Folgeerkrankungen sowie Verwendung der Proteine MyfA und PsaA von Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis als rekombinante Antigene

Das Genus Yersinia umfasst drei humanpathogene Yersinia spp., Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica und acht weitere Species wie Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. moolaretti, Y. rohdei und Y. rucken, die eher als opportunistische Krankheitserreger bei Wunden und Sepsis beim Menschen eine Rolle spielen. Y. pestis ist der Erreger der Pest und kann durch Flöhe von dem natürlichen Nagetier-Reservoir auf den Menschen übertragen werden. Y. enterocolitica und Y pseudotuberculosis treten weltweit in den gemäßigten bis subtropischen Klimazonen bei Wild- und Nutztieren auf. In Deutschland ist die durch Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis hervorgerufene Darmerkrankung, die sog. Yersiniose, nach der Salmonellose (Salmonella enterica) und Campylobacter-Enteritis {Campylobacter jejuni) die dritthäufigste bakterielle Enteritiserkrankung, die dem Robert Koch-Institut (RKI) Berlin jährlich gemeldet wird. Im Jahr 2007 wurden in Deutschland 4.987 und im Jahr 2006 5.162 durch Yersinien bedingte Erkrankungen gemäß RKI- Falldefinition an das Robert Koch -Institut übermittelt. Die höchste altersspezifische Inzidenz wurde bei Kleinkindern im Alter von 1 bis 4 Jahren beobachtet (RKI). Die tatsächliche Häufigkeit dieser Erkrankungen ist allerdings nicht genau bekannt - viele Erkrankte suchen bei subklinischen bzw. bei leichten und kurzen Krankheitsverläufen keinen Arzt auf, viele Erkrankungen werden ätiologisch nicht geklärt und nicht alle diagnostizierten Erkrankungsfälle werden gemeldet. Schätzungsweise bis zu 43% der Blutspender in Deutschland und 31% der Blutspender in Finnland haben spezifische Antikörper gegen Yersinien (getestet mit Hilfe von Enzym-Immunoassays bzw. Immunoblots). Dieses Ergebnis lässt eine unerwartet hohe Prävalenz von durchgemachten Yersiniosen in Industrieländern mit hohen Hygienestandards vermuten.

Die enteropathogenen Y. enterocolitica- und Y. pseudotuberculosis -Erreger kommen bei Schweinen, Schafen, Rindern und Geflügel vor und gelangen hauptsächlich durch den Schlachtprozess in Lebensmittel (z.B. rohes Schweinefleisch) und Trinkwasser. Darüber hinaus sind Übertragungen auf Haustiere beschrieben. Auch konnte festgestellt werden, dass bis zu 100% der Wildschweine Yersinia enterocolitica im Nasenrachenraum tragen. Yersinien besitzen die Fähigkeit, sich bei niedrigen Temperaturen (> 4 ⁰ C) zu vermehren. In den Industrieländern stellt die Vermehrung in gekühlten Lebensmitteln die epidemiologisch wichtigste Verbreitungsform von Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis dar.

Die genaue Infektionsdosis ist nicht bekannt (vermutlich >10000 Bakterien). Die Inkubationszeit beträgt zwei bis fünf Tage nach der Ansteckung. Enteropathogene Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis -Stämme siedeln sich meist im darmassoziierten lymphatischen Gewebe des terminalen Ileums, in den so genannten Peyer'schen Plaques (zusammenhängende Ansammlung von Lymphfollikeln), an. Nach Ansiedlung überwinden die Yersinien über sog. M-Zellen in der Follikel-assoziierten Epithelzellschicht der Peyer'schen Plaques die gastrointestinale Barriere des Organismus und breiten sich über die abfließenden Lymphgefäße in den mesenterialen Lymphknoten aus. Durch Y. enterocolitica werden nachfolgend weitere Darmbereiche befallen und geschädigt, was die typischen Gewebsverletzungen des Dünn- und Dickdarms bei Yersiniose-Patienten erklärt. Y. pseudotuberculosis zeigt einen ähnlichen Infektionsverlauf wie Y. enterocolitica, wobei aber häufiger mesenteriale Lymphknoten, Leber und Milz betroffen sind und Enteritissymptomatik und die Ausscheidung über den Darm viel geringer sind als bei Y. enterocolitica.

Die enteritische Form der Yersinien-Infektionen, auch als Yersiniose bezeichnet, ist in unkomplizierten Fällen auf den Magen-Darm-Trakt begrenzt und durch mehrtägigen wässrigen Durchfall gekennzeichnet (sog. akute Yersinien-Gastroenteritis). Jedoch können Yersiniosen in Abhängigkeit vom Alter, dem Immunstatus, dem Histokompatibilitätstyp (HLA-B27) und dem Geschlecht der Patienten unterschiedliche Verlaufsformen und Symptome aufzeigen, wie z.B. Fieber, Übelkeit, kolikartige Unterbauchschmerzen (Pseudoappendizitis), Muskel- und Kopfschmerzen und Entzündungen im Rachenbereich (Pharyngitis), in den mesenteriale Lymphknoten (akute mesenteriale Lymphadenitis) und im Ileum und Kolon (Yersinia-Iletitis und -Colitis). In unkomplizierten Fällen klingt die Erkrankung nach wenigen Tagen bis spätestens nach zwei Wochen ab. Bei Patienten mit Grunderkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus, Leberzirrhose, Eisenspeicherkrankheiten (Dialyse-Patienten, Thalassämie) oder einer Immunsuppression kann es zu extraintestinalen Infektionen kommen (z. B. septische Formen). Nicht selten kommt es nach einer Bluttransfusion mit Yersinia-kontaminierten Blutkonserven zum septischen Schock mit hoher Letalität (ca.75%).

Neben den intestinalen und extraintestinalen Formen der Yersiniose, bei denen der Erreger meist isoliert werden kann, treten in bis zu 30% der Fälle noch Begleit- oder Folgeerkrankungen auf, die meist einen aseptischen Verlauf haben. Die häufigste Folgeerkrankung ist die HLA-B27-assoziierte Reaktive Arthritis [kurz: ReA] (etwa 60-80% der ReA -Fälle sind HLA-B27 positiv). Die ReA beginnt ca. 1-4 Wochen nach dem Auftreten der intestinalen Symptome (oft aber ohne vorangegangener Darmsymptomatik). Dabei sind am häufigsten die Gelenke der unteren Extremitäten betroffen. In den meisten Fällen klingt die Symptomatik nach ca. 3-12 Monaten ab, der Verlauf kann sich aber auch chronisch oder rezidivierend entwickeln. Weitere häufig auftretende Komplikationen nach einer Yersiniose sind Entzündungen der Schilddrüse (Thyroiditis), des Herzmuskels (Myokarditis) und der Nieren (Glomerulonephritis), rötliche Hauterscheinungen (Erythem) in den unteren Extremitäten (Erythems nodosum) und akute oder chronische Vergrößerungen der Lymphknoten (Lymphadenopathien) oder der Milz (Splenomegalien).

Bei Yersiniosen ohne weitere immunologische Komplikationen, wie z. B. reaktive Arthritis, kommt es meist nach kurzer Zeit zum Abklingen der Symptome. Damit ist eine Behandlung einer Yersinien-Infektion mit Antibiotika in den meisten Fällen unnötig. Bei septischen Verläufen oder lang anhaltenden Symptomen ist eine differenzierte Behandlung mit Antibiotika notwendig. Wegen der häufig vorkommenden Betalaktamasen bei Yersinien werden Infektionen mit Y. enterocolitica oder Y. pseudotuberculosis erregerspezifisch mit Gyrasehemmern, Tetracyclin, Trimethoprim/Sulfmethoxazol u.a. behandelt.

Die Unterscheidung verwandter Yersinien-Arten (z. B. Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis) erfolgt biochemisch. Y. pseudotuberculosis bildet dabei eine biochemisch einheitliche Gruppe, die sich in acht Serogruppen aufteilt, von denen in Europa die Serovare I, Il und III von humanmedizinischer Bedeutung sind (Bottone, [1997] Clin. Microbiol. Rev., 10, 257-276). Dagegen ist Y. enterocolitica eine sowohl biochemisch wie auch serologisch äußerst heterogene Art, bei der pathogene und apathogene geographisch getrennte Untergruppen vorkommen. Y. enterocolitica wird in sechs Biovare(BV)/Biotypen mit unterschiedlichen biochemischen Leistungen (1A, 1 B, 2, 3, 4. 5) und ca. 60 Serovare (anhand unterschiedlicher O- und H-Antigene) (Wauters et al., [1987] Contrib. Microbiol. Immunol., 9, 14-21) unterteilt. Während Biovar 1A Yersinien hauptsächlich in der Umwelt vorkommen, gehören die bekannten humanpathogenen Y. enterocolitica -Stämme zu den BV 1 B (Serotypen 0:8, 0:4, 0:13, 0:18, 0:20, 0:21 , hauptsächliches Vorkommen in den USA), BV 2 (Europa [0:9], USA, Japan [0:5, 27]), BV 3 (0:9 und 0:5, 27) und BV 4 (Europa und USA [0:3]). (Bucher et al., [2008] Foodborne Pathog. Dis., 5, 273-280). Ca. 80-90% der gemeldeten Yersinien-Gastroenteritiden in Deutschland werden durch Y. enterocolitica -Serotyp 0:3 verursacht (RKI).

Die Virulenz der enteropathogenen Yersinien (Y. enterocolitica Biovare 1 B, 2, 3, 4 und 5, Y. pseudotuberculosis) und des Pesterregers Y. pestis wird durch ein hoch konserviertes 65 — 70-kp großes Virulenzplasmid pYV (in Y. pestis pCDI) hervorgerufen. Dessen Virulenzfaktoren ermöglichen pathogenen Yersinien im lymphoidalen Gewebe des Wirtes zu überleben. Der Y. enterocolitica -Biovar 1A trägt kein pYV-Plasmid und wird daher als apathogen betrachtet.

Das pYV-Plasmid kodiert für das Membranprotein YadA (Yersinia Adhäsin) sowie eine Reihe von sog. Yersinia outer proteins (Yops) und den zugehörigen Sekretionsapparat (T3SS), der als Ysc (Yop secretion) bezeichnet wird. Als Substrat des T3SS werden die Yops als Anti-Wirts-Effektoren in eukaryontische Zellen (z. B. in Makrophagen) injiziert. Der Proteinkomplex des T3SS besteht aus 27 Proteinen mit bekannten oder unbekannten Funktionen, wie z. B. einer regulatorischen Funktion (YopQ, YopN), Translokationsfunktion (YopB, YopD) und Effektorfunktion (YopH, YopE, YopT, YopP, YopO). Das Adhäsin YadA wird ebenfalls auf dem Virulenzplasmid kodiert. Es vermittelt die Adhäsion der Erreger an Wirtszellen und ermöglicht die Yops in die Zielzellen zu injizieren. Das sogenannte V-Antigen (LcrV) ist ebenfalls auf dem pYV-Plasmid kodiert. Dieses Antigen bildet die Spitze des Ysc-Injektisoms, reguliert die Yop-Sekretion und Modulation des Immunsystems des Wirts. Die Virulenz der Yersinien wird abgesehen von den plasmidkodierten Virulenzfaktoren auch durch chromosomal kodierte Faktoren beeinflusst. Die Adhäsion der Yersinien an Epithelzellen des Darms erfordert unter anderem das Vorhandensein des Invasins Inv und des Adhäsins AiI (sog. "attachment invasion locus" der Y. enterocolitica), welche von allen enteropathogenen Yersinien exprimiert werden können.

Weitere bekannte chromosomal kodierte Pathogenitätsfaktoren sind z. B. das sezemierte und hitzestabile Enterotoxin Yst, das sog. "Mucoid Yersinia factor" MyfA von Y. enterocolitica, bzw. das homologe pH 6-Antigen PsaA von Y. pseudotuberculosis und Y. pestis, das auf der sogenannten Hochpathogenitätsinsel (HPI) kodierte Yersiniabactin- Siderophorsystem (FyuA-Rezeptor mit lrp1-9), der Ysa Type-Ill-Sekretionsapparat, das für alle gram-negativen Bakterien charakteristische Lipopolysaccharid LPS, das Enzym Urease und der auf Insekten wirkende Toxinkomplex TC (tcbA, tcaC, tccC).

Das MyF-Fibrillensystem besteht aus den drei Untereinheiten MyfA, MyfB und MyfC. Die Fibrille wird aus MyfA-Untereinheiten aufgebaut, während die MyfB- und MyfC den Transport- und Aufbauapparat bilden. Das ca. 17-kD-große MyfA-Oberflächenantigen wird in vitro während der frühen stationären Wachstumsphase exprimiert, und die volle Expression erfolgt nur bei 37 ⁰ C in saurem Milieu (pH 6). Das myfA-Gen ist in humanpathogenen Y. enterocolitca -Stämmen (z. B. 0:3, 0:4, 0:8; 0:9) und in ca. 16% der nicht-humanpathogenen Y. enterocolitica BV 1A -Stämmen vorhanden und zeigt einen signifikanten Zusammenhang mit der Virulenz. Leiva und Mitarbeiter zeigten in Koagglutination-Experimenten mit Seren aus Kaninchen, die mit lebenden Y. enterocolitica- oder Y. pseudotuberculosis-Stämmen intravenös immunisiert wurden, dass die erhaltenen Antiseren gegen MyfA (V. enterocolitica) bzw. PsaA (Y. pseudotuberculosis) eine bakteriologische Differenzierung zwischen Y. enterocolitica (MyfA)- und Y. pseudotuberculosis (PsaA)-Stämmen erlauben (Leiva et al., [1995] Contrib. Microbiol. Immunol., 13, 158-164). Diese Immunisierungsexperimente zeigen auch, dass MyfA bzw. PsaA unter Laborbedingungen, d.h. unter kontrollierten Nährstoffbedingungen (Wachstumsmedium) sowie Temperatur- und pH-Bedingungen, produziert werden und die Produktion der Serumantikörper in intravenös immunisierten Kaninchen induzieren. Eine serodiagnostische Anwendung beim Menschen wird jedoch nicht in Betracht gezogen. Insbesondere, da die natürliche Funktion der Antigene nicht bekannt ist, kann auch nicht ohne weiteres erwartet werden, dass das MyfA- bzw. PsaA-Antigen während einer natürlichen Infektion im menschlichen Darmtrakt von pathogenen Yersinien exprimiert werden. Zusätzlich ist zu beachten, dass tierexperimentelle Daten selten auf die diagnostische Situation am Menschen übertragbar sind, weil bekanntermaßen die Produktion von Antikörpern in Tieren sich von der im Menschen unterscheiden kann.

Der Psa-Antigenkomplex (pH6-Antigen) von enteropathogenen Y. pseudotuberculosis wurde ursprünglich im Pesterreger Y. pestis als fimbrilläre Struktur mit einem Durchmesser von 3-5 nm charakterisiert. Die PsaA-Untereinheiten werden auf der Bakterienoberfläche durch den Translokations- und Aufbauapparat, der aus PsaB und PsaC besteht, angeordnet. Die ca. 17-kD-große Antigendomäne PsaA zeigt ca. 44-47%- ige Aminosäuresequenzhomologie mit den Y. enteroco/tf/ca-homologen MyfA. Wie beim MyfA wird die Produktion von PsaA in Yersinien durch die Temperatur (37 ⁰ C) und den leicht sauren pH-Wert (pH 6) unter Laborbedingungen induziert. Die PsaA- Deletionmutantenstämme von Y. pestis zeigen eine signifikant reduzierte Virulenz in vitro und in vivo.

Die Beobachtungen, dass MyfA- und PsaA-Antigene unter Laborbedingungen nur bei 37 ⁰ C und in saurem pH exprimiert werden und, dass eine Immunantwort in Labormäusen und -kaninchen nach einer Infektion mit vorkultivierten (in vitro) Yersinienstämmen hervorgerufen werden kann, führt zur Vermutung, dass diese Proteine eine Funktion während einer Infektion haben könnten bzw. in dem sauren Milieu des Darmtraktes exprimiert werden könnten. Jedoch sind die genauen Funktionen von Myf und Psa bei einer Yersinieninfektion, und somit die Bedeutung dieser Antigene für die Yersinien- Pathogenese, weitergehend unbekannt.

Die klassische Diagnose der akuten Yersiniose-Erkrankungen stützt sich primär auf den Erregernachweis im Stuhl, z. B. mittels Kälteanreicherung, selektivem Nährboden (z. B. sog. cefsulodin-lrgasan™-novobiocin -Agamährboden [CIN-Agar]), biochemischen Eigenschaften (z. B. sog. API E20 -Test; bioMerieux, Paris, Frankreich) und den Nachweis von Erreger-spezifischer Nukleinsäuren (DNA) mittels Polymerase-Ketten- Reaktion (PCR, engl. "Polymerase chain reaction"). Der Keimnachweis im Stuhl kann über eine Zeitdauer von 2 bis 12 Wochen möglich sein. Nach Abklingen der Durchfallsymptomatik sind Yersinien im Stuhl typischerweise nicht mehr nachzuweisen. Die Serologie, d. h. der Nachweis der individuellen Serumantikörperantwort gegen Yersinien-spezifische O- und H-Antigene (sog. Widal- und passive Hämagglutinations- Tests), virulenzassoziierte Proteine (z. B. mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay [ELISA) - und Immunoblot -Teste) oder Bakterienultrasonikat (mittels Komplementbindungsreaktion [KBR]), ist nach geltenden Standards zur ergänzenden Diagnostik der akuten Infektion geeignet.

Jedoch ist die Serodiagnostik für die Aufklärung von Folgeerkrankungen, wie z. B. der reaktiven Arthritis, essentiell, weil der direkte Erregernachweis meistens nach Abklingen der akuten Infektion nicht möglich ist. Dir vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Diagnostik mit deren Hilfe zwischen einer Infektion mit Yersinia enterocolitica von einer Infektion mit Yersinia pseudotuberculosis serologisch unterschieden werden kann.

Bei einer akuten Yersinien-Infektion sind typischerweise die Yersinia-spezifische Immunoglobulin (Ig) -Klassen IgM-, IgA- und meist auch IgG nachweisbar. Im Verlauf der Infektion schwächt sich die spezifische IgM- und IgA -Antwort innerhalb von 3-6 Monaten ab (Persistenz von IgM: ca. 1-3 Monate und IgA: ca. 2-4 Monate), während Yersinien- spezifische IgG-Antikörper mehrere Jahre, eventuell auch lebenslang persistieren können (bei 80% der Patienten nach einer Yersinien-Infektion). Bei der chronischen Yersinien- Infektion und der Yersinien-induzierten reaktiven Arthritis können über Jahre, neben Yersinia-spezifischen Antikörper der IgG-Klasse auch persistierende IgA-Antikörper nachgewiesen werden. Die Yersinien-spezifischen Antikörper der IgM-Klasse sind bei Folgeerkrankungen meistens nicht mehr nachweisbar.

Die herkömmlichen serologischen Nachweismethoden, wie die gegen Ganzzellsysate gerichtete Widal- und Komplementbindungsreaktion, besitzen aufgrund der Kreuzreaktivität mit einer Vielzahl von humanen Krankheitserregern (wie z. B. Bartonella henselae, Borrelia burgdorferi, Chlamydia pneumoniae, Rickettsia rickettsii, Escherichia coli, Brucella spp., Salmonella spp.) nur eine geringe diagnostische Sensitivität und Spezifität. Daher werden heute Enzymimmunoassays (ELISA) und Immunoblots zum Nachweis von IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern gegen rekombinant hergestellte virulenzassoziierte Yersinien-spezifische Antigene (z. B. Yops und V-AG) bevorzugt. Die gegenwärtige Yersinien-Serodiagnostik basiert hauptsächlich auf der Nachweisreaktion der IgG- und IgA- (bedingt auch IgM-) Antwort gegen Virulenzplasmid pYV sezemierte Yop-Proteine, wie z. B. YopD, YopH, YopM, YopE, V-AG und YopN. Die Spezifität und Sensitivität dieser Yop-Antigene ist jedoch verbesserungswürdig und wird erfindungsgemäß durch zusätzliche Yersinien-spezifische Antigene ergänzt.

Zusätzlich bedingt durch die Ähnlichkeit der Ätiologie und des Infektionsvorgangs, einen subklinischen Infektionsverlauf bzw. eine unspezifische Symptomatik sowie eine hohe Durchseuchungsrate, ist die Unterscheidung zwischen Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis -Infektionen bzw. durch diese Erreger hergerufene Folgeerkrankungen (wie z. B. ReA bzw. postenteritische Arthritiden, Myokarditis, Glomerulonephritis, Lymphadenopathien, Splenomegalien, Erytheme nodosum) mit den herkömmlichen diagnostischen Testverfahren schwierig. Ein spezifisches serologisches Nachweisverfahren (d. h. insbesondere Differenzierung zwischen den häufigsten humanpathogenen Yersinien-Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis) ist jedoch erforderlich, um eine frühzeitige und effektive Behandlung der Yersiniosen bzw. eine Vorbeugung der Folgeerkrankungen gewährleisten zu können (d. h. adäquate Antibiotikatherapie). Hier können die unterschiedlichen Proteine von Y. enterocolitica (MyfA) und Y. pseudotuberculosis (PsaA) einen Beitrag leisten.

Heesemann et al. (Microbial Pathogenesis [1988], S. 437-447) beschreiben die Immunantwort von oral infizierten Kaninchen auf virulente (pYV-Plasmid) und avirulente (kein pYV-Plasmid) Serotyp O:3-Stämme von Yersinia enterocolitica, die über Nacht in neutralem Wachstumsmedium (BHI) vorkultiviert wurden. Es ist unwahrscheinlich, dass das MyfA-Antigen unter diesen Bedingungen exprimiert wurde aufgrund neutralen pHs und der Wachstumsphase. Zusätzlich ist das Vorhandensein des PsaA-Antigens ausgeschlossen (Die Autoren setzten nur Y.enferoco/tf/ca-Stämme ein.). Die Antigene wurden mit SDS-Elektrophorese aufgetrennt und im Western Blot weiter untersucht. Eine weitergehende Reinigung erfolgte nicht. Weiterhin stellten die Autoren fest, dass dieses Verfahren aufgrund hoher Kreuzreaktivität mit darmpathogenen Escherichia coli und Sa/moA7e//a-Stämmen als solches für diagnostische Zwecke eher ungeeignet ist. Tomaso et al. (European Journal of Epidemiology [2006], 21: 77-81) und Stolck-Engelaar et al. (Scand.J.Infect.Dis. [1996], S. 571-575) beschreiben die Seroprevalenz von Anti- Yersina-Antikörpern in gesunden Österreichern bzw. an Yersinose erkrankten Niederländern. Die Bestimmung erfolgt mittels eines kommerziellen Western Blot-Tests mit den Antigenen Yop M, Yop H, V-Ag, Yop D und Yop E. Die Antigene MyfA oder PsaA werden nicht verwendet.

Das einzige bis jetzt vorgeschlagene Verfahren basierend auf den MyfA- und PsaA- Antigenen wurde von Leiva et al., 1995, beschrieben. Dabei handelte es sich aber um eine bakteriologische Nachweismethode zur Identifizierung von pathogenen Yersinien- Stämmen nach Anzucht der Zellen auf einem Agamährboden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung im weiteren Sinne zur serologischen Unterscheidung einer Infektion mit Yersinia enterocolitica von einer Infektion mit Yersinia pseudotuberculosis. Eine "serologische Unterscheidung" im Sinne der vorliegenden Anmeldung bedeutet, dass anhand einer aus Blut (Serum, Plasma) gewonnenen Probe mit Hilfe eines immunologischen Tests bestimmt werden kann, ob es sich um eine Infektion handelt, die durch einen Stamm von Yersinia enterocolitica oder Yersinia pseudotuberculosis hervorgerufen wurde. Eine derartige Vorrichtung enthält wenigstens ein Antigen ausgewählt aus einer Gruppe von Antigenen, die den äußeren Oberflächenproteinen oder sezernierten Proteinen von Yersinia zugerechnet werden können. In der Vorrichtung muss wenigstens eines dieser Antigene eingesetzt werden, wobei es nicht zwangsläufig erforderlich ist, dass das komplette Protein eingesetzt wird, sondern es kann durchaus genügen, Proteinfragmente einzusetzen, die ein diagnostisch relevantes Epitop aufweisen.

Erfindungsgemäß werden die Antigene in im wesentlichen reiner Form eingesetzt, dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass die Antigene rekombinant hergestellt und nicht aus Zelllysat isoliert werden.

Ausreichend ist ein Fragment eines der nachfolgend aufgezählten Antigene, das mindestens acht aufeinanderfolgende Aminosäuren, bevorzugt mindestens 12, noch bevorzugter mindestens 20, weiter bevorzugt wenigstens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide 10 bis 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren auf. Jedes Peptid/Fragment weist wenigstens ein diagnostisch relevantes Epitop auf.

Bei der Auswahl der Fragmente wird ein solcher Bereich ausgewählt, der wenigstens ein diagnostisch relevantes Epitop enthält. Die Lokalisierung der Epitop-Bereiche kann durch dem Fachmann bekannte Standardmethoden erfolgen. Es ist möglich, die Hydrophilizität/Hydrophobizität des Proteins mit geeigneten Computerprogrammen zu bestimmen. Hydrophile Bereiche sind in der Regel dazu prädestiniert geeignete Epitope zu tragen, da die hydrophilen Bereiche im gefalteten Protein an der Oberfläche zu liegen kommen. Hydrophobe Bereiche werden eher im Inneren des gefalteten Proteins lokalisiert sein und sind daher an diagnostisch relevanten Epitopen eher nicht beteiligt. Bei den Epitopen handelt es sich bevorzugt um lineare Epitope, Konformationsepitope können jedoch auch vorteilhafterweise eingesetzt werden.

Wenn geeignete Bereiche identifiziert wurden, können diese entweder durch chemische Synthese synthetisiert werden oder rekombinant hergestellt werden. Diese Proteine oder Peptide können dann mit geeigneten Blut-, Serum- oder Plasmaproben, deren Ätiologie mit anderen, medizinischen Parametern bestimmte wurde, umgesetzt werden. Auf diese Art und Weise kann der Fachmann geeignete Epitope lokalisieren.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthalten also wenigstens ein Antigen bzw. ein Fragment eines dieser Antigene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, die nachfolgend aufgezählt sind. Es handelt sich hierbei um folgende Antigene:

YopD (Seq ID No. 1)

MTINIKTDSPIITTGSQIDAITTETVGQSGEVKKTEDTRHEAQAIKSSEASLSRSQV PELIKP SQGINVALLSKSQGDLNGTLSILLLLLELARKAREMGLQQRDIENKAAITAQKEQVAEMV S GAKLMIAMAWSGIMAATSTVASAFSIAKEVKIVKQEQILNSNIAGRDQLIDTKLQQMSNT S DKAVSREDIGRIWKPEQVADQNKLALLDKEFRMTDSKANAFNAATQPLGQMANSAIQVH RGYSQAEVKEKEVNASIAANEKQKAEEAMNYNDNFMKDVLRLIEQYVSSHTHAMKAAFG

W. YopH (Seq ID No. 2)

MNLSLSDLHRQVSRLVQQESGDCTGKLRGNVAANKETTFQGLTIASGARESEKVFAQ TV

LSHVANIVLTQEDTAKLLQSTVKHNLNNYELRSVGNGNSVLVSLRSDQMTLQDAKVL LEA

ALRQESGARGHVSSHSHSVLHAPGTPVREGLRSHLDPRTPPLPPRERPHTSGHHGAG E

ARATAPSTVSPYGPEARAELSSRLTTLRNTLAPATNDPRYLQACGGEKLNRFRDIQC CRQ

TAVRADLNANYIQVGNTRTIACQYPLQSQLESHFRMLAENRTPVLAVLASSSEIANQ RFG

MPDYFRQSGTYGSITVESKMTQQVGLGDGIMADMYTLTIREAGQKTISVPWHVGNWP D

QTAVSSEVTKALASLVDQTAETKRNMYESKGSSAVADDSKLRPVIHCRAGVGRTAQL IGA

MCMNDSRNSQLSVEDMVSQMRVQRNGIMVQKDEQLDVLIKLAEGQGRPLLNS.

YopN (Seq ID No. 3)

MTTLHNISYGNTTLRNEHPETASSQIVNQTLGQFRGESVQIVSGTLQSIADMAEEVT FVFS

ERKELSLDKRKLSDSQARVSDVEEQVNQYLSKVPELEQKQNVSELLSLLSNSPNISL SQL

KAYLEGKSEEPSEQFKMLCGLRDALKGRPELAHLSHLVEQALVSMAEEQGEAIVLGA RIT

PEAYRESQSSVNPLQPLRDTYRDAVMGYQGIYAIWSDLQKRFPNGDIDSVILFLQKA LSA

DLQSQQSGSGREKLGIVISDLQKLKEFGSVSDQVKGFWQFFSEGKTNGVRPF.

YopE (Seq ID No. 4)

MPKISSFISTSLPLPTSVSGSSSVGEMSGRSVSQQKSEQYANNLAGRTESPQGSSLA SRI TEKLSSMARSAIEFIKRMFSEGSHKPWTPAPTPAQMPSPTSFSDSIKQLAAETLPKYIQQ L SSLDAETLQKNHDQFATGSGPLRGSITQCQGLMQFCGGELQAEASAILNTPVCGIPFSQ WGTIGGAASAYVASGVDLTQAANELKGLAQQMHQLLSLM.

YopM (Seq ID No. 5)

MFINPRNVSNTFLQEPLRHSSDLTEIPVEAENVKSKTEYYNAWSEWERNAPPGNGEQ RE

MAVSRLRDCLDRQAHELELNNLGLSSLPELPPHLERLVASCNSLTELPELPQSLKSL EVYE

NNLKALPDLPPLLVDLRVFNNQLEELPELQNLPFLTEIYANNNSLKTLPDLPPSLVD LNVRE

NYLTALPELPQSLIFLDISDNILSGLSELPPNLSCLDASRNGIRSLCDLPPSLVYLD VRDNQL

IELPALPSGLERLIASFNHLAELPELPPNLYYLDASRNEISSLCDLPPSLVDLNVRK NQLIEL

PALPPDLERLIASFNHLAELPELPPNLSYLDASRNEISSLCDLPPSLVDLNVRKNQL IELPAL

PPDLERLIASFNHLAELPELPPNLSYLDASRNEISSLCDLPPSLVELDVRDNQLIEL PALPPH

LERLIASLNHLAEVPELPQNLKQLHVEHNALREFPDIPESVEDLRMDSERVIDPYEF AHETI

DKLEDDVFE.

V- AG (auch LCRV genannt) (Seq ID No. 6)

MIRAYEQNPQHFIEDLEKVRVEQLTGHGSSVLEELVQLVKDKKIDISIKYDPKKDSE VFAER

VITDDIELLKKILAYFLPEDAILKGGHYDNQLQNGIKRVKEFLESSPNTQWELRAFM AVMHF

SLTADRIDDDILKVIVDSMNHHGDARSKLREELAELTAELKIYSVIQAEINKHLSSS GTINIHE

KSINLMDKNLYGYTDEEIFKASAEYKILKKMPQTTIKDDELHEVGVIAGAEKQIVSI KNFLES

ENKRTGALGNLKDSYSYNKDNNELSHFATACSDKSRPLNDLVSQKTTQLSDITSRFN SAI

EALNRFIQKYDSVMQRLLDDTR.

Zusätzlich zu dem Antigen aus der ersten Gruppe von Antigenen weist die erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin wenigstens eines von zwei weiteren Proteinen, nämlich entweder das Protein MyfA und/oder das Protein PsaA oder Fragmente eines dieser beiden Proteine auf. Auch hier weisen die Fragmente eine Mindestgröße von wenigstens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt wenigstens 12 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, noch bevorzugter wenigstens 20, besonders bevorzugt wenigstens 30 und ganz besonders bevorzugt wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines der Proteine MyfA und/oder PsaA auf.

Es ist bevorzugt, dass die Vorrichtung die beiden vollständigen Proteine MyfA und PsaA oder Fragmente davon zusammen aufweist, wobei die einzelnen Antigene räumlich voneinander getrennt sind. Die Aminosäuresequenzen der beiden Proteine MyfA und PsaA (ohne Leader-Sequenz) sind nachfolgend wiedergegeben.

MyfA (132-AA) (Seq ID No. 7)

MEPTVINSKDISATKTVKEGGSFSVEFKATENEIVSGKLDADTPAFHLVMSDSGEHK GWNV

RPTGASEGGQMVSADGTRVDLHTNELSWDNDHWWIDDGSERVEATFFLAAGDEVKAG E

YQFTGRVEEYVE.

PsaA (134-AA) (Seq ID No. 8)

MSTVINSKDVSGEVTVKQGNTFHVDFAPNTGEIFAGKQPGDVTMFTLTMGDTAPHGG W

RLIPTGDSKGGYMISADGDYVGLYSYMMSWVGIDNNWYINDDSPKDIKDHLYVKAGT VLK

PTTYKFTGRVEEYVF.

Die Proteine MyfA bzw. PsaA werden durch die nachfolgend wiedergegebenen Nucleotidsequenzen myfA bzw. psaA codiert und können unter Verwendung geeigneter Vektoren und Wirtszellen rekombinant hergestellt werden.

myfA (Seq ID No. 9)

atggaaccgactgttattaatagtaaagacatctctgcaacaaaaactgttaaagag ggaggttcgttctcagttgaattcaag gccactgaaaacgagattgtgtcaggcaaattggatgcagatacacctgccttccatctg gtaatgtcggactcaggggaac ataaaggttggaatgttcggcctaccggtgcatctgagggaggacagatggtttctgcag atggtaccagagttgacttacat acaaatgagctatcgtgggataacgaccactggtggatagatgacggttctgagcgtgtg gaagcgactttctttcttgctgctg gcgacgaggttaaagcaggtgaatatcagttcactgggcgtgttgaggaatatgtcgagt aa psaA (Seq ID No. 10)

atgtctactgtcattaactccaaggatgtttctggtgaggtgactgtcaagcaggga aacacattccacgtcgattttgcgccta acacaggagagatttttgcgggtaaacagccgggtgatgtcactatgtttacgctaacta tgggtgatactgcaccacacggt ggttggcgtttgattccaacaggggactcaaaaggtggatatatgatcagcgccgatggt gactatgttggtttatacagttatat gatgtcatgggtaggtatagataataactggtatataaatgatgactctcctaaagatat aaaagatcatctgtacgttaaggca gggactgtccttaaaccaacgacttataaattcacggggcgtgttgaagagtatgtattt taa

Die einzelnen Antigene werden erfindungsgemäß räumlich getrennt voneinander in der Testvorrichtung bzw. dem Testkit angeordnet. Bei Western Blots beispielsweise können die Antigene in Bandenform auf das Trägermaterial aufgebracht werden, wobei die einzelnen Antigene jeweils in einer bestimmten, wohldefinierten Bande vorhanden sind. Diese räumliche Trennung der einzelnen Antigene kann ebenso erreicht werden, wenn die Antigene in einem Line-Assay räumlich getrennt voneinander aufgebracht werden. Es ist aber auch möglich, die einzelnen Antigene auf einer Mikrotiterplatte so aufzubringen, dass in jeder Vertiefung nur ein Antigen vorhanden ist. In einer alternativen Ausführungsform wird jeweils ein Antigen auf einem Typ von Trägern (beispielsweise Kugeln) aufgebracht, so dass auf jeden Träger nur ein Antigen gebunden ist. Alternativ hierzu können die Antigene auf Testplatten (Microchips) aufgebracht werden, wobei auf derartigen Chips die einzelnen Antigene an bestimmten Punkten fixiert sind.

Erfindungsgemäß wird zunächst durch Reaktion mit wenigstens einem, oder auch mehreren Antigenen ausgewählt aus der Gruppe Yop D, Yop H, Yop M, Yop E, V-AG und/oder Yop N bestimmt, ob es sich um eine Yersinien-Infektion handelt. Wenn dieser Test positiv ausgefallen ist, wird mit Hilfe des Antigens MyfA und/oder PsaA bestimmt, ob es sich bei dem Infektionsverursacher um Yersinia enterocolitica bzw. Y.pseudotuberculosis handelt. Die einzelnen Nachweisschritte können entweder gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden.

Bei einer Vorrichtung zum serologischen Nachweis einer Infektion von Yers/wa-Species handelt es sich erfindungsgemäß in bevorzugter Ausführungsform um einen diagnostischen Kit. Darunter versteht man eine Vorrichtung, die von diagnostisch tätigen Labors zur serologischen Diagnose eingesetzt werden. In bevorzugter Ausführungsform werden die Antigene räumlich voneinander getrennt auf eine Trägermatrix, wie z.B. Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, Kugeln, Nitrocellulose oder Nylon, gebunden. Die in eine Patientenprobe (z.B. Blut, Serum, Plasma, Saliva) vorhandenen Antikörper (vor allem der Klassen IgG, IgM und IgA) reagieren mit den gebundenen Antigenen und werden dabei immobilsiert. In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich hierbei um diagnostische Kits, wobei ELISA-Tests eine bevorzugte Ausführungsform darstellen. Bei den ELISA-Testkits wird üblicherweise das Antigen an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gebunden. Die in den Proben vorhandenen spezifischen Antikörper können mit den Antigenen reagieren. Die Antikörper aus dem Serum oder Plasma, die an die in den Vertiefungen befindlichen Antigene spezifisch gebunden haben, werden in der Regel mit Anti-Antikörpern, die eine Markierung, vorzugsweise eine Enzym-Markierung, tragen, nachgewiesen.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind sogenannte Line-Tests. Hierbei werden mehrere Antigene nach einem vorbestimmten Muster auf die Teststreifen aufgebracht. Die zu untersuchenden Blutproben (Seren oder Plasmen) werden mit den Teststreifen umgesetzt und Antigen-Antikörper Reaktionen werden durch Enzym-markierten Antikörper und anschließende Färbereaktion nachgewiesen. Aus dem spezifischen Muster der Reaktivitäten bzw. Farbsignale kann auf die Infektion bzw. Infektionsverursacher geschlossen werden.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann es sich auch um einen Immunoblot bzw. Western Blot handeln. Hierbei werden die diagnostisch relevanten Proteine zunächst der Größe nach beispielsweise durch Diffusion, Kapillarwirkung oder Elektrophorese aufgetrennt und auf ein Trägermaterial, beispielsweise eine Nylonmembran oder eine Nitrocellulosemembran übertragen und dort fixiert. Dieses Trägermaterial mit den daran gebundenen Proteinen bzw. Proteinfragmenten wird mit Blutproben (Serum oder Plasma) von Patienten umgesetzt.

Die immobilisierten spezifischen Antikörper können beispielsweise durch Reaktion mit einem Anti-Antikörper nachgewiesen. Es können bevorzugt verschiedene Anti-Antikörper eingesetzt werden, die entweder mit IgG, IgM oder IgA reagieren. Dadurch wird eine weitere Differenzierung der Immunantwort ermöglicht. Diese Anti-Antikörper tragen in der Regel eine Markierung. Hierbei kann es sich um ein Enzym handeln, das eine Farbreaktion katalysiert, es kann sich aber auch um fluoreszierende Reste oder radioaktive Reste handeln. Wichtig ist, dass mit den Anti-Antikörpern an Antigen gebundene Antikörper nachgewiesen werden können. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung um einen auf Kügelchen basierenden Test (sog. Bead-Based-Assay). Eine bekannte kommerzielle Anwendungsform von diesen sphärischen Mikroarrays stellt die Luminex-XMAB-Technologie von Luminex Corporation (Austin, USA) dar. Bei diesem System werden Mikrokugeln (sog. Beads) eingesetzt und mit Hilfe der Flow-Cytometrie ausgewertet. Bei Fluoreszenz-markierten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Antigene auf Kugeln fixiert werden und die Bindung der Antikörper an die Antigene wird durch geeignete Markierungen, z.B. Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Protein-Mikroarrays. Hierbei werden verschiedene Antigene auf engem Raum an eine Oberfläche fixiert. Da bekannt ist, welches Antigen an welcher Stelle vorhanden ist, kann nach Sichtbarmachung der Antigen-Antikörperreaktion beispielsweise mit Hilfe einer Farbreaktion oder Fluoreszenz-Markierung auch eine Aussage getroffen werden, welches Antigen mit den Antikörpern in dem Serum reagiert hat.

Üblicherweise werden die einzelnen Antigene so in der Vorrichtung fixiert, dass nach der Reaktion unterscheidbar festgestellt werden kann, mit welchem Antigen die in der Probe vorhandenen Antikörper reagiert haben. Bei einem ELISA-Test werden beispielsweise die einzelnen Antigene in verschiedene Kavitäten der Mikrotiterplatte eingebracht. Beim Line- Assay werden die Antigene auf verschiedene Streifen des Trägermaterials aufgesprüht und bei den sphärischen und planaren Mikroarrays werden die jeweiligen Antigene immer an definierter Stelle auf den Träger bzw. definierten Beads aufgebracht. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen dienen dem Nachweis von humanpathogenen Vers/n/a-Species bzw. Subspecies. Durch die Kombination von verschiedenen Antigenen ist es einerseits möglich, einen sensitiven und spezifischen Nachweis der Erreger zu führen und andererseits ist in bevorzugter Ausführungsform auch ein differentialdiagnositischer Nachweis möglich, wobei zwischen einer Infektion verursacht durch Yersinia enterocolitica unterscheiden werden kann von einer Infektion mit Yersinia pseudotuberculosis.

Ein anderer wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch, dass ein serologischer Nachweis bzw. eine serologische Differenzierung dann möglich ist, wenn die akute Yersinieninfektion bereits abgeklungen ist. Für die Therapie von derartigen Folgeerkrankungen ist es wesentlich, dass unterscheiden werden kann, durch welches Bakterium (Yersinia enterocolitica oder Yersinia pseudotuberculosis) die ursprüngliche Infektion verursacht wurde.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist also wenigstens zwei verschiedene Antigene auf, wobei das eine Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den oben näher dargestellten Antigenen YopD, YopH, YopM, YopE, V-AG und YopN. Die andere Gruppe umfasst die Antigene MyfA und PsaA.

In besonders bevorzugter Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung das Antigen YopD sowie das Antigen YopH zusammen mit entweder MyfA oder PsaA.

In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die erfindungsgemäße Vorrichtung die Antigene YopD, YopH, YopM und entweder MyfA oder PsaA, wobei aber der kombinierte Einsatz von MyfA und PsaA ganz besonders bevorzugt ist.

In besonders bevorzugter Ausführungsform weist also die erfindungsgemäße Vorrichtung die Proteine MyfA und/oder PsaA oder Fragmente hiervon, wie vorstehend definiert, zusammen auf mit dem folgenden Protein bzw. Proteinkombinationen, wobei diese Proteine auch in Form von Fragmenten, wie vorstehend definiert vorliegen können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist wenigstens das Protein YopD auf, das bevorzugt zusammen mit YopH und noch bevorzugter zusammen mit YopM kombiniert mit MyfA und/oder PsaA eingesetzt wird.

Eine weiter bevorzugte Ausführungsform beinhaltet die Proteine oder Fragmente von YopD, YopH, YopM und YopE zusammen mit MyfA und/oder PsaA.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform beinhaltet die Proteine und/oder Fragmente von YopD, YopH, YopM, YopE, V-AG zusammen mit MyfA und/oder PsaA.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform beinhaltet eine Kombination von Proteinen und/oder Fragmenten der folgenden Bezeichnungen: YopD, YopH, YopM, YopE, V-AG, YopN, sowie MyfA und/oder PsaA. Die genannten Antigene können auch in Form von Fragmenten davon eingesetzt werden, wobei die Fragmente ein serologisch relevantes Epitop aufweisen. Wenn erfindungsgemäß Fragmente der Antigene eingesetzt werden, ist bei dem Antigen MyfA einerseits das N-terminale Fragment mit den Aminosäuren 30-41 und andererseits das C- terminale Fragment mit den Aminosäuren 148-159 besonders bevorzugt. In dem PsaA Protein sind die Fragmente besonders bevorzugt, die die Aminosäuren 27-37 (N- Terminus) sowie 144-155 (C-Terminus) beinhalten. In diesem Fall werden Fragmente eingesetzt, die diese Aminosäuresequenz beinhalten und die oben näher definierten Größen aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also die Verwendung eines antigenen Proteins MyfA oder eines Fragments hiervon, wie oben näher definiert, entweder allein oder zusammen mit dem antigenen Protein PsaA oder einem Fragment hiervon, wie oben definiert, zum serologischen Nachweis einer durch Yersinia verursachten Infektion bzw. einer Infektion verursacht durch Y.enterocolitica oder Y.pseudotuberculosis. Diese Unterscheidung hat klinische Relevanz, weil eine Infektion, verursacht durch Yersinia enterocolitica, anders behandelt werden kann, als eine Infektion hervorgerufen durch Yersinia pseudotuberculosis.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Yersinien nachgewiesen werden, die eine erhebliche Bedeutung haben, da sie humanpathogen sind. Die Yersinien kommen in Nutztieren, wie z.B. Schweinen und Geflügel, vor und können bei einer Infektion eine Erkrankung am Menschen hervorrufen. Es kann daher eine erhebliche medizinische und epidemiologische Bedeutung haben, mit Hilfe eines einfachen und verhältnismäßig kostengünstigen Testkits nachzuweisen, wie die Infektionsketten verlaufen sind. Dadurch sind Rückschlüsse auf die Quellen der Krankheitserreger möglich und diese können identifiziert und gegebenenfalls unschädlich gemacht werden. Es ist also möglich, die Erreger von Yersiniosen nachzuweisen und zu unterscheiden.

Die Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Nachweis erzielt werden können, sind überraschend, weil nicht ohne weiteres angenommen werden konnte, dass die Antigene MyfA und/oder PsaA auch in einem menschlichen Organismus unter realen Infektionsbedingungen in einer zur Antikörperbildung ausreichende Mengen exprimiert werden. Weiterhin war es nicht bekannt, dass spezifische Antikörper der IgG-, IgM- und IgA-Klasse gegen MyfA- und PsaA-Antigene im Menschen gebildet werden. Aufgrund der relativ hohen Proteinhomologie (44 %) zwischen MyfA- und PsaA-Antigenen und der bereits beschriebenen Interspezieshomologie bzw. Interspezieskreuzreaktivität zwischen nicht pathogenen Yersinienstämmen und anderen Enterobakterien, wie z.B. E. coli und Salmonella-Spezies, konnte nicht erwartet werden, dass das MyfA bzw. das PsaA-Antigen zur Differenzierung des Infektionsverursachers verwendet werden kann. Der Nachweis bzw. die Differenzierung wird bevorzugt mit menschlichem Blut, insbesondere Serum oder Plasma durchgeführt. Die Bestimmung ist aber auch mit Liquor oder Saliva möglich.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird die zu untersuchende Probe einerseits mit einem Antigen ausgewählt aus der Gruppe Yop D, Yop H, Yop M, Yop E, V- AG und Yop-N, ganz besonders bevorzugt mit Yop D, umgesetzt. Wenn hier keine positive Reaktion erfolgt und auch sonst kein spezieller weiterführender Verdacht besteht, kann die Diagnostik hiermit abgeschlossen werden.

Wenn die zu untersuchende Probe dagegen mit diesem Antigen, insbesondere Yop D, positiv reagiert, kann in einem weiteren diagnostischen Schritt die zu untersuchende Probe mit dem Antigen PsaA und/oder MyfA, bevorzugt mit beiden Antigenen umgesetzt werden. Weiterhin hilfreich ist eine Differenzierung der aufgefundenen Antikörper dahingehend, ob es sich um IgG- oder um IgA-Antikörper handelt. Wenn der IgM- oder IgA-Befund negativ, der IgG-Befund aber positiv ist, liegt vermutlich eine abgelaufene Infektion vor.

Wenn der IgM- oder IgA-Befund, bevorzugt IgA-Befund, positiv ist, kann eine akute Infektion oder eine Folgeerkrankung vorliegen. Die Infektion wird hervorgerufen durch Yersinia enterocolitica, wenn die IgG-, IgM- oder IgA-Reaktion, bevorzugt IgG-Befund, mit MyfA positiv ist. Wenn eine positive Reaktion mit PsaA vorliegt, handelt es sich um eine Infektion mit Yersinia pseudotuberculosis.

Die Figuren verdeutlichen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und erläutern die in den Beispielen erhaltenen Ergebnisse.

Figur 1 zeigt die homologen Aminosäuresequenzbereiche der MyfA- und PsaA-Antigene. Die homologen Bereiche (Konsensus) sind schwarz markiert. Die N- und C-terminalen homologen Bereiche sind umrandet. Figur 2 erläutert die In s///co-Bestimmung der antigenen Domänen von MyfA und PsaA. Der Antigenitätsindex wurde anhand des Jameson-Wolf -Algorithmus und die Hydrophilizität des Antigens anhand des Kyte-Doolittle -Algorithmus berechnet. Die sog. Leader-Sequenz ist mit einem schwarzen Pfeil markiert.

Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der DNA-Sequenzen der vier verwendeten His-Tag-MyfA-Fusionsproteine. Die zur Amplifikation verwendeten Primersequenzen sind mit Pfeilen (I, II, III, IV) markiert. Die Leader-Sequenzen sind hellgrau und die mit PsaA- homologen Bereichen weiß dargestellt.

Figur 4 zeigt die chromatographische Trennung (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) der MyfA-Teilfragmente myfA 1-441 , myfA 121-441 und myfA 121-447 (Fig. 3) mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung (links) und Immunoblot (myfA, myfA 1-441, myfA 121-441 und myfA 121-447; Fig. 3) mit Anti-Y. enterocolitica (0:3 bzw. 0:9)- und Anti-MyfA -Seren aus Kaninchen (rechts).

Figur 5 zeigt die Überprüfung der serologischen Reaktivität des aufgereinigten MyfA- Gesamtproteins (MyfA) und der aufgereinigten MyfA -Teilfragmente MyfA 1-441 , MyfA 121-441 und MyfA 121-447 (Fig. 1 ; Fig. 3) mittels Line-Assays. Die Teststreifen wurden mit vier verschiedenen Anti-V. enterocolitica 0:3, 0:8 bzw. 0:9 -Seren aus Kaninchen (1- 4) vor (*) und nach der Infektion inkubiert.

Figur 6 zeigt die Serologische Reaktivität der humanen Anti-Y. enterocolitica- bzw. Anti-Y. pseudotuberculosis -Serum mit YopM, YopH, V-AG, YopD, YopN, YopE, MyfA und PsaA im Line-Assay.

Figur 7 stellt die IgG-Antwort gegen Yop-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK-Antigene unter den getesteten bayerischen Blutspenderseren (n=40) dar.

Figur 8 erläutert die IgG-Antwort gegen Yop-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK-Antigene unter den getesteten Yersiniose-Patientenseren aus Finnland (n=18). Figur 9 zeigt die IgG-Antwort gegen Yop-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK-Antigene unter den getesteten Yersiniose-Patientenseren aus Deutschland (n=23). Unter dem Oberflächenprotein ist YopD für den Einsatz in diagnostischen Testvorrichtungen besonders geeignet.

Beispiel 1

In silico Bestimmung der immunogenen Domänen der MyfA- und PsaA-Antigene

Die Bestimmung der homologen Antigenbereiche, die für die immunogene Reaktivität bzw. Kreuzreaktivität der MyfA- und PsaA- Antigene verantwortlich sein könnten, erfolgte in silico mittels direkten Aminosäuresequenzvergleichs (siehe Figur 1). Die homologen Bereiche befinden sich hauptsächlich im N- und C-Terminus des MyfA- (AA 32-40 und 150-159) und PsaA- (AA 29-38 und 149-158) Antigens.

Der Antigenitätsindex und der hydrophile Charakter der Antigenregionen wurde in silico anhand der Algorithmen von Jameson und Wolf (Comput. Appl. Biosci. (1988) S. 181-186) bzw. von Kyte und Doolittle (Kyte and Doolittle, (1982) J. Mol. Biol., 157, S. 105-132) bestimmt (Fig. 2). Die acht > 5 AA immunogenen Domänen des PsaA-Antigens befinden sich voraussichtlich in AA 30-48, 52-56, 59-67, 74-83, 87-96, 122-133, 144-150 und 151- 158. Die sieben putativen > 5 AA immunogenen Domänen des MyfA-Antigens wurden in AA 35-42, 43-54, 55-73, 79-100, 101-133, 139-148 und 152-159 lokalisiert. Diese Fragmente werden erfindungsgemäß bevorzugt in den diagnostischen Tests eingesetzt. Da jedoch der prädikative Kyte-Doolittle-Algorithmus nur bedingt aussagekräftig ist, wurden die immunogenen Epitope der neuen Antigene experimentell bestimmt (Beispiel 2).

Vollständige Gesamtprotein-Sequenzen:

MyfA (159-AA) (Seq ID No. 11)

AA 1-29: Leader-Sequenz

AA 30-41 : N-terminales Fragment (Beispiel 2)

AA 148-159: C-terminales Fragment (Beispiel 2) MNMKKFVKKPLAIAVLMLASGGMVNMVHAEPTVINSKDISATKTVKEGGSFSVEFKATEN

EIVSGKLDADTPAFHLVMSDSGEHKGWNVRPTGASEGGQMVSADGTRVDLHTNELSW D

NDHWWIDDGSERVEATFFLAAGDEVKAGEYQFTGRVEEYVE

PsaA (158-AA) (Seq ID No. 12)

AA 1-26: Leader-Sequenz

MKMKCFAKNALAVTTLMIAACGMANASTVINSKDVSGEVTVKQGNTFHVDFAPNTGE IFA

GKQPGDVTMFTLTMGDTAPHGGWRLIPTGDSKGGYMISADGDYVGLYSYMMSWVGID N

NWYINDDSPKDIKDHLYVKAGTVLKPTTYKFTGRVEEYVF

Beispiel 2

Experimentelle Bestimmung der immunogenen Domänen der MyfA-Antigene

Herstellung der MyfA-Teilfragmente

Ausgehend vom vollständigen Leserahmen des MyfA-Antigens (Beispiel 1) wurden vier Fragmente hergestellt. Dabei wurden sowohl der gesamte Leserahmen einschließlich des Leader-Peptids als auch N-, C-, und N- und C-terminal verkürzte Teilfragmente dargestellt (Fig. 1 ; Fig. 3).

Die spezifische Amplifikation der myΛA-Teilfragmente erfolgte mittels PCR mit chromosomaler DNA aus Y. enterocolitica Serotyp 0:3/4 (Y. enterocolitica subsp. palearctica Stamm Y- 11 ; DMSZ 13030) als Template.

Die resultierenden Amplifikate wurden mittels Restriktionsendonukleasen enzymatisch gespalten und in einen geeigneten Vektor, pET21-b, der mit denselben Restriktionsendonukleasen wie die Amplifikate geschnitten wurde, ligiert. Nach der Transformation des Ligationsansatzes in einen geeigneten E. co//-Stamm, z. B. BL21 pLys, wurden einzelne Klone auf das Vorhandensein von myfA und psaA mittels Agarose- Gelelektrophorese enzymatisch gespaltener Plasmid-DNA getestet und anschließend sequenziert. Des Weiteren wurde die Expression der Teilfragmente durch Analyse der Expressionsprodukte mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung bzw. anschließendem Transfer auf Nitrozellulose gefolgt von einer immunologischen Detektion identifiziert und charakterisiert. Die Reinigung der Fusionsproteine erfolgte mittels Ni-NTA-Säulenchromatographie gemäß Herstellerangaben (Firma Qiagen).

Neben dem kompletten Leserahmen von MyfA (MyfA; Fig. 3) wurden drei Teilfragmente des Antigens als His-Tag-Fusionsproteine in Vektor pET21-b kloniert. Das erste Fragment (MyfA 1-441) wurde ohne den zu PsaA homologen C-terminalen Bereich (Beispiel 1 ; Fig. 1) kloniert und umfasst die AA 1-147 (Nukleotid [NT] 1-441). Das zweite Fragment (MyfA 121-441) kodiert für die AA 40-147 (NT 121-441) und enthält somit nicht die zu PsaA homologen N- und C-terminalen Bereiche (Beispiel 1 ; Fig. 1). Das dritte Fragment (MyfA 121-477) kodiert für die AA 40-159 (NT 121-477) und enthält nicht die N-terminale Sequenz von MyfA (Beispiel 1 ; Fig. 3; Fig. 1).

Nachfolgende Oligonukleotid-Primer wurden zur Darstellung der Sequenzen verwendet.

Primer 1 (I): myfA-f: GTA ATT CCA TAT GAA TAT GAA AAA ATT TGT (Seq ID No. 13)

Primer 2 (II): myfA_121f: GTA ATC CCA TAT GGC AAC AAA AAC TGT (Seq ID No. 14)

Primer 3 (III): myfA_441rev: TTA CTC GAG TTC ACC TGC TTT AAC (Seq ID No. 15)

Primer 4 (IV): myfA_rev: ATC TAC TCG AGC TCG ACA TAT TCC TCA A (Seq ID No 16)

Dabei wurden die folgenden Primerkombinationen verwendet:

myfA: Primer 1 und Primer 4 myfA 1-441 : Primer 1 und Primer 3 myfA 121 -441 : Primer 2 und Primer 3 myfA 121-477: Primer 2 und Primer 4 Beispiel 3

Überprüfung der Antigen ität

Die immunologische Reaktivität/Antigenität der MyfA-Fusionsproteine (Beispiel 2) wurde mittels Immunoblot (Fig. 4) und Line-Assay getestet (Fig. 5)

In Fig. 4 links sind jeweils Zellysate (ZL) von MyfA-Gesamtprotein (MyfA, inklusiver Leader-Sequenz; Beispiel 1 ; Fig. 1 ; Beispiel 2; Fig. 3) beziehungsweise eines der drei MyfA-Teilfragmente (MyfA 1-441 , MyfA 121-441 und MyfA 121-447) exprimierenden E. coli BL21 pLys -Zellen sowie die mittels Ni-NTA-Säulenchromatographie aufgereinigten His-getaggten rekombinanten MyfA-Proteine (MyfA 1-441 , MyfA 121-441 und MyfA 121- 447) dargestellt.

Die rechte Darstellung in Fig. 4 zeigt einen Immunoblot mit zwei Anti-Y enterocolitica 0:3 bzw. 0:9 - Seren und einem Anti-MyfA-Serum aus Kaninchen. Das am N- und C- Terminus verkürzte MyfA -Protein (MyfA 121-441 ; Beispiel 1 ; Fig. 1 ; Beispiel 2; Fig. 3) zeigt keine Reaktion mit den verwendeten Seren. Das am C-Terminus verkürzte Protein MyfA 1-441 (Fig. 1 ; Fig. 2) zeigt eine schwächere Reaktion als das am N-Terminus verkürzte Protein MyfA 121-447 (Fig. 1 ; Fig. 2). Somit scheint der C-Terminus einen besonders wichtigen immunogenen Bereich zu beinhalten, aber auch der N-Terminus ist diagnostisch bedeutend.

Durch Nachweis des His-tags mit einem Nickel-NTA-Konjugat aus Kaninchen konnten die Proteine nachgewiesen werden (sehr schwache Reaktion, keine Doppelbanden). Der Immunoblot mit einem Anti-Y. pseudotuberculosis -Serum aus Kaninchen zeigte keine Reaktion.

Die Überprüfung der immunologischen Reaktivität/Antigenität des aufgereinigten MyfA- Gesamtproteins (MyfA) und der aufgereinigten MyfA -Teilfragmente MyfA 1-441 , MyfA 121-441 und MyfA 121-447 (Beispiel 1 , Fig. 1 ; Beispiel 2; Fig. 3) erfolgte mittels Line- Assays (Fig. 5). Die Teststreifen wurden mit vier verschiedenen Anti-Y. enterocolitica- Seren aus Kaninchen (Serum 1 und 4: Serotyp 0:3; Serum 2: Serum 0:9, Serum 3: 0:8) vor (*) und nach der experimentellen peroralen Infektion mit vorkultivierten Yersinien inkubiert. Als Immunisierungs- bzw. Assay-Kontrolle wurden rekombinant hergestellte YopD- und YopH-Antigene in den Assay eingebaut. Zusätzlich, um die Kreuzreaktivität der MyfA- und PsaA-Antigene evaluieren zu können, wurde auch rekombinant hergestelltes PsaA-Antigen in den Assay eingefügt (Fig. 5). Die Reaktivität der Antigene wurde außerdem mit einem Anti-Y. pseudotuberculosis -Serum aus Kaninchen überprüft.

Die vor Infektion abgenommenen Blutproben zeigten keine Reaktivität mit den Antigenen des Assays (d. h. YopD, YopH, MyfA, MyfA 1-441 , MyfA 121-441 , MyfA 121-447, PsaA). Nach der experimentellen Infektion reagierten alle vier Proben mit den Yersinien- spezifischen Antigenen YopD und YopH (Fig. 5). Wie schon beim Immunoblot dargestellt (Fig. 4), zeigten das C- (Δ C-Terminus) bzw. das N- und C- (Δ N- und C-Terminus) terminal verkürzte MyfA-Protein deutlich verminderte und das N-terminal verkürzte Protein (Δ N-Terminus) verminderte Reaktivität im Vergleich zum MyfA-Gesamtprotein (Fig. 5). Interessanterweise reagierten die Seren Nr. 2 (sehr schwach), 3 (schwach) und 4 (positiv) auch mit dem aufgetragenen PsaA-Antigen. Das Anti-Y. pseudotuberculosis -Serum aus Kaninchen reagierte sehr stark mit YopD und PsaA, zeigte aber keine Reaktivität mit dem Gesamtantigen MyfA oder dessen Teilfragmenten. Die in dem Assay auftretende Kreuzreaktivität der Anti-V. enterocolitica -Seren mit PsaA wird möglicherweise durch semi-optimale Produktionsbedingungen verursacht (d.h. Aufreinigung über His-Taq, Pufferkonditionen oder zu hohe Antigenkonzentration). Zusätzlich sind auftretende Kreuzreaktivitäten zwischen MyfA und PsaA bzw. andere Yersinien-Oberflächenproteine (sog. RPs) in mit vorkultivierten Yersinien-immunisierten Kaninchenseren bekannt (Leiva et al., Heesemann et al.). Für folgende Experimente wurden die MyfA- und PsaA Antigene umkloniert (ohne His-Taq und Leader-Sequenz), aufgereinigt und die Assay-Konditionen optimiert (Beispiele 3-5).

Beispiel 4

Herstellung und Reinigung der rekombinanten MyfA- und PsaA-Antigene

Ausgehend von den vollständigen Leserahmen (Beispiel 1) der beiden Antigene wurden MyfA (pmyfA MIK)- und PsaA (ppsa>A-MIK)-Expressionsklone hergestellt. Nachfolgende Oligonukleotid-Primer wurden zur Darstellung der Sequenzen verwendet. Die Proteine wurden ohne Leader-Sequenz (MyfA AA 1-29 und PsaA AA 1-26; Beispiel 1) hergestellt, da die vorherigen Experimenten zeigten, dass das Leader-Peptid eine reduzierte Expression hervorruft. pmyfA-MIK

Primer 5 (Seq ID No. 17): myfA-F-Ndel: CAC ATA JGG AAC CGA CTG TTA TTA ATA GTA AAG ACA TC

Primer 6 (Seq ID No. 18): myfA-R-Baml: ATG GAT CCT TAC TCG ACA TAT TCC TCA ACA CG

ppsaA-MIK

Primer 7 (Seq ID No. 19): psaA-F-Ndel: GCC ATA TOT CTA CTG TCA TTA ACT CCA AGG ATG

Primer 8 (Seq ID No. 20): psaA-R-Baml: CAG GAT CCT TAA AAT ACA TAC TCT TCA ACA CGC C

Die spezifische Amplifikation des my/iA-Fragments erfolgte mittels PCR mit chromosomaler DNA aus Y. enterocolitica Serotyp 0:3/4 (Y. enterocolitica subsp. palearctica Stamm Y-11 ; DMSZ 13030) als Template. Das psa>4-Fragment wurde mit chromosomaler DNA aus Y. pseudotuberculosis Serotyp 1A amplifiziert.

Die resultierenden Amplifikate wurden mittels Restriktionsendonukleasen Nde I und Bam Hl enzymatisch gespalten und in einen geeigneten Vektor, pET3c (New England Biolabs) ligiert. Nach der Transformation des Ligationsansatzes in den E. co//-Stamm UT 5600 (Elish et al. [1998] J. Gen. Microbiol., 134, S. 1355-1364) wurden die Klone auf das Vorhandensein der myfA- und psaA -Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese von enzymatisch gespaltener Plasmid-DNA und mittels DNA-Sequenzierung (siehe unten) getestet. Des Weiteren wurde die Expression der Antigene durch Analyse der Expressionsprodukte MyfA-MIK und PsaA-MIK mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung bzw. anschließendem Transfer auf Nitrozellulose gefolgt von einer immunologischen Detektion identifiziert und charakterisiert. Die Reinigung der rekombinanten Proteine MyfA-MIK und PsaA-MIK erfolgte mittels Anionenaustausch- und Kationenaustausch-Säulenchromatographie. Im ersten Schritt wurde ein Anionenaustausch (Q-Sepharose Fast Flow; GE Healthcare, München, Deutschland), im zweiten ein Kationenaustausch (S-Source 15; GE Healthcare) und im dritten ein Anionenaustausch (Q-Source 30; GE Healthcare) durchgeführt. Die einzelnen Reinigungsschritte bzw. das aufgereinigte Protein wurde mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung bzw. anschließendem Transfer auf Nitrozellulose gefolgt von einer immunologischen Detektion überprüft und hinsichtlich des Reinheitsgrads, möglicher Proteinspaltung und immunologischer Reaktivität charakterisiert.

Beispiel 5

DNA-Sequenzierung der pmyfA-MIK und ppsaA-MIK-Expressionsklone und daraus resultierende Proteinsequenzen (AA) MyfA-MIK und PsaA-MIK

Die START (atg)- und STOP (uaa)-Kodons sind schwarz markiert.

DNA-Sequenzen

der pmyfA-MIK (396 bp) (Seq ID No. 21):

atggaaccgactgttattaatagtaaagacatctctgcaacaaaaactgttaaagag ggaggttcgttctcagttgaattcaag gccactgaaaacgagattgtgtcaggcaaattggatgcagatacacctgccttccatctg gtaatgtcggactcaggggaac ataaaggttggaatgttcggcctaccggtgcatctgagggaggacagatggtttctgcag atggtaccagagttgacttacat acaaatgagctatcgtgggataacgaccactggtggatagatgacggttctgagcgtgtg gaagcgactttctttcttgctgctg gcgacgaggttaaagcaggtgaatatcagttcactgggcgtgttgaggaatatgtcgagt aa ppsaA-MIK (402 bp) (Seq ID No. 22):

atgtctactgtcattaactccaaggatgtttctggtgaggtgactgtcaagcaggga aacacattccacgtcgattttgcgccta acacaggagagatttttgcgggtaaacagccgggtgatgtcactatgtttacgctaacta tgggtgatactgcaccacacggt ggttggcgtttgattccaacaggggactcaaaaggtggatatatgatcagcgccgatggt gactatgttggtttatacagttatat gatgtcatgggtaggtatagataataactggtatataaatgatgactctcctaaagatat aaaagatcatctgtacgüaaggca gggactgtccttaaaccaacgacttataaattcacggggcgtgttgaagagtatgtattt taa

Aminosäuresequenzen (AA)

MyfA-MIK (132-AA) (Seq ID No. 23)

MEPTVINSKDISATKTVKEGGSFSVEFKATENEIVSGKLDADTP AFHLVMSDSGEHKGWNV

RPTGASEGGQMVSADGTRVDLHTNELSWDNDHWWIDDGSERVEATFFLAAGDEVKAG E

YQFTGRVEEYVE.

PsaA-MIK (134-AA) (Seq ID No. 24)

MSTVINSKDVSGEVTVKQGNTFHVDFAPNTGEIFAGKQPGDVTMFTLTMGDTAPHGG W

RLIPTGDSKGGYMISADGDYVGLYSYMMSWVGIDNNWYINDDSPKDIKDHLYVKAGT VLK

PTTYKFTGRVEEYVF.

Beispiel 6

Serologische Differenzierung der Yersiniosen verursacht durch Y. enterocolitica oder Y. pseudotυberculosis

Zwei humane Serumproben wurden mittels Widal-Reaktion als Anti-Y. enterocolitica Serotyp 0:3 (LYE16)- bzw. als Anti-Y. pseudotuberculosis (LYE01) -IgG-positiv definiert.

Der Vergleich der serologischen IgG-Reaktivität von Yop-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK - Antigenen (Beispiel 3) mittels Line-Assays zeigte, dass die Y. pseudotuberculosis - positive Serumprobe sehr stark mit YopD und PsaA reagierte. Die Anti-Y. enterocolitica- IgG-positive Probe reagierte hingegen mit den Antigenen YopM, YopH, V-AG, YopD, YopN, YopE und MyfA. Diese Serumprobe zeigte auch eine sehr schwache Reaktivität mit PsaA.

Somit ergibt sich ein Hinweis darauf, dass die Antigene MyfA-MIK und PsaA-MIK die serologische Differenzierung von Y. enterocolitica- und Y. pseudotuberculosis-\nfektionen ermöglicht.

Beispiel 7

Vergleich der serologischen Prävalenz der Anti-Yop-, Anti-MyfA- und Anti-PsaA- Antikörper der IgG-, IgM- und IgA-Klasse in Serumproben von bayerischen Blutspendern bzw. in Serumproben von finnischen und deutschen Yersiniose- Patienten

Die IgG-, IgM- und IgA-Antwort gegen rekombinant hergestellte YopM-, YopH-, V-AG-, YopD, YopN-, YopE-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK- (Beispiel 4 und 5) Antigene mit Seren aus drei verschiedenen Serensammlungen (d. h. bayerische Blutspender n=40; Bayern; Deutschland, Yersiniose-Patienten aus Finnland [KTL, n=18] und Yersiniose-Patienten aus Deutschland [YeD, n=23]) wurden mittels Line-Assays untersucht. Als Referenztest wurde der recomUne Yersinia der Fa. Mikrogen GmbH verwendet.

Blutspenderseren

48-% (n=19) der getesteten Blutspenderseren aus Bayern (n=40) zeigten eine IgG- Reaktivität mit YopD (Fig. 7; Tabelle 1). Acht Serumproben wiesen eine IgG-Antwort auf, die nicht gegen YopD sondern ausschließlich gegen YopH (n=4), YopH und YopN (n=1), YopH und V-AG (n=1), YopM (n=1) und PsaA-MIK (n=1) gerichtet war. Drei der Proben reagierten mit den beiden neuen Yersinien-Antigene MyfA-MIK (n=4) und PsaA-MIK (n=9; Tab. 1).

Da die Seren von gesunden Spendern stammten, konnte in keinem der getesteten Seren IgM-Antikörper gegen YopD nachgewiesen werden (Tab. 1). Drei Yop-lgG-positive Seren (n=19) wiesen einen isolierten IgM-Titer gerichtet gegen YopH (n=2; 11 %; Serum Nr. 1087: hohe IgG-Titer gegen YopD und PsaA; Serum Nr. 1099: hohe IgG-Titer gegen YopD) oder PsaA (n=1 ; 5%, Serum Nr. 1083: hohe IgG-Titer gegen YopD, MyfA-MIK und PsaA-MIK) auf. Keine der getesteten Proben reagierte mit MyfA-MIK (Tab. 1).

Sieben YopD-lgG-positive Serumproben aus Blutspendern (n=19) zeigten einen IgA-Titer gegen YopD (Tab. 1). Drei der getesteten Seren reagierten mit PsaA-MIK. Interessanterweise zeigte die Yop-lgG-negative Serumprobe Nr. 1080 eine sehr schwache isolierte Reaktivität mit PsaA. Die YopD- und PsaA-MIK IgG-hoch positiven Serumproben Nr. 1096 und Nr. 1110 wiesen auch eine starke (Serum Nr. 1096) bzw. schwache (Serum Nr. 1110) IgA-Antwort gegen PsaA-MIK (Tab. 1) auf. Keiner der getesteten Proben reagierte mit MyfA-MIK (Tab. 1). Aufgrund der parallel auftretenden Anti-lgA-Reaktivität gegen die YopD-, Yop-N- und PsaA- Antigene in den Proben Nr. 1110 ist es zu erwarten, dass es hier um einen diagnostisch relevanten serologischen Befund handelt, wie z.B. kürzliche Y.pseudotuberculosis-\ni Aktion bzw. auftretende reaktive Arthritis.

Yersiniose-Patientenseren aus Finnland

17 (90-%) der getesteten Seren aus Patienten mit Verdacht auf Yersinien-induzierte reaktive Arthritis aus Finnland (n=18) zeigten eine IgG-Antwort gegen YopD (Fig. 8; Tab. 2). Elf der Proben reagierten mit MyfA-MIK (65 %) und vier mit PsaA-MIK (24%) (Fig. 8; Tab. 2).

15 (88%) der getesteten Seren hatten IgM-Antikörper gegen YopD (Tab. 2). Ein Serum (Nr. 52) zeigte auch eine starke IgM-Antwort gegen PsaA-MIK (Tab. 2).

17 Serumproben aus Yersiniose-Patienten (n=18) wiesen einen IgA-Titer gegen YopD (Tab. 2) auf. Drei der getesteten Seren reagierten auch mit PsaA-MIK (Nr. 23, 24 und 40; Tab. 2).

Yersiniose-Patientenseren aus Deutschland

Alle (n=23) getesteten Yersiniose-Patientenseren aus Deutschland zeigten eine IgG- Reaktivität mit YopD (Fig. 9; Tab. 3). 15 Serumproben (65%) wiesen zusätzlich eine IgG- Antwort gegen PsaA-MIK auf. Vier (17 %) der Proben reagierten mit dem Antigen MyfA-MIK (Fig. 9; Tab. 3). Interessanterweise reagierten zwei der Serumproben (Serum 1038 und 1025) mit den beiden Antigenen MyfA-MIK und PsaA-MIK. Jedoch war die IgG- Antwort gegen MyfA-MIK deutlich schwächer im Vergleich zu PsaA-MIK (Tab. 3).

Nur in zwei (9 %) der getesteten Seren (n=23) wurde eine niedrige IgM-Antwort gegen YopD und in drei Seren gegen YopE nachgewiesen (Tab. 3). Ein Serum, Nr. 986, reagierte sehr stark mit PsaA-MIK (Tab. 3).

Alle getesteten Yersiniose-Patientenseren wiesen eine IgA-Antwort gegen YopD (Tab. 3) auf. Eine der Proben reagierte auch mit MyfA-MIK (Serum Nr. 976) und eine andere mit PsaA-MIK (Serum Nr. 1025). Diese Seren zeigten auch eine starke IgG-Antwort gegen MyfA-MIK bzw. PsaA-MIK (Tab. 3).

Interessanterweise unterscheiden sich die zwei getesteten Yersiniose- Patientenprobensammlungen aus Finnland und Deutschland in der Anti-MyfA- und Anti- PsaA-lgG-Prävalenz. Aufgrund niedriger Isolierungsrate bzw. technisch schwerer Kultivierung und Isolierung der Y.pseudotuberculosis-Stämme sind momentan keine zuverlässigen epidemiologischen Daten vorhanden.

Tabelle 1. Die IgG-, IgM- und IgA-Antwort gegen rekombinant hergestellte YopM-, YopH-, V-AG-, YopD, YopN-, YopE-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK -Antigene unter den getesteten Blutspenderseren aus Bayern (n=40). Die Reaktivität wurde semi-quantitativ dargestellt mit folgendem Auswertungsschema: 1 = sehr schwache Reaktivität, 2 = schwache Reaktivität, 3 und 4 = starke Reaktivität.

Tabelle 2. Die IgG-, IgM- und IgA-Antwort gegen rekombinant hergestellte YopM-, YopH-, V-AG-, YopD, YopN-, YopE-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK -Antigene unter den getesteten Yersiniose-Patientenseren aus Finnland (n=18). Die Reaktivität wurde semi-quantitativ dargestellt mit folgendem Auswertungsschema: 1 = sehr schwache Reaktivität, 2 = schwache Reaktivität, 3 und 4 = starke Reaktivität.

Tabelle 3. Die IgG-, IgM- und IgA-Antwort gegen rekombinant hergestellte YopM-, YopH-, V-AG-, YopD, YopN-, YopE-, MyfA-MIK- und PsaA-MIK -Antigene unter den getesteten Yersiniose-Patientenseren aus Deutschland (n=23). Die Reaktivität wurde semi-quantitativ dargestellt mit folgendem Auswertungsschema: 1 = sehr schwache Reaktivität, 2 = schwache Reaktivität, 3 und 4 = starke Reaktivität.

Beispiel 8

Diagnostische Relevanz der PsaA-MIK- und MyfA-MIK -Antigene bei der Diagnose von akuten Y. pseudotuberculosis -Infektionen

Die verwendete Abkürzung "MIK" besagt, dass die Antigene von der Anmelderin rekombinant hergestellt werden.

Die PsaA-MIK- und MyfA-MIK -Antigene wurde eingesetzt in einen bead -basiertem Testsystem (Luminex) zum Nachweis einer IgG-, IgM- und IgA -Reaktivität gegen das PsaA-MIK- bzw. das MyfA-MIK -Antigen. Eine Sammlung von Serumproben von Patienten, die an einer akuten, durch Yersinia pseudotuberculosis verursachten Yersiniose erkrankt waren (K. Jalava, P. Nuorti: „Porkkanaraasteesta laaja Yersinia pseudotuberculosis -epidemia, Kansanterveyslehti, 2003) wurde eingesetzt. Als negative Vergleichsgruppe wurden 8 Y. enterocolitica IgG -positive (bestimmt mit sog. Widal - Hemagglutinationstest und ein Blot -Assay) und 19 Y. enterocolitica -negative Routineproben eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

96.9% (63 Proben aus 65 getesteten Proben) der getesteten Y. pseudotuberculosis - Patientenproben zeigten hohe IgG -Reaktivität gegen das PsaA-MIK -Antigen. Nur drei der getesteten Proben reagierten parallel gegen beide Antigene (MyfA-MIK- und PsaA- MIK). 44.6% der Proben wiesen eine Anti -PsaA-MIK -IgM - und 58.5% der Proben eine Anti -PsaA-MIK -IgA -Reaktivität auf. Keine der getesteten Proben reagierte mit den MyfA-MIK -Antigen, wenn Antikörper der IgM- und IgA -Klassen untersucht wurden.

75.0% der Y. enterocolitica WIDAL- und Blot -positiven Proben waren IgG -positiv für das MyfA-MIK -Antigen. Keine dieser Proben reagierte mit dem PsaA-MIK -Antigen. Keine dieser Proben zeigte eine IgM- oder IgA -Reaktivität gegen die PsaA-MIK- oder MyfA- MIK -Antigene.

Keine der Yersinia -IgG -negativen Proben (n=19) reagierte mit dem PsaA-MIK -Antigen. Drei der Proben zeigten isolierte Anti -MyfA-MIK -IgG -Reaktivität und zwei der Proben isolierte Anti -PsaA-MIK -IgM -Reaktivität.

Tabelle 4. Untersuchung der Anti- PsaA-MIK und -MyfA-MIK IgG-, IgM- und IgA - Reaktivität bei Y. pseudotuberculosis -verursachten Yersiniose -Patienten und bei Y. enterocolitica -IgG -positiven bzw. Yersinia -IgG -negativen Proben.

Das vorliegende Beispiel belegt, dass überraschenderweise die Antigene PsaA bzw. MyfA die Unterscheidung von Infektionen mit Y.pseudotuberculosis von Infektionen mit Y.enterocolitica ermöglichen, obwohl verhältnismäßig hohe Homologien zwischen den beiden Antigenen vorhanden sind, die auch zu Kreuzreaktivitäten führen können. Kreuzreaktivitäten zu MyfA- bzw. PsaA-ähnlichen Antigenen, die in anderen Enterobakterien vorkommen, können durch Verwendung der anderen hier beschriebenen Antigene, insbesondere Yop D, ausgeschlossen werden.

Aufgrund dieser Ergebnisse ist anzunehmen, dass die hier beschriebene Vorrichtung auch zum serologischen Nachweis einer Infektion verursacht durch Y.pestis eingesetzt werden könnte. Da aber eine Y.pesfrs-Infektion - im Gegensatz zu einer Y.pseudotuberculosis- Infektion typischerweise mit einer schwarzen, schnell voranschreitenden, anders verlaufenden Symptomatik assoziiert ist (sog. Lungenpest, Beulenpest), erlaubt eine Serodiagnose unterstützt mit klinischer Symptomatik eine zuverlässige Unterscheidung der beiden Infektionstypen.