KRELL HANS-WILLI (DE)
MARTIN ULRICH (DE)
KONETSCHNY RAPP SILVIA (DE)
KRELL HANS WILLI (DE)
MARTIN ULRICH (DE)
| WO1993011152A1 | 1993-06-10 |
| EP0192135A2 | 1986-08-27 |
M. MURAKAMI ET AL.: "Aeruginosin 298-A, a Thrombin Inhibitor from the Blue-Green Alga microcystis aeruginosa", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 35, no. 19, 9 May 1994 (1994-05-09), OXFORD GB, pages 3129 - 3132
G. DE NANTEUIL ET AL.: "New Tripeptidic Thrombin Inhibitors. Influence of P2 and P3 Residues on Activity and Selectivity", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 3, no. 8, pages 1019 - 1024
| 1. | Verbindungen der Formel I in der R und R . die gleich oder verschieden sein können, eine Hvdroxv oder eine λcvloxygruppe bedeuten und RJ Wasserstoff darstellt, wobei R2 und RJ gemeinsam auch einen Valenzstπch bedeuten können, deren optische aktive Formen, sowie deren pharmakologisch unbedenkliche Saureadditionssaize Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man Cyanobakterien der Art Oscillatoria agardhii in üblicher Weise unter Dauerbelichtung kultiviert und das Produkt der Formel I. in der R1 und R2 Hydroxy und RJ Wasserstoff bedeuten, nach üblichen Methoden isoliert und anschließend die erhaltenen Verbindungen gewunschtenfails acvliert oder in eine andere Verbmdune der Formel I überfuhrt Verbindungen, erhaltlich nach Verfahren gemäß Anspruch 2 4 .Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß πAnspruch 1 oder 3 neben üblichen Trager und Hilfsstoffen 5 Verwendung von Verbindungen gemäß πAnspruch 1 oder 3 zur Herstellung von .Arzneimitteln mit Thrombininhibierender Wirkung. b Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 3 zur Herstellung von Arzneimitteln mit Trypsininhibierender Wirkung. |
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Dipeptid-Derivat. Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in pharmazeutischen Präparaten.
Das neue Dipeptid-Derivat hat die Struktur gemäß Formel (I):
Es wird als Oscillarin bezeichnet.
Die Erfindung betrifft auch Derivate der Verbindung der Formel (I). Unter Derivaten versteht man Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III) in der R und R' gleich oder verschieden sind und Acylgruppen bedeuten, vorzugsweise die Formvl-, Acetyl-, Propionyi- und Benzoylgruppe.
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Ferner betrifft die Erfindung alle Salze der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (III). Salze sind in erster Linie die Saureadditionssalze. Für pharmazeutische Zwecke kommen hauptsachlich physiologisch unbedenkliche Salze in Frage. Beispiele von physiologisch verwendbaren Salzen der Verbindung der Formel (I) sind Salze mit physiologisch vertraglichen Mineralsauren. wie Salzsaure, Schwefelsaure, schweflige Saure oder Phosphorsaure, oder mit organischen Säuren, wie Methansulfonsaure, p- Toluolsulfonsaure, Essigsaure. Trifluoressigsaure. Zitronensaure. Fumarsaure. Maleinsäure. Weinsaure. Bernsteinsaure oder Salicylsaure
Zur Isolierung oder Reinigung können auch pharmazeutisch ungeeignete Salze Verwendung finden. Die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (III) können solvatisiert, insbesondere hydratisiert sein Die Hydratisierung kann im Zuge der Herstellung erfolgen oder allmählich als Folge hygroskopischer Eigenschaften der zunächst wasserfreien Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (III) auftreten
Die Verbindungen der Formeln (I) bis (III) besitzen mehrere Asymmetriezentren Gegenstand der Erfindung sind somit auch die optisch aktiven Formen
Weiter wurde gefunden, daß die neuen Dipeptid-Derivate der Formeln (I) bis (III) sowie alle ihre Hydrate. Solvate und physiologisch vertraglichen Salze sowohl die durch Thrombin induzierte Gerinnung von Fibrinogen im Blut als auch die durch Thrombin induzierte Aggregation der Blutplattchen hemmt. Sie verhindern damit die Entstehung von Gerinnungsthromben und von plättchenreichen Thromben und können bei der Bekämpfung und Verhütung von Krankheiten, wie Thrombosen. Apoplexie, Herzinfarkt. Entzündungen und Arteriosklerose. verwendet werden
Thrombin. das letzte Enzym der Gerinnungskaskade, spaltet Fibrinogen zu Fibrin, das durch den Faktor XIII quervernetzt und zu einem unlöslichen Gel wird, das die Matrix für einen Thrombus bildet. Thrombin aktiviert durch Proteolyse seines Re- zeptors auf den Blutplattchen die Plättchenaggregation und tragt auf diesem Weg ebenfalls zur Thrombusbildung bei. Bei der Verletzung von Blutgefäßen sind diese Prozesse notwendig, um eine Blutung zu stoppen. Unter normalen Umstanden sind
/11941 PC17EP95/03982
keine meßbaren Thrombin-Konzentrationen im Blutplasma vorhanden. Ansteigen der Thrombinkonzentration kann zur Ausbildung von Thromben und damit zu thromboembolischen Krankheiten fuhren, die vor allem in den Industriestaaten sehr häufig auftreten. Thrombin wird im Plasma in Form des Prothrombins bereitgehalten, und durch den Falctor Xa aus diesem freigesetzt. Thrombin aktiviert die Faktoren V, VIII und XI die dann den Faktor X in Xa umwandeln Thrombin katalysiert dadurch seine eigene Freisetaing, weshalb es zu sehr rasch ansteigenden Thrombin-Kon¬ zentrationen kommen kann Thrombin-Inhibitoren und Faktor Xa-Inhibitoren können deshalb die Freisetzung des Thrombins. die plattcheninduzierte und die plasmatische Blutgerinnung hemmen.
Neben Thrombin hemmen die neuen Dipeptid-Derivate der Formeln (I) bis (III) auch Trypsm. jedoch nicht Plasmin Alle drei Enzyme gehören zur Klasse der Serinproteasen, die Peptidsubstrate neben einer basischen Aminosäure spalten
Trypsm in ein Verdauungsenzym, das vom Pancreas bei Bedarf ausgeschüttet wird. Bei Verletzungen oder Entzündungen des Pancreas kann die dadurch bedingte er¬ höhte Freisetzung von Trypsin zur Gewebezerstorung fiihren. Trypsin-Inhibitoren können diese Gefahr eindämmen und zur Behandlung etwa der Pancreatitis eingesetzt werden.
Plasmin ist ein proteoiytisches Enzym, dessen Aktivität der des Trypsins ähnelt Es wird im Plasma unter dem Einfluß von Aktivatoren aus dem Protein Plasminogen gebildet und dient zur Auflosung der Thromben, indem es Fibrin abbaut. Hemmung des Plasmins hatte also gerade den gegenteiligen Effekt, den man mit der Hemmung des Thrombins erzielen mochte.
Eine dem neuen Dipeptid-Derivat der Formel (I) strukturell ahnliche Verbindung (Aeruginosin 298- A), die ebenfalls Thrombin und Trypsin inhibiert, wurde aus dem Cyanobakterium Microcystis aeruginosa isoliert (M. Murakami et al ( 1994) Tetra¬ hedron Lett. 3_5, 3129-3132) Vor kurzem wurden zwei weitere Vertreter dieses Strukturtyps mit ahnlichem Wirkprofil gegenüber Serinproteasen veröffentlicht (M
Murakami et al. ( 1995) Tetrahedron Letters 36, 2785-2788) Ferner wurden aus Microcystis aeruginosa die Micropeptine A. B und 90 als potente Trypsin- und Plasmin-Inhibitoren beschrieben (T Okino et al. (1993) Tetrahedron Lett 34, 8131- 8134; K. Ishida et al. ( 1995) Tetrahedron Lett. 36, 3535-3538). Von N Fusetani et 5 al wurden Thrombin-Inhibitoren aus dem Meeresschwamm Theonella sp. publiziert, die Cyclopeptide Cyclotheonamid A und B. die auch Trypsin und Plasmin hemmen (N Fusetani et al. ( 1990) J Am Chem. Soc JT 2, 7053-7054) sowie das lineare Peptid Nazumamid A. das kein Trypsin-Inhibitor ist (N Fusetani ( 1991 ) Tetrahedron Lett. 32, 7073-7074)
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Man erhalt das neue Dipeptid-Derivat der Formel (I), wenn man geeignete Blaualgen (Cyanobakterien), vorzugsweise der Art Oscillatonae agardhii, in üblicher Weise in einer mineralischen Nährlosung, der Spurenelemente zugesetzt sind, unter Dauer¬ belichtung kultiviert und das Produkt der Formel (I) nach den üblichen Methoden
15 isoliert
Die Erfinding betrifft auch Kulturbruhen und die aus diesen gewonnenen Extrakte und Konzentrate, welche die Verbindung der Formel (I) enthalten.
20 Bei Kenntnis der Eigenschaften der neuen Verbindung der Formel (I) ist es mit Hilfe von üblichen chromatographischen, spektroskopischen und/oder Gerinnungs- /Enzymtests (Thrombin, Trypsin) leicht möglich, in Routineverfahren geeignete Cyanobakterienstamme auszusuchen, welche die erfindungsgemaße Verbindung der Formel (I) produzieren
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Zur Gewinnung des Dipeptid-Derivats der Formel (I) eignen sich bevorzugt Cyanobakterien der Art Oscillatoria agardhii Gomont. Die Algen können von öffent¬ lich zuganglichen Algensammlungen, wie z.B der American Type Culture Collection (ATCC) oder der Sammlung von Algenkulturen in Gottingen, bezogen werden .Alternativ können auch Eigenisolate von Oscillatoria agardii verwendet werden Sie lassen sich aus Wasserproben von meso- oder eutrophen Seen, bevorzugt in Mittel- und Nordeuropa, mit klassischen und konventionellen Methoden isolieren Seit Jahren
entwickelt sich Oscillatoria agardhii in hollandischen hypertrophen Seen zur dominanten Spezies (C. Berger, ( 1975) Int. Ver. Theor. Angew Limnol. Verh 19, 2689-2697)
Für die Eigenisolation können die Algen mittels eines konventionellen Planktonnetzes aus dem Gewässer gefischt werden Vorzugsweise werden die Algen direkt einer Algenblute entnommen. Für eine Erstanreicherung eignen sich Nährboden mit einer Zusammensetzung wie im folgenden beispielhaft beschrieben
Nahrmedium 1
0 7 g KNO 3 . 0 05 g Ca(NO 3 ) 2 x 4 H 2 O. 0 1 g NaNO 3 , 0.2 g MgSO x 7 H 2 O. 0 4 g K2HPO4, 5 ml Spurenelementlosung, 15 0 g Agar. 1000 ml deionisiertes Wasser, pH 7 5
Spurenelementlosung: 800 mg NaFeEDTA x 2 H2O. 10 mg MnCh x 4 H O, 2 mg CoCh, 1 mg CuSO 4 , 1 mg Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O, 2 mg ZnCh, 0 5 mg LiCl. 0 5 mg SnCh x 2 H 2 O, 1 mg H3BO3, 2 mg KBr, 2 mg KJ, 0 5 mg BaCl 2 , 1000 ml deionisiertes Wasser, pH 6
Weitere Isolierungsmethoden sind bei E.G Pringsheim (HAJgenreinkulturen. VEB Gustav Fischer, Jena, 1954) zu finden. Oscillatorien haben keine Heterocvsten und bilden keine Sporen. Die Trichome bewegen sich durch charakteristiche pendelartige Schwingungen. Sie besitzen keine Gallertscheide. Die scheibenförmigen Zellen enthalten immer eingewachsene Querwände unterschiedlichen Alters.
Zur Anzucht von Oscillatoria agardhii und somit zur Produktion von Oscillarin können alle gangigen Kulturverfahren angewendet werden, die eine ausreichende Bio¬ massenproduktion ermöglichen. Die Bildung von Oscillarin ist prinzipiell unabhängig von den verwendeten Kulturgefäßen Kultivierung auf Nähragar. Roller und Schuttelkolben sowie alle beschriebenen Fermentertypen eignen sich gleichermaßen
Die Anzucht erfolgt in allen Fällen unter sterilen Bedingungen. Die Beimpfung der Nahrmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden. z.B Schragrohrchen oder Kolbenkulturen
Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Cyanobakterien verwendet werden
Bevorzugt wird ein mineralisches Grundmedium nach Zielinski in leicht modifizierter Form eingesetzt
Nahrmedium 2
3 6 mg CaCl 2 x 2 H 2 O, 20.3 mg Ca(NO 3 ) 2 x 4 H 2 O, 2 7 mg KC1, 1.5 mg K 2 HPO 4 , 76 0 mg MgSO x 7 H O, 84 0 mg NaHCO 3 , 1 ml Spurenelementlόsung, 1000 ml deionisiertes Wasser Spurenelementlosung 875 mg Na 4 EDTA, 9 7 mg Co(NO 3 ) x 6 H 2 O. 284 mg FeCh 6 H 2 O, 72.2 mg MnCl 2 x 4 H O, 25 2 mg Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O. 43 7 mg ZnSO 4 x 7 H 2 O, 1000 ml deionisiertes Wasser (K Zielinski. Dissertation. Univ Freiburg, 1988, S.23)
.Alternativ kann auch ein modifiziertes Medium nach A. Zehnder und E O Hughes verwendet werden
Nahrmedium 3
200 mg NaNO 3 , 10 mg NH 4 CI, 65 mg K 2 HPO x 3 H 2 O. 50 mg MgSO 4 x 7 H 2 O. 13 mg CaCl 2 x 2 H 2 O. 1 ml Spurenelementlosung, 1000 ml deionisiertes Wasser
Spurenelementlosung: wie Nährmedium 2 (A. Zehnder. E O Hughes (1958) Can J Microbiol 4, 309-408)
Die Kulturen werden üblicherweise dauerbelichetet, z.B. mit Philips "warm white" fluorescent lamp TLE 22W/33 (durchschnittliche Bestrahlung z.B 30 Wm "2 ) und standig mit sterilfiltrierter Raumluft begast. Die Wachstumstemperatur kann zwischen etwa 15 und etwa 35 °C. vorzugsweise bei etwa 20 °C liegen. Der pH-Wert der
wachsenden Kulturen sollte zwischen 7 und 10, vorzugsweise auf 8.5 eingestellt sein. Ein Anstieg des pH-Werts der Nährlösung in den stärker alkalischen Bereich (durch Photosynthese) sollte vermieden werden z.B. durch Zudosieren von gasförmigem CO 2 Licht- und Temperaturwechsel können beliebig verändert werden, wobei die Ausbeute an Oscillarin beeinflußt wird.
Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Cyanobakterien ausreichend mit Nähr¬ stoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Ruhren, Schuttein und Begasen erfolgen.
Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. In der Regel betragt die Fermentationsdauer 8 bis 30 Tage. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden
/Mle Abweichungen und Modifikationen von den beschriebenen Kulturbediπgungen sind möglich.
Die Aufarbeitung der Kulturen erfolgt nach üblichen Methoden durch Abtrennen der Algenzellen mittels Zentrifugation oder Filtration. Zur Gewinnung des Dipeptid- Derivats der Formel (I) werden die abgetrennten Zellen mit πHilfe der üblichen Me¬ thoden z.B. durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol auf¬ geschlossen. Dazu kann die Zellmasse auch vorher lyophilisiert werden
Die Verbindung der Formel (I) kann in geringeren Mengen auch im Kulturuberstand enthalten sein, aus dem sie entsprechend üblicher Methoden, wie z.B Adsorption an geeignete Harze, Ionenaustaucher oder Aktivkohle gewonnen werden kann
Aus den gewonnenen organischen Rohextrakten kann die Verbindung der Formel (I) mit Hilfe der üblichen Extraktions-. Adsorptions-. Fällungs- und/oder Chromato¬ graphieverfahren isoliert und gegebenenfalls feingereinigt werden. Dazu können alle
geeigneten Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische sowie alle üblichen anorgani¬ schen und organischen Trennphasen, wie z.B. unmodifizierte und modifizierte Kieselgele. Ionenaustauscher, gelchromatographische Phasen oder Adsorberharze eingesetzt werden. Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Dipeptid-Derivats der Formel (I) nach folgendem Verfahren.
Das Lyophilisat der abzentrifugierten Zellmasse wird mit Methanol aufgeschlossen Anschließend wird der organische Extrakt einer Flussig/flüssig- Verteilung zwischen Wasser und Butanol unterworfen. Der Butanolextrakt wird an einer CN-modifizierten Kieselgelphase mit Hilfe eines Wasser/ Acetonitril-Gradienten unter sauren Be¬ dingungen, bevorzugt bei pH < 3 aufgetrennt. Die die Verbindung der Formel (I) ent¬ haltenden Fraktionen werden anschließend an Kieselgel z.B mit Chloro- form/Methanol/Eisessig/Wasser (65:25:3 4) als Fließmittel Chromatographien
Die weitere Aufreinigung kann mittels mehrerer hochdruckflussigkeitschromatogra- phischer Schritte an einer C 18-modifizierten πKieselgelphase erfolgen Als Fließmittel werden Actonitril/Wasser-Gemische bzw -Gradienten mit unterschiedlichen pH- Werten eingesetzt. Nichtflüchtige Puffer können nach den üblichen Methoden z.B durch Reversed-Phase-Chromatographie über eine C 18-Phase oder durch Gelchromatographie abgetrennt werden.
Je nach verwendetem Puffer werden unterschiedliche Salze der Verbindung der Formel (I) erhalten, wie z.B. das Trifluoroacetat bei Verwendung von Trifluoressigsaure oder das entsprechende Phosphat bei Verwendung von Phosphatpuffern Das Gegenanion der Verbindung der Formel (I) in diesen Salzen kann nach den allgemein üblichen Methoden, wie z.B. mit Hilfe eines Anionenaustauschers gegen ein anderes Gegenion ausgetauscht werden
Aus ihren Losungen kann die erfindungsgemaße Verbindung nach den üblichen Methoden. z.B. Verdampfen des Losungsmittels, Gefriertrocknung usw erhalten werden
Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in weichen die erfindungsgemaße Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z.B. HPLC, DC oder biochemische Methoden wie z.B. Bestimmung der Thrombinzeitverlangerung oder der Hemmung der enzymatischen Aktivität von Thrombin oder Trypsin herangezogen werden
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) stellt man aus dem Dipeptid-Derivat der Formel (I) nach an sich bekannten Methoden dar Die Umsetzung erfolgt mit Λcylierungsreagenzien wie Carbonsauren unter Wasserabspaltung oder durch aktivierte Carbonsaurederivate wie Säurechloride und -anhydride oder aktivierte Ester in einem neutralen Losungsmittel wie Toluol, Dichlormethan, Diethylether oder Tetrahydrofuran bei Temperaturen zwischen -20°C und dem Siedepunkt des Losungsmittels, vorzugsweise in Gegenwart von Basen wie Triethylamin, Di- methylarninopyridin oder in Pyridin, das man als Losungsmittel einsetzt.
Verbindungen der allgemeinen Formel (III) stellt man durch Wasserabspaltung aus der Verbindung der Formel (I) und anschließender Acylierung entsprechend den oben für V erbindungen der Formel (II) genannten Methoden dar. Die Wasserabspaltung geschieht bevorzugt in einem neutralen Lösungsmittel wie Toluol, Dichlormethan, Diethylether oder Tetrahydrofuran in Gegenwart von Sauren wie Salzsaure. Schwefelsäure oder Trifluoressigsaure
Zur Herstellung von Arzneimitteln werden die Substanzen der allgemeinen Formen! (I) bis (III) und ihre Salze mit geeigneten pharmazeutischen Trägersubstanzen. .Aroma-, Geschmacks- und Farbstoffen gemischt und beispielsweise als Tabletten oder Dragees ausgeformt oder unter Zugabe entsprechender Hilfsstoffe in Wasser oder Ol, z B in Olivenöl, suspendiert oder gelost
Die Substanzen der allgemeinen Formeln (I) bis (III) und ihre Salze können in flussiger oder fester Form enteral oder parenteral appiiziert werden Als Iniektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei
Injektionslosungen üblichen Zusätze wie Stabilisierungsmittel. Lösungsvermittler oder Puffer enthält. Derartige Zusätze sind z.B. Tartrat- und Citratpuffer. Komplexbildner (wie Ethylendiamintetraessigsaure und deren untoxische Salze) und hochmolekulare Polymere wie flüssiges Polyethylenoxid zur Viskositatsregulierung. Feste Tragerstoffe sind z B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, Talcum, hochdisperse Kieselsauren, hochmolekulare Fettsauren (wie Stearinsaure), tierische und pflanzliche Fette und feste hochmolekulare Polymere (wie Polvethylenglykole) Für orale Applikation geeignete Zubereitungen können gewunschtenfalls Geschmacks- und Sußstotfe enthalten
Die Verbindungen werden üblicherweise in Mengen von 10-1500 mg pro Tag bezo¬ gen auf 75 kg Korpergewicht appliziert. Bevorzugt ist es. 2-3 mal pro Tag 1 -2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 5-500 mg zu verabreichen. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch nur noch einmal pro Tag 1 -2 Tabletten mit 20- 700 mg Wirkstoff gegeben werden müssen. Der Wirkstoff kann auch durch Injektion 1-8 mal pro Tag oder durch Dauerinfusion gegeben werden, wobei 50-2000 mg pro Tag normalerweise ausreichen.
Herstellungsbeispiele
Beispiel 1
Produktion der Biomasse
Drei 20 I Glaszylinder, die mit einer pH-Regeleinheit ausgestattet sind, werden mit dem oben angegebenen, sterilfiltierten Nahrmedium 2 beschickt, mit jeweils 50 ml Vorkultur von Oscillatoria agardhii beimpft und bei einem konstanten pH von 8 5, einer Temperatur von 20 °C und einer durchschnittlichen Bestrahlung von 30 Wm ~ 2 unter standiger Begasung mit sterilfiltierter Raumluft ca 14 Tage inkubiert
Aufarbeitung der 3x20 L Kulturen
Zum Emtezeitpunkt werden die drei 20 1 Kulturen vereinigt und die Zellen und Nährlösung durch schonende Zentnfugation (5000g, 10 min) getrennt Die Biomasse wird bei -20°C eingefroren und anschließend lyophilisiert Der Überstand (ca 57 1) wird über einen starken Kationenaustauscher (Bio Rad AG 50W-X8/H + -Form. 2 kg) gegeben, der anschließend mit 5 I Wasser gewaschen wird Von diesem wird die Verbindung der Formel (I) mit 10 1 1 M Ameisensaure eluiert und das Eluat bei 40 °C am Rotationsverdampfer eingeengt
Das Lyophilisat (ca. 30 g) wird einmal mit 1000 ml und zweimal mit je 500 ml Methanol extrahiert und die vereinigten Methanolphasen zur Trockne eingeengt. Der Methanolextrakt (ca. 7 g) wird in in 500 ml Wasser aufgenommen und dreimal mit je 500 ml Butanol ausgeschüttelt Die Butanolphasen werden vereinigt und bei 40 °C am Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert .Analog wird mit dem konzentrierten Eluat der Kationenaustauschersaule (ca. 30 g) verfahren
Die Butanoiextrakte (ca 5 g aus dem Lyophilisat bzw ca. 2 g aus dem Kationenaus- tauschereluat) werden vereinigt, in 150 ml Methanol aufgenommen und auf ca 25 g LiChroprep-CN-Phase (25-40 μm) aufgezogen und über eine LiChroprep-CN-Saule chromatographiert (Säule. 52 x 356 mm; Fließmittel-Gradient Wasser/ Acetonitril/Tri- fluoressigsaure von ( 100 0 0 1 ) bis (50:50 0 1 ), Gesamtelutionsvolumen 5 1)
Die die Verbindung der Formel (I) enthaltenden Fraktionen, die z.B mit Hilfe der DC oder des Thrombinzeitverlangerungsassays identiziert werden können, werden vereinigt und bei 40 °C am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt.
Das Konzentrat (ca. 1 g) wird in 100 ml Methanol gelöst, auf ca. 5 g Kieselgel LiChroprep Si60 ( 15-25 μml aufgezogen und über eine Kieselgelsäule (26 x 360 mm) mit 1500 ml Chlorofoim/Methanol/Eisessig/Wasser (65 25:3 4) als Fließmittel chromatographiert
Die vereinigten (I) enthaltenden und aufkonzentrierten Fraktionen (ca. 200 mg) wer¬ den zur weiteren Reinigung in 3 ml Methanoi aufgenommen und über eine Hoch- druckfkussigkeitschromatographie an Nucleosil-100 RP18 ( 10 μm. Säule 20 x 250 mm) mit Wasser/ Acetonitril/Trifluoressigsaure (70 30 0.1 ) als Fließmittel weiter getrennt.
Die aufkonzentrierte, die Verbindung der Formel (I) enthaltende Fraktion (20 mg) wird in 1 ml Methanol aufgenommen und einer weiteren Hochdruckflussigkeits- chromatographie unterworfen ( Säule Nucleosil-100 RP18. 10 μm. 20 x 250 mm.
Fheßmittel 50 mM Phosphatpuffer pH 7 8/Acetorutπl (70 30)) Die nur (I) enthaltende Fraktion wird auf ca 5 ml wassπge Losung eingeengt
Zur Entfernung des Puffers wird das Konzentrat über eine Nucleosιl-100 RP18-Saule 1 15 x 100 mm) gegeben, wobei die Verbindung der Formel (I) gebunden wird Nach Waschen mit 100 ml Wasser erfolgt die Elution von (I) mittels 200 ml Wasser/Methanol ( 10 90) Das methanolische Eluat. das nur die Verbindung der Formel (I) enthalt, wird am Rotationsverdampfer bei 40°C zur Trockne eingeengt Man erhalt ca 3 mg reines ( I) als Phosphatsalz
λnalvsendaten von (I), welche auch zur Charakterisierung der Verbindung geeignet
!H-NMR (500.14 MHz) |a|: Ö 7 87 (t. IH), 7 33-7 17 (Aromaten. 10 H), 5 64 (verbreitert. IH), 4 8 ( IH), 4 25 ( dd. 3 8. 7 2 Hz, IH), 4 18 (unres m, 4H), 4 13 (t. 9 3 Hz, IH), 4 00 (unres m. IH), 3 64 (m, IH), 3 42 (m, IH). 3 28 (m, IH), 3 07 (dd. 3 4.13 9 Hz, IH), 2 89 (dd. 5 7, 12 7 Hz. 1 H), 2 83 (dd, 7 7. 13 9 Hz. IH), 2 81 (dd. 9 4. 12 7 Hz, IH), 2 41 (m, 2H), 2 13 (m, IH), 1 97 (dt. 12 5. 7 5 Hz, IH), 1 82 (m. IH), 1 77 (dt, 10 2. 12 5, IH), 1 58 (dt. 2 8. appr 13 Hz. IH), 1 43 (m, IH). 1 42 (m. IH), 1 41 (m. IH), 1 33 im, IH)
l3 C-NMR(125.77 MHz) [al: δ 174 30 (s), 171 64 (s), 139 00 (s), 137 92 (s), 137 20 (s), 130 86 (d), 130 70 (d), 129 81 (d), 129 27 (d), 128 35 (d), 127 60 (d), 120 77 (d), 73 84 (d), 66 52 (d), 61 69 (d), 56 62 (t), 56 38 (d), 55 3 1 (t), 53 52 (d). 41 77 (t), 40 00 (t), 38 47 (t), 37 58 (d), 34 08 (t), 3 1 86 (t), 29 46 (t), 26 78 (t), 19 87 (t)
LSIMS (Hochauflösung): 617 34587 Da [M+HH Summenformel C 34 H 4 5Ngθ5
Rf-Werte: 0 66 (Butanol/Eisessig/Wasser 4 2 2, Kieselgel 60 F 2 5 4 ) 0 57 (Chloroform/Methanol/Eisessig/Wasser 65 25 3 4, Kieselgel 60 F 2 5 4 )
HPLC- Kapazitätsfaktor (b|: k 1 = 4 25
(Nucleosιl- 100 RP18. Fließmittel Wasser/ Acetonitril/Trifluoressigsaure (70 30 0 1 ))
[a] Bruker AMX 500 Kemresonanzspektrometer. Konzentration der Probe 13 mM Phosphatsalz in CD 3 OD und m CD OH. 305 K. Referenz TMS
[b] ' = (tR - t m ) / t m , tR = Gesa tretentionszeit. t m = Totzeit
Pharmakologische Versuchsbeschreibung
Thrombinzeit
Ein in der klinischen Geπnnungsdiagnostik gebrauchlicher Test ist die Thrombinzeit Dieser Parameter erfaßt die Thrombinwirkung auf Fibrinogen und die Geπnnsel- bildung Inhibitoren von Thrombm bewirken eine Verlagerung der Thrombinzeit
Zur Plasmagewinnung wurden 9 Teile frisches Blut gesunder Spender mit einem Teil Natπumcitratlosung (0 1 1 Mol/1) gemischt und bei ca 3000 U/min 10 Mm bei Raumtemperatur zentrifugiert Das Plasma wurde abpipettiert und kann bei Raum¬ temperatur ca 8 h aufbewahrt werden
200 μl Citratplasma wurden in einem Kugelkoagulometer (KC10 der Firma πAmelung) 2 Min bei 37° C inkubiert Zu 190 μl vortempeπertem Thrombin-Reagenz (Boehπnger Mannheim. GmbH, enthalt ca 3 U/ml Pferdethrombin und 0 0125 M Ca- ~ ) gab man 10 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) oder eine Losung der Wirksubstanz in DMSO Mit Zugabe dieser 200 μl Losung zum Plasma wurde eine Stoppuhr ge¬ startet und der Zeitpunkt bis zum Eintritt der Gerinnung bestimmt Die Thrombinzeit betrug bei den Kontrollmessungen ca 24 Sek und wurde durch die Wirksubstanz der
Formel (I) konzentrationsabhängig verlängert (Testkonzentration Thrombinzeit- verlängerung: 340 nM / > 300* see; 34 nM / 65 see; 3.5 nM / 5 see). * Nach 5 Min. wurde der Versuch abgebrochen.
Thrombin-Inhibierung
Die kinetischen Messungen wurden in 0.1 M Phosphatpuffer, der 0 2 M Kochsalz und 0 5% Polyethylenglycol 6000 enthielt, bei einem pH = 7 5 und 25° C mit dem Substrat H-(D)-Phe-Pro-Arg-pNA (S-2238 Kabi) und humanem α-Thrombin ( Sigma. spezifische Aktivität = 2150 NIH-units/mg) in Polystyrol-Halbmikroküvetten in einem Gesamtvolumen von 1 ml durchgeführt.
In einem Vorversuch wurde bestimmt, ob die Verbindung der Formel (I) Thrombin schnell oder langsam inhibiert. Dazu wurde die Reaktion einmal durch Zugabe von 0.03 NIH-units Thrombin zu einer 100 μM-Lösung des Substrats und des Wirkstoffs gestartet. In einem zweiten Versuch wurde Substrat zu einer 5 Min. inkubierten Lösung des Thrombins und des Wirkstoffs gegeben. Die Zunahme der Konzentration von p-Nitroanilid mit der Zeit wurde spektrophotometrisch (UN-VIS-Spektro- photometer Lambda-2 der Firma Perkin-Elmer) bei 405 nm 12 Min. verfolgt. Da die bei beiden Versuchen erhaltenen Messkurven linear und parallel waren, handelt es sich bei der Wirksubstanz der Formel (I) um einen schnellen Thrombin-Inhibitor. Die Inhibitionskonstante Kj wurde wie folgt bestimmt. Das Substrat wurde in den Konzentrationen 100 μM, 50 μM, 30 μM, 20 μM eingesetzt und bei jeder Substrat¬ konzentration eine Messung ohne Inhibitor und drei Messungen in Gegenwart unter- schiedlicher Konzentrationen des Inhibitors der Formel (I) durchgeführt Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Thrombin gestartet. Die Zunahme der Extink¬ tion bei 405 nm durch das entstehende p-Νitroanilid über einen Zeitraum von 12 Min verfolgt. Im Abstand von 20 Sek wurden Meßpunkte (Zeit vs. Extinktion) auf einen PC übertragen Aus den Daten wurden die Geschwindigkeiten V 0 (Extinktionsänderungen pro Sek.; Messungen ohne Inhibitor) und Vj (Messungen mit Inhibitor) durch lineare Regression bestimmt. Benutzt wurde nur der Teil jeder Messung, bei dem sich die Substratkonzentration um weniger als 15 % vermindert
hatte. Aus einer Meßreihe ( konstante Inhibitorkonzentration, variable Substratkon¬ zentrationen) bestimmte man K m ' und V max durch nichtlinearen Fit auf die Gleichung
v max * [ s ] V
[S] - κ m
Aus den gesamten Meßreihen berechnete man schließlich K: durch nichtlinearen Fit auf die Gleichune
v max * t s l V =
K m * ( l [SjTKi) - [S]
Die Michaeliskonstande K m betrug in allen Messungen 3.8 ; 2μM
Die Inhibitionskoπstante Kj der Wirksubstanz der Formel (I) betragt 150 nM
Inhibierung von Trvpsin und Plasmin
10 mg Bovines pancreatisches Trypsin (Sigma) wurden in 100 ml mM Salzsaure gelöst und im Kühlschrank aufbewahrt. 20 μl davon wurden mit 980 μl 1 mM Salz¬ saure versetzt. 25 μl davon wurden für jede Messung verwendet. Die Messung wurde wie für Thrombin beschrieben durchgeführt. K m = 45 μM Die erfindungsgemäße Verbindung (I) hemmt Trypsin mit einer Inhibitionskonstante Kj von 100 nM Die Messungen mit humanem Plasmin (Sigma. 10 Units) wurden mit dem Substrat S- 2251 (H-(D)-Val-Leu-Lys-pNA. Kabi) wie für Thrombin beschrieben durchgeführt Pro Messung wurden 0 01 Units Plasmin verwendet K m = 250 μM. Die Verbindung der Formel (I) hemmt Plasmin nicht (Kj > 400 μM)