Vorrichtung zur nicht-invasiven Messung von Zellsignalen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur nicht- invasiven Messung von Zellsignalen.

Die Kenntnis der exakten Signalform elektrisch aktiver Zellen ist von Bedeutung für die Evaluierung der Wir¬ kungsweise von Testsubstanzen, wie z. B. Medikamenten auf die Zellen. Die Kenntnis der Signalform ist ebenso Vorraussetzung bei der Entwicklung neuartiger Biosensoren und Implan¬ tate.

Aus dem Stand der Technik bekannt ist die sogenannte patch-clamp-Technik, bei der die Leitfähigkeit biologi- scher Membranen untersucht wird. Dabei wird die Membran einer intakten Zelle mit Hilfe einer Mikropipette ange¬ saugt und durch den verwendeten Unterdruck an deren Rand versiegelt. Das Membranstück kann aus der Zelle abgetrennt und in ein geeignetes Elektrolytbad einge- taucht werden und die Leitfähigkeit zwischen diesem und einer Elektrolytlösung innerhalb der Pipette gemessen werden. Im inaktiven Zustand der Membran werden Wider¬ stände im Gigaohm-Bereich gefunden. In Abhängigkeit von den in die Elektrolytlösung zugesetzten Testsubstanzen oder einer angelegten Spannung können sich Ionenkanäle öffnen, und die Leitfähigkeit steigt sprunghaft an. Die Methode ermöglicht den Nachweis der Wirkungsweise von Testsubstanzen auf spezifische Ionenkanäle.

Aus dem Stand der Technik sind ebenfalls nicht-invasive Messmethoden bekannt. Die Zellen werden bei der Messung der Zellsignale mechanisch nicht verletzt, so dass vor¬ teilhaft LangZeitmessungen zur Wirkungsweise der Test- Substanzen auf die Zellen ermöglicht werden.

Elektrisch spontan-aktive, aber auch zu elektrischer Aktivität stimulierbare Zellen, wie z. B. Herzmuskel- zellen, Skelettmuskelzellen oder Nervenzellen, werden in einer Suspension mit den entsprechenden Nährmedien auf eine oder mehrere Elektroden einer Messvorrichtung gegeben und in einem Brutschrank unter geeigneten Be¬ dingungen inkubiert. Nach einiger Zeit adhärieren die Zellen auf den Elektrodenoberflächen.

Zwischen der Zellmembran der Zellen und den jeweiligen Elektrodenoberflächen liegt ein mit Elektrolytlösung gefüllter Spalt geringen Volumens vor. Der Spalt steht mit der freien Elektrolytlösung, welche die Zellen als Reservoir umgibt, in direktem Kontakt.

Es resultiert ein elektrisches Leitungsband im Adhäsi- onsbereich. Dieses Leitungsband weist aufgrund des mit der Elektrolytlösung gefüllten Spaltes, die Eigenschaft eines elektrischen Widerstandes Rj auf. Die Leitfähig¬ keit g _σ des Leitungsbandes ergibt sich aus

Die Elektrolytlösung im Reservoir wird über einen Me¬ talldraht, z. B. mittels eines chlorierten Silberdrah¬ tes, mit der Masse der Messvorrichtung verbunden und liegt somit auf Erdpotential.

Die elektrische Aktivität der Zellen stellt unabhängig von dem verwendeten Zelltyp und von der spontanen oder durch gezielte Erregung ausgelösten elektrischen Akti¬ vität den Fluss von Ionen wie z. B. Na ⁺ -, K ⁺ -, Ca ²⁺ - und anderen Ionen durch die Ionenkanäle der Zellmembran dar.

Je nach adhäriertem Zelltyp und Testbedingungen wird zwischen einem Influx von Ionen in bzw. einem Efflux von Ionen aus der Zelle unterschieden. Der Ionenflux erfolgt durch die Ionenkanäle der Zell¬ membran, welche in Wechselwirkung mit der die Zellen umgebenden Elektrolytlösung im Reservoir steht. Die Io¬ nenkanäle werden durch Zugabe der TestSubstanzen akti¬ viert und ihre charakteristischen kinetischen Eigen- Schäften, wie die Geschwindigkeit des Öffnens und Schließens oder die Geschwindigkeit des Fluxes verändert .

Die Aktivität der Zellen führt spontan zur Änderung der Ionenkonzentrationen in der Elektrolytlösung in der Umgebung der Zellen.

Diese Änderung fällt aufgrund des geringen Volumens des Spaltes gegenüber dem großen Volumen des Reservoirs im Spalt relativ stärker aus. Die unterschiedlichen Ionen¬ konzentrationen im Spalt und in der freien Elektrolyt- lösung führen zum Abfallen einer elektrischen Spannung über Rj. Diese Spannungssignale werden mit der Elektro¬ de, die im Spalt der adhärierten Zellmembran gegenüber¬ liegt, abgegriffen.

Durch Einsatz vieler Elektroden in Elektrodenarrays oder in parallelen Reaktionsgefäßen wird der Messdurch¬ satz erhöht.

Messtechnisch betrachtet stellen die immobilisierten Zellen eine Stromquelle I _s i _g und der mit Elektrolytlö- sung gefüllte Spalt zwischen Zellmembran und Elektro¬ denoberfläche den Widerstand dar.

Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, die Messvor¬ richtungen so auszugestalten, dass die von der Elektro- de abgegriffenen Signale über eine Anordnung aus Kon¬ densator mit einer Kapazität Ci _n und einem Widerstand Ri _n an einen Verstärker gesendet werden. Hiermit wird vorteilhaft erreicht, dass der Biasstrom des Operationsverstärkers nicht zur Elektrode fließt. Zum anderen wird eine Filterung der Signale in Abhän¬ gigkeit von deren Frequenz erhalten. In Abhängigkeit von den elektrischen Eigenschaften des verwendeten Kon¬ densators Ci _n und des Widerstands Ri _n ist es möglich, bestimmte Frequenzanteile aus den Signalen gemäß der Formel f _Off =l/ (Ci _n *Ri _n ) als so genannte cut-off-Frequenz herauszufiltern. Bei gegebenen Werten von Ci _n «1000 pF und Ri _n «50 MΩ resultiert eine nominelle Grenzfrequenz von 20 Hz.

Nachteilig ist es bisher mit derartigen Messvorrichtun- gen noch nicht gelungen, derartig niederfrequente An¬ teile der Signale zu erfassen und mit bestimmten Test- substanzen in Beziehung zu setzen, obwohl dies an Hand der Grenzfrequenz möglich sein sollte.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Er¬ fassung der von auf Elektroden immobilisierten Zellen ausgehenden elektrischen Signale bereit zu stellen, mit der breitbandig die Frequenzgänge der von den Zellen ausgehenden Signale und auch deren niederfrequente Signalanteile erfasst werden können.

Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Hauptan¬ spruch gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf jeweils rückbezogenen Patentansprü- chen.

Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die mit Zellen behaftete Elektrode zur Übertragung induzierter Signale unmittelbar, das heißt direkt mit einem Verstärker verbunden ist. Die Signale werden also nicht zunächst über eine Anordnung aus Kon¬ densator Ci _n und Widerstand R± _n an den Verstärker gelei¬ tet .

Hierdurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Signale in einem vorhersehbaren und breitbandigen Frequenzbereich verstärkt werden, der auch die niederfrequenten Signal- anteile umfasst . Breitbandig bedeutet, dass Frequenzan¬ teile größer 0,01 Hz ermittelt werden können. Die Mes¬ sung des Frequenzgangs zu hohen Frequenzen ist nicht limitiert .

Es wurde erkannt, dass die im Stand der Technik angege¬ benen Werte zum verstärkten Frequenzbereich nicht der Realität entsprechen. Die tatsächliche Grenzfrequenz beträgt stattdessen mehr als 200 Hz. Die elektrischen Zellsignale in Form zeitabhängiger Spannungen darunter

werden nicht erfasst.

Gerade dieser Frequenzbereich ist aber zum Nachweis der Wirksamkeit bestimmter Testsubstanzen von besonderem Interesse, da sich die Zellsignale aus dem zeitlichen Zusammenspiel aller beteiligten Ionenkanälen mit ihren jeweiligen charakteristischen Eigenschaften zusammen¬ setzen, die zum Teil langsame und lang anhaltende, nie¬ derfrequente Signalanteile verursachen. Die mit dem Stand der Technik ermittelten Signalformen sind daher nicht aussagekräftig.

Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Elekt¬ rode als Wachstumsoberfläche für die Zellen eine Paral¬ lelschaltung, bestehend aus einer Kapazität C _e und ei¬ nem Widerstand R _e darstellt. Deren Größe ist vom Material der Elektrode aus z. B. Gold oder Platin, der Fläche, der Form, der Oberflächenstruktur und dem Kon¬ takt zwischen den adhärierten Zellen und der Elektrode abhängig. Es wurde auch erkannt, dass in Schaltungen gemäß Stand der Technik der Widerstand der Elektrode R _e größer als der Widerstand Ri _n ist (R _e >R _in ) . Ebenfalls wurde erkannt, dass die Kapazität C _e der Elektrode we¬ sentlich kleiner als die Kapazität Ci _n ist (C _e <<Ci _n ) .

Somit stellt die Schaltung gemäß Stand der Technik einen effektiven Hochpassfilter dar, dessen Grenzfre- quenz von der Kapazität C _e der Elektrode und dem Wider¬ stand Ri _n abhängig ist, da C _e <<Ci _n gilt. Bei Werten von C _e «100 pF und Ri _n «50 MΩ resultiert eine Grenzfrequenz von Hz.

Vorteilhaft weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ei¬ nen Operationsverstärker OP mit einem Eingangswider¬ stand R _O p>10 ¹² Ω auf.

Bei einer Kapazität C _e der Elektrode von C _e =100 pF wird vorteilhaft ein effektiver Hochpassfilter mit einer

Grenzfrequenz von 0,01 Hz bereit gestellt. Dies ermög¬ licht eine um den Faktor 20000 verbesserte niederfre¬ quente Signalerfassung im Vergleich zum Stand der Tech¬ nik mit f _off =200 Hz, mit den bekannten Auswirkungen auf die erweiterte Auswahl der TestSubstanzen und Aussage¬ kräftigkeit der Messergebnisse.

Besonders vorteilhaft wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung auch das Systemrauschen drastisch verklei¬ nert. Die Rauschamplitude ist definiert durch den Term

^Rauschen =V ^{4 x k x T x i?} in '

mit k= Boltzmann-Konstante (l,38xlθ ^~23 J/K) , bei T = 293 K.

Es können sämtliche nicht-invasiv erfassten Signale der elektrischen Zellaktivität auf Elektroden mit dieser extrem breitbandigen und zudem rauscharmen Schaltung ausgelesen und verstärkt werden.

Ein Elektrodenarray, Biosensor oder Implantat umfasst hierzu mindestens eine erfindungsgemäße Vorrichtung.

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungs- beispielen und den beigefügten Figuren näher beschrie¬ ben.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung gemäß Stand der Technik.

Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung.

Fig. 3 zeigt beispielhaft ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes Zellsignal.

Fig. 4 bis 6 zeigen den nachteiligen Einfluss eines zu¬ sätzlichen Widerstandes R _s/ der dem Widerstand Ri _n gemäß Stand der Technik entspricht auf die induzierten Signa¬ le im Vergleich zu den durch die erfindungsgemäße Vor¬ richtung gemessenen Signale.

Gemäß Fig. 1 ist die Elektrode über eine Schaltung aus Kondensator mit Ci _n und einem Widerstand Ri _n mit dem Verstärker verbunden. Diese Anordnung bildet einen Hochpassfilter mit der Grenzfrequenz

(Ci _n *Ri _n )=20 Hz, bei C _1n -IOOOpF und R _in ~50MΩ.

Frequenzen mit einem geringeren Wert sollen durch die Vorrichtung herausgefiltert werden.

Die Anordnung aus Kondensator Ci _n und Widerstand Ri _n bildet, wie erläutert, zusammen mit den auf der Elekt¬ rode immobilisierten Zellen einen effektiven Hochpassfilter, dessen Grenzfrequenz von der Elektro¬ denkapazität C _e und dem Eingangswiderstand Ri _n abhängig ist, da die Kapazität der Elektrode C _e viel kleiner

ist, als die Kapazität Ci _n des dem Verstärker OP vorge¬ schalteten Kondensators. Bei Werten von C _e =100 pF und Ri _n =50 MΩ resultiert ein tatsächlicher Wert der Grenzfrequenz von f _off =200 Hz. Niederfrequente Signale der elektrischen Zellaktivität werden herausgefiltert. Es werden falsch negative Er¬ gebnisse in Bezug auf die getesteten Substanzen er¬ zeugt .

Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung, in der auf die Verwendung des Eingangswiderstandes Ri _n und des Kondensators Ci _n verzichtet wurde, mit Ce=IOO pF und R _OP =10 ¹² Ω.

Fig. 3 zeigt exemplarisch ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes Signal einer HerzmuskelzelIe einer embryonalen Ratte, die auf einer Elektrode ge¬ wachsen ist.

Das Signal setzt sich zusammen aus einem sehr schnellen positiven Peak 1, der der Depolarisation der Zellmemb¬ ran entspricht. Hierauf folgt ein sehr schneller nega- tiver Peak 2, der auf den Na ⁺ -Influx durch die nur we¬ nige Millisekunden geöffneten, spannungsabhängigen Na ⁺ - Kanäle zurückzuführen ist. Hierauf folgt ein langsam abfallender und wieder ansteigender negativer Signalan¬ teil 3, der dem Ca ²⁺ -Influx durch die mehrere Hundert Millisekunden geöffneten Ca ²⁺ -Kanäle entspricht. Ein langsam ansteigender und wieder abfallender positiver Signalanteil 4 ist auf den K ⁺ -Efflux durch die zeitlich verzögert, langanhaltend geöffneten K ⁺ -Kanäle zurückzu¬ führen.

Die HerzmuskelZeilen zeigen charakteristische Aktions¬ potentiale. Sobald ein Schrittmacherpotential aus dem Sinusknoten an den Zellen ankommt, laufen die erläuter¬ ten, zeitlich aufeinander folgenden Ereignisse ab. Erst bei Erreichen des Schwellenpotentials öffnen sich sehr schnell die spannungsgesteuerten Na ⁺ -Kanäle. Der Na ⁺ - Einstrom in die Zelle verursacht die schnelle Depolari- sation der Zellmembran. Dieser Vorgang ist in den ext¬ razellulären Abteilungen als schneller Peak 1 zu Beginn des Aktionspotentials zu sehen. Durch Inaktivieren der Na ⁺ -Kanäle und Depolarisation werden die Ca ²⁺ -Kanäle ge¬ öffnet. Durch Ca ²⁺ -Einstrom wird die Kontraktion des Herzmuskels ausgelöst und das Membranpotential auf po¬ sitive Werte gehalten. Während dieser lang anhaltenden Depolarisation bleiben die Na ⁺ -Kanäle inaktiviert. Mit Verzögerung öffnen lang anhaltend die K ⁺ -Kanäle. Der resultierende K ⁺ -Ausstrom aus der Zelle repolarisiert die Zellmembran.

Zum Nachweis der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Schaltung gemäß der Fig. 2 bis 6 und der Vorteile ge¬ genüber dem Stand der Technik gemäß Fig. 1 wurde in die erfindungsgemäße Schaltung gemäß Fig. 2 ein Nebenwider¬ stand R _s mit unterschiedlicher Größe (R _s =100MΩ, 10MΩ oder 1MΩ) eingefügt, der in Fig. 4 mit dem Zustand K2 angegeben ist und Ri _n in Fig. 1 entspricht. Die Schal¬ tung Kl entspricht hingegen der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ohne Nebenwiderstand.

Auf den Elektroden wurden Herzmuskelzellen embryonaler Ratten ausplattiert und inkubiert. Nach einigen Tagen

wurde die spontane elektrische Aktivität dieser Herz¬ muskelzellen mit Hilfe der Elektroden gemessen.

In Fig. 5 und 6 sind beispielhaft Spuren aus einer Messserie aufgeführt. Es ist die Signalamplitude gegen die Zeit aufgetragen.

In der ersten Spur gemäß der Fig. 5A sind Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne den Nebenwider¬ stand abgebildet.

Die Zellsignale weisen deutlich sichtbar sowohl sehr schnelle, hochfrequente Anteile, als auch sehr langsa¬ me, niederfrequente Anteile auf.

Die Einführung des Nebenwiderstandes R _s =100MΩ (K2 in Fig. 4 und Fig. 5B) wie aus dem Stand der Technik be¬ kannt, führt zu deutlichen Veränderungen der aufge- zeichneten Zellsignale. Niederfrequente Signalanteile sind nicht nachweisbar. Es werden nachteilig nur hochfrequente Komponenten in Form schmaler Peaks gemes¬ sen. Das Rauschen der Messanordnung, erkennbar an der breiten Basislinie, ist im Vergleich zu der erfindungs- gemäßen Anordnung nachteilig deutlich erhöht.

Nebenwiderstände unterschiedlicher Größe (vgl. Fig. 5C: R _s =10MΩ, Fig. 5D: R ₃ =I MΩ) haben neben dem völligen Verschwinden langsamer Signalkomponenten auch eine Ver¬ kleinerung der Amplituden der hochfrequenten Signalan- teile zur Folge. Durch den Nebenwiderstand wird der

Frequenzgang der Schaltung verändert. Der Nebenwider¬ stand mit R _s =100 MΩ hat eine Veränderung von f _off =0,01 Hz (Fig. 5A, Zustand Kl) auf f _off =100 Hz zur Folge (vgl.

Fig. 5C: f _off =1000 Hz, Fig. 5D: f _off =10000 Hz) . In Fig. 5B und 5C werden etwa die Signale wiedergegeben, die mit dem Stand der Technik gemessen werden.

In den jeweils oberen Spuren der Fig. 6A-D (jeweils Zu- stand Kl) sind Messungen mit der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ohne den Nebenwiderstand dargestellt. Embryonale Rattenherzzellen wurden auf den Elektroden kultiviert. Es ist erkennbar, dass sich die verschiede¬ nen Spuren in den Signalformen deutlich voneinander un- terscheiden. Fig. 6A (Zustand Kl) zeigt ausschließlich das abgeleitete Signal der Membrandepolarisation. Fig. 6B und Fig 6C (Zustand Kl) zeigen neben der Depolarisa- tion zeitaufgelöst die Aktivität der Na ⁺ -, Ca ²⁺ - und K ⁺ - Kanäle, wobei das Signal des Na ⁺ -Influxes in Fig. 6C nur schwach aufgezeichnet wurde. Das Signal in Fig. 6D (Zustand Kl) besteht hingegen nur aus der Depolarisati- on und dem K ⁺ -Efflux. Die Unterschiede hinsichtlich der Signalzusammensetzung ist darauf zurückzuführen, dass die Zellen in den verschiedenen Versuchsansätzen unter- schiedlich auf den Elektroden adhäriert sind und somit die Signalübertragung im Spalt zwischen Zelle und Elektrode verschieden ausgeprägt ist. Die jeweiligen unteren Spuren der Fig. 6A-D (Zustand K2) zeigen die aufgezeichneten Signale nach Einführen eines Nebenwi- derstandes R _s =100MΩ. Unabhängig von der ursprünglichen Signalform sind nach Einführen des Nebenwiderstandes ausschließlich die schnellen, hochfrequenten Signalan¬ teile erfasst . Sämtliche langsamen, niederfrequenten Anteile des Ca ²⁺ -Influx und K ⁺ -Efflux sind aus den Sig- nalen vollständig herausgefiltert. Ebenso hat das Sig¬ nalrauschen durch den Nebenwiderstand zugenommen, er-

kennbar an der breiteren Basislinie, im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Anordnung.

Die Verminderung der Amplitude, vor allem jedoch das Fehlen der niederfrequenten Signalanteile hat nachtei- lig zur Folge, dass sich mit dem Stand der Technik der Einfluss unterschiedlicher Testsubstanzen, die von größter pharmakologischer Bedeutung sind, auf die Kinetik eines Teiles der an den Signalen beteiligten Ionenkanäle nicht nachvollziehen lässt, da die langsamen, niederfrequenten Signalanteile der K ⁺ - und Ca ²⁺ -Kanäle messtechnisch nicht auflösbar sind.

Exemplarisch seien an dieser Stelle verschiedene Test- substanzen aufgeführt, die einen Einfluss auf die Kine¬ tik der Ionenkanäle besitzen und insofern die nie- derfrequenten Signale beeinflussen.

Noradrenalin erhöht beispielsweise die Offen-Wahr- scheinlichkeit der spannungsabhängigen Ca ²⁺ -Kanäle. Dies hat eine erhöhte Kontraktilität des Herzens, eine erhöhte Herzfrequenz und eine erhöhte Erregungsleitung zur Folge.

Verapamil unterbindet den Ca ²⁺ -Influx durch Hemmung der langsamen Ca ²⁺ -Kanäle, während zumindest im therapeuti¬ schen Konzentrationsbereich der schnelle Na ⁺ -Einstrom nicht beeinflusst wird. Carbachol aktiviert über den K ⁺ -Efflux aus den Zellen. Dies hemmt vor allem die spontane Erregungsausbreitung im Sinusknoten. Zugleich ist eine Inhibierung des Ca ²⁺ -Influxes in die Zellen zu beobachten.

Der Einfluss derartiger Testsubstanzen lässt sich erst mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfassen.

Die nur beispielhaft dargestellten Signale ohne einen Nebenwiderstand zeigen ein deutlich vermindertes Rau¬ schen auf im Vergleich zu den Messungen mit dem Neben¬ widerstand. Dies ist daran zu erkennen, dass die peak- to-peak-Breite der mit dem Nebenwiderstand gemessenen Signale etwa 50-100% größer ist, als bei den Ver¬ gleichsmessungen ohne den Nebenwiderstand.

Die Vorrichtung ist somit zur breitbandigen und rausch¬ armen Signalwidergabe besonders geeignet. Mit der Vor¬ richtung können Signale ab einer Grenzfrequenz von ins¬ besondere 0,01 Hz aufwärts breitbandig aufgezeichnet werden. Das Rauschen der aufgezeichneten Signale liegt je nach Güte der Adhäsion zwischen 10 μV und 20 μV oder kleiner.