REDUITS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procé¬ dé de préparation de composés diastéréoisomères dérivant de l'acide tétrahydrofolique. Ces composés comprennent en tant que produits industriels (i) le mélange de diastéréoisomères 6P et 6Q tels que définis ci-après (et répondant vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données plus loin), dans le rapport molaire 6P/6Q d'environ 7/3, (ii) le diastéréoisomère 6P pur et (iii) le diastéréoisomère 6Q pur.

L'invention concerne également l'utilisation desdits diastéréoisomères 6P et 6Q dans la synthèse de diastéréoisomères 6S et 6R de folates réduits tels que notamment les acides 5-CHO-(6S)-THF,

5-CHO-(6R)-THF, 5-Me-(6S)-THF, 5-Me-(6R)-THF, 5,10-CH ⁺ -(6R)-THF, 5,10-CH ⁺ -(6S)-THF, et leurs sels.

ABREVIATIONS

Dans la présente description on a utilisé par commodité les abréviations suivantes : a) pour les folates réduits 5 THF = acide 5,6,7,8-tétrahydrofolique

5-CHϋ-(6RS)-THF = acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique (ou acide folinique) 5-CHO-(6S)-THF = acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-té- -- trahydrofolique (ou facteur de croissance du Leuconostoc citro- vorum) , appartenant à la série de configuration dite "naturel¬ le",le sel de calcium de cet _! 5 acide étant connu sous le nom de

"leucovorine" 5-CHO-(6R)-THF = diastéréoisomère 6R de l'acide folinique, appartenant à la série de configuration dite 2 ₀ "non-naturelle"

5-Me-(6RS)-THF = acide (6RS)-5-méthyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique 5-Me-(6S)-THF = acide (6S)-5-méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofolique,appartenant à la ²⁵ série de configuration dite

"naturelle" 5-Me-(6R)-THF = acide (6R)-5-méthyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique appartenant à la série de configuration dite ³⁰ "non-naturelle"

[5,10-CH ⁺ -(6RS)-THF]X ^"

= sel de l'acide (6RS)-N ⁵ ,N ¹⁰ - méthényl-5,6,7,8-tétrahydro- folique (ou "anhydro-leucovori- 35 ne") avec l'anion X~

[ 5 , 10-CH ⁺ - ( 6R ) -THF ] X

= sel de l'acide (6R)-N ⁵ ,N ¹⁰ - méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X~, apparte- z- nant à la série de configuration dite "naturelle" [5,10-CH ⁺ -(6S)-THF]X~

= sel de l'acide (6S)-N ⁵ ,N ¹⁰ - méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- _Q que avec l'anion X~, appartenant à la série de configuration dite "non-naturelle" [5,10-CH ⁺ -(6RS)-THF]X ^" ,HX

= sel de l'acide (6RS)-N ⁵ ,N ¹⁰ - 5 méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X ^" et l'acide HX [5,10-CH ⁺ -(6S)-THF]X ^" ,HX

= sel de l'acide (6S)-N ⁵ ,N ¹⁰ - ₀ méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X~ et l'acide HX 5,10-CH ₂ -(6RS)-THF = acide (6RS)-N ⁵ ,N ¹⁰ -méthylène-

5,6,7,8-tétrahydrofolique ⁵ 5,10-CH ₂ -(6R)-THF = acide (6R)-N ⁵ ,N ¹⁰ -méthylène-

5,6,7,8-tétrahydrofolique appar¬ tenant à la série de configura¬ tion dite "naturelle" 5,10-CH ₂ -(6S)-THF ≈ acide (6S)-N ⁵ ,N ¹⁰ -méthylène- 0 5,6,7,8-tétrahydrofolique appar¬ tenant à la série de configura¬ tion dite "non-naturelle" b) pour les autres abréviations DMSO = diméthylsulfoxyde

FAB = bombardement atomique rapide (de l'anglais: "fast atomic bombard- ment")

HPLC = chromatographie liquide haute performance

H-TSA = acide p-toluènesulfonique MS = spectrométrie de masse

MS(FAB) = spectrométrie de masse avec dis¬ positif de bombardement atomique rapide Py = pyridine

RT ^' = température ambiante (15-20°C) TSA ^~ = ion p-toluènesulfonate

ART ANTERIEUR

On sait que l'acide folinique commercial [ou 5- CH0-(6RS)-THF] , qui répond aux nomenclatures d'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique et d'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydroptéroyl-L-glutamique et qui est notamment préparé avec son sel de calcium à partir de l'acide folique ou de l'acide N^,N^^-méthényl- ,6,7,8-tétrahydrofolique [voir par exemple les brevets CH-A-496 012 et GB-A-1 560 372], est un mélange molaire 1/1 de deux diastéréoisomères qui diffèrent l'un de l'autre par leur configuration en C° (atome de carbone en position 6 du cycle ptéridinyle).

On sait que le brevet britannique GB-A-1 560 372 envisage dans sa description (voir page 2, lignes 4-6) l'utilisation d'un complexe, sel interne ou zwitterion, de l'anhydro-leucovorine (composé de formule [5,10-CH ⁺ -(6RS)-THF]X ^~ ) dans lequel l'un des ions carboxylate C00 ^" du reste R-p-benzoyl-(L)-glutamique a réagi avec la char¬ ge positive délocalisée sur les atomes N-, C - et N ¹⁰ comme matière première dans la synthèse de l'acide (6RS)- folinique et de son sel de calcium.

On sait de l'article de J.C. FONTECILLA-CAMPS et. al., J. Am. Chem. Soc, 101, 614 (1979) que le diastéréo¬ isomère biologiquement actif de l'acide folinique est de configuration 6S. Il est rappelé que ce diastéréoisomère a été dénommé dans le passé "isomère naturel" par commodité en raison de son activité biologique, d'une part, et "acide (1,L)-folinique" où le terme "1" se réfère à la configuration en C° et le terme "L" à la configuration de la chaîne latérale acide glutamique, d'autre part.

L'acide (ôRS)-folinique 5-CHO-(6RS)-THF est généralement et communément utilisé, avec son sel de cal¬ cium, en tant que moyen thérapeutique de "secours" chez les patients soumis à une chimiothérapie anti-cancer à base de méthotréxate et en tant que moyen augmentant l'inhibition de la thymidylate synthétase par les agents anti-cancéreux tels que les 5-fluorouracil et 5-fluoro- 2'-désoxyuridine.

On a longtemps pensé que le diastéréoisomère 6R de l'acide folinique, dénommé par commodité "isomère non- naturel" (par opposition au 6S biologiquement actif) était inactif; cependant il a été signalé [voir. F.M. SIROTNAK et al., Biochem. Pharm. , _28, 2993 (1979); et J.K. SATO et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., _, 25, 312 (1984)] que ledit diastéréoisomère 6R est susceptible d'interférer avec le transport ou la polyglumatation du diastéréoisomère 6S actif.

Il existe en conséquence un besoin de mettre au point, en ce qui concerne l'acide folinique, une techni- que d'obtention du diastéréoisomère 6S pur par séparation du mélange (6RS) ou par synthèse stéréospécifique.

Il se trouve que les techniques décrites par D.B. COSULICH et al., J. Am. Chem. Soc, l , 4215 (1952) [pro¬ posant la séparation des stéréoisomères de l'acide folinique par cristallisation fractionnée de leurs sels de calcium dans l'eau], d'une part, et par C. TEMPLE et

- D'¬

aï., Cancer Treatment Reports, 6_5_, 1117 (1981) [proposant la séparation de l'acide (6S)-folinique à partir du mélange (6RS) par solubilisation différentielle des sels de calcium dans l'eau], d'autre part, sont inefficaces dès lors qu'elles conduisent à un mélange de 6S et 6R dans le rapport molaire 1/1.

Pour isoler le (6S)-folinate de calcium à partir du mélange (6RS) une autre méthode a été préconisée dans la demande internationale PCT publiée WO-A-8808844 (EPROVA) qui est fondée sur la cristallisation préféren¬ tielle du (6S)-folinate de calcium à partir d'un milieu alcalin aqueux contenant Ca ²⁺ en excès.

On sait par ailleurs que d'autres folates réduits ont été obtenus sous une forme diastéréoisomériquement pure, soit à partir d'acides (6S)- et (6R)-tétrahydrofo- liques préparés par voie enzymatique [voir notamment F.M. SIROTNAK et al., Biochem. Pharm. , 2J3, 2993 (1979) pré¬ cité; H.C.S. 00D et al., Chem. and Biol. of Pteridines, 533 (1983); P.L. CHELLO et al., Biochem. Pharm., _31, 1527 (1982)], soit encore par d'autres méthodes chimiques et chromatographiques longues et fastidieuses [voir notamment B.T. KAUFMAN et al., J. Biol. Chem., 238, 1498 (1963); S.B. HORWITZ et al., J. Med. Chem., _12, 49 (1969); B.V. RAMASASTRY et al., J. Biochem. Biophys. Res. Com . , .12, 478 (1963); J.C. HITE et al., Chem. and Biol. of Pteridines, 625 (1979); et J. FEENEY et al., Biochemistry, 2 , 1837 (1981)]; or il se trouve que toutes ces méthodes, qui conduisent à l'obtention de très petites quantités (de l'ordre du milligramme) de pro- duits qui n'ont pas été isolés sous forme de solides cristallisés ou qui ont été obtenus sous forme de poudre lyophilisée de pureté toujours inférieure ou égale à 80 %, ne sont pas satisfaisantes.

De plus, il se trouve que les tentatives de réduire asymétriquement l'acide dihydrofolique par voie

chimique n'ont jamais été couronnées de succès [voir L. REES et al., Tetrahedron, .42, 117 (1986)].

Le fait de disposer de quantités importantes de folates réduits diastéréoisomériquement purs permettrait de comparer et apprécier de façon claire les activités enzymatiques, biologiques et/ou thérapeutiques de chaque diastéréoisomère. En effet, jusqu'à présent la plupart des expérimentations qui ont été entreprises ont été réalisées soit avec le mélange molaire 1/1 des diastéréoisomères soit avec le diastéréoisomère dit "naturel", les activités du diastéréoisomère dit "non- naturel" étant extrapolées à partir des valeurs obtenues à partir dudit mélange molaire 1/1 et dudit diastéréoisomère naturel [voir notamment J.A. STRA et al., Cancer Research, 41_, 3936 (1981)]. A la connaissance de la Demanderesse, les seuls isomères foliniques "non- naturels" avec lesquels des expérimentations ont été effectuées sont ceux de l'acide folinique et de l'acide N ⁵ -méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui ont été obtenus in situ par déplétion (i.e. élimination ou inhibition) enzymatique de l'isomère "naturel" correspondant [.voir notamment J.K. SATO précité].

On connait enfin de EP-A-0 348 641 (date de pu¬ blication : 3 janvier 1990), deux méthodes (I et II) d'accès aux folates réduits ayant la configuration de la série dite "naturelle". Selon la méthode I, on traite le sel complexe dénommé "(acide (6RS)-5,10-méthényl-5,6,7,8- tétrahydofolique) chlorure, chlorhydrate, dihydrate" de formule abrégée : [5,10-CH ⁺ -(6RS)-THF]C1 ^" ,HC1,2H ₂ 0 au moyen d'un mélange HC00H/HC1 2N pour obtenir par cristal¬ lisation le diastéréoisomère naturel répondant à la formule [5,10-CH ⁺ -(6R)-THF]C1 ^" ,HC1.

La méthode II, comprend les étapes suivantes : en premier lieu (selon l'exemple 5.1 de EP-A-0 348 641), (a) on solubilise ledit sel complexe précité, de formule

• c. -

[5,10-CH ⁺ -(6RS)-THF]C1 ^" ,HC1,2H ₂ 0, dans l'acide HCOOH, (b) on traite la solution résultante avec une résine échan- geuse d'anions [AMBERLITE ^R IRA-68], (c) on évapore sous pression réduite l'éluat qui a été recueilli, puis (d) on traite le résidu d'évaporation, ainsi obtenu, avec AcOH et MeOH, pour précipiter un produit dénommé sel interne de l'acide 5,10-CH-(6RS)-THF, puis en second lieu (selon l'exemple 11 de EP-A-0 348 641), on fait réagir ledit sel interne avec une solution aqueuse de HCOOH à 20°C sous agitation, il se forme un précipité et, par filtration, on recueille le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6S)-THF avec une teneur en diastéréoisomère de forme 6S de 73%, (en répétant l'opération de précipitation on augmente la teneur en diastéréoisomère de forme 6S jusqu'à 90%); et, pa traitement des filtrats combinés au moyen d'acétone, on précipite le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6R)-THF à 75 % de pureté.

BUT DE L'INVENTION

Selon l'invention on propose une nouvelle solu- tion technique permettant la synthèse des diastéréoiso¬ mères 6R et 6S de folates réduits pour satisfaire les besoins précités. Cette nouvelle solution technique se différencie de la méthode II de EP-A-0 348 641 rappelée ci-dessus notamment par le fait que le traitement avec la résine échangeuse d'anions puis le mélange AcOH/MeOH est remplacé par la réaction de 5-CHO-(6RS)-THF ou de [5,10- CH ⁺ -(6RS)-THF]X ^" avec l'acide HCOOH à un pH se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6.

Cette nouvelle solution technique conduit à 1'ob- tention de composés diastéréoisomériquement purs, définis ci-après, de configuration 6P et 6Q et répondant très vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données ci-après. Cette solution technique constitue une nouvelle source d'accès aux folates réduits, dès lors qu'elle permet notamment la préparation de composés dias-

téréoisomériquement purs tels que les acides (6S)- et (όR)-foliniques, (6S)- et (6R)-N ⁵ ,N ¹⁰ -méthylène-5,6,7,8- tétrahydrofoliques, (6S)- et (6R)-N ⁵ -méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofoliques et leurs sels, à partir des dits dia¬ stéréoisomères de formules III et IV.

OBJET DE L'INVENTION

Selon l'un des aspects de l'invention, on préco¬ nise un procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoisomères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :

1°) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par

(i) l'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule

dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta- mique de formule :

où A est H; et ses sels, et (ii) l' acide N ⁵ , N ¹⁰ -méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli¬ que de formule

dans laquelle X ^" est un anion et R est défini comme ci- dessus; avec HCOOH à un pH se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6; et

2°) la récupération du précipité, qui s'est for¬ mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon¬ dant, d'autre part;

3°) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration non-naturelle, dénommé ci-après diastéréo¬ isomère 6Q, et répondant très vraisemblablement à la formule IV, par recristallisation fractionnée; et,

4°) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2°) et/ou des filtrats de recristallisation selon le stade 3°), d'un second dia¬ stéréoisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle, dénommé ci-après diastéréoisomère 6P, et répondant très vraisemblablement à la formule III.

Selon ce procédé, on obtient au stade 2°) un précipité de diastéréoisomères 6Q et 6P dans un rapport molaire 6Q/6P d'environ 7/3.

Dans la formule II, la liaison en pointillés reliant les atomes d'azote N et N^ a pour but de signa-

ler que la charge positive est délocalisée sur les atomes N ⁵ , C ¹¹ et N ¹⁰ .

Suivant un autre aspect de l'invention, on propo¬ se en tant que produits industriels nouveaux lesdits diastéréoisomères 6Q, 6P et leurs mélanges, notamment le mélange molaire 7/3 précité. Le diastéréoisomère 6P appartient à la série dite naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-(6S)-THF, 5,10-CH-(6R)-THF, ,10-CH ₂ -(6R)-THF et 5-Me-(6S)-THF, et à leurs sels. Le diastéréoisomère 6Q appartient à la série dite non-naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-(6R)-THF, ^' 5,10-CH-(6S)-THF, 5,10-CH ₂ -(6S)-THF et -Me-(6R)-THF, et à leurs sels. Suivant encore un autre aspect de l'invention, on préconise l'utilisation desdits diastéréoisomères 6P et 6Q pour l'obtention des folates réduits diastéréoisoméri- quement purs des séries naturelle et non-naturelle. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les diastéréoisomères selon l'invention ont été désignés 6P et 6Q par commodité, car il n'a pas été possible de déterminer de façon directe leur configura¬ tion. On a néanmoins de sérieuses raisons de présumer que le composé 6P est de configuration 6R et que le composé 6Q est de configuration 6S; on a également de sérieuses raisons de penser que ces diastéréoisomères sont des com¬ posés du type orthoamide et répondent aux formules III et IV, (même si dans l'état actuel des connaissances il s'a¬ girait d'hypothèses ne liant pas la Demanderesse). Comme indiqué ci-dessus, le diastéréoisomère 6P appartenant à la série naturelle répond très vraisembla¬ blement à la formule :

H

et le diastéréoisomère 6Q répond très vraisemblablement à la formule :

La transformation des dérivés orthoa ides 6P et 6Q en 5-CHO-THF, 5-Me-THF et 5,10-CH ₂ -THF, n'affecte pas la stéréochimie du centre C . Ainsi les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration naturelle présentent une configuration spatiale en C° telle qu'illustrée notamment par les formules V, VII, VIII, et XI ci-après, d'une part, et les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration non-naturelle présentent une configuration spatiale en C° telle qu'illustrée notamment par les formules VI, IX, X, et XII ci-après, d'autre part. En revanche, la notation R ou S change à l'intérieur de chaque série eu égard aux règles de nommenclature; dans la série de configuration naturelle on passe du diastéréoisomère 6S [par exemple 5-

CH0-(6S)-THF ou 5-Me-(6S)-THF] au diastéréoisomère 6R [par exemple ,10-CH-(6R)-THF ou 5,10-CH ₂ -(6R)-THF] quand le squelette bicyclique du reste ptéridinyle devient tricyclique. II est important que lors de la mise en oeuvre du stade 1°) le pH du milieu réactionnel soit ajusté entre 2,0 et 2,6. Le réglage du pH à l'intérieur de cette gamme sera avantageusement effectué par addition de NHo ou NH^OH. De préférence, au stade 1°), le pH du milieu réac- tionnel sera compris entre 2,2 et 2,4 et plus avantageu¬ sement de l'ordre de 2,30-2,35.

De façon également avantageuse, la réaction du stade 1°) sera effectuée pendant au moins 0,25 h, à une température de 40 à 65°C, et mieux à une température de 45-60°C.

De façon pratique, le stade 1°) selon l'invention sera mis en oeuvre suivant deux voies différentes :

(a) II > III + IV

(b) I > III + IV. Dans la voie (a), on incorpore directement l'ammoniac dans le mélange II + H ₂ 0/ HCOOH pour réguler le pH, la réaction étant effectuée à une température de 55-65°C, pendant au moins 0,25 h. Dans la voie (b), l'on fait réagir le composé I avec un mélange H ₂ 0/HC00H à 60- 65°C pendant au moins lh, refroidit le milieu réactionnel résultant à 40-45°C, puis introduit l'ammoniac, la réac¬ tion se poursuivant ensuite à 40-45°C pendant au moins 0,25 h.

Dans les deux voies, le mélange réactionnel donne par refroidissement à RT un précipité cristallin de couleur jaune brillant qui est pratiquement insoluble dans les solvants usuels.

L'analyse élémentaire de ce précipité est en accord avec les structures III et IV; il s'agit d'un mélange d'orthoamides résultant (i) de 1'énolisation du

groupe oxo exocyclique (en position C^ du squelette ptéridinyle) de la fonction lactame et (ii) d'une cyclisation par formation d'une liaison entre l'oxanion et l'atome de carbone en C ¹¹ de la formule II. La structure orthoamide des composés de formules

III et IV est également confirmé par les faits suivants :

- l'analyse par spectrométrie de masse SM(FAB) des com¬ posés de formules III et IV donne un spectre pratiquement identique à celle du précurseur de formule II et indique que la réaction II = III/IV traduit une conversion du type protonation/déprotonation;

- un échantillon du produit III/IV traité avec un excès d'acide p-toluènesulfonique ne se distingue pas du produit de formule II (ou du couple VII/IX) par analyse HPLC (sur colonne non-chirale) .

Selon l'invention, les cristallisations fraction¬ nées des stades 3°) et 4°) peuvent être remplacées par une chromatographie sur colonne pour séparation chirale. En pratique on préfère enrichir les teneurs respectives en diastéréoisomères de configuration naturelle et respectivement de configuration non-naturelle des compo¬ sés III et respectivement IV par cristallisation frac¬ tionnée, puis, si nécessaire, purifier chaque produit par HPLC sur colonne chirale • Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anion X~ du composé de formule II sera un anion approprié, et pourra notamment être choisi parmi l'ensemble constitué par les ions F ^" , Cl ^" , Br~, I ^" , NO ^" , I/2SO ^2" , I/3PO4 ^3"" , oxalate, p-toluènesulfonate, maléate, benzènesulfonate, méthanesulfonate, trifluoroacétate, et trichloroacétate.

Les orthoamides de formules III et respectivement

IV peuvent être convertis en composés V et respectivement VI par hydrolyse à 100°C à pH 7 et en leurs sels :

et

Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être également utilisés pour la préparation des acides diastéréoisomériquement purs 5,10-CH2-(6R)-THF de formule VIII et respectivement 5,10-CH ₂ -(6S)-THF de formule X, et de leurs sels, par conversion de III et IV en VII et respectivement IX, traitement ensuite avec NaBH^ dans un solvant aprotique contenant de la pyridine, puis purification suivant l'enseignement de la demande de brevet suisse No 02 736/89 de la Demanderesse :

(VII)

ic et

d'une part,

et

d'autre part.

Dans la synthèse des composés de formules VIII et X, (ou encore de formules XI et XII), on peut, si cela est nécessaire, isoler les composés intermédiaires VII et respectivement IX. Toutefois, une telle opération n'est pas essentielle, et la suite de la synthèse est générale¬ ment effectuée sans isoler ledit composé VII ou respecti¬ vement IX.

De même les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être utilisés pour la prépara- ration des acides diastéréoisomériquement purs 5-Me-(6S)- THF de formule XI et respectivement 5-Me-(6R)-THF de formule XII, et de leurs sels, par conversion en VII et respectivement IX, suivie d'une réduction avec NaB^CN dans un solvant aprotique :

et

Les sels des diastéréoisomères de configuration naturelle de formules V, VIII et XI, d'une part, et de configuration non-naturelle de formules VI, X et XII, d'autre part, comprennent selon l'invention (i) les sels métalliques, notamment ceux des métaux alcalins et alca-

lino-terreux, tels que Na, K, Ca et Mg, et (ii) les sels d'addition obtenus avec les bases organiques, telles que en particulier les éthylamine, 2-(N,N-diméthylamino)étha- nol, 2-(N,N-diéthylamino)éthanol, morpholine, pipéridine et analogues.

Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention est illustré par les schémas réactionnels suivants. SCHEMA 1

(a) (b)

/H ₂ 0/Λ

1 Q

où le groupe A intervenant dans le reste R de la formule I est l/2Ca ²⁺ , le groupe A intervenant dans le reste R des formules II, III et IV est H, et le groupe X ^" intervenant dans la formule II est Cl ^" .

SCHEMA 2

CHO

III CH ₂ —HH—R (V)

H

où le groupe A intervenant dans le reste R des formules V et VI est l^Ca^ ,1e groupe A intervenant dans le reste R des formules III et IV est H.

SCHEMA 3

I

Py/NaBH ₄ /DMSO

Mg ²⁺ purif./cristall,

purif./cristall,

où le groupe A intervenant dans le reste R des formules VIII et X est l/2Mg ²⁺ ,le groupe A intervenant dans le reste R des formules III, IV, VII et IX est H, et le

groupe X ^" intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate (TSA~). SCHEMA 4

XII

où le groupe A intervenant dans le reste R des formules VII, IX, XI et XII est H, et le groupe X ^" intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate. D'autre avantages et caractéristiques de l'inven¬ tion seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. PREPARATION I

Obtention de 1Orthoamide de formule III (exemple 1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2)

Dans un mélange de 1200 ml d'eau et 270 ml d'acide formique, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte (azote ou argon), on ajoute une quantité suffisan¬ te d'ammoniaque pour arriver à un pH de 2,3. On chauffe la solution résultante à 60°C et ajoute 15,41 g de [5,10- CH ⁺ -(6RS)-THF]X ^" de formule II (où X = Cl obtenu selon le procédé décrit par C. TEMPLE et al., J. Med. Chem., 22, 731, (1979). On maintient l'agitation jusqu'à dissolution

totale des matières solides. On filtre le milieu réactionnel et laisse reposer le filtrat à RT pendant 48 h. Le précipité volumineux de couleur jaune brillant qui s'est formé est recueilli par filtration sur Buchner et lavé avec de l'eau puis de l'acétonitrile (les filtrats sont recueillis pour traitement ultérieur) et séché pendant 1 h sous pression réduite à 50°C. On obtient 7,76 g (rendement : 54 %) du mélange d'orthoamides de formules III et IV.

Pour déterminer le rapport molaire des deux dia¬ stéréoisomères, un échantillon du mélange ainsi obtenu est transformé en un mélange d'acides N ⁵ -méthyl- tétrahydrofolique de formules XI et XII puis analysé par HPLC au moyen d'une colonne chirale RES0LV0SIL ^R selon l'enseignement de K.E.CHOI et al. Anal. Bioch. ,168,pages 398-404 (1988). Dans ce but, 11 mg du mélange III/IV qui a été obtenu est mis en supension dans 1,5 ml d'une solution aqueuse d'acide p-toluènesulfonique à 18 g/1; on ajoute 6 mg de NaBH _β CN en solution dans une faible quantité d'eau et agite le mélange résultant pendant 0,25 h à RT; on dilue ce mélange avec 7,5 volumes d'eau avant introduction dans le système HPLC. On déduit (du rapport des diastéréoisomères XII/XI) que, dans ledit mélange, III/IV les deux diastéréoisomères sont dans un rapport molaire IV/III de 7/3.

Par recristallisation répétée dudit mélange III/IV au moyen de H ₂ 0/HC00H 6/1 v/v, on obtient 1,1 g (rendement : 15,4 %) d'orthoamide de formule IV diasté- réoisométriquement pur.

On combine les liqueurs mères de la préparation du composé IV, les traite avec 190 ml d'eau et les laisse reposer à 4°C pendant 62 h. On obtient un précipité jaune brillant que l'on isole par filtration, lave avec H ₂ 0 puis avec de l'acétonitrile, sèche sous pression réduite

pendant 1 h à 50°C. On obtient ainsi 2,2 g d'un produit qui est constitué (selon analyse HPLC sur colonne RES0LV0SIL ^R ) d'un mélange III/IV dans un rapport molaire 96/4. La recristallisation de ce mélange est réalisée 5 comme suit : à un mélange de 252 ml d'eau et de 57 ml de HCOOH sous agitation, à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute une quantité suffisante de NH^OH pour ajuster le pH à 2,3; on porte le mélange résultant à la température de 60°C puis ajoute ledit mélange III/IV 96/4 ; on agite ° jusqu'à dissolution complète; le milieu réactionnel résultant est ensuite filtré à chaud sur Btlchner, et on laisse le filtrat reposer à RT pendant 8 h puis à 4°C pendant 60 h; le solide jaune brillant qui a précipité est isolé par filtration, lavé avec de l'eau puis de 5 1'acétonitrile et séché sous pression réduite pendant 1 h à 50°C pour donner 1,41 g (rendement : 20 %) de l'ortho¬ amide de formule III diastéréoisométriquement pur, comme cela est confirmé par analyse sur colonne RESOLVOSIL ^R . PREPARATION II ₀ Obtention de l'orthoamide de formule III (exemple

1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2) à _. partir du sel de calcium de l'acide (6RS)-folinique

Dans un mélange de 464 ml d'eau et de 136 ml de HCOOH sous agitation à 55-60°C et sous atmosphère inerte ₅ dans un réacteur pourvu d'une électrode de pH, on introduit 18,9 g de folinate de calcium pentahydraté de formule I, et agite le mélange résultant à 55-60°C pendant 1 h. On refroidit ledit mélange à 4 °C, ajuste le pH (apparent) à 2,35 en ajoutant goutte à goutte la ₀ quantité appropriée d'ammoniaque concentrée, et agite pendant une nuit à RT. Le précipité jaune qui s'est formé est isolé par filtration, lavage à l'eau puis à l'acétone. Par séchage sous pression réduite à 50°C pendant 1 h, on obtient 8,81 g d'un mélange IV/III dans 5 un rapport molaire de 7/3 selon l'analyse sur colonne

RES0LV0SIL ^R précitée.

Par recristallisation répétée de ce mélange au moyen de H ₂ 0/HCOOH 6/1 on obtient 1,32 g (rendement : 18,4 %) dOrthoamide de formule IV diastéréoisoméri¬ quement pur (confirmation par analyse HPLC comme indiqué ci-dessus).

Analyse élémentaire pour C _Q H ₂ ^NyOg,4H ₂ 0 théorie : C = 45,55% ; H = 5,54% ; N = 18,59% trouvé : C = 45,91% ; H = 5,27% ; N = 18,45% Spectre de masse MS(FAB)

(matrice rïhioglycérine; 8 keV) : 456(m ⁺ ,100), 412(7,5), 410(9,1), 326(10), 311(7,0), 283(11,6), 282(21,2) On combine les liqueurs mères et les dilue avec 80 ml d'eau. On refroidit à 0°C et agite à cette température sous atmosphère inerte pendant 24 h. On recueille le précipité formé par filtration sur Btlchner, lave avec de l'eau puis de l'acétone et sèche sous pression réduite à 50°C. On obtient 2,67 g d'un produit constitué de III/IV dans un rapport molaire de 98/2, selon l'analyse HPLC sur colonne RES0LV0SIL ^R précitée. Par recristallisation selon le mode opératoire donné à la préparation I ci-dessus (pour l'obtention du composé III), on recueille 1,91 g (rendement : 23,9%) du produit de formule III diastéréoisométriquement pur (confirmation par HPLC sur colonne RES0LV0SIL ^R précitée.) Analyse élémentaire pour C^H^ yO^,HCOOH,1/2H ₂ 0 théorie : C = 49,42% ; H = 4,74% ; N = 19,21% trouvé : C = 49,45% ; H = 4,70% ; N = 19,45%

Spectre de masse MS(FAB)

(matrice :thioglycérine; 8 keV) : 456(m ⁺ ,100), 412(13,3), 410(10,8), 326(13,3), 311(10,4), 283(13,7), 282(24,1), 232(39,4)

PREPARATION III

Obtention du sel de calcium de 5-CHO-(6S)-THF (exemple 3 ; formule V)

Dans un mélange dégazé de 2 litres d'eau et de 20 ml de 2-mercaptoéthanol maintenu sous agitation à RT sous une atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'un condenseur de reflux et d'une électrode de pH, on introduit 80 g du diastéréoisomère III pur obtenu selon la préparation II ci-dessus, puis 100 ml d'une solution aqueuse de tris(hydroxyméthylamino)méthane 2M. On chauffe le mélange résultant à 45-50°C et maintient le pH à 7,3 par addition de la quantité nécessaire de la solution de tris(hydroxyméthylamino)méthane jusqu'à dissolution com¬ plète de la matière solide. Le milieu résultant est porté au reflux pendant 4,5 h; on ajoute 3,3 g de noir de carbone à la solution chaude et poursuit l'agitation pendant 1 h tandis que l'on refroidit ledit milieu à RT. Après filtration du milieu réactionnel sur celite, on ajoute au fitrat 87 ml d'une solution aqueuse de CaCl 2M et dilue lentement la solution résultante avec 3,6 litres de EtOH (à 94 %). On conserve ladite solution ainsi diluée pendant une nuit à 0°C, on recueille par filtration le précipité formé, le lave avec EtOH (à 94%) puis MeCOMe. Par séchage sous pression réduite à 50°C pendant 2 h, on obtient 79 g de (6S)-folinate de calcium brut. Ce produit présente par HPLC une pureté de 96 %; par recristallisation répétée au moyen de H ₂ 0 et séchage sous pression réduite à 50°C, on obtient 43,5 g (rende¬ ment : 48,5 %) de (όS)-folinate de calcium pur. Analyses

- teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 15 %

- teneur en Ca : 8,11 % (théorie : 7,84 %)

- pureté HPLC : 100 %

- test HPLC [ contre l'étalon (6RS) de la phama- copée US] : 99,5 %

- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : 100 %

- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : ^λ max = 282 nm (£ = 30 060) ^λ in ^{= 242 nm} rapport des 2 pic d'adsorption A-^/A ₂ = 4,96

- [oi] _D = -14,6° ( c = 1 dans H ₂ 0) PREPARATION IV

Obtention du sel de calcium de 5-CHO-(6R)-THF (exemple 4 ; formule VI)

En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation III ci-dessus, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient le produit attendu.

Analyses

- teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 10,2 %

- pureté HPLC : 99 %

- test HPLC [ contre l'étalon (6RS) de la phama- copée US] : 95 %

- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure à 98 %

- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : max = 282 nm ( €=28 350) min = ^{242 nm} rapport des 2 pic d'adsorption A^/A ₂ = 4,25

- [oG _D ^≈ +39,8° ( c = 1 dans H ₂ 0) PREPARATION V

Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH ₂ ~(6S)-THF (exemple 5 ; formule X)

On met en suspension 10 g du diastéréoisomère orthoamide de formule IV dans une solution de 4,18 g de

H-TSA dans 130 ml de DMSO sec et agite à RT sous atmosphère inerte jusqu'à dissolution complète. On ajoute à RT 44 ml de pyridine puis on ajoute lentement (pendant

10 minutes) une solution de 880 mg de aBH^ dans 44 ml de DMSO. Après avoir agité le mélange résultant à RT pendant une durée de 10 minutes on refroidit le milieu réactionnel au moyen d'un bain de glace et on le dilue goutte à goutte avec un litre de méthyléthylcétone. On agite pendant 20 minutes à 0° C et recueille le précipité jaune formé par filtration ; on lave ce précipité avec de l'acétone (2 fois) et le sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h pour obtenir 6,14 grammes de 5,10-CH ₉ ~ (6S)-THF brut (probablement sous forme d'un sel mixte de Na ⁺ /pyridinium). Ce produit a une pureté apparente par HPLC de 87,2 % et contient environ 11 % de 5-Me-THF.

On ajoute par portion ce produit brut à 80 ml d'eau contenant des traces de NaOH sous agitation à 0° C sous atmosphère inerte : pendant cette opération le pH est maintenu à environ 9,0 par addition le moment venu de NaOH IN. On ajoute à la solution résultante 6,0 ml d'une solution aqueuse de MgCl 2M, ce qui amène le pH à 8,4. On élimine la petite quantité d'insoluble par filtration sur celite. Le filtrat résultant est agité à 0° C tout en étant dilué goutte à goutte avec 105 ml d'acétone ; après agitation pendant 45 autres minutes à 0° C on recueille le précipité par filtration, le lave (2 fois) à l'acétone et le sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h. On obtient 3,9 g du sel de magnésium attendu de formule X.

Analyses

- teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 14 %

- pureté HPLC : 92,3 %

(le produit contient 6 % de 5-Me-(6R)-THF) - pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure ou égale à 98 %

- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : λ _maχ ≈ 296 nm (ε =28 300)

*min " ²⁴⁴ ' ^{5 n} rapport des 2 pic d'adsorption A^/A = 3,68

- [*] _D = -88,7° ( c = 1 dans H ₂ 0) PREPARATION VI

Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH ₂ -(6R)-THF (Exemple 6 ; formule VIII) Ce produit est obtenu selon des modalités opératoires analogues à celles décrites dans la préparation V à partir du diastéréoisomère orthoamide de formule III.

Analyses - teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 14,0 %

- pureté HPLC : 95,7 %

(le produit contient 3,6 % de 5-Me-(6S)-THF)

- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 99 % - spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : λ _max = 296 n (£ =28 300) min ^{= 245} n* rapport des 2 pic d'adsorption A^/A ₂ = 4,11

- [*] _D " +123,9° ( c = 1 dans H ₂ 0) PREPARATION VII

Obtention de l'acide 5-Me-(6S)-THF

(Exemple 7 ; formule XI)

A une solution de 910 mg de H-TSA dans 53 ml d'eau, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute 1,0 g du diastéréoisomère orthoamide de formule III. On ajoute ensuite goutte à goutte une solution de 500 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 1 ml d'eau puis agite le mélange résultant pendant 5 h à RT ; il se forme un précipité blanc que l'on isole par filtration, lave avec de l'eau froide, de l'éthanol puis de l'acétone, sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h. On obtient 923 mg de l'acide brut de formule XI.

Ce produit brut est mis en suspension dans un mélange de 37 ml d'eau et 0,25 ml de 2-mercaptoéthanol.

Le mélange résultant est agité à RT sous atmosphère inerte et on ajoute une quantité suffisante de NaOH IN pour obtenir une dissolution complète. On filtre et acidifie le filtrat en ajoutant goutte à goutte HCl IN pour atteindre un pH de 3,5. Après agitation de la suspension résultante pendant 1 h à 0° C , on centrifuge, remet en suspension le solide d'abord dans de l'eau, puis dans de l'éthanol et enfin dans de l'acétone. Après séchage sous pression réduite à 50° C pendant 1 h, on obtient 636 mg de l'acide de formule XI attendu.

Analyses

- teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 10 %

- pureté HPLC : 96,0 %

- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 100 %

- spectre UV

(20 mg/1 dans tampon phosphate 0,1 M; pH 6,5) •: Λ _maχ = 290 n (£ =32 100) min = ^{245 nm} rapport des 2 pic d'adsorption A^/A ₂ = 3,65

- [ ]p = +38,0° ( c = 0,5 dans tampon phosphate

0,1M ; pH 6,5) PREPARATION VIII

Obtention de l'acide 5-Me-(6R)-THF (Exemple 8 ; formule XII)

En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation VII, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient l'acide attendu de configu- ration non-naturelle.

Analyses

- teneur en H ₂ 0 (selon FISCHER) : 11,5 %

- pureté HPLC : 96,3%

- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 100 %

- spectre UV

(20 mg/1 dans tampon phosphate 0,1 M; pH 6,5) : >. _maχ = 290 nm ( =32 500) rapport des 2 pic d'adsorption A-^/A = 3,74

- M _T) ⁼ "9,2° ( c = 0,5 dans tampon phosphate

0,1M ; pH 6,5) UTILISATION THERAPEUTIQUE

L'acide N ⁵ ,N ¹⁰ -méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydro- folique de formule X et ses sels (notamment le sel de magnésium obtenu selon le procédé de la préparation V ci- dessus) sont des produits diastéréoisomériquement purs, appartenant à la série des folates réduits de configuration non-naturelle, et utiles en thérapeutique. On a trouvé qu'ils inhibent la thymidylate synthétase et sont avantageusement destinés à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le cancer.

Selon l'invention, on préconise donc en tant que produits industriels nouveaux, l'acide 5,10-CH ₂ -(6S)-THF diastéréoisomériquement pur et ses sels diastéréoisoméri¬ quement purs.

On préconise également l'utilisation d'une substance diastéréoisomériquement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH ₂ -(6S)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase destinée à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le cancer.

En variante, on préconise également l'utilisa- tion dans laquelle (1) ladite substance diastéréoisoméri¬ quement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH2-(6S)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges est associée avec (2) un agent antinéoplasme notamment choisi parmi le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-2'-

désoxyuridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges.

Dans cette dernière utilisation, ladite substance (1) et ledit agent (2) sont avantageusement présentés sous la forme d'une composition en association avec un excipient physiologiquement acceptable. L'association (1) + (2) offre l'avantage de présenter des effets syner- gétiques.

Par ailleurs, on vient de trouver que le diasté- réoisomère de la série dite de configuration non- naturelle 5-CHO-(6R)-THF et ses sels présentent des pro¬ priétés cytostatiques intéressantes en thérapeutique. Le fait d'avoir pu déceler ces propriétés cytostatiques est (i) surprenant en ce sens que le 5-CHO-(6S)-THF de la série dite de configuration naturelle, l'acide folinique commercial de formule 5-CHO-(6RS)-THF et leurs sels ont été utilisés jusqu'à présent pour limiter les effets des agents cytostatiques tels que le méthotréxate, et (ii) bénéfique en ce sens que le 5-CHO-(6R)-THF et ses sels, qui sont peu toxiques, peuvent avantageusement remplacer, en totalité ou en partie, les agents cytostatiques ou antinéoplasmes de référence réputés très toxiques ou néfastes vis-à-vis de la cellule, tels que le métho¬ tréxate. Dans l'état actuel des connaissances, la Demande¬ resse présume que l'effet cytostatique qu'elle a décelé pour le 5-CHO-(6R)-THF et ses sels serait dû à une action bénéfique de ces produits sur un ou plusieurs enzymes essentiels des cellules; cependant, la Demanderesse n'est nullement liée par cet aspect théorique.

Ainsi selon l'invention, on préconise une nouvel¬ le utilisation d'une substance diastéréoisomériquement pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide (6R)- 5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule 5-CHO-(6R)- THF, ses sels non toxiques et leurs mélanges, pour

l'obtention d'un médicament cytostatique destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des maladies néopla- siques, notamment le cancer.

Bien entendu, selon l'invention, dans le cadre de la nouvelle utilisation des 5,10-CH ₂ -(6S)-THF, 5-CH0- (6R)-THF et de leurs sels non toxiques en tant que prin¬ cipes actifs cytostatiques, chaque principe actif inter¬ viendra à une dose thérapeutiquement efficace. Dans cette optique, on fera appel à une composition renfermant, en association avec un excipient physiologiquement accepta¬ ble, une quantité cytostatiquement efficace d'un ingré¬ dient actif choisi .parmi (a) le composé 5,10-CH ₂ ~(6S)- THF, ses sels non toxiques et leurs mélanges, et (b) le composé 5-CHO-(6R)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges.