Title:
DNA SEQUENCES WHICH CODE EXPORT SYSTEMS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/007591
Kind Code:
A2
Abstract:
The invention relates to DNA sequences which code export systems, especially export systems of bacteria of the genus Pseudomonas, for example, the Pseudomonas-putida group and Pseudomonas-fluorescens group.
Inventors:
FRASER CLAIRE M (US)
VENTER CRAIG (US)
TUEMMLER BURKHARD (DE)
HOHEISEL JOERG (DE)
DUESTERHOEFT ANDREAS (DE)
HILBERT HELMUT (DE)
TIMMIS KENNETH N (DE)
MOORE EDWARD (DE)
STRAETZ MICHAEL (DE)
HEIM SABINA (DE)
VENTER CRAIG (US)
TUEMMLER BURKHARD (DE)
HOHEISEL JOERG (DE)
DUESTERHOEFT ANDREAS (DE)
HILBERT HELMUT (DE)
TIMMIS KENNETH N (DE)
MOORE EDWARD (DE)
STRAETZ MICHAEL (DE)
HEIM SABINA (DE)
Application Number:
PCT/EP2000/007243
Publication Date:
February 01, 2001
Filing Date:
July 27, 2000
Export Citation:
Assignee:
INST GENOMIC RES TIGR (US)
QIAGEN GMBH (DE)
BIOTECHNOLOG FORSCHUNG GMBH (DE)
DEUTSCHES KREBSFORSCH (DE)
HANNOVER MED HOCHSCHULE (DE)
FRASER CLAIRE M (US)
VENTER CRAIG (US)
TUEMMLER BURKHARD (DE)
HOHEISEL JOERG (DE)
DUESTERHOEFT ANDREAS (DE)
HILBERT HELMUT (DE)
TIMMIS KENNETH N (DE)
MOORE EDWARD (DE)
STRAETZ MICHAEL (DE)
HEIM SABINA (DE)
QIAGEN GMBH (DE)
BIOTECHNOLOG FORSCHUNG GMBH (DE)
DEUTSCHES KREBSFORSCH (DE)
HANNOVER MED HOCHSCHULE (DE)
FRASER CLAIRE M (US)
VENTER CRAIG (US)
TUEMMLER BURKHARD (DE)
HOHEISEL JOERG (DE)
DUESTERHOEFT ANDREAS (DE)
HILBERT HELMUT (DE)
TIMMIS KENNETH N (DE)
MOORE EDWARD (DE)
STRAETZ MICHAEL (DE)
HEIM SABINA (DE)
International Classes:
C07K14/21; C12N15/31; C12N15/82; (IPC1-7): C12N15/00
Other References:
DE GROOT, A. ET AL.: "Molecular organization of the xcp gene cluster in Pseudomonas putida: absence of an xcpX (gspK) homologue" GENE, Bd. 226, Nr. 1, 8. Januar 1999 (1999-01-08), Seiten 35-40, XP004154468
MARTINEZ, A. ET AL.: "Identification of an additional member of the secretin superfamily of proteins in Pseudomonas aeruginosa that is able to function in type II protein secretion" MOLECULAR MICROBIOLOGY, Bd. 28, Nr. 6, Juni 1998 (1998-06), Seiten 1235-1246, XP000945072
DE GROOT, A. ET AL.: "Characterization of type II protein secretion (xcp) genes in the plant growth-stimulating Pseudomonas putida, strain WCS358" MOLECULAR & GENERAL GENETICS, Bd. 250, Nr. 4, 1996, Seiten 491-504, XP002154108
HUTCHESON, S.W.: "The hrp-encoded protein export systems of Pseudomonas syringae and other plant pathogenic bacteria and their role in pathogenicity" PLANT-MICROBE INTERACTIONS, Bd. 3, 1997, Seiten 145-179, XP000945217
EMBL DATABASE; EMBL:AF079997; ACCESSION-NO: AF079997, 31. M{rz 1999 (1999-03-31), XP002157067
MARTINEZ, A. ET AL.: "Identification of an additional member of the secretin superfamily of proteins in Pseudomonas aeruginosa that is able to function in type II protein secretion" MOLECULAR MICROBIOLOGY, Bd. 28, Nr. 6, Juni 1998 (1998-06), Seiten 1235-1246, XP000945072
DE GROOT, A. ET AL.: "Characterization of type II protein secretion (xcp) genes in the plant growth-stimulating Pseudomonas putida, strain WCS358" MOLECULAR & GENERAL GENETICS, Bd. 250, Nr. 4, 1996, Seiten 491-504, XP002154108
HUTCHESON, S.W.: "The hrp-encoded protein export systems of Pseudomonas syringae and other plant pathogenic bacteria and their role in pathogenicity" PLANT-MICROBE INTERACTIONS, Bd. 3, 1997, Seiten 145-179, XP000945217
EMBL DATABASE; EMBL:AF079997; ACCESSION-NO: AF079997, 31. M{rz 1999 (1999-03-31), XP002157067
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Claims:
Patentansprüche
| 1. | DNASequenzen, deren Expressionsprodukte die biologische Funktion von Ex portsystemen haben. |
| 2. | DNASequenzen nach Anspruch 1, wobei die DNA aus Bakterien der Gattung Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, stammt. |
| 3. | DNASequenzen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA ausgewählt ist unter : (a) den folgenden DNASequenzen : >ORF00068a. seq ATGCGCATGAATTTGCCCGTCACTGAGCACGAAAGAACCTTCCCCGGCGATC AACGCCTTATTTCCACGACTGACCTCGA CAGCCGCATCACCTACTGCAACGACGCCTTTGTGGCAATCAGCGGCTTTACCT ATGACGAGCTGGTCGGCCAACCGCACA ACCTGGTGCGCCACCCAGACATGCCGCCGGCGGTGTTTGGCCATATGTGGGA AACCATCAAGCAGGGCAAACCCTGGATG GGCATCGTCAAAAACCGGGCGAAGAACGGCGATTACTATTGGGTAAGCGCCT ATGTCACGGCGATATACGAACAAGGCCG GATCAGTGGCTACGAGTCGGTGCGCTCGGTGCCCACGCGTGAGCAGATCCGC CGGGCCGAGGCGCTGTATGCGCGCTTGC GCGATGGCCGCAGCCCGGTGCCCTGGGCTGCTCGCCTGGGGCACGGCCTGGG CCATGGCTGGCCACTGATCGGCGCCGGC CTGCTGTCGGCGGCGGGTTACCTTTGGCTGCCCCCCTATGCGGCGCTCGCGGT GCTGATGGCAAGTCTGCTGCTGGCTTG GTACTGGGTCGAGCACCGGCAGAACCAGGCCATTCGTCGCACGTTGGCTGAG CATCCCAAGGCCTTTACCAGTCCGTTGG TGGCGCTGACCTACAGCGACAACCCAGGCCTGAAGGGCCAGCTCGACCTGGC CATCATCAGCGAAGAAGCCCGTCTGCAA ACGGCCCTGACCCGCCTGGTGGATGCCGGGGTCGGGGTAAAGTCGCGGGCGG CGCAATCTTCCGACTTGTCCGATGCCCA 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TCTCTCGCTGCTCGGCGGCAGTGTGCTGGCGATGCTGCTGATCGCCCTGGTGT GTTTCCAGTTCCTGTCGTCCAGCGTGC GTGGCTACGCCGAGCTGGTCGACGGGCCGCTGCGGGCCTCGCAATTGATTGA CGAAGCCAACCTGCAGTTCAAGATCCAG <BR> <BR> GTGCAGGAATGGAAGAACGTGCTGTTGCGAGGGCGCCAGCCTGCGGAAATG GACAAGTACTGGCAGCAGTTCCAGGCCCG AGAACAGCAAGTTCAACAACTGCTCGGGCAATTGATCGACAACAGCGATGCC AGGCTCAAGGCGTCGCTGCAGCAATTGC GCGACAGCCACCGCCAGTTGGGCCAGGCCTATGCACAAGGCCGCCAGGCGTT CCTGGCGGCAGGCGGCGACCCGGTAGCG GGCGACCGGGCGGTCAAAGGCGTGGACCGTGCCGCCAGTGAGCAAATGAGC GAACTGGTCGAGCAACTGCGCGCCGATGC TCGCCAGCGTGCAGCCAGCATCAATGCCAGTGCCGAGCGCACGGTATGGTTG GGCCTGCTGGTGATGCTGGCTTCAGCGG TGCTGGTGGGGCTGCTCAGCCTGTGGCTGGTCAACCGTAGCCTGATCGAGCC GATCCGCCAGTTGATCGAGTACGTCGCG CAGCTCAGCCAAGGCAGCTTTGCTGCCCGGGTCGACAGCCGTCGGGAGGATG AGCTGGGGCGCCTGGCGCGGGCGGCCAA CACCCTGCGTGACTTCCTTGCCGATACCGTCGGCCGGCTGCAGGACAACGCT CAGGAGCTGGAAGGTGCCAGCGGCCAGT TGCGCAGTATTGCCGGTGACATGGCCCGCGGTACTCATGACCAGTTCCAGCG TACCGACCAGGTAGCCACGGCCATGCAC GAAATGTCCGCCACTGCCCAAGAGGTCGCTCGCCACGCTGCCGAGGCGGCCC GCGCGGCCGATGACGCCGACCACAGCGC 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<BR> CGGCCAGGGCCTCTCTGTCGCGTTGTTCGACTTTGCGTTTGCCCAGGTCGAGG CTCACCGTTCGCAGCTCATTGCCCATG ATTTCCATGTTGTTCTGCAACTGCTCGACGCGTACGGCGGCGCGGCGGTACTG ATCCAGGCTGGTGCGGTACTTGCTCAG CTCGACACCGGGTTGCTCACTGATGGCGCGTGGCAAGCCCAGGGGCGCAAGG CCTTCAAGCAGTTGCGCAAGGCTACTGT CGGCGGCGTTCAGGGCGTTATCACCGACTTTGGCAAAATCCTCGACCGGGAC GAAGGTGTAGGCTGGAACCAGGCTTTGC TGGTTGGCACCTTCGACATGCCGGCTGAGGGTGTCCATCAGGCCCAGCACAC CACTTTGCTGACTGTCGTCAGGCATTTT CAGCAAGGCCTGGGTCTGCAGTTGGTCAATCGCCTCGCTGAGTGCATGCTCCT GTGACTGCAGGGCTTCACGCAGGGCTA CACGGCTGGCGACGCTGCGCTGCAGTTCGCTGAAGTTGTCGCGCAGACGCTG TAACAATGCCATTTTTTCTGTCAGCAAC TGCCGTGACTCATCGACATTGCTGCGTTGCTGCAGGGTGGTCAGCATGCTGTT GAGCTGGTCGAGGATGTTGCTGATGCG TGCTTTGCTGGCATCGTCGTTGAGCACGCGGTAGGTGATGCGTTCCGCGCGCA GGTCTTTTGTCAGGTCGTTGATCAGGC CTATTTCGCTGAGTTGCTGTGAGCGCACGATGGCACCATCCAGGGCACGCCA GCCGCTGATGGTGGTGGCCAGGGTGAGC AGCAGGACCACGGCAAAGCCGAGGGCCAGCTTGGCGGCGACACTGATGTTG CCGAGCTTGCGGTTGAGGGAGCCAAGCAT GGGGAATCTCCGAGCGAGTGAGAGAAAGGATGCAGGCGCATGGCTGGCATC ACATCTCTGCCCATCGGCAGCGGAGCTGT 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CGCAGCCAGGAGGCCAGCGTAAGCTCCGCCGACGTGGCCGACGCCGTGCACC AGATGATGATCATCATGGAAGAGCAACT CGGCGAACTGCAGCAGGCCTCGGTCAGCGCCGAGCAGATGAAGCAGGCCAT GGACGAAGTGGTCAGCCGCGCACGCGCGC AGTACCAGGCGGTGCAGGCGGGCACGCAGTCGATCCGCGATGTGGTGGCGC GCTCATCATCCAGCGTGCAGCGGCTCGAC AGCCGCATGGTCGAGATCGACAACATCACCGGGTTGATCAGCGAAATCACCA ACCAGACCAACCTGCTGGCGCTCAATGC CGCCATCGAGGCGGCGCGTGCCGGGGAGCATGGCCGTGGCTTCGCGGTGGTG GCCGACGAGGTGCGCAGCCTGGCCGCAC GCACCTCGCGTGCCGCCGACGACATTCGCCACATGGTCGAGAGCCTGCAGGG CGAAACCCGGCAGGCGGTAAGCTTCATG GAGCAGGGCGTGCAGGACGTCGACAACAGCCTGCGCCTGGCGGAGGACGCT TCTTCCGAAAATGTACAGCTGCACCAGGC GGTGGAGAGCATGTTCGCCATTATCCAGCAGCTCAACCGTCGCAGCGTGGAA TACGGCAAGACGATCGAGCAGGTCAACC AGTCCTCCAGCGAGATGCGCCAGACCGCCCTGGTGCTGCAAAGCAGTGCGCA GAAGGTGAAGGTGGATGCTGGCAAGTTG CAGAAGCTGGTGGGGCAGTTCGAAGTCAGTGA >ORF09543a. seq TTGTCGGAGCGCCTGCAAAGCGAGCAGCAGCAACTACGCAGCACCCTGGAA AAGAACCTCAAGGATTCCGCCAACGACAT GGCCGAGCTGCTGGCTTCGGTTGCGCCGCGGGCGATCTGGGACAACGACGTG CCGGTGCTCTCGGATTTCGCACGACGCG 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komplementären Strängen, (b) DNASequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die Proteine kodierenden Regionen der in (a) definierten DNASequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren, (c) DNASequenzen, die wegen der Degeneration des genetischen Kodes an die un ter (a) und (b) definierten DNASequenzen hybridisieren, (d) allele Variationen und durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden entstandene Mutanten der unter (a) bis (c) definierten DNASequenzen, die isofunktio nelle Expressionsprodukte ergeben. |
| 4. | Rekombinierter Expressionsvektor, der eine DNASequenz nach einem der An sprüche 1 bis 3 enthält. |
| 5. | Prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer DNASequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mit einem rekombinierten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert oder transfiziert ist. |
| 6. | Zelle nach Anspruch 5, wobei die Zelle von Bakterien, insbesondere der Gattung Pseudomonas, z. B. Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, vorzugsweise Pseudomonas putida KT 2440, stammt. |
| 7. | Verfahren zur Herstellung von Exportsystemen, bei dem eine Zelle nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die Exportsysteme aus dem Medium isoliert werden. |
| 8. | Expressionsprodukt oder Teilexpressionsprodukt einer DNASequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3. 9. |
| 9. | Synthetisches Peptid oder Protein mit der Aminosäuresequenz eines Expressions produktes oder Teilexpressionsproduktes nach Anspruch 8. |
| 10. | Polyklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei lexpressionsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist. |
| 11. | Monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei lexpressionsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist. |
| 12. | Hybridomzelle, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 11 bildet. |
| 13. | Polyoder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 10 oder 11, der nachweisbar markiert ist. |
| 14. | Polyoder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13, wobei die Markierung eine oder mehrere radioaktive, farbige oder fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Im mobilisierung an einer festen Phase und/oder Gruppen für eine indirekte oder direkte Re aktion, insbesondere mit Hilfe von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, des auf Biotin/Avidin (Streptavidin) oder des auf kolloidalem Gold beruhenden Systems umfaßt. |
| 15. | Trangene Pflanze, die transformierte oder transfizierte Zellen nach Anspruch 5 enthält. |
| 16. | Transgene Pflanze nach Anspruch 15, die zu den Leguminosen gehört. |
| 17. | Verwendung von DNASequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Teilse quenzen davon als Sonden zum Nachweis oder zur Isolierung von"Fulllength"cDNA Sequenzen und/oder als Primer zur Amplifikation derartiger"Fulllength"cDNA Sequenzen durch die Polymerasekettenreaktion. |
| 18. | Verwendung von transformierten Zellen nach Patentanspruch 5 oder von nach dem Verfahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Exportsystemen oder von Expressi onsoder Teilexpressionsprodukten nach Patentanspruch 8 oder von synthetischen Pepti den oder Proteinen nach Patentanspruch 9 zur Förderung der Entwicklung, des Wachs tums und des Ertrags von Pflanzen. |
| 19. | Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Pflanze zu den Leguminosen gehört. |
Description:
DNA-Sequenzen, die Exportsysteme kodieren.
Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die Exportsysteme kodieren, insbesondere Ex- portsysteme von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas- putida-und Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe.
Einleitung und Stand der Technik Das Exportsystem der P.-putida-Gruppe und seine Homologen in der P.-fluoreszenz- Gruppe exportiert Peptide, Proteine und andere Substrate durch die bakterielle Zellwand.
Beschreibung der Erfindung Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von DNA-Sequenzen gemäß Patentanspruch 1, die Exportsysteme kodieren, insbesondere Exportsysteme von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida-oder Pseudomonas-fluoreszenz- Gruppe. Im folgenden bedeutet die Angabe"ORF"einen offenen Leserahmen (open reading fra- me).
Durch die Bereitstellung derartiger DNA-Sequenzen lassen sich folgende Vorteile erzie- len.
Mit Hilfe der natürlichen oder modifizierten Sequenzen und davon abgeleiteter Expressi- onsprodukte kann P. putida oder ein anderer geeigneter Wirt endogene oder modifizierte Metabolite sowie endogen oder heterolog exprimierte Proteine translozieren und auf die- se Weise die Bodenqualität erhöhen, phytoprotektiv wirken und Entwicklung, Wachstum und Ertrag von Pflanzen verbessern. Die Verwendung von P. putida KT2440 ist eine biologische Sicherheitsmaßnahme und ist daher für den Einsatz im Freiland geeignet.
Die DNA-Sequenzen lassen sich mit üblichen molekularbiologischen Methoden (vgl. z.
B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis,"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989) in bekannte und optimierte Ex- pressionsvektoren insertieren, wodurch die entsprechende Transformation, Selektion und Klonierung von Zellen möglich ist, die dann zur Synthese von Exportsystemen durch Fermentation in der Lage sind. Wenn ein überproduzierender Zellklon gewählt wird, las- sen sich die gewünschten Exportsysteme leicht in großen Mengen herstellen und gewin- nen.
Die Kenntnis der DNA-Sequenzen gestattet die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagenesis") mit üblichen gentechnischen Methoden und somit die Konstruktion von optimierten Exportsystemen ("protein engineering").
Ferner ist die Modulation der Expression der kodierenden Sequenzen, insbesondere in Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida-oder Pseudomonas fluoreszenz-Gruppe, möglich. Unter Modulation wird allgemein eine Be- einflußung der Expression verstanden, z. B. das An-und Ausschalten oder die Erhö- hung/Erniedrigung der Expression.
Die Erfindung betrifft somit ferner einen rekombinierten Expressionsvektor nach Patent- anspruch 4, damit transformierte Zellen nach Patentanspruch 5, ein Verfahren zur Her- stellung von Exportsystemen nach Patentanspruch 7, Expressions-bzw. Teilexpressions- produkte nach Patentanspruch 8, synthetische Peptide bzw. Proteine nach Patentanspruch 9, poly-bzw. monoklonale Antikörper nach Patentanspruch 10 bzw. 11, Hybridomzellen nach Patentanspruch 12, transgene Pflanzen nach Patentanspruch 15 sowie die Verwen- dung der DNA-Sequenzen als Sonden bzw. PCR-Primer nach Patentanspruch 17 und die Verwendung der transformierten Zellen nach Patentanspruch 5 oder der nach dem Ver- fahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Exportsysteme oder der Expressions-bzw.
Teilexpressionsprodukte nach Patentanspruch 8 oder der synthetischen Peptide bzw.
Proteine nach Patentanspruch 9 zur Förderung der Entwicklung, des Wachstums und des Ertrags von Pflanzen nach Patentanspruch 18.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Verfahren zum Anzüchten beliebiger Zellen, zur Isolierung der DNA daraus sowie zu deren Amplifikation, z. B. durch die Polymerasekettenreaktion, und deren Sequenzierung sind im Stand der Technik bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung. Das glei- che gilt für die Rekombination von DNA-Sequenzen, die Konstruktion/Rekombination von geeigneten Expressionsvektoren und die Transformation/Transfektion von beliebigen Zellen mit molekularbiologischen Techniken, die Identifikation/Selektion von geeigneten Klonen und deren Anzüchtung und die Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung der von diesen Klonen produzierten Expressionsprodukte (vgl. beispielsweise das oben zi- tierte Standardwerk von Maniatis et al. ; D. S. T. Nicholl,"Gentechnische Methoden", Spektrum Akademischer Verlag, 1995 ; C. R. Newton, A. Graham,"PCR", Spektrum Akademischer Verlag, 1994 ; F. Lotspeich/H. Zorbas (Hrsg.),"Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag, 1998). Auch die Herstellung und Markierung von poly-oder monoklonalen Antikörpern bzw. die Herstellung der die letzteren bildenden Hybridome ist seit langem bekannt (vgl. beispielsweise : E. Harlow, D. Lane,"Antibodies, A Labo- ratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ; E. Lidell, I. Weeks,"Antikörper- Techniken", Spektrum Akademischer Verlag, 1996).
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