Titre : CONSTRUCTION D’ADN POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES OCULAIRES

Domaine technique

La présente invention concerne une nouvelle construction d’ADN ainsi que sa mise en œuvre dans le traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale. Une méthode selon l’invention concerne plus particulièrement ladite construction d’ADN permettant la production ciblée intraoculaire de deux protéines thérapeutiques durant une période pouvant aller jusqu’à plusieurs mois. La construction d’ADN et son utilisation selon l’invention sont plus particulièrement adaptées au traitement des pathologies de la rétine par le biais d’une injection de la construction d’ADN dans le muscle ciliaire suivie d’un électrotransfert pour la production intraoculaire et durable des protéines thérapeutiques d’intérêt.

Technique antérieure

La cécité liée aux maladies métaboliques, inflammatoires ou à l’âge est en forte croissance et pose un problème de société de plus en plus significatif en Europe et dans le monde en terme de santé publique. Les causes principales de cécité sont liées à des pathologies de la rétine, parmi lesquelles la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), les rétinopathies diabétiques (RD), Tuvéite, le glaucome, les rétinites pigmentaires, les hémorragies consécutives au trauma oculaires et le décollement de rétine. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) entraînant une cécité a une prévalence de l’ordre de 8,7%, affecte près de 26% de la population de 50 ans et plus. La DMLA devient un problème majeur de santé publique et social en raison de l’accroissement de l’âge de la population. L’augmentation constante et majeure de l’incidence du diabète est la cause majeure des rétinopathies diabétiques (RD) qui deviennent à leur tour une priorité de santé publique et de recherche scientifique. Les statistiques montrent que le diabète de type II touchera d’ici 2030 plus de 4,5% de la population dont près de 30% souffrira de rétinopathie diabétique. Enfin, Tuvéite représente un groupe de maladies inflammatoires oculaires dont la prévalence est estimée à 1/1000 et l’incidence à 0,5/1000. L’uvéite est responsable de 10% des cas de cécité et a donc, bien que plus rare que les maladies précédentes, un impact social et économique majeur chez de jeunes patients en âge de travailler. Le glaucome est la deuxième cause de cécité irréversible dans le monde. Le nombre de personnes atteintes de glaucome dans le monde devrait passer de 76 millions en 2020 à 111 millions en 2040. Le glaucome se caractérise par une pression intraoculaire anormale induisant une neuropathie optique progressive caractérisée par une dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes et une perte du champ visuel. La pression intraoculaire est actuellement le seul facteur de risque pour lequel il existe des traitements. Cependant, les dommages glaucomateux persistent chez près de 50% des patients, malgré une baisse de la pression intraoculaire. Les rétinites pigmentaires représentent un groupe cliniquement et génétiquement hétérogène de troubles héréditaires de la rétine caractérisés par une perte progressive des photorécepteurs en périphérie de la rétine qui progresse ensuite vers la macula. La déficience visuelle se manifeste généralement par une cécité nocturne et une perte progressive du champ visuel. Sa prévalence est de 1/3000 à 1/5000. Plus de 50 gènes responsables de rétinites pigmentaires ont été identifiés à ce jour.

Pour traiter certaines de ces pathologies, des injections intraoculaires, voire intravitréennes, d’agents thérapeutiques ont été développées. En 2006, les premières protéines thérapeutiques de type anti-VEGF (pour Vascular Endothélial Growth Factor ou facteur de croissance de l’endothélium vasculaire) ont été administrées par voie intraoculaire pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA. On citera notamment en tant qu’ exemple de protéine de type anti-VEGF le Lucentis® (ranibizumab) qui a obtenu une autorisation de mise sur le marché pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA et de l’œdème diabétique maculaire. Les injections intraoculaires de protéines thérapeutiques, et notamment de protéines recombinantes, sont devenues depuis communes pour le traitement des œdèmes maculaires de la DMLA, de la rétinopathie diabétique et des occlusions veineuses. Afin d’assurer un effet continu sur les pathologies oculaires, les anti-VEGF décrits ci-dessus sont administrés une fois par mois ou au mieux une fois tous les deux mois selon les patients. Il y a donc une nécessité de suivi de chaque patient afin de déterminer la fréquence d’administration des anti-VEGF pour que le traitement soit pleinement efficace. Ce suivi engendre une contrainte importante pour les patients, les aidants ainsi que pour les soignants qui le plus souvent résulte en un traitement sous-optimal et peu efficace sur le long terme (Ciulla 2020, Ophthalmology Retina 2020;4:19-30). Par ailleurs, cette méthode de traitement induit des variations du taux de protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient, à savoir une concentration importante lors de l’injection (un pic) et une concentration qui s’amenuise petit à petit pour tendre vers zéro jusqu’à l’injection suivante. La concentration en protéine thérapeutique n’est donc pas régulière et n’est pas optimale pour toute la durée du traitement. De plus le risque d’effets secondaires associés à l'administration intravitréenne augmente avec la répétition des administrations (Schargus 2020, Clinical Ophthalmology 2020:14 897-904).

Parmi les pathologies oculaires, l’uvéite est définie comme un processus inflammatoire qui affecte l’iris, le corps ciliaire ou la choroïde de l’œil du patient, ces trois éléments formant l’uvée. C’est un terme générique qui couvre plusieurs pathologies différentes dont les causes demeurent inconnues mais sont généralement de deux types : les uvéites infectieuses et les uvéites non infectieuses. On distingue l’uvéite antérieure qui touche l’iris ou le corps ciliaire et est la plus commune des uvéites dans les pays de l’ouest, de l’uvéite intermédiaire qui touche le vitré antérieur, et l’uvéite postérieure qui touche la choroïde et la rétine. L’uvéite non infectieuse a souvent une composante autoimmune. L’uvéite antérieure aigue associée à l’antigène HLA-B27 représente la première cause d’uvéite (Rothova et a 1., Br J Ophthalmol. 1992; 76:137-41). Par ailleurs on retrouve des uvéites antérieures associées à de nombreuses maladies rhumatologiques telles la sarcoïdose. L’uvéite postérieure de cause non infectieuse est le plus souvent associée à la maladie de Behçet, à la maladie de Vogt Koyanagi Harada, à la chorio-rétinopathie de Birdshot, etc.

Le traitement avec des corticoïdes par voie orale et/ou topique est largement utilisé dans le traitement des uvéites postérieures non infectieuses. De plus, pour les pathologies les plus réfractaires, des immunosuppresseurs peuvent être ajoutés au traitement pour augmenter les effets anti-inflammatoires des corticostéroïdes. Ceci concerne notamment mais pas exclusivement la cyclosporine, le methotrexate, G azathioprine, le mycophénolate mofétil, le tacrolimus et le chlorambucil. Depuis une dizaine d’années, des traitements utilisant des anticorps anti-TNF alpha peuvent également été utilisés dont Humira® (Adalimumab) récemment approuvé pour le traitement de l’uvéite non infectieuse avec inflammation de l’arrière de l’œil.

Des essais cliniques portant sur l’utilisation des composés thérapeutiques suivants : cyclosporine A, rapamycine, tacrolimus, et anti-TNF alpha, ont été menés pour évaluer l’efficacité et la sûreté de ces composés et ainsi pouvoir traiter des pathologies oculaires autoimmunes comme la maladie de Behçet. Il a cependant été montré que l’administration systémique de ces composés thérapeutiques conduit à long terme à de nombreux effets secondaires et que pour certains d’entre eux, leur administration locale présente peu d’efficacité ou une mauvaise tolérance par le patient.

Les méthodes de traitement décrites ci-dessus présentent donc plusieurs inconvénients. Les composés thérapeutiques administrés par voie systémique et topique entraînent de très nombreux effets secondaires. Les protéines recombinantes administrées par injections intra vitréennes doivent être administrées fréquemment avec des fluctuations importantes des concentrations entre chaque administration. La répétition de ces injections reste extrêmement lourdes et stressantes pour les patients et peuvent engendrer également des effets secondaires (élévation de la pression intraoculaire, inflammation intraoculaire, endophtalmie, cataracte, etc). Ainsi, au final, de nombreux patients renoncent à leur traitement.

Afin de surmonter ce problème, les inventeurs ont précédemment proposé, comme notamment illustré dans la demande FR3031112, de diminuer le nombre et/ou la fréquence des interventions du chirurgien, et donc de réduire l’aspect invasif des injections intra oculaires, tout en assurant une production stable et constante d’une protéine thérapeutique pendant une durée de plusieurs mois via la mise en œuvre d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient. Cette construction comprend une origine de réplication, un promoteur permettant l’expression de G ADN dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d’un électrotransfert.

Le traitement des pathologies oculaires précédemment mentionnées peut toutefois nécessiter la mise en œuvre de deux actifs thérapeutiques, d’un second composé venant potentialiser l’efficacité d’un actif thérapeutique, ou d’un composé constitué de 2 sous-unités peptidiques. Dans le cadre de la méthode mentionnée ci-dessus, il pourrait ainsi être envisagé d’administrer au patient une composition comprenant deux types de constructions d’ADN, se distinguant en ce qu’un premier type permet l’expression de la première molécule d’intérêt tandis qu’un second type permet l’expression de la seconde molécule d’intérêt. Une telle méthode ne serait toutefois pas idéale, (i) en ce qu’elle nécessiterait le développement de deux produits, ce qui conduirait à une augmentation des coûts de développement et de production, et à la nécessité d’évaluer l’activité et la sécurité de chacun des produits pris séparément et en combinaison, (ii) en ce qu’elle imposerait une contrainte importante en terme de dosage, réduisant de moitié la dose maximale de chacun des deux actifs thérapeutiques pouvant être administrés, et enfin (iii) en ce qu’elle ne permettrait pas la maîtrise complète de la quantité de chacune de ces constructions pénétrant les cellules ciblées, ce qui conduirait par conséquent à une incertitude quant au ratio entre ces molécules d’intérêt exprimées au niveau de l’œil. De telles contraintes et incertitudes ne sont pas souhaitables dans le cadre du traitement d’une pathologie.

Les inventeurs proposent par conséquent, dans le cadre de la présente invention, la mise en œuvre d’une construction d’ADN comprenant les séquences codant pour les deux protéines d’intérêt. Résumé de l’invention

Un premier objet de la présente invention concerne donc une construction d’ADN pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :

(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,

(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,

(c) une première séquence nucléotidique codant :

- pour une première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique ;

(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;

(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;

(f) une seconde séquence nucléotidique codant :

- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;

(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et

(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique ; ladite construction d’ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.

En effet, et contre toute attente, l’augmentation significative de la taille de la construction d’ADN, conséquence de l’introduction non pas d’une mais de deux séquences codant pour les molécules d’intérêt, n’affecte pas négativement sa capacité à pénétrer les cellules ciblées dans le cadre d’une méthode telle qu’indiquée ci-dessus, comprenant non seulement l’injection directe dans le muscle ciliaire de ladite construction, mais également une étape d’électrotransfert.

Par conséquent, une méthode et une construction selon l’invention permettent avantageusement, et contre toute attente :

- non seulement de démultiplier les possibilités de traitements de pathologies oculaires, en permettant la production in situ de deux actifs ou d’un actif et d’un composé apte à potentialiser l’activité/1’ efficacité de l’actif ;

- mais également de conserver, sans les diminuer, les avantages de la méthode indiquée ci- dessus en termes de nombre / de fréquence réduit(e) des interventions du chirurgien, et par conséquent de réduction de l’aspect invasif des injections intra oculaires, tout en assurant une production stable et constante des protéines thérapeutiques pendant une durée de plusieurs mois.

Selon un mode de réalisation, la première protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine de type anti-VEGF, en particulier choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept.

Selon un mode de réalisation, la première protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est plus particulièrement encodée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2.

Selon un mode de réalisation, la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine.

Selon un mode de réalisation, la seconde protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, et en particulier par une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, plus particulièrement constitué par la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence SEQ ID NO : 1, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 11.

Selon un mode de réalisation, une construction d’ADN pour son utilisation selon l’invention est telle que :

(c) la première séquence nucléotidique code : - pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement Aflibercept ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.

Selon un mode de réalisation, l’origine de réplication d’une construction d’ADN telle que mentionnée ci-dessus est bactérienne, et est en particulier une origine de réplication issue du plasmide naturel R6K d ’Escherichia coli , en particulier l’origine de réplication R6K gamma du plasmide naturel R6k d ’ Escherichia coli, notamment de séquence SEQ ID NO : 31.

La construction d’ADN selon l’invention peut être de forme linéaire ou circulaire, en particulier de forme circulaire. Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN selon l’invention est un plasmide circulaire.

Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN est une construction d’ADN nu.

Selon un mode de réalisation, une construction d’ADN pour son utilisation telle que mentionnée ci-dessus est caractérisée en ce que la pathologie oculaire est une dégénérescence rétinienne, en particulier une dégénérescence rétinienne choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), humide ou sèche ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; d’une uvéite, en particulier d’une uvéite non infectieuse ; d’une rétinite pigmentaire et d’un glaucome, et plus particulièrement en ce que la dégénérescence rétinienne est choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier de la forme néovasculaire (humide) de la DMLA ; d’une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique.

Un autre objet de la présente invention concerne une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu’elle comprend : (a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,

(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,

(c) une première séquence nucléotidique codant :

- pour une première protéine thérapeutique, ladite première protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique ;

(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;

(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;

(f) une seconde séquence nucléotidique codant :

- pour une seconde protéine thérapeutique, ladite seconde protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;

(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et

(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.

En particulier, la construction d’ADN selon l’invention est telle que : c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend : - une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.

Brève description des dessins

La Figure 1 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide A).

La Figure 2 représente une construction d’ADN non conforme à l’invention car ne codant que pour une seule protéine thérapeutique (la transferrine - même séquence que celle utilisée dans le Plasmide A), celle-ci étant, tout comme dans le Plasmide A, sous le contrôle d’un promoteur de type CMV (Plasmide a’).

La Figure 3 représente la variation de la concentration en Transferrine de séquence SEQ ID NO : 17 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 30 jours (abscisse : jours post-électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction, conforme à l’invention (Plasmide A) ou d’une construction non conforme à l’invention (Plasmide a’) car ne codant que pour la transferrine, celle-ci étant sous le contrôle du même promoteur que dans le plasmide A, dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats. Chaque groupe de rats s’est ainsi vu administrer une construction spécifique parmi les deux mentionnées.

La Figure 4 représente la variation de la concentration en protéine de fusion anti-TNF-alpha de séquence SEQ ID NO : 22 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 30 jours (abscisse : jours post-électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction, conforme à l’invention (Plasmide A) dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats.

La Figure 5 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide B).

La Figure 6 représente une construction d’ADN non conforme à l’invention car ne codant que pour une seule protéine thérapeutique (l’aflibercept - même séquence que celle utilisée dans le Plasmide B, i.e. séquence SEQ ID NO : 2), celle-ci étant, tout comme dans le Plasmide B, sous le contrôle d’un promoteur de type CAG (Plasmide b’).

La Figure 7 représente la variation de la concentration en Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 21 jours (abscisse : jours post électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction conforme à l’invention (Plasmide B) ou d’une construction non conforme à l’invention (Plasmide b’) car ne codant que pour l’aflibercept, celle-ci étant sous le contrôle du même promoteur que dans le plasmide B, dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats. Chaque groupe de rats s’est ainsi vu administrer une construction spécifique parmi les deux mentionnées.

La Figure 8 représente la variation de la concentration en Décorine de séquence SEQ ID NO : 8 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 21 jours (abscisse : jours post électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction conforme à l’invention (Plasmide B) dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats.

La Figure 9 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide C).

La Figure 10 représente le pourcentage d’impact présentant une fuite sévère (grade 3) (ordonnée : % Grade 3 CNV Lésions) en fonction des traitements (abscisse). A gauche : véhicule (contrôle). A droite : Plasmide C.

Description détaillée

Définitions

Dans le contexte du présent texte, les termes « traiter » et « traitement » associés à une pathologie oculaire, désignent une diminution, voire une interruption de ladite pathologie.

Le terme « patient » tel qu’utilisé dans le présent texte désigne de préférence un mammifère, y compris un mammifère non-humain, et plus particulièrement un être humain.

Les termes « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » sont utilisés dans le présent texte afin de permettre, lors de la lecture de celui-ci, de clairement faire la distinction entre ces deux séquences et les protéines qu’elles encodent.

De telles séquences nucléotidiques correspondent à des cassettes d’expression, chacune de ces cassettes étant telle que définie ci-après.

Ces termes de « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » ne visent toutefois pas à indiquer l’ordre dans lequel ces séquences/cassettes d’expression sont présentent dans une construction selon l’invention. Ainsi, selon un mode de réalisation, dans le sens de lecture d’une construction selon l’invention, la première séquence nucléotidique peut être présente avant la seconde séquence nucléotidique. Dans un autre mode de réalisation, dans le sens de lecture d’une construction selon l’invention, la seconde séquence nucléotidique peut être présente avant la première séquence nucléotidique.

Conformément à ce qui est précédemment indiqué, la « première séquence nucléotidique » comprend une séquence codant pour une première protéine thérapeutique et une séquence codant pour un peptide signal, ces séquences étant, au sein de la « première séquence nucléotidique », dans l’ordre tel que spécifiquement indiqué les unes par rapport aux autres, à savoir que la séquence codant pour le peptide signal est telle que le peptide signal est en N- terminal de la première protéine thérapeutique, i.e. la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la première protéine thérapeutique.

De même, et en conformité avec ce qui est précédemment indiqué, la « seconde séquence nucléotidique » comprend une séquence codant pour une seconde protéine thérapeutique et une séquence codant pour un peptide signal, ces séquences étant, au sein de la « seconde séquence nucléotidique », dans l’ordre tel que spécifiquement indiqué les unes par rapport aux autres, à savoir que la séquence codant pour le peptide signal est telle que le peptide signal est en N- terminal de la seconde protéine thérapeutique, i.e. la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la seconde protéine thérapeutique.

Le "pourcentage d'identité" entre deux séquences d’acides aminés ou d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.

Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé identique (ou une base nucléique identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés (ou entre les deux bases nucléiques) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés (ou en nucléotides) des deux séquences entre elles.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.

De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = " full " ; (3) OUTPUT FORMAT = " aln w/numbers " ; (4) OUTPUT ORDER = " aligned " ; (5) COLOR ALIGNMENT = " no " ; (6) KTUP (word size) = " default " ; (7) WINDOW LENGTH = " default " ; (8) SCORE TYPE = " percent " ; (9) TOPDIAG = " default " ; (10) PAIRGAP = " default " ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = " none " ; (12) MATRIX = " default " ; (13) GAP OPEN = " default " ; (14) END GAPS = " default " ; (15) GAP EXTENSION = " default " ; (16) GAP DISTANCES = " default " ; (17) TREE TYPE = " cladogram " et (18) TREE GRAP DISTANCES = " hide

Au sens de l’invention, une séquence d’acides aminés ayant par exemple au moins 80 % d’identité en acides aminés avec une séquence d’acides aminés de référence englobe les séquences d’acides aminés ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d’identité en acides aminés avec ladite séquence de référence.

Au sens de l’invention, une séquence nucléotidique ayant par exemple au moins 80 % d’identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique de référence englobe les séquences nucléotidiques ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d’identité en nucléotides avec ladite séquence de référence.

Construction d’ADN

Comme précédemment indiqué, la présente invention concerne en premier lieu une construction d’ADN pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire.

Cette construction est destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire.

Par ailleurs, une construction d’ADN selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle comprend (a) une origine de réplication bactérienne ou procary otique.

Selon un mode de réalisation particulier, une telle origine de réplication est en particulier bactérienne et peut par exemple être une origine de réplication de type Escherichia coli , plus particulièrement choisie dans le groupe constitué d’une origine de réplication issue du plasmide naturel R6K d’ Escherichia coli, en particulier l’origine de réplication R6K gamma du plasmide naturel R6k d’ Escherichia coli ; et de l’origine de réplication pUC OriC.

Les origines de réplication issue du plasmide naturel R6K d’ Escherichia coli sont en particulier définies dans le brevet EP1366176B2.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce qu’elle comprend (b) une ou plusieurs séquence(s) favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient. De telles séquences favorisant l’expression de l’ADN sont bien connues de l’homme du métier, telles que par exemples les séquences de type enhancer, également appelées des séquences amplificatrices ou activatrices. Peuvent par exemple être mentionnées les séquences enhancer issues de cytomégalovirus (CMV) et/ou du virus tumoral à ADN simien SV40.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs également caractérisée en ce qu’elle comprend (c) une première séquence nucléotidique codant notamment pour une première protéine thérapeutique ainsi que (f) une seconde séquence nucléotidique codant notamment pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique. Selon un mode de réalisation particulier, une construction d’ADN selon l’invention ne comprend que deux séquences codant pour des protéines thérapeutiques, i.e. ne comprend que deux cassettes d’expression, chacune de ces cassettes d’expression comprenant l’une des deux séquences codant pour une protéine thérapeutique.

Ces premières et secondes protéines thérapeutiques peuvent notamment être choisies parmi les protéines connues pour leur effet sur les pathologies oculaires.

Les effets de ces deux protéines peuvent être additionnels ou complémentaires. Par ailleurs, l’une de ces deux protéines peut avoir un effet potentialisateur de l’activité thérapeutique de l’autre protéine produite à partir de la construction d’ADN selon l’invention.

En particulier, les premières et secondes protéines thérapeutiques, différentes l’une de l’autre, peuvent par exemple être choisies dans le groupe constitué :

(i) d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ;

(ii) d’une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone

Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine;

(iii) d’une protéine ayant des propriétés anti-inflammatoires, en particulier d’une protéine de type anti-TNF, tel que par exemple hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgGl, le Lenercept ou la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, plus particulièrement une protéine de type anti TNF-alpha, en particulier une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851), et plus particulièrement une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22 ; (iv) d’une protéine de type anti-VEGF, en particulier choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept ;

(v) d’une protéine ayant des propriétés anti-angiogéniques, telle que l’angiostatine, l’endostatine, la thrombospondine, une protéine de type anti angiopoiétine-2, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti PLGF, une protéine de type anti PDGF ; et

(vi) d’une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément.

En particulier, (i) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la transferrine (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17).

En particulier, (ii) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la décorine (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8).

En particulier, (iii) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la protéine de fusion de séquence SEQ ID NO : 22 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22. En particulier, (iv) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3. En particulier, cette protéine est plus particulièrement l’aflibercept (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3).

En particulier, (vi) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26. En particulier, cette protéine est plus particulièrement le facteur H du complément (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26).

En particulier, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques, différentes l’une de l’autre, peuvent par exemple être choisies dans le groupe constitué :

(i) d’une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, en particulier d’une séquence nucléotidique ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16;

(ii) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti- fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11;

(iii) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti- inflammatoires, en particulier d’une protéine de type anti-TNF, tel que par exemple hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgGl, le Lenercept ou la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, plus particulièrement une séquence codant pour une protéine de type anti TNF-alpha, en particulier une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, et plus particulièrement une séquence ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ;

(iv) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ;

(v) d’une séquence codant pour une protéine ayant des propriétés anti-angiogéniques, telle que l’angiostatine, l’endostatine, la thrombospondine, une protéine de type anti angiopoiétine-2, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti PLGF, une protéine de type anti PDGF ; et

(vi) d’une séquence codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25.

Par « séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques », il ne faut pas entendre « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » telles qu’indiquées précédemment, mais bien les séquences qui sont présentent au sein de la première séquence nucléotidique et au sein de la seconde séquence nucléotidique selon l’invention, et qui codent spécifiquement pour la première et la seconde protéines thérapeutiques.

Selon un mode de réalisation, la première ou la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18. Ainsi, l’une des séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention peut en particulier être une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16. En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal.

Selon un mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques codées par une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et

- une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, et plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22.

Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16; et

- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21.

L’inflammation et le stress oxydatif sont des composantes importantes des dégénérescences rétiniennes telles que la DMLA ou la neuropathie glaucomateuse consécutive à l’augmentation de la pression intraoculaire engendrée par le glaucome. En particulier, une augmentation des concentrations intraoculaires en TNF alpha est observée dans les yeux glaucomateux (Tezel et al., 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul; 42(8): 1787-94) etTinjection de TNF-alpha dans l’œil de rongeur induit une dégénérescence axonale du nerf optique et une mort programmée des cellules ganglionnaires de la rétine (Kitaoka 2006, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47:1448-1457). Une augmentation de l’expression des gènes régulant le taux de fer a aussi été observée dans les yeux glaucomateux suggérant que le stress oxydatif induit par le fer puisse jouer un rôle dans la pathogenèse du glaucome (Farkas et al., 2004). L’administration d’un anti-TNF et d’un chélateur du fer, tel que la transferrine, permet avantageusement de réduire à la fois l’inflammation et le stress oxydatif médié par le fer.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 21 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 23 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, cette protéine étant plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 23.

Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques codées par une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et

- une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine.

Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11.

Le glaucome, en particulier le glaucome à angle ouvert primaire, se caractérise par une augmentation de la pression intraoculaire consécutive à la fibrose du réseau trabéculaire, et par la perte des cellules ganglionnaires de la rétine et la dégénérescence du nerf optique. Les traitements actuels du glaucome réduisent la pression intraoculaire mais ne permettent pas de freiner l’évolution de la neurodégénérescence. L’administration d’un agent agissant comme neuroprotecteur, tel qu’un anti-TNF ou la transferrine, permet avantageusement de potentialiser les effets d’un anti-fibrotique tel que la décorine, et de réduire à la fois la pression intraoculaire et de protéger la rétine et le nerf optique de la dégénérescence.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.

Selon un mode de réalisation, la première ou la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept. En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.

Ainsi, l’une des séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention peut en particulier être une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, F Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour F Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.

Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et

- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement F Aflibercept.

Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

La présence de l’actif anti-fibrotique permet avantageusement de potentialiser les effets de l’anti-VEGF, améliorant ainsi l’efficacité de ce composé dans le traitement des pathologies oculaires visées. Notamment, il a été observé que même chez les patients recevant des injections d'anti-VEGF à des intervalles optimaux, le développement d'une fibrose sous-rétinienne apparaît avec le temps dans plus de la moitié des patients, réduisant l’efficacité des anti-VEGF au fil du temps (Daniel et al. 2014, Ophthalmology 121, 656-666). Par ailleurs, le développement de fibrose sous-rétinienne a été identifié comme une cause de mauvaise réponse thérapeutique aux anti-VEGF chez les patients DMLA non-répondeurs aux anti-VEGF (Cohen ét al. 2012, Retina 32, 1480-1485).

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour l’Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend : - une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 7 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.

Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement : - une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, et plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ;

- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept.

Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

La présence de l’actif anti-TNF-alpha permet avantageusement de potentialiser les effets de l’anti-VEGF, améliorant ainsi l’efficacité de ce composé dans le traitement des pathologies oculaires visées. Notamment, il est bien connu que le VEGF induit la perméabilité rétinienne mais des agents inflammatoires, tels que le TNF-alpha, peuvent également conduire à la perméabilité vasculaire, en particulier chez les patients qui ne répondent pas au traitement anti- VEGF tel que cela peut être observé chez les patients souffrant de rétinopathie diabétique (Arias L. et al. ; Retina 2010, 30:1601el608 et Sfikakis et al. ; Diabètes Care 2010, 33: 1523el528). Des preuves récentes suggèrent que le VEGF et le TNF-alpha induisent la perméabilité par des mécanismes distincts.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 21 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 23 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour l’Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, cette protéine étant plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 23 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.

Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- d’une protéine régulant l’activation du complément, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément ;

- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept. Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

L’activation de la voie alterne du complément est une composante importante de la DMLA. Cette activation conduit à la formation du complexe d’attaque membranaire, au recrutement de macrophages, et à l’induction d’une inflammation avec production de cytokines impliquées dans l’inflammasome. Le facteur H du complément intervient pour réguler l’auto-activation du complément. Plusieurs variants polymorphiques dans le gène codant CFH, affectant la fonction de la protéine, confèrent une forte susceptibilité pour développer les deux formes de DMLA, sèche et humide. A l’inverse, l’inhibition de la voie alterne par l’injection intraoculaire de CFH réduit la néovascularisation dans des modèles animaux de néovascularisation choroidienne. Aussi, l’administration d’un actif régulant l’activation du complément_et d’un anti-VEGF, tel que F aflibercept, permet avantageusement de réduire à la fois la néovascularisation et l’inflammation associées à la DMLA.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et

- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :

- une séquence nucléotidique codant pour F Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.

En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :

(c) la première séquence nucléotidique code :

- pour une protéine régulant l’activation du complément, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :

- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et

- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique code également pour un peptide signal permettant la sécrétion de la première protéine thérapeutique.

Un tel peptide signal est bien connu de l’homme du métier. Ce peptide signal peut par exemple être l’activateur tissulaire du plasminogène humain (tPA) de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5) ou le peptide signal du HTLV-1 Env de séquence peptidique SEQ ID NO : 29 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30). Il peut également s’agir du peptide signal natif de la protéine thérapeutique considérée, tel que par exemple :

- le peptide signal natif de la Décorine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 13 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14) ;

- le peptide signal natif de la Transferrine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 (et pouvant être par exemple codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 19 ou par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20) ;

- le peptide signal d’une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier le peptide signal natif protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, ce peptide signal ayant une séquence peptidique SEQ ID NO : 23 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 24) ; ou - le peptide signal natif du facteur H, de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28).

Comme précédemment indiqué, ce peptide signal est contiguë de la première protéine thérapeutique, c’est-à-dire qu’il se trouve directement accolé en N-terminal de la première protéine thérapeutique, et ainsi donc, la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la première protéine thérapeutique.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce que la seconde séquence nucléotidique code également pour un peptide signal permettant la sécrétion de la seconde protéine thérapeutique.

Ce peptide signal peut par exemple être l’activateur tissulaire du plasminogène humain (tPA) de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5) ou le peptide signal du HTLV-1 Env de séquence peptidique SEQ ID NO : 29 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30). Il peut également s’agir du peptide signal natif de la protéine thérapeutique considérée, tel que par exemple :

- le peptide signal natif de la Décorine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 13 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14) ;

- le peptide signal natif de la Transferrine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 (et pouvant être par exemple codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 19 ou par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20) ;

- le peptide signal d’une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier le peptide signal natif protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, ce peptide signal ayant une séquence peptide SEQ ID NO : 23 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 24) ; ou

- le peptide signal natif du facteur H, de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28).

Ce peptide signal peut être identique ou différent du peptide signal codé par la première séquence nucléotidique, et est préférentiellement différent du peptide signal codé par la première séquence nucléotidique. Comme précédemment indiqué, ce peptide signal est contiguë de la seconde protéine thérapeutique, c’est-à-dire qu’il se trouve directement accolé en N-terminal de la seconde protéine thérapeutique, et ainsi donc, la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la seconde protéine thérapeutique.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide signal codé par la première séquence nucléotidique et le peptide signal codé par la seconde séquence nucléotidique sont, indépendamment l’un de l’autre, choisis dans le groupe constitué des séquences peptidiques SEQ ID NO : 4 ; SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 27 et SEQ ID NO : 29.

Selon un mode de réalisation, la séquence codant pour le peptide signal codé par la première séquence nucléotidique et la séquence codant pour le peptide signal codé par la seconde séquence nucléotidique sont, indépendamment l’une de l’autre, choisies dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 5; SEQ ID NO : 14; SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20; SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 30.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs également caractérisée en ce qu’elle comprend (d) un promoteur permettant l’expression de la première protéine thérapeutique d’une construction selon l’invention ainsi que (g) un promoteur permettant l’expression de la seconde protéine thérapeutique d’une construction selon l’invention.

Ces promoteurs peuvent être identiques ou différents. Selon un mode de réalisation particulier, ces deux promoteurs sont différents l’un de l’autre.

De tels promoteurs peuvent par exemple être des promoteurs de type CAG, ou CMV.

Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce qu’elle comprend (e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique et (h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.

Une séquence de polyadénylation contient en particulier un motif conservé de séquence AATAAA bien connue de l’homme du métier.

Ces deux séquences de polyadénylation peuvent être identiques ou différentes l’une de l’autre. Selon un mode de réalisation, elles sont différentes l’une de l’autre.

Ces séquences de polyadénylation peuvent par exemple être des séquences de polyadénylation de type RBG (Rabbit Beta Globin), ou BGH (Bovine Growth Hormone). Enfin, comme précédemment indiqué, une construction d’ADN selon l’invention est administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.

Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN selon l’invention est de forme circulaire.

Dans un mode de réalisation de l’invention la construction d’ADN est une construction d’ADN nu.

Selon un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire.

Dans un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21. Dans un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

Dans une mode de réalisation, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11.

Dans une mode de réalisation selon l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence protéique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ; et - une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

Dans une mode de réalisation selon l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et

- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.

La présente invention concerne également une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu’elle comprend :

(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,

(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de F ADN dans la sphère oculaire du patient,

(c) une première séquence nucléotidique codant :

- pour une première protéine thérapeutique, ladite première protéine thérapeutique étant l’aflibercept ; et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,

(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;

(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ; (f) une seconde séquence nucléotidique codant :

- pour une seconde protéine thérapeutique, ladite seconde protéine thérapeutique étant la décorine, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ; et

(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et

(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.

Mise en œuyre d’une construction d’ADN décrite ci-dessus

Une construction d’ADN telle que définie ci-dessus est notamment dédiée au traitement de pathologies oculaires.

Une pathologie oculaire selon la présente invention est une dégénérescence rétinienne.

Cette dégénérescence rétienne peut en particulier être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), humide ou sèche ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; d’une uvéite, en particulier d’une uvéite non infectieuse ; d’une rétinite pigmentaire et d’un glaucome.

A titre de rétinopathie diabétique, on entend en particulier désigner une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD), à une hémorragie intravitréenne, un décollement de rétine, ou un glaucome néovasculaire.

Selon un mode de réalisation particulier, et notamment lorsque une construction selon l’invention mise en œuvre pour le traitement d’une pathologie oculaire comprend à titre de première et seconde protéines thérapeutiques G Aflibercept et la Décorine telle que définie ci- dessus, ladite pathologie oculaire est une dégénérescence rétinienne pouvant plus particulièrement être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier la forme humide ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; et plus particulièrement être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier de la forme néovasculaire (humide) de la DMLA ; d’une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique.

A titre de rétinopathie diabétique, on entend en particulier désigner une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) et la formation de néovaisseaux observée dans la forme proliférante de rétinopathie diabétique.

Comme indiqué précédemment, une construction d’ADN selon l’invention est injectée dans un muscle oculaire, le muscle ciliaire, où elle est soumise à un électrotransfert. La technique connue de thérapie génique non virale utilisée dans la présente invention est l’injection de la construction d’ADN dans un muscle oculaire puis G électrotransfert pour induire une perméabilisation transitoire des cellules du muscle ciliaire et une migration de l'ADN pour optimiser la transfection de la construction d’ADN. Cette technique d’électrotransfert d’ADN (appelée aussi électroporation ou électroperméabilisation) est simple à mettre en œuvre, fiable et sûre pour le patient. A l’inverse des vecteurs viraux, G électrotransfert d’ADN n’induit pas de réponse immunitaire et permet une expression à long terme des gènes ainsi introduits. De plus, les études menées sur les lentivirus et les rétrovirus montrent que ces derniers sont susceptibles d’induire des mutations d’insertion durant leur intégration dans le génome hôte. Les constructions d’ADN présentement décrites ne présentent pas ce type d’inconvénients, sont faciles à produire et à manipuler et n’induisent pas de réponse immunitaire, les rendant ainsi parfaitement adaptées à la thérapie génique de patients, notamment humains.

Selon la présente invention, l’injection d’une construction d’ADN se fait dans le muscle ciliaire car ce dernier est capable de produire les protéines de façon homogène et constante et, du fait de sa position, favorise la diffusion de ces protéines dans l’ensemble de la sphère oculaire (Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis”, FASEB J. 2006 Feb;20(2):389-91). Les cellules musculaires lisses ont un taux de renouvellement faible et sont bien réparties de part et d’autre du cristallin. La quantité de protéine à produire est proportionnelle à la surface du muscle transfecté (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Ainsi, la production des protéines d’intérêt selon la présente invention, et notamment de protéines thérapeutiques telles que précédemment décrites, sera homogène et constante dans l’ensemble de la sphère oculaire et sera limitée à cette sphère oculaire. On citera à titre d’exemple la méthode d’électrotransfert décrite dans la demande de brevet EP2266656 qui traite d’une méthode d’injection d’une composition pouvant contenir de l’ADN au niveau des tissus du corps ciliaire et/ou des tissus musculaires extraoculaires.

Le muscle ciliaire fait partie du corps ciliaire, proche du limbe et juste derrière la sclère. L’injection d’une construction d’ADN selon l’invention dans celui-ci est donc très faiblement invasive contrairement aux injections sous-rétiniennes et constitue donc avantageusement le lieu d’injection de la construction d’ADN selon l’invention.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également l’utilisation d’une construction d’ADN pour traiter une pathologie oculaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :

(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,

(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,

(c) une première séquence nucléotidique codant :

- pour une première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,

(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;

(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;

(f) une seconde séquence nucléotidique codant :

- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ; (g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient, et

(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique ; ladite construction d’ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode de traitement d’une pathologie oculaire, comprenant l’administration d’une construction d’ADN à un patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :

(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,

(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,

(c) une première séquence nucléotidique codant :

- pour une première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,

(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;

(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;

(f) une seconde séquence nucléotidique codant :

- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et

- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;

(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et

(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.

L’invention est décrite ci-dessous de façon plus détaillée au moyen des exemples suivants qui sont présentés à titre d’illustration uniquement. Exemple 1

Les inventeurs ont mis en évidence l’expression de deux protéines thérapeutiques encodées dans une construction d’ADN selon l’invention (plasmide) dans le vitré de l’œil de rats après électrotransfert de cette construction d’ADN dans le muscle ciliaire.

Plasmides

Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide A, comprenant :

- la séquence SEQ ID NO : 16 encodant la transferrine humaine de séquence SEQ ID NO : 17 (la séquence codant pour son peptide signal étant la séquence SEQ ID NO : 20);

- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 21 encodant une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl (hTNFR-Is/hlgGl) de séquence SEQ ID NO : 22 (la séquence codant pour son peptide signal étant la séquence SEQ ID NO : 24);

- ces deux séquences étant sous le contrôle de promoteurs de type CMV ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 1. Une construction comparative dite simple, en ce qu’elle ne code que pour une seule des protéines d’intérêt mentionnées ci-dessus, i.e. la séquence SEQ ID NO : 16 encodant la transferrine humaine de séquence SEQ ID NO : 17, a également été préparée selon une méthode similaire, avec un squelette plasmidique similaire à la construction plasmide A, la seule séquence codant pour une protéine d’intérêt étant également sous le contrôle d’un promoteur de type CMV. Ce plasmide comparatif (dénommée Plasmide a’) est représenté en Figure 2.

Animaux

Des rats Long Evans âgées de 7 semaines sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (pour Association for Research in Vision and Ophthalmology). Les rats sont anesthésiés par injection intramusculaire d’une dose de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (4 mg/kg) avant injection bilatérale du plasmide (30 pg/œil) et électrotransfert au jour 0 (J0). 6 rats sont utilisés pour chacun des temps d’analyse (J3, J7, J14, J21, et J30).

A chaque temps d’analyse, les rats sont euthanasiés par administration d’une dose létale de pentobarbital (400 mg/kg) puis les animaux sont énucléés et les liquides oculaires (humeur vitrée et humeur aqueuse) sont prélevés et conservés à -80°C jusqu’à analyse.

Électrotransfert au niveau du muscle ciliaire du rat L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » ( FASEB J 2006; 20: 389-391 ) en modifiant la voie d’injection par une approche transsclérale (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Les plasmides sont injectés à raison de 30 pg dans 10 pL de solution Tris- EDTANaCl, dans le muscle ciliaire des animaux à l’aide d’une seringue adaptée.

Les impulsions électriques sont administrées à l’aide d’une électrode spécifique iridium/platine de 250 pm de diamètre. Cette électrode interne est introduite dans le tunnel transscléral existant. L’électrode externe est une feuille d’acier inoxydable courbée pour épouser la forme de l’œil et placée au niveau du limbe face à l’électrode interne. L’électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur similaire à celui décrit dans Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov;l 2(11 ):904- 19).

Résultats des tests

Des échantillons de liquides oculaires sont prélevés 3 jours (J+3), 7 jours (J+7), 14 jours (J+14), 21 jours (J+21) et 30 jours (J+30) après l’injection de plasmide suivie de l’électrotransfert (J0). Pour chacun de ces échantillons, une mesure ELISA est réalisée afin de mesurer la quantité de transferrine humaine et/ou de la protéine fusion anti-TNF-alpha de séquence SEQ ID NO : 22 présente dans les échantillons.

Une concentration moyenne est ainsi calculée pour chacun des groupes au fil du temps.

Les résultats obtenus sont représentés :

- en Figure 3 et représente en particulier la concentration en transferrine humaine (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+30 par une construction conforme à l’invention en comparaison avec une construction non-conforme à l’invention ; et

- en Figure 4 qui représente la concentration en protéine fusion anti-TNF-alpha (en pg/mL) de séquence SEQ ID NO : 22 produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+30.

Il apparaît à la lecture de ces Figures que la concentration en protéine fusion anti-TNF-alpha et en transferrine humaine est constante au fil du temps chez les rats ayant reçu la construction selon l’invention.

Ainsi, ces expériences matérialisent le fait que la mise en œuvre d’une construction selon l’invention, ayant une taille très importante du fait de la présence de non pas une mais de deux séquences codant pour des protéines d’intérêt, pénètre efficacement les cellules ciblées et permet l’expression des deux protéines encodées par ladite construction au niveau du site d’intérêt.

Par ailleurs, elles illustrent également, et de manière tout à fait inattendue, la capacité d’une construction selon l’invention à produire de manière plus stable dans le temps les protéines qu’elle encode comparativement à des constructions ne codant que pour une seule de ces protéines (Fig. 3).

Exemple 2

Les inventeurs ont confirmé les observations faites dans l’Exemple 1 dans un second protocole expérimental mettant en œuvre un plasmide conforme à l’invention différent de celui utilisé dans l’exemple 1.

Plasmides

Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide B, comprenant :

- la séquence SEQ ID NO : 7 encodant la Décorine de séquence SEQ ID NO : 8;

- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 2 encodant G Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 ;

- ces deux séquences étant sous le contrôle, respectivement, de promoteurs de type CMV et de type CAG ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 5. Une construction comparative dite simple, en ce qu’elle ne code que pour une seule des protéines d’intérêt mentionnées ci-dessus, i.e. la séquence SEQ ID NO : 2 encodant l’Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3, a également été préparée selon une méthode similaire, avec un squelette plasmidique similaire à la construction plasmide B, la seule séquence codant pour une protéine d’intérêt étant également sous le contrôle d’un promoteur de type CAG. La cassette d’expression de cette protéine d’intérêt est ainsi identique dans les deux constructions. Ce plasmide comparatif (dénommée Plasmide b’) est représenté en Figure 6

Les animaux mis en œuvre dans ce protocole sont tels que décrits dans l’exemple 1. 6 rats sont utilisés pour chacun des temps d’analyse (J3, J7, J14 et J21).

A chaque temps d’analyse, les rats sont euthanasiés par administration d’une dose létale de pentobarbital (400 mg/kg) puis les animaux sont énucléés et les liquides oculaires (humeur vitrée et humeur aqueuse) sont prélevés et conservés à -80°C jusqu’à analyse. L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans l’exemple 1.

Résultats des tests

Des échantillons de liquides oculaires sont prélevés 3 jours (J+3), 7 jours (J+7), 14 jours (J+14) et 21 jours (J+21) après l’injection de plasmide suivie de G électrotransfert (J0). Pour chacun de ces échantillons, une mesure ELISA est réalisée afin de mesurer la quantité de décorine et/ou d’ Aflibercept présente dans les échantillons.

Une concentration moyenne est ainsi calculée pour chacun des groupes au fil du temps.

Les résultats obtenus sont représentés :

- en Figure 7 et représente en particulier la concentration en Aflibercept (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+21 par une construction conforme à l’invention en comparaison avec une construction non-conforme à l’invention ; et

- en Figure 8 qui représente la concentration en décorine (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+21.

Il apparaît à la lecture de ces Figures que le plasmide selon l’invention permet l’expression des deux protéines thérapeutiques d’intérêt.

Ainsi, ces expériences matérialisent le fait que la mise en œuvre d’une construction selon l’invention, ayant une taille très importante du fait de la présence de non pas une mais de deux séquences codant pour des protéines d’intérêt, pénètre efficacement les cellules ciblées et permet l’expression des deux protéines encodées par ladite construction au niveau du site d’intérêt.

Par ailleurs, comme cela avait précédemment été montré dans l’exemple 1, elles illustrent également, et de manière tout à fait inattendue, la capacité d’une construction selon l’invention à produire de manière plus stable dans le temps les protéines qu’elle encode comparativement à des constructions ne codant que pour une seule de ces protéines (Fig. 7).

Exemple 3

Les inventeurs ont par ailleurs également confirmé les observations faites ci-dessus dans un protocole expérimental mettant en œuvre un plasmide conforme à l’invention différent de celui utilisé dans les exemples 1 et 2. Plasmides

Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide C, comprenant :

- la séquence SEQ ID NO : 11 encodant la Décorine de séquence SEQ ID NO : 8 sous le contrôle d’un promoteur de type CMV;

- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 2 encodant G Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 sous le contrôle d’un promoteur de type CAG ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 9.

Animaux

Des rats Brown Norway âgés de 7 à 8 semaines sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (pour Association for Research in Vision and Ophthalmology). Les rats sont anesthésiés par injection intramusculaire d’une dose de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (4 mg/kg) avant injection bilatérale du plasmide (30 pg/œil) ou du véhicule (10 pL) et électrotransfert au jour 0 (J0). 6 rats sont utilisés pour chacun des traitements. L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans l’exemple 1.

A J3, une néovascularisation choroïdienne est induite chez tous les animaux par photocoagulation laser en plusieurs endroits de la rétine (4 à 5 impacts laser par œil).

Résultats des tests

Quatorze jours après la lésion (J 17), la fuite vasculaire des néo-vaisseaux est évaluée par angiographie fluorescente et attribution d’un score en fonction de la sévérité de la fuite vasculaire selon le tableau suivant.

Observation Grade

Pas d’hyper fluorescence 0

Légère hyper fluorescence sans augmentation d'intensité ni de taille 1

Hyper fluorescence augmentant d'intensité en phase tardive sans augmentation de taille (fuite modérée) 2

Hyper fluorescence avec fuite en phase précoce avec augmentation de la taille et de l'intensité en phase tardive (fuite sévère) 3

Les résultats obtenus sont représentés en Figure 10 et représentent en particulier le pourcentage d’impact présentant une fuite sévère (grade 3) en fonction des traitements. Il apparaît à la lecture de cette Figure que le plasmide selon Finvention permet de réduire de 38% le nombre d’impact présentant une fuite néo vasculaire sévère comparativement aux animaux ayant reçu le véhicule.

Listage de séquences

SEQ ID NO : 1 : séquence nucléotidique codant pour Aflibercept agtgatacaggtagacctttcgtagagatgtacagtgaaatccccgaaattatacacatg actgaaggaagggagctcgtcattccctgc cgggttacgtcacctaacatcactgttactttaaaaaagtttccacttgacactttgatc cctgatggaaaacgcataatctgggacagtag aaagggcttcatcatatcaaatgcaacgtacaaagaaatagggcttctgacctgtgaagc aacagtcaatgggcatttgtataagacaaa ctatctcacacatcgacaaaccaatacaatcatagatgtcgttctgagtccgtctcatgg aattgaactatctgttggagaaaagcttgtctt aaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttc ttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaac cgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactata gatggtgtaacccggagtgaccaaggatt gtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggt ccatgaaaaagacaaaactcacacatgc ccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaa cccaaggacaccctcatgatctcccgga cccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttca actggtacgtggacggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc gtcctcaccgtcctgcaccaggactg gctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gaaaaccatctccaaagccaaagggc agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaacc aggtcagcctgacctgcctggtcaaa ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac tacaagaccacgcctcccgtgctgga ctccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagca ggggaacgtcttctcatgctccgtgatgc atgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa

SEQ ID NO : 2: séquence nucléotidique codant pour Aflibercept cagcgacaccggcagacccttcgtggaaatgtacagcgagatccccgagatcatccacat gaccgagggccgcgagctggtgatcc cttgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgacactgaagaagttccctctggacacac tgatccccgacggcaagaggatcatctg ggacagcagaaagggcttcatcatcagcaacgccacatacaaagagatcggactgctgac atgcgaggccaccgtgaacggccatc tgtacaagaccaactatctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtggtgctga gccccagccacggcatcgagctgagcg tgggcgagaagctggtgctgaactgcaccgccagaaccgagctgaatgtgggcatcgact tcaactgggagtaccccagctccaag caccagcacaagaaactggtgaaccgggatctgaaaacccagagcggcagcgagatgaag aagtttctgagcacactgaccatcga cggcgtgaccagaagcgaccaaggactgtacacatgcgccgccagcagcggactgatgac caagaagaacagcacattcgtccgg gtgcacgagaaggacaagacccacacatgcccaccatgcccagccccagagctgctggga ggcccctccgtgtttctgttccctcca aagcccaaggacactctgatgatcagcagaacccccgaagtgacatgcgtggtggtggac gtgtcccacgaggacccagaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagagga acagtacaacagcacatacagagtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaagactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaa gtctccaacaaggctctgccagccccc atcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaagtgtacacactg cctccaagccgggacgagctgacca agaatcaagtgtctctgacatgtctggtgaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtgg aatgggagagcaacggccagcccgaga acaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttctttctgtactcca aactgaccgtggacaagagcagatggca gcaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacaccca gaagtctctgtctctgagccccggcaa gtga

SEQ ID NO : 3 : séquence peptidique de TAflibercept

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRII WDSR KGFII SN AT YKEIGLLTCE AT VN GHL YKTN YLTHRQTNTIID VVL SP SHGIEL SV GEKL VLNCT ARTELN V GIDFNWE YP S SKHQHKKL VNRDLKT Q S GSEMKKFL S TLTIDG VTR SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTC VVVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVF S C S VMHE ALHNH YT QK SL SL SPGK

SEQ ID NO : 4 : séquence peptidique du peptide signal TPA MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS

SEQ ID NO : 5 : séquence nucléotidique codant pour le peptide signal TPA atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt tcgcccag

SEQ ID NO : 6: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggata ggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc gagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccag tgttctgatttgggtctggacaaagtgccaa aggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatca aagatggagactttaagaacctgaagaa ccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttac acctttggtgaagttggaacgactttatctgtcc aagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcc catgagaatgagatcaccaaagtgcga aaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctg aagagctcaggaattgaaaatggggctttc cagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcct caaggtcttcctccttcccttacggaattaca tcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataattt ggctaagttgggattgagtttcaacagcatc tctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggac aacaacaagcttaccagagtacctggtggg ctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagtt ggatcaagtgacttctgcccacctggacaca acaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactggg agatacagccatccaccttcagatgtgtcta cgtgcgctctgccattcaactcggaaactataagtaa SEQ ID NO : 7: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggccagcggcatc ggccccgaagtgcccgatgatagagattt cgagccctctctgggccccgtgtgtcctttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgca gtgcagcgatctgggcctcgacaaagtgc ctaaggatctgcctccagacaccacactgctggatctgcagaacaacaagatcaccgaga tcaaggacggcgactttaagaatctgaa gaatctccacgctctgatcctcgtgaacaacaaaatctccaaagtgtctcccggcgcttt cacccctctggtcaagctggaacggctgtat ctgagcaagaaccagctgaaagaactgcccgagaagatgcccaagacactgcaagagctg agagcccacgagaacgagatcacc aaagtgcggaaagtgacattcaacgggctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcacc aatcctctgaagtcctccggaatcgag aacggcgccttccaaggcatgaagaagctgagctacatccggatcgccgacaccaacatc accagcattcctcaagggctgcctcca tctctgaccgagctgcatctggacggcaacaagatttccagagtggacgccgcctctctg aagggactgaacaatctggccaaactgg gactgagcttcaacagcatcagcgccgtggacaacggctctctggccaacacaccacatc tgcgggaactccatctggataacaaca agctgaccagagttcccggcggactggccgagcacaagtacatccaagtggtgtatctcc acaacaacaatatcagcgtcgtgggca gcagcgatttctgccctccgggacacaataccaagaaggccagctacagcggagtgtctc tgttcagcaatcccgtgcagtactggga gatccagcctagcacattcagatgcgtgtacgtgcggagcgccatccagctgggcaacta caagtgatga

SEQ ID NO : 8: Séquence peptidique de la Décorine

GPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLD KVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKL ERL YL SKN QLKELPEKMPKTLQELRAHENEITK VRK VTFN GLN QMI VIELGTNPLK S S GIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLA KLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNIS VVGSSDF CPPGHNTKKAS YSGV SLF SNP VQYWEIQPSTFRC VYVRS AIQLGNYK

SEQ ID NO : 9: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcctctggaatc ggacctgaggtgcccgacgacagagactt cgaaccttctctgggccctgtgtgccccttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgca gtgcagcgacctgggccttgataaggtgc ccaaggacctgcctcctgacaccacactgctggacctgcagaacaacaagatcaccgaga tcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacgccctgatcctggtcaacaacaaaatcagcaaggtgtcccctggcgcc ttcacacctctggtcaagctggaaagact gtacctgagcaagaaccagctgaaagaactgcccgagaagatgcccaagacactgcaaga gctgcgggcccacgagaacgagatc accaaagtgcggaaagtgaccttcaacggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggc accaatcctctgaagtccagcggcattg agaacggcgccttccagggcatgaagaagctgagctacatccggatcgccgacaccaaca tcaccagcattcctcagggcctgcctc caagcctgacagagctgcatctggacggcaacaagattagcagagtggacgccgcctctc tgaagggcctgaacaatctggccaaa ctgggcctgagcttcaacagcatcagcgccgtggataacggcagcctggccaacacacct cacctgagggaactgcacctggataac aacaagctgaccagagtgcctggcggactggccgagcacaagtacatccaggtggtgtat ctccacaacaacaacatctccgtcgtg ggcagcagcgacttctgtcctcctggccacaataccaagaaggccagctactctggcgtg tccctgttcagcaaccccgtgcagtactg ggagatccagcctagcacctttagatgcgtgtacgtgcggagcgccatccagctgggcaa ctacaaatga

SEQ ID NO : 10: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggctagcggaatt ggacctgaagtgcccgacgaccgcgatttt gaaccatcactgggacctgtctgcccctttagatgtcagtgccacctgagggtggtgcag tgttctgacctgggcctggataaggtgcc aaaggacctgccccctgataccacactgctggacctgcagaacaataagatcaccgagat caaggacggcgatttcaagaatctgaa gaacctgcacgccctgatcctggtgaacaataagatctctaaggtgagcccaggcgcctt tacccccctggtgaagctggagagactg tacctgagcaagaatcagctgaaggagctgcccgagaagatgcctaagacactgcaggag ctgcgggcccacgagaacgagatca ccaaggtgagaaaggtgacattcaatggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggca ccaatcccctgaagagctccggcatcg agaacggcgcctttcagggcatgaagaagctgtcctatatccggatcgccgacaccaata tcacatctatccctcagggcctgccaccc agcctgacagagctgcacctggacggcaacaagatcagcagagtggatgccgcctccctg aagggcctgaacaatctggccaagct gggcctgtccttcaactccatctctgccgtggacaatggctctctggccaacacccctca cctgagggagctgcacctggataacaata agctgacacgcgtgccaggcggcctggcagagcacaagtacatccaggtggtgtatctgc acaacaataacatctccgtggtgggct ctagcgatttctgccctccaggccacaatacaaagaaggccagctactccggcgtgtccc tgttttctaaccctgtgcagtattgggagat ccagccctctacttttcggtgcgtctatgtcaggtccgccattcagctggggaactacaa ataa

SEQ ID NO : 11: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggccagcggcatc ggccccgaggtgcccgacgaccgcgac ttcgagcccagcctgggccccgtgtgccccttccgctgccagtgccacctgcgcgtggtg cagtgcagcgacctgggcctggacaag gtgcccaaggacctgccccccgacaccaccctgctggacctgcagaacaacaagatcacc gagatcaaggacggcgacttcaaga acctgaagaacctgcacgccctgatcctggtgaacaacaagatcagcaaggtgagccccg gcgccttcacccccctggtgaagctgg agcgcctgtacctgagcaagaaccagctgaaggagctgcccgagaagatgcccaagaccc tgcaggagctgcgcgcccacgaga acgagatcaccaaggtgcgcaaggtgaccttcaacggcctgaaccagatgatcgtgatcg agctgggcaccaaccccctgaagagc agcggcatcgagaacggcgccttccagggcatgaagaagctgagctacatccgcatcgcc gacaccaacatcaccagcatccccca gggcctgccccccagcctgaccgagctgcacctggacggcaacaagatcagccgcgtgga cgccgccagcctgaagggcctgaa caacctggccaagctgggcctgagcttcaacagcatcagcgccgtggacaacggcagcct ggccaacaccccccacctgcgcgag ctgcacctggacaacaacaagctgacccgcgtgcccggcggcctggccgagcacaagtac atccaggtggtgtacctgcacaacaa caacatcagcgtggtgggcagcagcgacttctgcccccccggccacaacaccaagaaggc cagctacagcggcgtgagcctgttca gcaaccccgtgcagtactgggagatccagcccagcaccttccgctgcgtgtacgtgcgca gcgccatccagctgggcaactacaagt aa SEQ ID NO : 12: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcgagtggcatt ggacctgaagtacccgatgatagagacttt gaaccatcattgggcccagtttgcccttttaggtgtcagtgccacctccgggtagttcaa tgcagcgatttgggactcgataaagtaccga aagacttgccaccggacacaacattgctcgatcttcaaaacaacaagatcactgaaataa aggatggagactttaaaaatctgaagaatt tgcacgccctcatcctggtcaacaacaagatcagcaaggtgtcccctggagcattcacgc ccctcgtaaagttggaacgcctctacctg tctaagaaccagttgaaagaactgcccgagaagatgcctaaaactctgcaagagcttaga gctcatgaaaatgaaattaccaaggttcg gaaggtaacctttaacggtcttaaccagatgatagtcattgagttgggcacgaacccatt gaaatcttctggcatagaaaacggggctttc caggggatgaaaaaactctcatatatccgcatcgcggataccaacatcacatctatacct caaggtttgcccccgagtttgaccgagctt cacctggatggcaacaagataagccgggtcgacgctgcctcactcaaagggctcaataat ctggcgaaactggggttgagtttcaattc aatatctgctgtcgacaacggctcacttgcgaacacaccccatcttagggaacttcatct ggacaacaacaagttgacacgggttcctgg gggactcgctgaacataaatatatacaggtcgtttatctccataataataatatcagcgt tgtaggctcatctgacttctgccctccaggcca taatacaaagaaagcgtcatacagtggcgtcagtttgttctctaacccggttcagtattg ggagattcaaccgtccacttttcggtgcgttta cgtgaggagtgcgattcagctgggtaactataagtaa

SEQ ID NO : 13: Séquence peptidique du peptide signal natif de la Décorine MK ATIILLLL AQ V SW A

SEQ ID NO : 14: Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif de la Décorine atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggct

SEQ ID NO : 15: Séquence nucléotidique codant pour la transferrine gtccctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgaggccactaagtgccag agtttccgcgaccatatgaaaagcgtcat tccatccgatggtcccagtgttgcttgtgtgaagaaagcctcctaccttgattgcatcag ggccattgcggcaaacgaagcggatgctgt gacactggatgcaggtttggtgtatgatgcttacctggctcccaataacctgaagcctgt ggtggcagagttctatgggtcaaaagagga tccacagactttctattatgctgttgctgtggtgaagaaggatagtggcttccagatgaa ccagcttcgaggcaagaagtcctgccacac gggtctaggcaggtccgctgggtggaacatccccataggcttactttactgtgacttacc tgagccacgtaaacctcttgagaaagcagt ggccaatttcttctcgggcagctgtgccccttgtgcggatgggacggacttcccccagct gtgtcaactgtgtccagggtgtggctgctc cacccttaaccaatacttcggctactcgggagccttcaagtgtctgaaggatggtgctgg ggatgtggcctttgtcaagcactcgactata tttgagaacttggcaaacaaggctgacagggaccagtatgagctgctttgcctggacaac acccggaagccggtagatgaatacaag gactgccacttggcccaggtcccttctcataccgtcgtggcccgaagtatgggcggcaag gaggacttgatctgggagcttctcaacc aggcccaggaacattttggcaaagacaaatcaaaagaattccaactattcagctctcctc atgggaaggacctgctgtttaaggactctg cccacgggtttttaaaagtcccccccaggatggatgccaagatgtacctgggctatgagt atgtcactgccatccggaatctacgggaa ggcacatgcccagaagccccaacagatgaatgcaagcctgtgaagtggtgtgcgctgagc caccacgagaggctcaagtgtgatga gtggagtgttaacagtgtagggaaaatagagtgtgtatcagcagagaccaccgaagactg catcgccaagatcatgaatggagaagct gatgccatgagcttggatggagggtttgtctacatagcgggcaagtgtggtctggtgcct gtcttggcagaaaactacaataagagcga taattgtgaggatacaccagaggcagggtattttgctatagcagtggtgaagaaatcagc ttctgacctcacctgggacaatctgaaagg caagaagtcctgccatacggcagttggcagaaccgctggctggaacatccccatgggcct gctctacaataagatcaaccactgcaga tttgatgaatttttcagtgaaggttgtgcccctgggtctaagaaagactccagtctctgt aagctgtgtatgggctcaggcctaaacctgtgt gaacccaacaacaaagagggatactacggctacacaggcgctttcaggtgtctggttgag aagggagatgtggcctttgtgaaacacc agactgtcccacagaacactgggggaaaaaaccctgatccatgggctaagaatctgaatg aaaaagactatgagttgctgtgccttgat ggtaccaggaaacctgtggaggagtatgcgaactgccacctggccagagccccgaatcac gctgtggtcacacggaaagataagga agcttgcgtccacaagatattacgtcaacagcagcacctatttggaagcaacgtaactga ctgctcgggcaacttttgtttgttccggtcg gaaaccaaggaccttctgttcagagatgacacagtatgtttggccaaacttcatgacaga aacacatatgaaaaatacttaggagaaga atatgtcaaggctgttggtaacctgagaaaatgctccacctcatcactcctggaagcctg cactttccgtagaccttaa

SEQ ID NO : 16: Séquence nucléotidique codant pour la transferrine gtgccagataagacagttcgttggtgcgccgtgtctgagcacgaggccacaaagtgccag agcttccgggaccacatgaagtctgtg atccctagcgacggcccttccgtggcttgtgtgaagaaggccagctatctggactgcatc agagccattgccgccaacgaagccgatg ccgttacactggatgccggactggtgtacgatgcctatctggccccaaacaatctgaagc ccgtggtcgccgagttctacggctctaaa gaggaccctcagacattctactacgccgtggccgtggtcaagaaggacagcggctttcag atgaaccagctgcggggcaagaagtct tgtcacaccggacttggaagaagcgccggctggaatatccccatcggactgctgtactgc gatctgcccgagcctagaaagcctctgg aaaaggccgtggccaacttcttctctggctcttgtgccccttgcgccgatggcacagatt ttccacagctctgtcagctgtgtcccggctg tggctgtagcacactgaaccagtactttggctacagcggcgccttcaagtgtctgaaaga tggtgctggcgacgtggccttcgtgaagc acagcacaatcttcgagaatctggccaacaaggccgaccgggatcagtacgaactgctgt gcctcgacaacaccagaaagccagtg gacgagtacaaggactgccatctggctcaagtgcctagccacacagtggttgccagatcc atgggcggcaaagaggatctgatctgg gagctgctgaatcaagcccaagagcacttcggcaaggacaagagcaaagagttccagctg ttcagcagccctcacggcaaggatct gctgttcaaggatagcgcccacggatttctgaaagtgcctcctcggatggacgccaagat gtatctgggctacgagtacgtgaccgcc atccggaatctgagagaaggcacatgcccagaggctcccaccgatgagtgtaaaccagtg aagtggtgcgctctgtctcaccacgag agactgaagtgtgacgagtggtccgtgaacagcgtgggcaagattgagtgtgtgtccgcc gagacaaccgaggactgtatcgccaag atcatgaacggcgaggccgacgctatgtctctggatggcggatttgtgtacattgccgga aagtgtggactggtgccagtgctggccg agaactacaacaagagcgacaactgcgaggataccccagaggccggatattttgccgtgg cagtcgtgaagaagtccgccagcgat ctgacatgggacaatctcaagggcaagaaaagctgccacaccgccgtgggaagaacagcc ggatggaacattcctatggggctgct gtacaacaaaatcaaccactgccgcttcgacgagttcttcagcgaaggatgtgctcccgg cagcaagaaagacagctctctgtgcaag ctgtgcatgggcagcggactgaatctgtgcgagcccaacaacaaagagggctactacggc tacaccggggcctttagatgtctggttg agaagggcgacgttgcatttgtgaaacaccagaccgtgcctcagaacaccggcggcaaga atcccgatccttgggccaagaatctga acgagaaggactatgagctgctctgtctggacggcacccggaaaccagtggaagaatacg ccaactgtcatctggcaagagcccca aatcacgccgtcgtgaccagaaaggacaaagaggcttgcgtccacaagattctgcggcag cagcagcatctgttcggcagcaatgtg accgactgcagcggcaacttctgtctgttcagaagcgagacaaaggatctcctcttccgc gacgataccgtgtgtctcgccaagctgca cgaccggaacacatacgagaagtatctgggagaagagtatgtgaaggctgtgggcaatct gcggaagtgcagcacatcttctctgctc gaggcttgcacatttcggcggccttgatga

SEQ ID NO : 17 : Séquence peptidique de la transferrine humaine

VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEA D AVTLD AGL VYD AYL APNNLKP VVAEF Y GSKEDPQTF YY AVAVVKKDSGF QMNQL RGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQL CQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELL CLDNTRKP VDE YKDCHL AQ VP SHT V V ARSMGGKEDLIWELLN Q AQEHF GKDK SKEF QLF S SPHGKDLLFKD S AHGFLK VPPRMD AKMYLGYE Y VT AIRNLREGT CPE APTDEC KPVKW CAL SHHERLKCDEW S VN SV GKIEC V S AETTEDCI AKTMNGE AD AMSLDGGF V YI AGKC GL VP VL AENYNK SDN CEDTPE AGYF AV A VVKK S ASDLT WDNLKGKK S C HT AV GRT AGWNIPMGLL YNKINHCRFDEFF SEGC APGSKKD S SLCKLCMGSGLNLCE PNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELL CLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGN F CLFRSETKDLLFRDDT V CL AKLHDRNT YEKYLGEE YVK AV GNLRKC STS SLLEACT FRRP

SEQ ID NO : 18 : Séquence peptidique du peptide signal natif de la Transferrine humaine MRL AV GALL V C AVLGLCL A

SEQ ID NO : 19 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif de la Transferrine atgaggctcgccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggct

SEQ ID NO : 20 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal de la Transferrine atgagactggctgtgggagcactgcttgtgtgtgctgttctgggactgtgtctggcc

SEQ ID NO : 21 : séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483- 1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 : 845-851) actggtccctcacctaggggacagggagaagagagatagtgtgtgtccccaaggaaaata tatccaccctcaaaataattcgatttgct gtaccaagtgccacaaaggaacctacttgtacaatgactgtccaggcccggggcaggata cggactgcagggagtgtgagagcggc tccttcaccgcttcagaaaaccacctcagacactgcctcagctgctccaaatgccgaaag gaaatgggtcaggtggagatctcttcttgc acagtggaccgggacaccgtgtgtggctgcaggaagaaccagtaccggcattattggagt gaaaaccttttccagtgcttcaattgcag cctctgcctcaatgggaccgtgcacctctcctgccaggagaaacagaacaccgtgtgcac ctgccatgcaggtttctttctaagagaaa acgagtgtgtctcctgtagtaactgtaagaaaagcctggagtgcacgaagttgtgcctac cccagattgagaatgttaagggcactgag gactcaggcaccacactggttccgcgtggatccgacaaaactcacacatgcccaccgtgc ccagcacctgaactcctggggggacc gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcc acgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgcca agacaaagccgcgggaggagcagta caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatgg caaggagtacaagtgcaaggtctccaa caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgaga accacaggtgtacaccctgcccccat cccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatc ccagcgacatcgccgtggagtgggag agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggc tccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggct ctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaatga

SEQ ID NO : 22: séquence peptidique de la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851)

LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECES GSF T ASENHLRHCL S C SKCRKEMGQ VEI S S CT VDRDT VCGCRKN Q YRH YW SENLF Q CFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIE NVKGTED SGTTL VPRGSDKTHT CPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V VVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVV S VLTVLHQDWLNG KEYKCK V SNK ALP APIEKTI SK AKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKN Q VSLT CL VKGF YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO : 23 : Séquence peptidique du peptide signal natif de la protéine de séquence SEQ ID NO : 22

MGL ST VPDLLLPL VLLELL V GI YP S GVIG

SEQ ID NO : 24 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal de séquence SEQ ID NO : 23 atgggcctctccaccgtgcctgacctgctgctgccgctggtgctcctggagctgttggtg ggaatatacccctcaggggttattgg SEQ ID NO : 25: séquence nucléotidique codant pour le facteur H du complément gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtct gaccaaacatatccagaaggcacccaggc tatctataaatgccgccctggatatagatctcttggaaatataataatggtatgcaggaa gggagaatgggttgctcttaatccattaagga aatgtcagaaaaggccctgtggacatcctggagatactccttttggtacttttaccctta caggaggaaatgtgtttgaatatggtgtaaaa gctgtgtatacatgtaatgaggggtatcaattgctaggtgagattaattaccgtgaatgt gacacagatggatggaccaatgatattcctat atgtgaagttgtgaagtgtttaccagtgacagcaccagagaatggaaaaattgtcagtag tgcaatggaaccagatcgggaataccattt tggacaagcagtacggtttgtatgtaactcaggctacaagattgaaggagatgaagaaat gcattgttcagacgatggtttttggagtaaa gagaaaccaaagtgtgtggaaatttcatgcaaatccccagatgttataaatggatctcct atatctcagaagattatttataaggagaatga acgatttcaatataaatgtaacatgggttatgaatacagtgaaagaggagatgctgtatg cactgaatctggatggcgtccgttgccttcat gtgaagaaaaatcatgtgataatccttatattccaaatggtgactactcacctttaagga ttaaacacagaactggagatgaaatcacgtac cagtgtagaaatggtttttatcctgcaacccggggaaatacagcaaaatgcacaagtact ggctggatacctgctccgagatgtaccttg aaaccttgtgattatccagacattaaacatggaggtctatatcatgagaatatgcgtaga ccatactttccagtagctgtaggaaaatattac tcctattactgtgatgaacattttgagactccgtcaggaagttactgggatcacattcat tgcacacaagatggatggtcgccagcagtac catgcctcagaaaatgttattttccttatttggaaaatggatataatcaaaattatggaa gaaagtttgtacagggtaaatctatagacgttgc ctgccatcctggctacgctcttccaaaagcgcagaccacagttacatgtatggagaatgg ctggtctcctactcccagatgcatccgtgt caaaacatgttccaaatcaagtatagatattgagaatgggtttatttctgaatctcagta tacatatgccttaaaagaaaaagcgaaatatca atgcaaactaggatatgtaacagcagatggtgaaacatcaggatcaattacatgtgggaa agatggatggtcagctcaacccacgtgc attaaatcttgtgatatcccagtatttatgaatgccagaactaaaaatgacttcacatgg tttaagctgaatgacacattggactatgaatgc catgatggttatgaaagcaatactggaagcaccactggttccatagtgtgtggttacaat ggttggtctgatttacccatatgttatgaaaga gaatgcgaacttcctaaaatagatgtacacttagttcctgatcgcaagaaagaccagtat aaagttggagaggtgttgaaattctcctgca aaccaggatttacaatagttggacctaattccgttcagtgctaccactttggattgtctc ctgacctcccaatatgtaaagagcaagtacaat catgtggtccacctcctgaactcctcaatgggaatgttaaggaaaaaacgaaagaagaat atggacacagtgaagtggtggaatattatt gcaatcctagatttctaatgaagggacctaataaaattcaatgtgttgatggagagtgga caactttaccagtgtgtattgtggaggagagt acctgtggagatatacctgaacttgaacatggctgggcccagctttcttcccctccttat tactatggagattcagtggaattcaattgctca gaatcatttacaatgattggacacagatcaattacgtgtattcatggagtatggacccaa cttccccagtgtgtggcaatagataaacttaa gaagtgcaaatcatcaaatttaattatacttgaggaacatttaaaaaacaagaaggaatt cgatcataattctaacataaggtacagatgta gaggaaaagaaggatggatacacacagtctgcataaatggaagatgggatccagaagtga actgctcaatggcacaaatacaattatg cccacctccacctcagattcccaattctcacaatatgacaaccacactgaattatcggga tggagaaaaagtatctgttctttgccaagaa aattatctaattcaggaaggagaagaaattacatgcaaagatggaagatggcagtcaata ccactctgtgttgaaaaaattccatgttcac aaccacctcagatagaacacggaaccattaattcatccaggtcttcacaagaaagttatg cacatgggactaaattgagttatacttgtga gggtggtttcaggatatctgaagaaaatgaaacaacatgctacatgggaaaatggagttc tccacctcagtgtgaaggccttccttgtaa atctccacctgagatttctcatggtgttgtagctcacatgtcagacagttatcagtatgg agaagaagttacgtacaaatgttttgaaggtttt ggaattgatgggcctgcaattgcaaaatgcttaggagaaaaatggtctcaccctccatca tgcataaaaacagattgtctcagtttaccta gctttgaaaatgccatacccatgggagagaagaaggatgtgtataaggcgggtgagcaag tgacttacacttgtgcaacatattacaaa atggatggagccagtaatgtaacatgcattaatagcagatggacaggaaggccaacatgc agagacacctcctgtgtgaatccgccca cagtacaaaatgcttatatagtgtcgagacagatgagtaaatatccatctggtgagagag tacgttatcaatgtaggagcccttatgaaat gtttggggatgaagaagtgatgtgtttaaatggaaactggacggaaccacctcaatgcaa agattctacaggaaaatgtgggccccctc cacctattgacaatggggacattacttcattcccgttgtcagtatatgctccagcttcat cagttgagtaccaatgccagaacttgtatcaac ttgagggtaacaagcgaataacatgtagaaatggacaatggtcagaaccaccaaaatgct tacatccgtgtgtaatatcccgagaaatta tggaaaattataacatagcattaaggtggacagccaaacagaagctttattcgagaacag gtgaatcagttgaatttgtgtgtaaacggg gatatcgtctttcatcacgttctcacacattgcgaacaacatgttgggatgggaaactgg agtatccaacttgtgcaaaaagatag

SEQ ID NO : 26: séquence peptidique du facteur H du complément

EDCNELPPRRNTEILT GS W SDQT YPEGT Q AI YKCRPGYRSLGNUMV CRKGEW VALNP

LRKCQKRPCGHPGDTPF GTFTLTGGNVFEY GVKAVYTCNEGY QLLGEINYRECDTD

GWTNDIPICE V VKCLP VT APEN GKI V S S AMEPDREYHF GQ A VRF VCN S GYKIEGDEE

MHC SDDGF W SKEKPKC VEI S CK SPD VIN GSPI S QKIFYKENERF Q YKCNMGYE Y SERG

D A VCTES GWRPLP S CEEK S CDNP YIPN GD Y SPLRIKHRT GDEIT Y QCRN GF YP ATRGN

T AKC T S T GWIP APRC TLKPCD YPDIKHGGL YHENMRRP YFP V AV GK Y Y S Y Y CDEHFE

TPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHP

GYALPKAQTTVTCMENGW SPTPRCIRVKTC SK S S IDIEN GFISESQYTY ALKEK AK Y Q

CKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLD

YECHDGYESNT GSTTGSIVCGYNGW SDLPIC YERECELPKID VHLVPDRKKDQ YK V G

EVLKF SCKPGFTIVGPN S VQC YHF GLSPDLPICKEQ VQSCGPPPELLNGNVKEKTKEE

YGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLS

SPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILE EH

LKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSH

NMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEH G

TINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPE IS

HGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSF E

NAIPMGEKKD VYK AGEQ VT YT C AT YYKMDGASNVT CIN SRWT GRPTCRDT SC VNPP

TVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGK

CGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLH P

CVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKL

EYPTCAKR

SEQ ID NO : 27 : Séquence peptidique du peptide signal natif du facteur H MRLL AKIICLML W AIC V A SEQ ID NO : 28 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif du facteur H atgagacttctagcaaagattatttgccttatgttatgggctatttgtgtagca SEQ ID NO : 29 : séquence peptidique du peptide signal du HTLV-1 Env MGKFL ATLILFF QF CPLIF G

SEQ ID NO : 30 : séquence nucléotidique codant pour le peptide signal du HTLV-1 Env atgggtaagtttctcgccactttgattttattcttccagttctgccccctcatcttcggt

SEQ ID NO : 31 : séquence de l’origine de réplication gamma du plasmide E. coli R6K gatcagcagttcaacctgttgatagtatgtactaagctctcatgtttaatgtactaagct ctcatgtttaatgaactaaaccctcatggctaatg tactaagctctcatggctaatgtactaagctctcatgtttcacgtactaagctctcatgt ttgaacaataaaattaatataaatcagcaacttaa atagcctctaaggttttaagttttataagaaaaaaaagaatatataaggcttttaaagct tttaaggtttaatggttgtggacaacaagcc