einem Winkel von a = 71 ° zum Bewegungsvektor 9 ausgerichtet ist. Im Vergleich zur vollständig orthogonalen (a = 90°) Anordnung aus Figur 1 ist der Gasaustausch 10 hier zwar etwas schwächer, aber immer noch deutlich besser als bei Vorrichtungen mit passiver Begasung gemäß des aktuellen Stands der Technik. Vorteilhaft ist hier, wie auch in Figur 2B, die Gasaustauschöffnung 4 schräg von der Wand 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgesetzt, sodass Spritz- und Kondensflüssigkeit nicht nachteilig die Sterilbarriere 5 benetzt oder verschließt, sondern wieder zurück in die Kulturflüssigkeit 2 fließt.

Figur 2B zeigt eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben mit zwei seitlichen Gasaustauschöffnungen 4, deren Öffnungsflächen im dargestellten Bewegungszustand in einem Winkel von a = 71 ° zum Bewegungsvektor 9 ausgerichtet sind. Ähnlich wie im Ausführungsbeispiel aus Figur 1 sind die Gasaustauschöffnungen 4 hier gegenüberliegend angeordnet, sodass sich durch Querströmung eine bessere Durchmischung innerhalb der Kopfraumgasphase 3 einstellt.

Figur 2C zeigt eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schüttelkolben mit einer Vielzahl umlaufender Gasaustauschöffnungen 4, welche allesamt mit einer gemeinsamen Sterilbarriere 5 versehen sind und somit eine quasikontinuierliche Gasaustauschöffnung 4 darstellen. Diese Anordnung ist insbesondere bei Orbitalschüttelbetrieb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorteilhaft, da sie gewährleistet, dass die den Gasaustausch 10 begünstigende nichtparallele Anordnung zwischen Bewegungsvektor 9 und der Öffnungsfläche der Gasaustauschöffnung 4 zu jedem Zeitpunkt der Schüttelbewegung gegeben ist. Darüber hinaus erlaubt die in Figur 2C dargestellte Ausführungsform durch die radiale Anordnung der quasikontinuierlichen umlaufenden Gasaustauschöffnung 4 die Erzeugung eines mit der Schüttelbewegung mitrotierenden Gasaustausch-(10)-Wirbels, da mit der Orbitalschüttelbewegung die gegenüberliegenden Flächen/Punkte des maximalen Druckgradienten über die Gasaustauschöffnung 4 und die Sterilbarriere 5 durch den sich permanent ändernden Bewegungsvektor 9 innerhalb einer Periode der Orbitalschüttelbewegung einmal um den gesamten Kolben herumwandern.

Im Unterschied zu Figur 2A und 2B sind in der Ausführung aus Figur 2C die Gasaustauschöffnungen 4 nicht abgesetzt, sondern direkt in die Wand 1 integriert, sodass die Sterilbarriere 5 direkt auf der Wand 1 der Vorrichtung aufliegt und sich der Winkel a zwischen der Öffnungsfläche der Gasaustauschöffnungen 4 und dem Bewegungsvektor 9 durch die Geometrie der Wand 1 ergibt. Vorteile bietet dies insbesondere bezüglich der Fertigungsvereinfachung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, da sich hier die Sterilbarriere 5 einfacher aufbringen lässt, insbesondere aber nicht ausschließlich durch Verklebung mit oder Ultraschallschweißen auf die Wand 1. Vorteilhaft ist weiterhin, dass durch das Nichtabsetzen der Gasaustauschöffnungen 4 der Schwerpunkt der erfindungsgemäßen Vorrichtung näher am Boden bleibt, was sich insbesondere bei schnellem Schütteln positiv auf die Stabilität der Vorrichtung sowie auf die maximal zulässige Schüttelgeschwindigkeit auswirkt. Um einer Benetzung der nichtabgesetzten Sterilbarriere 5 durch Spritzer vorzubeugen, umfasst die Ausführungsform aus Figur 2C eine Spritzschutzwölbung 13, welche zwischen Gasaustauschöffnung 4 und Kulturflüssigkeit 2 angebracht ist, um spritzende Flüssigkeit zurückzuhalten. Auch oberhalb der Gasaustauschöffnung 4 kann eine Spritzschutzwölbung 13 vorteilhaft eingesetzt werden, insbesondere um einer Benetzung der Sterilbarriere 5 mit aus dem oberen Vorrichtungsteil abfließender Kondensflüssigkeit vorzubeugen. In einigen Ausführungsformen wird zudem das Absetzen mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 mit mindestens einer der vorgenannten Spritzschutzwölbungen 13 kombiniert. Eine ausgewählte Umsetzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Figur 2C ist in Figur 3 als perspektivischer Teilschnitt dargestellt. Die Vorrichtung ist hier als klassischer Schüttelkolben ausgeführt, umfassend eine Wand 1, in die oberhalb der Kulturflüssigkeit 2 radial umlaufend mehrere Gasaustauschöffnungen 4 eingebracht sind, sodass sich eine gesamte, quasikontinuierliche Gasaustauschöffnung 4 zum Gasaustausch 10 zwischen Kopfraumgasphase 3 und Umgebungsgasphase 6 ergibt, die nur durch schmale Verbindungsstreben 14 unterbrochen wird. Ebenfalls umlaufend bedeckt von außen eine zusammenhängende Sterilbarriere 5 (hier angeschnitten dargestellt) sämtliche Gasaustauschöffnungen 4. Unterhalb dieser verläuft ringförmig eine Spritzschutzwölbung 13. Die Vorrichtung verfügt zudem über eine weitere Öffnung 11 mit Verschluss 12.

Die in Figur 3 dargestellte Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist insbesondere geeignet, um als Einwegprodukt aus Kunststoff hergestellt und vorsterilisiert ausgeliefert zu werden.

Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit über eine weitere Öffnung 11 angeschlossenem Feeding-System. Die Vorrichtung ist hier als klassischer Schüttelkolben ausgeführt, umfassend eine Wand 1 , an die oberhalb der Kulturflüssigkeit 2 mehrere Gasaustauschöffnungen 4 in abgesetzter Ausführung zum Gasaustausch 10 zwischen Kopfraumgasphase 3 und Umgebungsgasphase 6 derart angebracht sind, dass zu mindestens einem Zeitpunkt der Schüttelbewegung der Winkel a zwischen Bewegungsvektor 9 und der Öffnungsfläche mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 größer als 0° ist und Bewegungsvektor 9 und Öffnungsfläche mindestens einer Gasaustauschöffnung 4 nichtparallel zueinander ausgerichtet sind. Jeweils eine gaspermeable Sterilbarriere 5 bedeckt jede Gasaustauschöffnungen 4. Die Vorrichtung verfügt über eine weitere Öffnung 11 , welche während des erfindungsgemäßen Betriebs der Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen durch einen Verschluss mit integriertem Feeding-Reservoir 15 verschlossen ist und auf dem ein Dosiersystem 16 angebracht ist. Dies ermöglicht vorteilhaft die Zugabe von Substraten und Nährstoffen während der Kultivierung von Zellen, insbesondere aber nicht ausschließlich als Fed-Batch-Prozess, sodass die hier dargestellte Vorrichtung infolge des erfindungsgemäß verbesserten Gasaustauschs 10 in der Lage ist, auch bei passiver Begasung Zellkultivierungsprozesse ohne Sauerstofflimitation durchzuführen, die sonst nur in deutlich komplexeren, aktiv begasten Rührkesselfermentern durchgeführt werden könnten.

Bezugszeichenliste

Zur jeweiligen Interpretation der Bezugszeichen sind Beschreibung und Ansprüche zu beachten.