Domaine technique

La présente invention concerne des composés de type disaccharide qui sont capables d’augmenter la production de calcium des cellules pré-ostéoblastiques et qui sont donc utilisables pour le traitement de certaines maladies osseuses.

Art antérieur

Les fractures de l’os sont des traumatismes fréquents et les complications de consolidation osseuse, malgré l’opération réalisée par un orthopédiste, constituent une problématique médicale. En effet, la consolidation osseuse n’est pas un phénomène constant, il existe en effet 10% des cas de fracture qui vont aboutir à une non- consolidation osseuse, et ce en l’absence de facteur de risque particulier. A l’opposé, en cas d’erreur technique (fixation inadéquate, contrôle approximatif de la rotation, notamment dans les fractures diaphysaires des os longs), le risque de non- consolidation est estimé à 50 %. Entre ces deux extrêmes, le risque de non- consolidation est fonction de la présence de facteurs locaux et généraux et peut atteindre 30%. Parmi ces facteurs, l’ostéoporose, le diabète type I, l’alcool... La fracture en lien avec l’ostéoporose touche 50% des femmes et 20% des hommes de plus de 50 ans. Elle se caractérise par une dégradation de la qualité et de la quantité de l’os ce qui augmente de façon marquée le risque d’avoir des fractures.

La prise en charge actuelle de référence des défauts osseux est l’autogreffe. La pièce osseuse est prélevée soit en zone spongieuse, soit en zone corticale ou encore cortico-spongieuse. Elle permet l’apport de la fraction minérale, de la fraction protéique avec ses protéines collagéniques et non collagéniques matricielles. Ce pool cellulaire suffit au bon déroulement du processus d’ostéogénèse dans le site de comblement.

La revascularisation d’une autogreffe spongieuse en zone corticale prend une quinzaine de jours. Puis, selon l’espèce, un délai d’un à six mois est nécessaire pour son intégration complète. Cette greffe présente l’avantage d’être ostéogène, ostéoinductive, ostéoconductive. Toutefois, cette technique possède des limitations significatives, y compris un accès douloureux et limité au site de la greffe, les importants volumes à récolter par le chirurgien ainsi que la morbidité au site de prélèvement. Elle peut se traduire par des boiteries transitoires d’intensité et de durée variables. La quantité de greffon autologue étant limitée, le chirurgien peut alors greffer soit du tissu allogénique, soit des matériaux de substitution osseuse. Ces matériaux sont ostéoconducteurs et ne servent que de support passif à la réparation osseuse. Toutefois, la recherche a été orientée vers de nouvelles solutions, telle que les BMP (bone morphogenic proteins) ou l’injection percutanée de moelle osseuse concentrée autologue. Cette dernière consiste à introduire des cellules souches mésenchymateuses qui sont à l’origine des cellules ostéocompétentes. Cette technique s’accompagne d’une morbidité mineure tout en conservant un certain nombre des propriétés d’ostéoinduction qui sont dépendantes de la concentration en cellules souches. Cette solution reste contraignante du fait de l’étape de prélèvement.

Les BMP quant à elles, sont introduites sur des supports implantables biocompatibles. Ce sont des glycoprotéines endogènes ostéoinductrices généralement libérées par acidification de la trame osseuse (résorption), ou lors d’une fracture. Elles vont induire le recrutement local de cellules mésenchymateuses et permettre le déclenchement de la cascade biologique conduisant à la formation osseuse. Elles sont de plus synthétisées par biologie de synthèse et commercialisées en tant que principe actif dans le domaine de la consolidation osseuse, sous les noms d’Osigraft® (BMP7), Inductos® et Infuse® Bone Graft (BMP2) en association à un traitement chirurgical. Ces médicaments se présentent sous la forme d’une solution à reconstituer (principe actif+solvant), puis à introduire sur un support collagénique (collagène bovin de type I). Cette matrice « imbibée » est positionnée, lors d’une opération de consolidation de fracture, par un chirurgien sur l’os fracturé avant fermeture de la plaie. Les autorisations de mise sur le marché ont pu être obtenues grâce à des études multicentriques randomisées chez l’homme dont l’analyse permet de mieux évaluer l’efficacité réelle et les indications de ce type de produit. Les principales études ont porté sur les fractures ouvertes de jambes enclouées, les pseudarthroses des os longs, les arthrodèses rachidiennes. Des études ont également été faites sur les ostéonécroses de la tête fémorale et l’épaississement des sinus maxillaires sans qu’elles permettent d’obtenir d’autorisations officielles. A cause de leurs effets indésirables ainsi que l’absence d’une bonne pratique de fabrication du support, la production des BMP2 et BMP7 a été arrêtée en 2016 en Europe.

Problèmes techniques à résoudre

Un problème que se propose de résoudre la présente invention est de proposer des composés de type disaccharide qui sont utilisables dans le traitement des maladies liées à une diminution de la densité osseuse et/ou dans les méthodes chirurgicales de traitement des défauts osseux ou des fractures osseuses.

En particulier, un autre problème que se propose de résoudre la présente invention est de proposer des composés de type disaccharide qui sont ostéoinducteurs, c’est-à- dire qu’ils sont capables d’induire la cascade de mécanismes biologiques aboutissant à la formation de l’os.

Un autre but de la présente invention est de proposer des composés tels que précités qui permettent une régénération plus rapide de l’os.

Un autre but de la présente invention est de proposer des composés tels que précités qui évitent la formation hétérotopique de l’os, c’est-à-dire la formation d’os à la place d’un autre tissu.

Un autre but de l’invention est de proposer un kit permettant le traitement d’un défaut osseux.

Brève description de l’invention

La présente invention concerne une composition pharmaceutique laquelle, de manière caractéristique contient en tant que principe actif au moins un composé de formule (I) dans laquelle Ri est choisi parmi H, SOs’, R2 est choisi parmi H et COCH3, R3 est choisi parmi H, COCH3 , benzyle, SOs’ et les sels pharmaceuticalement acceptables de ces composés - à l’exception du composé de formule (I) dans lequel Ri=SOs’ et R2= COCH3 et R ₃ =H et du sel de sodium de ce composé, et du composé de formule (I) dans lequel Ri=Rs=H et R2= COCH3 - et au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable.

Une telle composition s’est avérée susceptible d’augmenter la production de calcium dans les cellules pré-ostéoblastiques et dans les cellules ostéoblastiques humaines. Le document W0 2009098400 décrit le composé de formule suivante : [formule 2]

Dans ce document, le composé précité est utilisé comme insecticide. Ce document indique également que le composé précité peut être utilisé en tant que médicament du fait de son activité d’inhibition des chitinases, lesquelles sont connues pour être impliquées dans les mécanismes d’allergie et d’asthme.

La publication intitulée « Strong aphicidal activity of GlcNAc(P->4)Glc disaccharides : synthesis, physiological effects and chitinase inhibition » écrite par C. Dussouy et al et publiée dans la revue Chemistry a European journal (DOI : 10.1002/chem.201200887) décrit la synthèse de certains composés de l’invention et leur utilisation comme insecticides lorsqu’ils sont mélangés à une composition alimentaire permettant de nourrir les insectes. Certains de ces composés ont une activité d’inhibition des chitinases mais pas tous.

Description détaillée

S’agissant des sels pharmaceuticalement acceptables, il peut s’agir des sels de sodium, de lithium, de potassium, par exemple, des composés précités.

La composition pharmaceutique de l’invention peut ainsi contenir au moins un sel pharmaceuticalement acceptable, le ou lesdits sels étant choisis indépendamment les uns des autres parmi les sels de sodium, les sels de potassium et les sels de lithium. De préférence, la composition contient un sel de sodium ou plusieurs sels de sodium. Avantageusement, la composition de l’invention, ne comporte en tant qu’ingrédient actif uniquement un ou plusieurs sels de sodium.

Avantageusement, la composition de l’invention est sous forme liquide. Elle peut ainsi être injectée ou servir à l’imprégnation d’un support.

L’excipient n’est pas limité selon l’invention, il peut être choisi parmi l’eau distillée, les solutions aqueuses injectables de chlorure de sodium, en particulier les solutions aqueuses contenant 9g/L de chlorure de sodium.

La composition pharmaceutique que l’invention peut être administrée par injection, en sous-cutanée, en intraveineuse, en injection dans les os, par voie orale, par voie mucosale en particulier sublinguale ou nasale. En particulier, elle peut être utilisée en injection directement dans un défaut osseux.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique de l’invention contient en tant qu’ingrédient actif, un mélange dudit composé de formule (I) dans laquelle Ri=H ; R2=H et Rs= COCH3 et d’un deuxième composé de formule (I) dans laquelle Ri=H, R2= COCH3 et R3=H. Les inventeurs ont mis en évidence l’apparition du premier composé précité du fait d’un réarrangement lors de la solvatation du deuxième composé.

Avantageusement, le mélange contient 2/3 en masse du composé précité de formule

I dans laquelle Rs=H et 1/3 du deuxième composé.

La composition pharmaceutique de l’invention peut également, quel que soit son mode de réalisation, comprendre un ciment phosphocalcique apte à être injecté et à se solidifier dans le corps du patient, en particulier dans un os ou un défaut osseux du patient ou dans une zone osseuse de moindre densité.

II est ainsi possible, en injectant la composition de l’invention dans un défaut osseux de combler ce défaut et de délivrer les composés de l’invention qui vont induire la formation d’os.

La présente invention concerne également un kit comportant un support biocompatible, implantable dans le corps d’un sujet et au moins un composé de formule (I) suivante : dans laquelle Ri est choisi parmi H, SOs’ , R2 est choisi parmi H et COCH3 et R3 est choisi parmi H, COCH3 , benzyle, SOs’ et les sels pharmaceuticalement acceptables de ces composés.

Les Inventeurs ont en effet mis en évidence que les composés de l’invention sont capables d’induire la fabrication d’une masse osseuse sur un support. Le support biocompatible est avantageusement un support capable de remplacer la matière osseuse et/ou ostéo-conducteur (c’est-à-dire capable d’être recouvert de matière osseuse (os)).

Le composé précité peut également se trouver dans une composition pharmaceutique liquide dont l’excipent est une solution injectable de chlorure de sodium, par exemple. Selon l’invention, ledit support biocompatible est avantageusement choisi parmi les supports biocompatibles poreux, en particulier les supports comprenant ou constitués de polymère(s) biodégradable(s), notamment le PLA, le poly acide glycolique, le poly(acide lactique-co-glycolique), le collagène, le polyglicolide, le chitosan, la polycaprolactone, les supports comprenant ou constitués de céramique(s), les supports comprenant ou constitués de phosphate calcium, les supports comportant ou constitué de la partie minérale d’un os.

Avantageusement, le support biocompatible comporte ou est constitué de collagène. Le support peut être recouvert d’au moins un composé selon l’invention ou imprégné ou recouvert d’une composition pharmaceutique contenant le composé défini ci- dessus en référence au kit de l’invention.

La présente invention concerne également un composé de formule (I) suivante : dans laquelle a) Ri=Rs=H et R ₂ = COCH3 b) Ri= SO3- ; R ₃ =H ; R ₂ = COCH3 c) RI=R2=RS=H d) RI=SO ₃ - ; R ₂ =R ₃ =H e) RI=R ₂ =H ; R3=COCH3 et les sels pharmaceuticalement acceptables de ces composés pour leur utilisation seul ou combinés à deux ou plus dans le traitement d’une pathologie liée à une diminution de la densité osseuse, en particulier l’ostéoporose, l’ostéopénie, l’ostéomalacie, l’ostéogénèse imparfaite, la diabétoporose, l’ostéopétrose, la maladie osseuse de Paget, les tumeurs osseuses, les tumeurs osseuse cancéreuses ou pour leur utilisation seul ou combinés à deux ou plus dans une méthode chirurgicale de traitement des défauts osseux ou des fractures osseuses, en particulier des fractures pathologiques. Ces composés peuvent être utilisés en combinaison avec le support biocompatible pour former des modes de réalisation particuliers du kit de l’invention. Selon un mode de réalisation particulier, les composés définis aux a) et e) précités sont utilisés en combinaison pour le traitement des pathologie précitées ou dans une méthode chirurgicale telle que précitée.

La présente invention concerne également un composé de formule (I) suivante : dans laquelle RI=R2=H et Rs= COCH3

De manière générale, le substituant propoxy du composé de formule (I) est en position a ou B, tel qu’indiqué par la ligne ondulé dans la formule (I). Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, applicable à tous les modes de mise en œuvre de l’invention, le substituant propoxy du composé de formule (I) est en position a, tel qu’illustré ci-après.

Définitions

Une maladie ou pathologie liée à une diminution de la densité osseuse désigne, au sens de la présente invention, un état pathologique engendrant comme symptôme au moins localement une diminution de la densité osseuse et un état pathologique résultant de la diminution de la densité osseuse, par exemple une fracture. Les tumeurs osseuses et notamment les tumeurs osseuses cancéreuses engendrent une fragilité des os, laquelle peut être traitée par les composés de l’invention. Une fracture pathologique est définie comme étant une fracture occasionnée du fait de la diminution de la densité osseuse.

Un défaut osseux est selon la présente invention une zone d’un os qui présente un déficit en matière osseuse ; il peut s’agir d’un trou dans la matière osseuse ou d’une zone ou la matière osseuse est moins dense.

La matière osseuse recouvre, au sens de la présente invention, un tissu conjonctif solidifié ou en voie de solidification.

Le terme « traitement » englobe le traitement préventif et le traitement curatif. Les termes « principes actifs » indiquent que le ou les composés actifs concernés sont présent(s) en une quantité suffisante pour obtenir un effet pharmaceutique.

Figures

La Fig. 1 représente le dosage de calcium dans le milieu de culture MC3T3-E1 (en pg/mg de protéine par puit) après 9 Jours d’exposition de ces cellules à 4 mM de Pi (Pi = Phosphoinositide 3-kinases) (contrôle+Pi) et de 4mM de Pi en présence de 30pM de chacun des composés référencés DP2SNA, DP2NA, DP2K et DP2S ;

La Fig. 2 représente le % d’augmentation de la concentration en ions calcium par rapport au milieu minéralisant seul obtenu à J=25 par traitement des cellules MC3T3-E1 avec les disaccharides et les sels de sodium de ces disaccharides DP2 et DP2NA, respectivement ;

La Fig. 3 représente le pourcentage d’augmentation de la concentration en ions calcium par rapport au milieu minéralisant seul obtenu à J=14 par traitement des cellules HOb dans les conditions minéralisantes en présence des DP2 et DP2NA à 15, 30 et 50pM ;

La Fig. 4 représente le pourcentage d’augmentation de la concentration en ions calcium par rapport au milieu minéralisant seul obtenu à J=14 par traitement des cellules HOb dans les conditions minéralisantes en présence de DP2 et DP2NA à 5, 7,5, 10, 15, 30 et 50pM ;

La Fig. 5 représente la quantité de calcium (en pg) produite par des cellules musculaires lisses en présence des DP2, les cellules ont été traitées dans les conditions minéralisantes en présence de DP2 5, 7,5, 10, 15, 30 et 50pM ;

La Fig. 6 représente le pourcentage de minéralisation des cellules HOb obtenu après 14 jours de traitement dans les conditions minéralisantes en présence de DP2R0 à 30pM et BMP-2 100ng/ml ou leur mélange ; La Fig. 7 représente le pourcentage de minéralisation obtenu sur des cellules HOb traitées pendant 14 jours dans les conditions minéralisantes en présence de : (7A) DP2R2 à 30pM et (7B) DP2R2 ou DP2’ à 30pM et (7C) DP2R2 marqué à 95% de pureté (DP2M95 30pM) ;

La Fig. 8 représente l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline (U/L/pg de protéines) dans les cellules MC3T3-E1 et HOb, obtenue pour : (8A) les cellules MC3T3-E1 à J=13 jours en présence ou non de DP2R0 à 15, 30 et 50pM par comparaison au BMP-2 à 100ng/ml (8B) les cellules HOb à J=7 jours par le milieu minéralisant en présence ou non de DP2R0 à 30pM par comparaison au BMP-2 et BMP-7 à 100ng/ml, (8C) les cellules HOb traitées à J=7 traitées par le milieu minéralisant en présence ou non de DP2R2 à 30pM par comparaison au BMP-2 et BMP-7 à 100ng/ml.

La Fig. 9 représente les résultats des Tests de la cytotoxicité du DP2 à 30pM sur les cellules HOb à J=14 en utilisant le test MTT (9A) et en utilisant le test WST-1 (9B) ;

PARTIE EXPERIMENTALE

SYNTHESE CHIMIQUE DES COMPOSES DE L’INVENTION

Les synthèses des composés sont telles que décrites dans la publication « Strong aphicidal activity of GlcNAc(P->4)Glc disaccharides : synthesis, physiological effects and chitinase inhibition » écrite par C. Dussouy et al et publiée dans la revue Chemistry a European journal (DOI : 10.1002/chem.201200887).

Synthèse du composé DP2’

Le composé DP2’ a été extrait du mélange DP2-DP2’ qui se forme lorsque le composé DP2 est dissout dans de l’eau. Le composé DP2’ a été séparé par chromatographie HPLC préparative avec l’eau comme solvant d’élution.

Les Inventeurs ont constaté que lorsque le composé DP2’ se trouvait dans de l’eau, la délocalisation du groupement acétate était également présente mais avec une cinétique très lente comparée à la réaction DP2^DP2’. Ainsi, une solution de DP2’ dans de l’eau laissée au repos contient au bout de 44 jours 10 à 15% de DP2. Le DP2’ reste donc seul dans l’eau pendant une durée donnée assez longue. Il est donc possible de tester l’effet biologique du DP2’ en solution dans l’eau.

De même, les Inventeurs ont constaté que la cinétique de la réaction DP2^DP2’ est telle qu’il est également possible de tester l’activité biologique du composé DP2 seul après extraction du composé DP2’ formé. Ainsi, les deux composés DP2 et DP2’ peuvent coexister ou non dans l’eau pendant une durée donnée.

Par ailleurs dans d’autres solvants, comme le méthanol, aucune délocalisation du groupement acétate n’a été observée. Dans le méthanol, par exemple, le composé DP2 est donc seul.

Références utilisées

Les références suivantes : DP2, DP2R0, DP2R2, DP2K correspondent au composé n-propyl, 2-0-acétyl-a-D- Glucopyranoside, 4-O-(2-acétamido-2-deoxy-[3-D- glucopyranosyl) de formule 1 suivante :

Les nomenclatures RO, R2 et K faisant référence à des batchs de production de la moléculeDP2.

La référence DP2’ correspond au composé n-propyl, 3-0-acétyl-a-D- Glucopyranoside, 4-O-(2-acétamido-2-deoxy-[3-D-glucopyranosyl) de formule 1 ’ suivante :

La référence DP2S correspond au composé de formule (I) dans laquelle Ri= SOs’ et R ₂ =AC, tel que le n-propyl, 2-0-acétyl-6-O-sulfo-a-D- Glucopyranoside, 4-O-(2- acétamido-2-désoxy-p-D-glucopyranosyl), sel monosodique.

La référence DP2NA correspond au composé n-propyl, a-D- Glucopyranoside, 4-0- (2-acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranosyl) de formule 3 suivante :

La référence DP2SNA correspond au composé n-propyl, 6-O-sulfo-a-D-

Glucopyranoside, 4-O-(2-acétamido-2-désoxy-[3-D-glucopyranosyl), sel monosodique et de formule 4 suivante :

EXPERIMENTATIONS IN-VITRO

Culture cellulaire

Pour l’ensemble des expérimentations, une lignée de cellules pré-ostéoblastique de souris (MC3T3-E1 , ATCC) et des cellules ostéoblastiques primaires humaines (HOb, Promocell) ont été utilisées. Les cellules pré-ostéoblastiques de souris ont été cultivées dans des flasques de 75 cm ² , contenant 15mL de milieu a-MEM (M4526, SIGMA) et 10% de sérum de veau fœtal (SVF), contenant 1 % d’antibiotiques Péniciline/Streptomycine et 1 % de glutamine. De même, les cellules humaines HOb ont été cultivées dans des flasques de 75 cm ² contenant 15 mL de milieu de prolifération (Human Osteoblast Proliferation Medium, PromoCell). Les cellules sont maintenues dans l’étuve à 37°C, avec 5% de CO2 et 90% d’humidité. Le milieu a été changé tous les trois jours.

Les cellules MC3T3-E1 ont été ensemencées dans des plaques 6 puits à 63 700 cellules/puits pour être traitée afin d’extraire l’ARN ou pour le dosage de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline et dans des plaques 48 puits pour le dosage de calcium à 5 250 cellules/puits. Les cellules HOb ont été ensemencées à 182 000 cellules/puits dans des plaques 6 puits pour l’extraction d’ARN ou pour le dosage de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline ; à 15 000 cellules/puits dans des plaques 48 puits pour le dosage de calcium ; à 10000 cellules/puits dans des plaques 48 puits pour le test MTT ou le test WST-1 et à 100000 cell u les/pu its dans des plaques 6 puits pour l’extraction de protéines ou pour la fluorescence.

Traitement cellulaire

Afin d’induire la minéralisation, les cellules MC3T3-E1 ont été traitées par le milieu a-MEM contenant 5% de SVF auquel 10mM de p-glycérophosphate et 50pg/mL d’acide ascorbique sont ajoutés. Les cellules HOb ont été traitées par le « Osteoblast mineralization medium >> (Promocell). Selon les conditions, le DP2NA, DP2R0, DP2R2, DP2’, BMP-2 ou BMP-7 ont été ajouté à différentes concentrations. Après filtration, les cellules ont été traitées par les milieux respectifs (500pL par puits de la plaque 48 puits et 2mL par puits de la plaque 6 puits).

Activité pro-calcifiante des composés de l’invention

Le relargage du calcium dans le milieu de culture de cellules pré-ostéoblastiques de souris (MC3T3-E1 ) a été étudié. Les résultats sont présentés sur la Fig. 1 ; ils montrent de façon claire que 3 DP2 (DP2SNA ; DP2NA ; DP2K) ont la capacité d’augmenter la production de calcium par les cellules MC3T3-E1 contrairement à DP2S qui inhibe de façon importante l’expression de calcium.

Suite à ces résultats, l’activité pro-calcifiante sur les MC3T3-E1 traitées par DP2NA et DP2R0, pendant 25 jours, a été étudiée. Une augmentation de la calcification a été observée, par rapport au milieu minéralisant (Fig.2), en présence de DP2R0 à 15pM (40±2%), à 30pM (28±18%) et à 50pM (40±28%), et de DP2NA à 15pM (15±14%), à 30pM (33±12%) et à 50pM (10±19%).

La calcification a aussi été étudiée sur des cellules ostéoblastiques humaines (HOb, PromoCell, Heidelberg, Germany). Elles sont isolées à partir de tissus de l’os trabéculaire de fémur. Suite à un traitement de 14 jours en milieu minéralisant (PromoCell), sur les cellules primaires HOb, une augmentation significative de la calcification a été observée (voir Fig.3), par rapport à la condition minéralisante, en présence de DP2 à 15pM (26±10%), à 30pM (40±15%) et DP2NA à 30pM (44±7%) et à 50pM (35±8%). Une augmentation observée en présence de DP2 à 50pM (8±17%) et DP2NA à 15pM (45±42%) mais qui n’est pas significative à cause de l’écart-type.

Suite au traitement des cellules HOb par le DP2R0 et le DP2NA à des concentrations plus faibles (5, 7,5 et 10pM), une diminution de la minéralisation des cellules HOb a été observée par rapport au milieu minéralisant seul (Fig.4). Ceci suggère que des faibles concentrations de DP2 n’ont pas d’action sur la minéralisation et donc qu’à distance, contrairement à ce qui a été décrit dans le cas des BMP, il n’y aurait pas de développement d’os hétérotopique en présence des DP2.

De plus, les résultats présentés dans la Fig. 5 montrent qu’en condition contrôle non calcifiante, la présence des DP2 n’a aucune action pro-calcifiante sur les cellules musculaires lisses. Ceci renforce donc l’hypothèse que les DP2 n’induiront aucune calcification sur des cellules autres que les cellules ostéoblastiques.

Sur la base de ces résultats, les études ont été poursuivies en choisissant le DP2R0 comme molécule d’intérêt. Les résultats présentés dans la figure 6 montrent que DP2R0 30pM et BMP-2 100ng/ml augmentent la minéralisation de 181 ,573±9,155% et 214,153±37,938% respectivement. Ceci indique que DP2R0 30pM a une activité du même ordre de grandeur que la BMP-2 à la concentration définie dans la littérature (100ng/ml). L’effet synergique de DP2 avec BMP-2 sur la calcification a été également étudié sur les cellules ostéoblastiques humaines. Les résultats visibles sur la Fig. 6, montrent que DP2R0 et BMP-2 (152,950±16,176%) ne semblent pas avoir un effet synergique sur les cellules ostéoblastiques humaines.

Le prestataire Roowin a fourni une molécule DP2 nommée DP2R2 (2 ^ème batch produit), d’où le nom DP2R0 utilisé au-dessus pour désigner le DP2 produit par le laboratoire LG2A (UPJV, Amiens). L’activité pro-calcifiante de cette molécule a été étudiée et les résultats sont montrés dans la figure 7A ci-dessous (DP2R2 : 159,03±18,719%).

Les analyses chimiques de la solution aqueuse de DP2R2 ont montré que le composé DP2R2 (DP2) réagit avec l’eau pour donner le composé DP2’. Il y a environ 2/3 de DP2R2 pour 1/3 de DP2’ Le composé DP2’ provient d’une migration du groupement acétate (R2) sur la position 3OH. Le composé DP2’ a pu être isolé et synthétisé comme indiqué précédemment. Lorsque le composé DP2’ est mélangé à de l’eau, la réaction inverse qui conduit à la formation de DP2R2 n’est pas observée et seul du composé DP2’ est présent en solution. L’activité pro-calcifiante de cette molécule a été également étudiée, les résultats (Fig.7B) montrent que DP2’ à 30pM semble avoir une activité du même ordre de grandeur que DP2R2 à 30pM (143,806±36,657% et 137,012±52, 452% respectivement).

Dans le but d’étudier l’hypothèse de la pénétration cellulaire de notre molécule, DP2R2 a été couplé à un fluorophore : la fluorescéine. Ainsi, l’activité pro-calcifiante a été également testée et les résultats sont présentés dans la figure 7C. La minéralisation est de 204,472% pour DP2R2 30pM et 260,479% pour DP2R2 marqué à 95% de pureté (DP2M95 30pM).

Dosaqe de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline (ALP)

L’ALP est une enzyme synthétisée par les ostéoblastes. Elle hydrolyse les esters phosphoriques inhibiteurs de la minéralisation en libérant un groupe hydroxyle et un phosphate. Les ostéoblastes produisent des vésicules matricielles, réservoirs de phosphatases alcalines et d’ions, qui, déversées dans le milieu extracellulaire initieraient la minéralisation du tissu ostéoïde en favorisant les concentrations locales en ions calcium et phosphates. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits à 63700 cellules/puits pour les MC3T3-E1 et à 182000 cellules/puits pour les HOb. Le dosage a été effectué sur une plaque de 48 puits après 13 jours du traitement pour les cellules MC3T3-E1 et 7 jours du traitement pour les cellules HOb en utilisant le Kit BioVision Alkaline Phosphatase activity colorimetric assay (Tampon ALP Assay Buffer, Tablettes de pNPP, Enzyme phosphatase alcaline, Solution stop).

Après les rinçages au PBS, 50pl de tampon ALP Assay ont été ajoutés aux puits, le fond des puits a été gratté et ensuite les 50pl ont été prélevés. Une centrifugation pendant 3 minutes à 13000G a été réalisée pour enlever le matériel insoluble. Dans une plaque 96 puits, 10pl de chaque échantillon à tester sont mis avec 70pl du tampon ALP Assay et 50pl de la solution pNPP à 5mM. En parallèle, la gamme d’étalonnage a été préparée en mettant, dans la même plaque 96 puits. La réaction a été incubée pendant 60 min à 25°C, à l'abri de la lumière. La réaction a été arrêtée en ajoutant 20pl de la Solution Stop. La densité optique a été mesurée à 405nm.

Après le dosage de l’activité enzymatique de l’ALP, un dosage de protéine a été effectué afin de normaliser les résultats du dosage de l’ALP en fonction du nombre de protéines. Pour doser les protéines, la méthode colorimétrique avec le kit Pierce™ BCA Protein Assay Kit de thermofisher a été utilisée. Dans des tubes de 5mL, une gamme étalon à partir d’une solution d’albumine à 2mg/mL a été préparée. Dans une plaque à 96 puits, 5pl de la gamme étalon et des échantillons à tester ont été distribués. Ensuite, 200pl du réactif du kit ont été ajoutés aux puits. La réaction a été incubée pendant 15 minutes à 56°C. La densité optique a été mesurée à 565nm pour déterminer la quantité des protéines.

La phosphatase alcaline est une enzyme qui joue un rôle essentiel dans la formation osseuse. Durant la différenciation des ostéoblastes, l’expression de la phosphatase alcaline par les ostéoblastes augmente progressivement avec le temps. Pour cela, l’activité enzymatique phosphatase alcaline sur les cellules MC3T3-E1 et HOb a été étudié.

Sur les MC3T3-E1 , 13 jours post-traitement, l’activité enzymatique est légèrement augmentée en présence de DP2R0 15pM (118, 907±10,466%) et DP2R0 30pM (148,833±15,761%) par rapport au milieu minéralisé seul (100%). Cette augmentation est plus importante en présence de BMP-2 à 100ng/ml (307,645±30,440% ; Fig.8A).

De façon plus marquée sur les HOb, 7 jours post-traitement, l’activité enzymatique est augmentée significativement en présence de DP2R0 30pM (210,494±14,979%) et BMP-2 100ng/ml (262,567±46,207%) par rapport au milieu minéralisé seul (100%). Similaire à ce qui est observé pour la calcification osseuse, les résultats montrent que DP2 et BMP-2 ne semblent pas avoir un effet synergique sur les cellules ostéoblastiques humaines (Fig.SB).

L’activité enzymatique ALP a été confirmée également en présence de DP2R2 30pM (149,749%) par rapport au milieu minéralisé seul (100%) (Fig.SC).

Tests de cytotoxicité

Test MTT

Afin d’étudier la toxicité de DP2, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le test MTT (bromure de 3- (4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium). Les cellules HOb ont été ensemencées dans des plaques de 48 puits (10000 cellules par puits), deux jours après les cellules ont été traitées par DP2 30pM et le test MTT a été réalisée à J2, J4, J7 et J14 post-traitement.

Après lavage des cellules au DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sans rouge phénol, 250pl de la solution MTT diluée ont été ajouté à chaque puits et la plaque est incubée à 37°C avec 5% de CO2 pendant 1 h. La quantité de MTT réduite en formazan est proportionnelle aux cellules vivantes. Les cristaux de formazan violets ont été solubilisés dans 220pl de DMSO et après agitation pour homogénéiser la coloration, l’absorbance a été mesurée à 560nm (Envision, PerkinElmer). La cytotoxicité a été évalué en comparant la viabilité cellulaire entre le groupe témoin et le groupe expérimental.

Test WST-1

La toxicité de DP2 a été également étudié par un autre test de la viabilité cellulaire : le WST-1 (un sel de tétrazolium). Les cellules HOb ont été ensemencées dans des plaques de 48 puits (10000 cellules par puits), deux jours après, les cellules ont été traitées par DP2 30|iM et le test WST-1 a été réalisée à J2, J4, J7 et J14 posttraitement.

Au terme du traitement, 10Opl de la solution WST-1 (Roche Diagnostics) diluée ont été ajouté à chaque puits et la plaque est incubée à 37°C avec 5% de CO2 pendant 1 h. La prolifération cellulaire induit une augmentation de l'activité des déshydrogénases mitochondriales, qui clive le sel de tétrazolium en formazan. La quantité de colorant de formazan a été quantifiée en mesurant l’absorbance de colorant à 450nm (Envision, PerkinElmer). Les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité en comparaison à la condition contrôle non traitée.

Avant de déterminer si notre molécule altère la survie des cellules ostéoblastiques, sa cytotoxicité a été testé sur les cellules HOb par le test MTT et WST-1 . Les cellules ont été traité par du DP2 à 30pM avec le milieu de culture (Ctrl) ou le milieu minéralisant (Min) pour 2, 4, 7 et 14 jours (J).

Comme visible sur la figure 9, il n’y a pas de différence significative observée entre les différentes conditions de traitement pour les 4 temps testés. Une diminution de la viabilité cellulaire est constatée à J14 due à l’apoptose des ostéoblastes ce qui corréle avec la calcification induite. Ces résultats suggèrent que le DP2 à 30pM ne présente aucune toxicité pour les cellules HOb.

Expérimentations in-vivo

Animaux

L’hébergement des animaux et les procédures expérimentales ont été réalisés conformément à la directive de l’Union Européenne (2010/63/UE) et validés par le comité d’éthique (CREMEAP, CEEA N°96 ; APAFIS#15464-2018060810566765 v2) de l’Université de Picardie Jules Verne (UPJV).

Les rats Sprague-Dawley sont fournis par Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, France) et hébergés dans l’animalerie PLATAN de l’UPJV. Les rats ont été maintenus sous un cycle jour-nuit de 12 heures, à une température de 22 ±2°C et 50% d’humidité. Tous les rats ont eu un accès libre à l'eau et aux boulettes de nourriture, et les changements de poids des rats ont été surveillés.

Conception de l’étude

Afin d’évaluer la capacité ostéo-inductrices du disaccharide via l’accélération du phénomène de reconstruction osseuse et de déterminer la concentration de la molécule DP2 optimale, et la nature du support le mieux adapté dans les conditions physiologiques de l’opération de consolidation de fracture (réaction inflammatoire, activité cellulaire), 2 défauts osseux ont été réalisés au niveau du crâne de rats.

Trois différents types de supports ont été testés et deux concentrations différentes de DP2. Pour cela, 102 rats Sprague-Dawley mâles âgés de 8 semaines ont été divisés en 12 lots expérimentaux tels que :

- Support 1 : Substitut osseux de phosphate de calcium bioactif (MBCP ; Biomatlante ; Vigneux-de-Bretagne ; France) o Lot 1 (S1 L1 ): Support MBCP seul o Lot 2 (S1 L2): Support MBCP + DP2 [3mM] o Lot 3 (S1 L3): Support MBCP + DP2 [9mM] o Lot 4 (S1 L4): Support MBCP + BMP-2

- Support 2 : substitut osseux constitué de la partie minérale d’un os d’origine bovine (Bio-oss ; Roissy-en-France ; France) o Lot 5 (S2L5): Support Bio-oss seul o Lot 6 (S2L6): Support Bio-oss + DP2 [3mM] o Lot 7 (S2L7): Support Bio-oss + DP2 [9mM] o Lot 8 (S2L8): Support Bio-oss + BMP-2

- Support 3 : Collagène de type I du tendon d’Achille bovin (Sigma) o Lot 9 (S3L9): Support collagène seul o Lot 10 (S3L10): Support collagène + DP2 [3mM] o Lot 11 (S3L11 ): Support collagène + DP2 [9mM] o Lot 12 (S3L12): Support collagène + BMP-2

Pour réduire le nombre de rat utilisé, deux défauts osseux ont été réalisés par rat ; un défaut a été laissé vide et a servi de contrôle interne pour chaque rat. Ainsi, le lot support seul est considéré comme le contrôle de l’expérience. DP2 et BMP-2 ont été dilués dans du sérum physiologique stérile et ensuite mélangés avec le support et placés dans le défaut crânien. Pour la condition support seul, ce dernier est mélangé avec du sérum physiologique stérile.

Chirurgie

Après avoir été affecté à l'un des 12 lots présentés ci-dessus, le rat a été anesthésié par utilisation d’IsoVet (isoflurane) au masque (5% à l’induction et 2 à 3% en dose de maintien). Après 5 min, un test de nociception a été effectué en pinçant la patte ou la queue de l’animal pour vérifier l’efficacité de l’anesthésie. Sur le poste de travail, un rasage et une désinfection à la vétédine ont ensuite été réalisés en regard de l’incision. Une anesthésie locale a été également réalisée avec 7mg/kg de lidocaine 2% (20mg/mL) diluée à 5mg/ml.

Sur le poste de travail, l’incision de la peau au bistouri froid lame 15 le long de la ligne médiane a été effectué suivi par le décollement des tissus sous cutanés. Puis, l’incision le long de la ligne médiane et le soulèvement et déplacement latéral du périoste ont été fait. En utilisant une fraise, deux lésions crâniennes ont été effectuées de diamètre 5 mm de chaque côté de la suture sagittale en espaçant le plus possible et sans toucher le sinus sagittal supérieur. Du sérum physiologique a été utilisé durant les étapes de fraisage. L’implantation du support, en fonction du lot, sur le côté gauche a été faite ; le côté droit, sans support, a servi de contrôle pour évaluer l’effet de la lésion et les processus de réparation naturelle sans présence de support. Le périoste a été remis en place et suturé par du fil à peau 7/0. La peau a été également remise en place et fermée par du fil à peau 4/0.

Le rat a été injecté par du buprénorphine à une dose 0,05mg/kg en sous-cutanée en tant qu’analgésique. Après réveil, le rat a été replacé dans ses conditions classiques d’hébergement, en mettant 1 rat par cage. Les animaux ont été surveillés quotidiennement et un suivi du bien-être animal a été effectué.

Tous les animaux ont survécu pendant la durée de l'étude sans complications. Après 3 mois, il n'y avait aucun signe clinique d'infection, d'hématome ou de nécrose aux sites de défauts. Ceci indique que DP2 ne présente pas d’effet toxique in-vivo. De plus, tous les rats ont montré une homogénéité dans la reconstruction osseuse, ceci a été évalué en calculant les valeurs obtenues dans tous les trous vides qui ont servis comme contrôle interne pour chaque rat. Une augmentation importante (le pic) de la réparation osseuse est observée entre J14 et J63 ; ensuite, on assiste à une augmentation moins importante, comme un plateau qui commence à J63. Les résultats obtenus pour les 3 supports sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous.

[Tableaux 1]

(= : pas de différence, N/A : non applicable, *p<0,05, **p<0,01 , *** : p<0,001 )

Les résultats du tableau 1 montrent que les 2 lots MBCP+DP2 augmentent la minéralisation osseuse par rapport au MBCP seul à partir du J29 post-chirurgie. Les 3 lots de Bio-oss ne présentent pas d’effet par rapport au Bio-oss seul, ceci a été également observé dans un modèle de défaut crânien chez le lapin (Leventis et al., 2018). Cela peut être expliqué par un problème de relargage par le support. Seul le lot collagène + DP2 [3mM] augmente la minéralisation osseuse à J14.

De façon intéressante, il a été remarqué que le lot MBCP+BMP-2 forme de l’os hétérotopique avec le temps, ceci semble être similaire à ce qui est observé comme effet indésirable de BMP-2. De plus, le lot collagène+BMP-2 ne forme pas une réparation osseuse continue entre l’ancien os et l’os nouvellement formé, ce qui n’est pas le cas avec le composé DP2.