Genprodukte.

Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Proteine bekannt, die zur Klasse der der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

(GPCRs) gehören. Es handelt sich dabei um die größte Familie von Oberflächenmolekülen, die in die Signaltransduktion involviert sind. Sie werden von einer großen Vielfalt an Liganden und anderen Stimuli aktiviert, z. B. Licht (Rhodopsin), Gerüchen (Odorant-Rezeptoren), Calcium, Aminosäuren oder biogenen Aminen, Nukleotiden, Peptiden, Fettsäuren-und Derivaten, und verschiedenen Polypeptiden.

In Säugetieren geht man davon aus, daß ca. 1500 verschiedene Proteine der Klasse der GPCRs existieren, wobei ca. 1200 für Geruchs-, Geschmacks-, oder Vomeronasalrezeptoren kodieren.

Die Gesamtzahl von"orphan" (also Rezeptoren, denen bislang keine Funktionalität zugeordnet werden konnte) GPCRs wird auf 200-500 geschätzt (Howard AD, McAllister G, Feighner SD, Liu Q, Nargund RP, Van der Ploeg LH, Patchett AA (2001) Orphan G-protein-coupled receptors and natural ligand discovery. Trends Pharmacol Sci 22 : 132-140. ). In C. elegans machen GPCR-Sequenzen ca. 5% des Genoms aus und kodieren für ca. 1000 GPCR-Proteine (Bargmann CI (1998) Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science 282 : 2028-2033 und Bargmann CI, Kaplan JM (1998) Signal transduction in the Caenorhabditis elegans nervous system. Annu Rev Neurosci 21 : 279-308).

Für Drosophila melanogaster liegen aus dem Stand der Technik Erkenntnisse vor, daß dort ca. 200 GPCR-Sequenzen vorhanden sind (Brody T, Cravchik A (2000) Drosophila melanogaster G protein-coupled receptors. J Cell Biol 150 : 83-88). Es wird davon ausgegangen, daß sich diese große Gruppe an topologisch ähnlichen Molekülen konvergent entwickelt hat, und zwar mit dem Ziel des Koppelns an G-Proteine.

Die Klasse der GPCRs wird nach dem Stand der Technik in 3 oder 4 Familien unterteilt. Familie A hat dabei die weitaus meisten Mitglieder, hierzu gehören bspw. auch die Odorant- Rezeptoren (Buck L, Axel R (1991) A novel multigene family may encode odorant receptors : a molecular basis for odor recognition. Cell 65 : 175-187. ). Zur Familie B gehören Rezeptoren für Secretin, VIP, und Calcitonin. Familie C besteht aus Rezeptoren wie den metabotropen Glutamat- Rezeptoren, den Calcium-Rezeptoren, den GABA-B-Rezeptoren, den Geschmacksrezeptoren, und den Pheromon-Rezeptoren. Nahezu alle sog."orphan"GPCR-Sequenzen gehören jedoch in die Familie A.

Ein Kennzeichen der GPCR-Familien ist ihre Signalweiterleitung über G-Proteine. Die Bindung eines extrazellulären Liganden induziert die Aktivierung eines G- Proteins, das dann das Signal weiterleitet. Es gibt ca. 200 verschiedene G-Proteine, und jeder Zelltyp kann eine andere Ausstattung haben. Die aktive Form eines G-Proteins ist die GTP-gebundene, im inaktiven Zustand ist das G-Protein an GDP gebunden. Das G-Protein selbst führt dabei zu seiner Inaktivierung nach GTP-Bindung, da es eine GTPase darstellt.

Deswegen ist die Signalweiterleitung über G-Proteine stets ein transientes Ereignis. Jedes G-Protein besteht aus 3 Untereinheiten, alpha, beta und gamma. Dabei vermag die alpha-Untereinheit GTP-zu binden und kann daher wesentlich die nachgeschalteten Botenstoffe ("second messenger" Systeme) kontrollieren. G-Proteine Gs z. B. aktiviert (stimuliert) die Adenylat-Cyclase und führt so zu einer Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffes cAMP. G-Protein Gi inhibiert die Adenylat-Cyclase, und Gq

aktiviert Phospholipase C ("second messenger" : Inositoltriphosphat und Diacylglycerol). Andere häufig benutzte second messenger Systeme sind z. B. Calcium, K, cGMP, und andere. Es gibt auch chimäre G-Proteine. G beta und gamma Untereinheiten können ebenfalls zu einer Signalweiterleitung führen, nachdem sie sich von dem trimeren Proteinkomplex abgekoppelt haben, z. B. möglicherweise bei der Aktivierung von MAP-Kinase Signalwegen. Die Spezifität der G-Proteinkopplung eines bestimmten GPCRs stellt ein wichtiges pharmakologisches Charakteristikum dar, das u. a. zur Assayentwicklung ausgenutzt werden kann, typischerweise unter Bestimmung von Konzentrationsveränderungen der nachgeschalteten Botenstoffe, bspw. Calcium, cAMP oder Inositoltriphosphat. In jüngster Zeit haben in der Literatur mit vorläufigen Ergebnissen auch die MAP-Kinase Signalwege Beachtung gefunden, die ebenfalls GPCR-Signale weiterleiten können (Marinissen MJ, Gutkind JS (2001) G-protein-coupled receptors and signaling networks : emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22 : 368-376.).

Schließlich ist auch eine G-Protein-unabhängige Signalweiterleitung prinzipiell möglich, so z. B. moduliert die direkte Interaktion des beta-2-adrenergen Rezeptors mit dem NHERF-Protein die Aktivität eines Na/H Austauschers (Hall RA, Premont RT, Chow CW, Blitzer JT, Pitcher JA, Claing A, Stoffel RH, Barak LS, Shenolikar S, Weinman EJ, Grinstein S, Lefkowitz RJ (1998) The beta2-ad-renergic receptor interacts with the Na+/H+-exchanger regulatory factor to control Na+/H+ exchange. Nature 392 : 626-630).

Ein anderes Charakteristikum, das auf viele, wenn nicht alle GPCR-Rezeptoren zutrifft sind Oligomerisierungen. Besonders interessant sind hierbei Heterodimerisierungen zwischen verschiedenen GPCRs, die das pharmakologische Profil und die Ligandenspezifität verändern können (Bouvier M (2001) Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors.

Nat Rev Neurosci 2 : 274-286). So funktioniert bspw. der GABA- B-Rezeptor nur als Heterodimer zwischen GBR1 und GBR2 (Kuner R, Kohr G, Grunewald S, Eisenhardt G, Bach A, Kornau HC (1999) Role of heteromer formation in GABAB receptor function. Science 283 : 74-77). Eine solche Heterodimerisierung wurde inzwischen für eine ganze Reihe von GPCRs beschrieben, z. B. den mGluRS, den delta-opioid Rezeptor, und andere. In jüngster Zeit wurde am Falle der Präeklampsie belegt, dass die erhöhte Expression eines Partners in einem GPCR-Heterodimer Paar zu einer Erkrankung führen kann. Hier führt die erhöhte Expression des Bradykinin-II-Rezeptors zu einer verstärkten Bildung von BradykininII-AngiotensinII-Rezeptor Heterodimeren, deren veränderte pharmakologische Antwort den hypertonen Phänotyp erklären kann (AbdAlla, Lother, Massiery und Quitterer, Nat.

Medicine (2001), 7,1003-1009).

Schließlich handelt es sich bei den Proteinen der GPCR- Klasse um ein bevorzugtes pharmakologisches Zielmolekül. Bei den Proteinen der GPCR-Klasse greifen mehr als 25% der 100 meistverkauften Medikamente pharmakologisch an (Flower et al., 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1422,207-234). So sind insbesondere Agonisten und Antagonisten für folgende Rezeptorgruppen von größter pharmakologischer Bedeutung : die Gruppe der Adrenorezeptoren, der Angiotensin-II-Rezeptor,

Serotoninrezeptoren, Dopaminrezeptoren, Histaminrezeptoren, Leukotrien/Prostaglandinrezeptoren. Pharmaka, die auf diese Rezeptoren einwirken, decken ein therapeutisch breites Krankheitsspektrum ab, von psychiatrischen Krankheitbildern (Schizophrenien, Depressionen), über die Beeinflussung von Bluthochdruck bis hin zu Notfallmedikamenten bei Herzstillstand. Bekannte Beispiele von gebräuchlichen Medikamenten, die auf diese Rezeptoren einwirken, sind z. B. alpha-Adrenozeptoragonisten (Norfenefrin), Beta- Adrenozeptoragonisten (Isoprenalin, Fenoterol), Alpha- Adrenozeptorblocker (Prazosin), Beta-Adrenozeptorblocker (Propanolol), 5-HT-Antagonisten (Cyproheptadin), H2- Rezeptorenblocker (Cimetidin), H1-Rezeptorenblocker (Terfenadin), Dopaminagonisten (Bromocriptin) und andere.

Trotz intensiver Forschungsbemühungen sind jedoch die Signaltransduktionswege, die durch die Rezeptoren beeinflußt werden noch unzureichend aufgeklärt. Darüber hinaus fehlt es an einem vertieften Verständnis des komplexen Netzwerkes gegenseitiger Beeinflussung der verschiedenen GPCR-Systeme und deren Wirkung auf die nachgeschalteten intrazellulären Prozesse, insbesondere auch in Hinblick auf externe physiologische Zustände.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Mitglieder der Klasse der GPCR-Proteine und deren zugrundeliegende Nukleotidsequenzen zu identifizieren. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, auf der Basis identifizierter Proteine Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, therapeutische wirksame Substanzen

zu entwickeln, die in eine Pathophysiologie, die bspw. durch Fehlsteuerung der Expression und/oder Expression infunktioneller Varianten bedingt ist, aber auch bei physiologischer Expression auftreten kann, therapeutisch eingreifen können. Damit ist auch das Bereitstellen von entsprechenden Substanzen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben durch die Gegenstände der Ansprüche 1, 5,6, 8,11, 12,15, 16,17, 20,23, 26 und 27. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von AS 10 bis AS 45 (Sequenz 5 gemäß Fig. 13, jeweils bezeichnet vom N-zum C-Terminus), stärker bevorzugt AS 10 bis 65 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 6 gemäß Fig. 14), stärker bevorzugt AS 10 bis 75 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 7A gemäß Fig. 15A), stärker bevorzugt AS 10 bis 60 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 7B gemäß Fig. 15B), stärker bevorzugt AS 10 bis 60, noch stärker bevorzugt AS 10 bis AS 100 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 7C gemäß Fig. 15C), stärker bevorzugt AS 10 bis 60, noch stärker bevorzugt AS 10 bis AS 100 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 7B gemäß Fig. 15B), stärker bevorzugt AS 10 bis 60, noch stärker bevorzugt AS 10 bis AS 70 ; AS 10 bis AS 45 (Sequenz 8 gemäß Fig. 16), stärker bevorzugt AS 10 bis 60, noch stärker bevorzugt AS 10 bis AS 100 ; oder AS 10 bis AS 45 (Sequenz 11 gemäß Fig. 18), stärker bevorzugt AS 10 bis 60, noch stärker bevorzugt AS 10

bis AS 100 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Weiterhin bevorzugt sind solche Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz eines Proteins der ee3-Familie codiert, wobei insbesondere der C-terminale (intrazelluläre) Abschnitt eines erfindungsgemäßen Proteins oder ein Fragment desselben (vorzugsweise mindestens von einer Länge von 25 AS) eingeschlossen sein sollte. Insbesondere sind alle Nukleinsäure-Sequenzen offenbarungsgerecht mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert, wie in einer der Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 für die Sequenzen mit den Nummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11 wiedergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die physiologische Funktion, bspw. apoptotische Signalkaskade, inhibieren können. Auch mit diesen erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen hybridisierende DNA-Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges) sind mitoffenbart. Vorzugsweise bleibt bei den Derivaten, Allelen, Fragmenten oder Analoga der erfindungsgemäßen AS- Sequenzen mit den Nummern 5 bis 8 bzw. weiteren nativen Mitgliedern der ee3-Familie mindestens eine biologische Eigenschaft erhalten. Die Herstellung derartiger Derivate,

Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).

Hierbei werden bei den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, gehörend zur ee3-Familie, bspw. gemäß Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12, ein oder mehrere Codon (s) insertiert, deletiert oder substituiert, um nach Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure gegenüber den dazugehörigen nativen ee3-Proteinen, insbesondere den in den Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 dargestellten Sequenzen aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch DNA-Teilsequenzen der erfindungsgemäßen nativen ee3- Sequenzen, bspw. in den Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten Sequenzen. Diese Teilsequenzen enthalten typischerweise mindestens 60, stärker bevorzugt mindestens 150 und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukleotide umfassende Fragmente der in den Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten Nukleotidsequenzen. Insbesondere codieren bevorzugte Teilsequenzen für Polypeptide, die von AS 20 (Seq. 5), AS 20 (Seq. 6), AS 20 (Seq. 7A), AS 20 (Seq.

7B), AS 10 (Seq. 7C) bzw. AS 20 (Seq. 8) mindestens 20 AS, vorzugsweise mindestens 40, stärker bevorzugt mindestens 60 und am stärksten bevorzugt bis zum C-Terminus in Richtung C- Terminus verlaufen (Numerierung gemäß Figuren 13,14, 5A, 15B, 15C, 16 bzw. 18). Andereseits kann die für mindestens 20 AS codierende Teilsequenz aber auch an einem von den vorgenannten Punkten weiter proximal oder distal liegenden Codons beginnen. Mitoffenbart sind alle Derivate, Analoga

oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequenzen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen DNA-Teilsequenzen ergebenden AS-Sequenzen sind als solche oder als Bestandteil in größeren rekombinanten Proteinen mitoffenbart.

Insbesondere sind auch alle denkbaren bzw. nativ auftretenden Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.

Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens 60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80% und noch stärker bevorzugt mindestens 95%, mit den Sequenzen gemäß vorliegender Numerieung 5,6, 7 und 8 hat.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, bspw. gemäß Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12, oder deren funktionelle oder infunktionelle Äquivalente, wie z. B. Allelvarianten oder Isoformen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten verstanden, die 60 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100 %, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100 % aufweisen.

Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus nativen ee3- Sequenzen, bspw. aus gemäß Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten Sequenzen erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt.

Homologe oder sequenzverwandte DNA-Sequenzen können aus allen Säugerspezies oder anderen Spezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening

durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der nativen ee3-Sequenzen, bspw. der in den Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen,- Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht- codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Solche funktionellen Äquivalente lassen sich bspw. ausgehend von den in den Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten DNA- Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia, isolieren. Damit sind erfindungsgemäß alle mit den erfindungsgemäßen ee3- Sequenzen, insbesondere mit den Sequenzen gemäß Figuren 9, 10, 11A, 11B, 11C oder 12 hybridisierenden Sequenzen mitumfaßt. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden.

Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, varieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger

als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid, zu verstehen.

Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C.

Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen : Ausübel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York ; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford ; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen gehören insbesondere auch Derivate der in den Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 dargestellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, wobei die die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren erhalten bleiben kann oder, je nach Bedarf, verändert werden kann. So können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich-1 bis-1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht, wird.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche "Tags"sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (z. B. auch der Flag- Tag) (Studier et al., Meth. Enzymol., 185,1990 : 60-89 und Ausubel et al. (eds. ) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß Figuren 9,10, 11A, 11B, 11C oder 12 bzw. deren Derivate, Varianten, Homologe oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die bspw. einer einfacheren Reinigung dienen, insbesondere wird hierbei auch auf die Verlängerung durch die oben beschriebenen Tag-Sequenzen verwiesen.

Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die (c) DNA-Sequenzen erfindungsgemäßer genomischer DNA-Sequenzen enthalten oder diesen entsprechen.

Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise alle DNA- Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesentlichen der Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Proteine mit den Sequenznummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11 entspricht. Diese DNA-Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in den vorgenannten Figuren angegebenen Sequenzen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine mit den Sequenznummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11 codierenden DNA-Sequenzen entsprechenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein

biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Ausprägung der biologischen Funktion, bspw. im Zusammenhang mit neuronalen Vorgängen oder der Apoptose,- identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese- Verfahren gehören die"site-directed"-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymersierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem transferiert (z. B. E. coli) und entsprechend transformierte Klone isoliert.

Die Funktionalität erfindungsgemäßer Sequenzen steht u. a. in unmittelbarem Zusammenhang mit der Identifizierung weiter distal liegender Elemente der von erfindungsgemäßen Proteinen ausgelösten Signalkaskade. Hierbei wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß MAP-Kinasen durch erfindungsgemäße Rezeptoren stimuliert werden. Neben der Verwendung entsprechender Reporterassays (s.

Ausführungsbeispiel) zur Identifizierung der MAP-Kinasen können alternativ für diese Zwecke auch vorgefertigte Kits (z. B. Mercury in vivo kinase assay kits, Fa. Clontech) benutzt werden. Dabei wird der Tet-Repressor in Fusion mit der Transaktivatordomäne eines Phosphorylierungstargets (Transkriptionsfaktoren, z. B. Jun) exprimiert. Die Aktivierung eines Luciferasekonstruktes unter Kontrolle eines Tet-Repressor-Elements findet nur statt, wenn eine spezifische Phosphorylierung der Transaktivatordomäne durch eine Kinase erfolgt. Auf diese Weise ist erfindungsgemäß die

Einordnung der Aktivität eines erfindungsgemäßen Rezeptors der ee3-Familie oder einer erfindungsgemäßen Variante in einen zellulären Signaltransduktionsweg möglich.

Die Identifizierung erfindungsgemäßer Sequenzen beruht unter anderem auch auf der funktionellen Erkenntnis, daß die Hochregulation von erfindungsgemäßem murinen ee3_1_m in einem Tiermodell mit erhöhter EPO-Expression eine pathophysiologische Beteiligung dieses Rezeptors an Vorgängen, die das Überleben oder die Adaptation von Zellen an diesen Zustand beeinflussen, indiziert. Deshalb sind erfindungsgemäße Rezeptoren von besonderer pharmakologischer Bedeutung für Krankheiten die mit verminderter Sauerstoffversorgung einhergehen, insbesondere verminderter cerebraler Sauerstoffversorgung einhergehen.

Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt werden, wie z. B. Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Expressionsvektoren oder ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, das eine, wie oben beschrieben,

erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthält. Vorteilhafterweise werden hierbei die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem genetischen Regulationselement, wie bspw. Transkriptions- und Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw.

Erniedrigung der nativen Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestellten Expressionsvektoren können anschließend Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen transformiert werden, z. B. Zellkulturen aus Säugetierzellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) typischerweise das (die) native (n) Regulationselement (e) eingesetzt werden, d. h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer-Region des Gens für ein erfindungsgemäßes Protein aus der ee3-Familie, insbesondere für ein Protein mit der Sequenznummer 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11, bspw. aus Säugetieren, insbesondere entsprechende humane Regulationssequenzen. Ggf. können diese nativen oben bezeichneten Regulationssequenzen auch genetisch verändert sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzurufen. Zusätzlich zu diesen nativen vorbezeichneten Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen Regulationssequenzen können für andere Gene native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet (5'-oder 3'-Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation unter der Kontrolle der vorbezeichneten nativen Regulationssequenzen

ausgeschaltet ist und die Expression der Gene-je nach Wunsch-hierdurch erhöht oder erniedrigt werden kann.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5- , T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR-oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram- positiven Promotoren wie amy und SP02, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor- Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressionsvektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der

Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions-und/oder Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Sequenzen beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben Promotorsequehzen sog."Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können.

Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog.

"Locus Control Regions", "Silencer"oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden. Auch sog. Terminatorsequenzen werden vorteilhafterweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor vorhanden sein und erfindungsgemäß unter den Terminus"Regulationssequenz"subsumiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5'"upstream"von einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren, Polyadenylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere für die Sequenzen gemäß

Figuren 9,10, HA, 11B, 11C oder 12 bzw. für die entsprechenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Genkonstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf. auch auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Unter den Begriff"Expressionsvektor"fallen sowohl rekombinante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Regulationssequenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet.

Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. humanes Gen aus der ee3-Familie, insbesondere ex3_1 oder ee32, oder bspw. eine Teilsequenz eines solchen Gens, in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York- Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer, verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für interagierende oder für potentiell interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen aus der ee3-Familie in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, wie bspw.

Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren, insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und/oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem Vektorkonstrukt transformiert sind. Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die eine Expression erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen (wodurch als Derivate bspw. auch ihre Allele oder funktionelle Äquivalente eingeschlossen sind) allein oder im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulationssequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro-oder eukaryontischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae oderr die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282 : 39, (1997)). Insbesondere um größere Mengen an erfindungsgemäßen Proteinen herstellen zu können, eignen sich vorteilhafterweise methylotrophe Hefen, insbesondere Pichia pastoris. Die Rezeptoren werden dazu in geeignete Expressionsvektoren kloniert, die z. B. auch die Expression als Fusionsprotein mit zur Reinigung geeigneten"Tag"- Sequenzen erlauben. Nach Elektroporation der Hefen werden

schließlich stabile Klone selektiert. Eine gute Beschreibung der Methode sowie alle dafür nötigen Mittel werden von der Firma Invitrogen angeboten. Hernach können die Expressionsprodukte funktionell charakterisiert und ggf. für erfindungsgemäße"Screening"-Verfahren eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glykosylierung (N-und/oder 0-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen- im Vergleich zu Prokaryotenzellen-in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt : 293T (Embryonennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36 : 59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77 : 4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere-insbesondere für den Laboreinsatz etablierte- Zellinien, wie bspw. CHO-, HeLa-, HEK293-, Sf9-oder COS- Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bildenden Systems (aus dem

Knochenmark). Humane erfindungsgemäße transformierte Zellen, insbesondere autologe Zellen des Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder erfindungsgemäßen Expressionsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation.

Erfindungsgemäß werden insbesondere vorteilhafterweise erfindungsgemäße Proteine der ee3-Familie heterolog in Insektenzellen zur funktionellen Charakterisierung und zum Einsatz für erfindungsgemäße"Screening"-Verfahren hergestellt werden. Da die Konzentration endogener G Proteine in Insektenzellen relativ niedrig ist, so sind z. B.

Gi Proteine im"Western Blot"nicht nachzuweisen, und Insektenzellen den zu untersuchenden Rezeptor in der Regel nicht exprimieren, sind sie zur in vivo Rekonstitution von Signaltransduktionswegen erfindungsgemäßer Rezeptoren der ee3-Familie besonders geeignet. Die Rezeptoren der ee3- Familie werden in diesem Fall mittels des Baculovirus- Expressionssystems in verschiedenen Insektenzellinien, z. B.

Sf9, Sf21, Tn 368 oder Tn High Five, oder MB-Zellen exprimiert. Dazu werden z. B. mit dem BaculoGold Kit von Pharmingen rekombinante Baculoviren hergestellt und die obengenannten Insektenzellinien infiziert. Um erfindungsgemäß die Kopplung an G Proteine zu untersuchen, werden Ko-Infektionen durchgeführt. Dazu werden die Zellen mit dem Rezeptorvirus und zusätzlich noch mit den die drei G Protein Untereinheiten exprimierenden Viren infiziert und entsprechende Assays, z. B. cAMP-Assays durchgeführt. So kann

der Einfluß verschiedener G Proteinuntereinheiten auf die Aktivität des Rezeptors untersucht werden. Insektenzellen die Rezeptoren exprimieren oder deren Membranen können ebenfalls in Screening-Assays eingesetzt werden.

Insektenzellen können leicht in großen Mengen sowohl in Fermentern als auch in Schüttelkolben vermehrt werden und sind damit geeignetes Ausgangsmaterial, um rekombinantes Zell-oder Membranmaterial sowohl für"Screening"-Verfahren als auch für Rezeptorreinigungen bereitzustellen.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen 1, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293-Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen besonders geeignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen. Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form. Diese Proteine regulieren oder transportieren insbesondere apoptotische oder nekrotische, ggf. auch inflammatorische Signale oder Signale, die das Zellwachstum

oder die Zellplastizität betreffen. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es ein funktionshomologes oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel, Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält oder typischerweise aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht. Funktionshomologie wird im Sinne der vorliegenden Erfindung so definiert, daß mindestens noch eine der wesentlichen funktionellen Eigenschaften der gemäß Figuren 13 bis 16 bzw. 18 dargestellten Proteine mit der Sequenzbezeichnung 5,6, 7a (einschließlich 7b und 7c), 8 und 11 erhalten bleibt. Typischerweise werden funktionshomologe erfindungsgemäße Proteine insbesondere eine charakteristische, bspw. mindestens 60% ige, vorzugsweise mindestens 80% ige Sequenzidentität mit den biologisch funktionellen Abschnitten der erfindungsgemäßen Proteine, die bspw. Protein-Interaktionsdomänen darstellen, aufweisen. Insbesondere werden gemäß der vorliegenden Erfindung die gemäß Ausführungsbeispiel 6 offenbarten homologen Sequenzen auf den Chromosomen 3,5, 8 und X in die Offenbarung mit einbezogen sowie auch deren Varianten.

Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS- Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungsgemäße AS-Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers (über eine N-oder 0-glykosidische Bindung) oder Fett (säure) -restes (bspw. Myristylsäure), einer oder auch mehrerer Phosphatgruppe (n) und/oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N-oder C-Terminus eines

erfindungsgemäßen Oligo-oder Polypeptids. Darüber hinaus schließt der Begriff"Derivat"auch Fusionsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz an beliebige Oligo-oder Polypeptide gekoppelt ist.

Als"Analoge"werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Insertion, Substitution). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind solche konservativen Substitutionen bevorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten AS erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch funktionelle, tw.

Funktionelle oder biologisch infunktionelle Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber den nativen ee3-Proteinen, insbesondere gegenüber den gemäß Figuren 13, 14,15A, 15B, 15C, 16 oder 18 veränderten Proteine besitzen typischerweise wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (J. Mol. Biol., 215,403- 410,1990). Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von

Mammalia wie Homo sapiens, Rattus norvegicus oder Mus musculus isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verstehen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt,- auch bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Substitutionen können auch weniger konservative AS- Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere als Transduktor eines apoptotischen oder nekrotischen Signals oder eines Signals für die Zellproliferation, Zellplastizität oder das Zellwachstum, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungsassays oder bspw. zytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt hervorrufen können, d. h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an einen extrazellulären Liganden aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts, d. h. intrazellulär, weitergeben können.

Beispielsweise seien hier Varianten einer ee3 1-Sequenz offenbart, deren C-Terminus trunkiert ist, bspw. auch die beiden Spleißvarianten gemäß Figuren 11B oder 11C bzw. 15B oder 15C. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der biologischen Funktion, insbesondere als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed"-Mutagenese einer DNA-Sequenz, die für

ein erfindungsgemäßes Protein (typischerweise Sequenzen mit der Numerierung 5,6, 7 (b, c), 8 und 11), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinanten Zellkultur exprimieren kann (Sambrook et al., 1989, s. o. ). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS-Sequenzen zugrundeliegenden DNA-Sequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsgemäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C-terminal oder auch intrasequentiell). Sie können einen dominant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich erfindungsgemäß von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA- Allelen der in den Figuren angegebenen DNA-Sequenzen nach Transkription und Translation ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N- Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungsgemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form

einzelner Aminosäuren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N-und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Proteins.

Insbesondere sind hier sogenannte Signal-oder"Leader"- Sequenzen am N-Terminus der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N-oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Aminosäuren lautet : DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Oberprüfung und leichte Reinigung des rekombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der nativen ee3-Sequenzen, insbesondere den in den Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 offenbarten Sequenzen. Derartige Teilsequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bspw. chemisch synthetisiert werden und können vorzugsweise als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es sich bei

diesen Teilabschnitten bzw. deren Derivaten, Allelen oder Fragmenten um offenbarte Sequenzen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine solche Regionen bilden, die in den nativen erfindungsgemäßen ee3-Sequenzen, insbesondere den in den Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16, zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen. Bevorzugte Teilsequenzen von mindestens 20 AS Länge werden zumindest tw. den cytoplasmatischen Abschnitt der erfindungsgemäßen Proteine der ee3-Familie umfassen, insbesondere bevorzugt wird ein erfindungsgemäßer Teilabschnitt mindestens 20 AS lange Peptide einer der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Figur 8 zwischen Position 600 und Position 752 (gemäß Figur 8) aufweisen, bspw. das Peptid WWFGIRKDFCQFLLEIFPFLRE (Position 609 bis 630,21 AS Länge).

Erfindungsgemäße AS-Sequenzen, bspw. die Sequenzen der humanen Proteine ex3 1 oder ee32, weisen darüber hinaus spezifische Sequenzmotive auf, die sich auch bei anderen Vertretern der GPCR-Klasse in ähnlicher Form wiederfinden.

So tritt bspw. eine typische Signatur-Triplett-Sequenz unterhalb der dritten Transmembrandomäne bei Proteinen der GPCR-Klasse auf (Sequenz mit der Sequenzfolge DRY (AS im Ein-Buchstaben-Code).

Bei erfindungsgemäßem ee3 1 findet sich die Sequenzfolge DRI (Position 103-105) unterhalb von TM3 (83-102) (gemäß Figur 15A). Bei nach dem Stand der Technik bekannten Vertretern der GPCR-Klasse (Galanin-2-Rezeptor, C5a-Rezeptor (Ratte), BK-2 (human) oder CXCR-5 (human)) findet sich die Sequenzfolge DRY oder DRF an entsprechenden Positionen.

Daher sind erfindungsgemäße Peptide, wie oben beschrieben, mit einer Länge von mindestens 20 AS dann ganz besonders bevorzugt, wenn sie das AS-Triplett DRI umfassen. Als Beispiel eines solchen erfindungsgemäßen Peptids sei ein Peptid mit der Sequenz VLVCDRIERGSHFWLLVFMP genannt.

Derartige erfindungsgemäße Peptide können insbesondere im Zusammenhang mit der Modulation der physiologischen Funktion der Rezeptoren Verwendung finden. Im Falle einer Inkorporation oder allgemeiner Verfügbarkeit derartiger Peptidsequenzen in einer Zelle können die Agonisten- abhängige Aktivierung von intrazellulären Signaltransduktionsprozessen, die Aktivierung der Interaktion von erfindungsgemäßen Rezeptoren mit G-Proteinen und ggf. die Internalisierung des Rezeptors beeinflußt werden. Ggf. können auch gewisse erfindungsgemäße Oligo- oder Polypeptide zur konstitutiven Aktivierung des nachgeschalteten Signaltransduktionswegs beitragen. Daher eigenen sich erfindungsgemäße Oligo-oder Polypeptide ganz besonders zur Verwendung als Arzneimittel oder zur Herstellung eines solchen.

Darüber hinaus können erfindungsgemäße Oligo-oder Polypeptide von mindestens 20 AS Länge auch vorzugsweise 2 konservierte Cysteine (Position 78 und 145 bei ee3_1 gemäß Figur 15A) in den ersten beiden extrazellulären Loops von bspw. ee3_1 (siehe Fig. 8) enthalten, die ein typisches Merkmal der Klasse der GPCR-Proteine sind (Sequenz GETCV am Ende des ersten extrazellulären Loops, Sequenz ELEILCSVNIL in der Mitte des zweiten extrazellulären Loops). Die erfindungsgemäßen Oligopeptide schlissen daher bspw. die beiden vorgenannten Sequenzfolgen in ihre Sequenz ein.

Schließlich sind auch solche mindestens 20 AS langen Peptide aus einer Sequenz eines Proteins der ee3-Familie ganz besonders bevorzugt, die aus dem TM-Bereichen stammen, bspw. das Peptid LDGHNAFSCIPIFVPLWLSLIT (tw. die C-terminale TM- Domäne umfassend). Derartige erfindungsgemäße Peptide werden vorzugsweise zur Modulation, insbesondere Inhibition, der Rezeptorwirkung von ee3-Proteinen eingesetzt, wobei das therapeutische Profil derartiger Peptide sich auf die nachstehend genannten erfindungsgemäßen Indikationen erstreckt. Peptide, die TM-Strukturen inhibieren führen durch Disruption der normalen Bindung zu Funktionsänderung, speziell-verlusten der Rezeptoren. In diesem Zusamenhang wird bspw. auf entsprechende Ansätze für die sechste TM- Domäne des beta-2-adrenergen Rezeptors durchgeführt (Hebert TE, Moffett S, Morello JP, Loisel TP, Bichet DG, Barret C, Bouvier M (1996) A peptide derived from a beta2-adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both receptor dimerization and activation. J Biol Chem 271 : 16384-16392) hingewiesen. Darüber hinaus werden erfindungsgemäß ligandenbindende Peptidfragmente von mindestens 20 AS Länge aus einer Sequenz eines Proteins der ee3-Familie, auch zur Verwendung als Arzneimittel oder zur Herstellung desselben, zur Verfügung gestellt, die in Kompetion um Bindungsplätze zu nativen (extra-oder intrazellulären Liganden) treten können und auf diese Weise die Bindung von nativen ee3- Liganden blockieren können. Erfindungsgemäße Peptide dieser Art treten dann als sog."decoy-Rezeptoren"auf, was zu einem therapeutischen Profil in allen in dieser Anmeldung genannten Indikationen führt.

Weiterhin werden auch Verfahren zur Identifizierung bspw. inhibitorischer erfindungsgemäßer Peptide offenbart.

Insbesondere kommt hierfür erfindungsgemäß das von Tarasova et al. in anderem Kontext beschriebene Verfahren in Betracht (Tarasova NI, Rice WG, Michejda CJ (1999) Inhibition of G- protein-coupled receptor function by disruption of transmembrane domain interactions. J Biol Chem 274 : 34911- 34915), das in bezug auf das methodische Vorgehen vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung ist.

Diese erfindungsgemäßen inhibitorischen Peptide können bspw. eine intramolekulare Interaktion verschiedener TM-Domänen- eine wichtige Voraussetzung für das Funktionieren eines erfindungsgemäßen Proteins der ee3-Familie-modulieren, z. B. inhibieren. Auch derartige erfindungsgemäße Peptide kommen als Arzneimittel oder zur Herstellung eines Arzneimittels in Betracht.

Erfindungsgemäße Peptide oben genannter Art können auch als Peptidanaloga (Peptidomimetika) vorliegen. In diesem Fall wird vorzugsweise die amidartige Bindung des Rückgrats durch alternative, strukturell aber vergleichbare Bindungen, die vorzugsweise nicht durch native humane Enzyme spaltbar wären, substituiert sein. In Betracht kommen bspw.

Oligocarbamate. Monomere N-geschützte Aminoalkylcarbonate sind bspw. aus den entsprechenden Aminoalkoholen leicht zugänglich und können nach Überführung in Aktivester unter Verwendung der basenlabilen Fmoc-Gruppe der Festphasen- Synthese zugeführt werden. Da derartige Analoga hydrophober als die entsprechenden Peptide sind, eignen diese sich besonders gut für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke, d. h. insbesondere als Arzneimittel für den neurologischen Einsatz.

Transgene Tiere stellen einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar. Bei erfindungsgemäßen transgenen Tieren handelt es sich um Tiere, die genetisch dahingehend verändert sind, daß sie eine im Vergleich zum Normaltier veränderte Menge eines erfindungsgemäßen Genprodukts in mindestens einem Gewebe exprimieren bzw. enthalten (bspw. durch Modifikation der Promotorbereichs eines erfindungsgemäßen Gens) oder ein verändertes Genprodukt (bspw. ein erfindungsgemäßes Derivat eines Proteins der ee3- Familie, bspw. auch ein Fragment) enthalten oder exprimieren. Hierbei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen, die die nativ vorhandene erfindungsgemäße DNA-Sequenz (a) auf der genetischen Ebene entweder tw. oder vollständig nicht mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfindungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkribieren und/oder translatieren können und daher das Genprodukt nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem transgenen Tier die native erfindungsgemäßen Sequenzen, also Sequenzen der ee3- Proteinfamilie, bspw. Sequenzen mit der Numerierung 5,6, 7 (einschl. 7b und 7c), 8 und 11) (ob vorhanden oder nicht vorhanden) um mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz ergänzt bzw. durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz substituiert sein. Insbesondere kann es sich bei der (den) substituierten und/oder ergänzten Sequenz (en) um erfindungsgemäße Sequenzen handeln, die nicht-nativer Natur sind.

Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen transgenen und/oder"knock-out"Tieren, insbesondere Mäusen, Ratten Schweinen, Rindern, Schafen, Fruchtfliegen

(Drosophila), C. elegans oder Zebrafischen, erfolgt auf dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird z. B. eine erfindungsgemäße cDNA Sequenz oder native oder nicht-native Variante in transgenen Mäusen exprimiert, z. B. unter einem NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP-Promotor in Oligodendrozyten etc.. Die genetisch veränderten Tiere können danach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht werden (z. B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO). Die Herstellung von"knock-out"Tieren kann zudem Hinweise auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen liefern, da ein"knock out Modell" insoweit der Inhibition erfindungsgemäßer nativer Sequenzen entspricht. Insoweit kann ein derartiges Verfahren bei einer präklinischen Prüfung von erfindungsgemäßen inhibitorischen Substanzen, z. B. erfindungsgemäße Peptide, Peptidanaloga oder andere kleine organische Verbindungen, zum Einsatz kommen.

Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß transgen ausgestaltet sein, insbesondere Säugetiere, bspw. Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte"Knock-Out"-Tiere handeln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktionellen Sequenz, die für erfindungsgemäße Proteine kodiert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die native (n) erfindungsgemäße (n) Nukleotidsequenz (en) ee3- Familie, insbesondere der Sequenzen mit den Nummern 1 bis 4), durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out-oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen bei gentechnisch veränderten Tieren (Ausubel et al. (eds. ) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., (eds. ) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford). Darüber hinaus können ebenso bestimmte Mutationen, bspw. Veränderungen der Promotoren oder Insertion von Enhancern, eingeführt werden, um beispielsweise konstitutiv aktive ee3-Proteine in den transgenen Tieren zu erzeugen ("knock-in"-Tiere). Auch derartige Tiere können bspw. erfindungsgemäß eingesetzt werden, um in präklinischen Untersuchungen Analogiemodelle für potentielle Agonisten der ee3-Proteinfunktion zu liefern.

Über transgene Oberexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle

weitere Informationen über die (Patho-) Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die biologische Funktion von erfindungsgemäßen Proteinen, insbesondere von Proteinen mit einer der Sequenzen 5 bis 9 für neurale, immunologische, proliferative oder andere Prozesse beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemäßen ee3- Genprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Protein gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 oder Derivaten, Fragmenten oder Isoformen oder Allelen, erkennt, aber auch gegen z. B. erfindungsgemäße mRNA gerichtet sein kann. Der Begriff"Antikörper"umfaßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper, chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch"Label"markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also

sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B.

Köhler und Milstein, Nature, 256,495-397, (1975) ; US-Patent 4,376, 110 ; Ausübel et al., Harlow und Lane"Antikörper" : Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988) ; Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). ). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse

mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch"site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden.

Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Erkrankungen eignen, bei denen Proteine der ee3-Familie von pathophysiologischer Bedeutung ist.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören : IgG, IdD, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM.

Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen

Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B.- Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse- monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden.

Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81 : 3273-3277 (1984) ; Morrison et al.

Proc. Natl. Acad. Sci USA 81 : 6851-6855 (1984) ; Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984) ; Cabilly et al., EP-A-125023 ; Neuberger et al., Nature 314 : 268-270 (1985) ; Taniguchi et al., EP-A-171496 ; Morrion et al., EP-A-173494 ; Neuberger et al., WO 86/01533 ; Kudo et al., EP-A-184187 ; Sahagan et al., J. Immunol. 137 : 1066-1074 (1986) ; Robinson et al., WO 87/02671 ; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 : 3439-3443 (1987) ; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 : 214218 (1987) ; Better et al., Science 240 : 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper : A Laboratory Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.

Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper gegen einen extrazellulären Abschnitt auf einem erfindungsgemäßen ee3-Protein, insbesondere einem Protein gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 als Epitop gerichtet sein. Erfindungsgemäße Antikörper, in allen Variationen wie zuvor offenbart, können zur Inhibierung von erfindungsgemäßen Proteinen der ee3-Familie eingesetzt werden, bspw. in vitro für experimentelle Untersuchungen, in situ für bspw. Markierungszwecke oder auch in vivo zum therapeutischen Einsatz, indem sie z. B. i. v., subkutan, intraarteriell oder intramuskulär injiziert werden.

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z. B. eines Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden.

Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper), erkennen (U. S. 4,699, 880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti-idiotypischen Antikörpers zu führen.

Der anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht,

bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti- idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfindungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti- idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigenschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung"Antikörper"soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente

seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab-oder F (ab') 2- Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab-oder F (ab') 2. Fab und F (ab') 2-Fragmente entbehren eines Fc- Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab-und F (ab') 2-Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern, ebenso wie diese selbst, bei der Detektion (qualitativ) und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen (ggf. auch zur Detektion der Proteinaktivität (z. B. spezifische Phosphorylierungen) der erfindungsgemäßen Proteine) eingesetzt werden können, weswegen auch Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung bzw. zur zur Quantifizierung der Proteinaktivität von erfindungsgemäßen Proteinen Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.

Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F (ab') 2, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen von Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung. Neben

den Antikörpern können auch Mischungen von Antikörpern für alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren oder Verwendungen eingesetzt werden. Sowohl gereinigte Fraktionen monoklonaler Antikörper, polyklonale Antikörper oder Mischungen monoklonaler Antikörper kommen als Arzneimittel zum Einsatz und finden Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur behandlung von cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, und neurologischen Erkrankungen, wie z. B. Epilepsie.

Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, bzw. deren Mischungen können zur quantitativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem ee3-Genprodukt, insbesondere Proteinen gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18 oder deren Fragmente oder Derivate, in einer Probe eingesetzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Insoweit wird die Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper als Diagnostika offenbart. So kann etwa über erfindungsgemäße Antikörper die Menge an erfindungsgemäßem Genprodukt und u. U. deren Aktivität (z. B. spezifische Phosphorylierungen), bspw. der Proteine gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18, bestimmt werden. Die Detektion kann mit Hilfe von Immunofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluoreszenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Antikörper im Sinne der Erfindung (dies schließt Fragmente dieser Antikörper ein oder auch

Mischungen von Antikörpern) eignen sich für histologische Untersuchungen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoelektromikroskopie, für die in situ Detektion eines erfindungsgemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch erfolgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten genommen wird und markierte erfindungsgemäße- Antikörper zu einer solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikörper (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in markierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Protein in der Probe zu bestimmen, sondern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebeextrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Verfahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträger, wie z. B.

Nitrocellulose oder ein anderes Trägermaterial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein-oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektierbar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht-gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem

Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natürliche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Antikörper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Aspariginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markierung

eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays sichergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA ; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z.

B. 152E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B.

Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz- markierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht, detektiert.

Beispiele für derartige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleichermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine

Unterart der Chemilumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in- Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als"two-site" oder"sandwich"Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immunometrische Assay-Systeme schließen sog."Vorwärts"- Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß der Antikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog.

"sandwich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein

einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen"Vorwärts"-Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkubationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.

Nach der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur Expression von erfindungsgemäßen ee3-Genprodukten, insbesondere also von Polypeptiden gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18, einschließlich aller Derivate, Analoge und Fragmente, offenbart, wobei hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert werden.

Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern vielmehr dazu, den Zellstoffwechsel

durch das Einführen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Erkrankungen,- bspw. von Tumorerkrankungen, neurologischen Erkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen (bspw. Multipler Sklerose, Morbus Parkinson) cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall).

Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen bei Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation der Apoptose, der Nekrose, des Zellwachstums, der Zellteilung, der Zelldifferenzierung oder der Zellplastizität zugrunde liegt. Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplantiert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, insbesondere der Sequenzen mit den Nummern 5,6, 7 (einschließl. 7b und 7c), 8 und 11, zumindest über eine Teilsequenz von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 AS homologen Teilsequenz, wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann. Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann

ohne weiteres erkennen, daß die jeweiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreinigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombinanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z. B.

Amicon oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gelfiltrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe von säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed-Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das translatierte Protein

sekretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes rekombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296 : 171 (1994)) offenbart sind und Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden erfindung sind.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, und/oder erfindungsgemäße Genprodukte können als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels Verwendung finden. Diese können als solche verabreicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral, parenteral, nasal, subkutan) oder in Kombination mit weiteren Wirk-, Hilfs-oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen. Erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure, insbesondere intravenös, injiziert werden oder aber mit Hilfe von Vektoren dem Patienten verabreicht werden. Bei diesen Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adenovirale Vektoren, oder auch um Liposomen, die nackte erfindungsgemäße DNA oder ein Plasmid, das erfindungsgemäße DNA enthält, aufweisen können.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere der Nukleotid-oder Aminosäuresequenzen 1 bis 8 bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwecken, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur

Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen oder pathophysiologischen Zuständen, die auf fehlgesteuerter Regulation der Homöostase von Zelltod-und Proliferationsereignissen beruhen.

In diesem Zusammenhang kommt insbesondere auch die- erfindungsgemäße Erkenntnis zum Tragen, daß EPO, dessen Wirkung auf die Veränderung des Transkriptionsverhaltens von Zellen zurückzuführen ist, auf direkte oder indirekte Weise die transkriptionelle Hochregulation erfindungsgemäßer Rezeptoren, bspw. eue3-1, induziert. Erfindungsgemäße Rezeptoren vermitteln also die Wirkung von EPO und haben daher auch kritische Bedeutung für die hiermit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen. Dies bedeutet u. a., daß erfindungsgemäße Rezeptoren bestimmte Wirkungen von EPO selektiv beeinflussen können, z. B. eine neuroprotektive Wirkung (z. B bei neurodegenerativen Erkrankungen), wobei z. B. die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB ein wichtiger Schritt in der neuroprotektiven Wirkung von EPO ist), oder eine Hirnleistungssteigerung, (z. B bei Demenzen). Entsprechende Untersuchungen an Tierexperimenten lassen eine funktionelle Zuschreibung erfindungsgemäßer Gegenstände bei Modellen neurologischer Erkrankungen wie cerebrale Ischämien, experimentell induzierte Enzephalomyelitis, oder Subarachnoidalblutungen zu.

Dies ist für diese Teilwirkungen wünschenswert, da die Gabe von EPO neben der neuroprotektiven Wirkung eine Erhöhung des Hämatokrit bewirken würde, die z. T. der neuroprotektiven Wirkung entgegenstehen würde, da die rheologischen Eigenschaften des Blutes verschlechtert würden, was sich

negativ auf die Mikrozirkulation auswirkt, wie bei Mäusen mit Oberexpression von Erythropoetin gezeigt (Wiessner et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21,857-64).

Damit kommt die Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände, bspw. erfindungsgemäßer Nukleotidsequenzen, Oligo-oder Polypeptide, Expressionsvektoren, Wirtszellen oder von Surrogatliganden, die sich an alle für die regulation relevanten Positionen von erfindungsgemäßen Rezeptoren anlagern können, insbesondere für die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung neurologischer, insbesondere neurodegenerative Erkrankungen, in Betracht.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung können Zelltodprozesse, z. B. Kaskaden, die zur Apoptose führen, oder Prozesse, die zur Nekrose führen, in allen Zelltypen, die erfindungsgemäße Proteine der ee3-Familie oder eine native Variante hiervon exprimieren, insbesondere in neuralen Zellen, beeinflußt werden, bspw. durch Modulation von Zell-Zell-Interaktionen, insbesondere solche, an denen G-Protein gekoppelte Proteine beteiligt sind.

Die nativen erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere solche mit den Sequenzen 5 bis 8, sind als Rezeptoren erfindungsgemäß Bestandteil von intrazellulären Signaltransduktionswegen, typischerweise als Start einer Signalkaskade, wobei dessen Fehlsteuerung für eine Vielzahl von Erkrankungen ursächlich ist. Insofern finden sich die vorgenannten erfindungsgemäßen Proteine insbesondere als Komponenten bei den folgenden zellulären Prozessen wieder und weisen zelluläre Funktionen z. B. auf bei :

Signaltransduktion im allgemeinen, mit Wirkung auf Zelldifferenzierung, Zellteilung, Wachstum, Plastizität, Regeneration, Zelldifferenzierung, Proliferation oder Zelltod. Entsprechend kann typischerweise durch Infunktionalität eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. von ex3_1 oder ee32, oder durch infunktionelle Expression oder durch Überexpression desselben ein pathophysiologischer Zustand ausgelöst werden, der mit einer Fehlsteuerung bspw. der Zelldifferenzierung, des Zellwachstums, der Zellplastizität oder der Zellregeneration einhergeht.

Andererseits können auch andere Mechanismen zu pathophysiologischen Zuständen führen, bspw. eine Infunktionalität oder eine Überfunktionalität des/der nativen Liganden von erfindungsgemäßen ee3-Rezeptoren. Je nach molekularem Mechanismus der pathophysiologischen Störung kann zu therapeutischen Zwecken die Gabe funktionellen erfindungsgemäßen Proteins oder zumindest eine höhere Expression desselben oder aber eine Inhibition des zellulär überexprimierten oder des exprimierten infunktionellen Proteins erwünscht sein. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere Sequenzen mit den Nummern 1 bis 11, im Zusammenhang mit deren Funktion beim neuronalen Zelltod, Excitation und Neurogenese. Aus diesen erfindungsgemäßen Erkenntnissen ergibt sich die Verwendung erfindungsgemäßer Sequenzen (Nukleotid-und Aminosäuresequenzen) sowie entsprechender Derivate (bspw. Peptide, Oligonukleotide oder Antikörper) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen und neurologischen Erkrankungen, insbesondere ischämische Zustände (Schlaganfall), multipler Sklerose, neurodegenerative

Erkrankungen, wie bspw. Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklerose, heredodegenerative Ataxien, Neuropathien, Morbus Huntington, Epilepsien und Morbus Alzheimer. Aufgrund der Hochregulation im Falle erhöhter Erythropoetin- Expression kommt darüber hinaus die Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände für alle pathologischen Prozesse in Betracht, bei denen EPO eine (protektive) Rolle hat (z. B. dem Schlaganfall, und allen Formen akuter und chronischer Hypoxien).

Um auf auf der Basis molekularer Zusammenhänge zu weiteren Indikationen zu gelangen, erweisen sich erfindungsgemäß Zell-basierte HTS-Assays zur funktionellen Rezeptor- Aktivierung, gemessen durch Enzymkomplementation, als geeignet. Der Assay basiert auf dem allgemeinen Regulationsmechanismus von GPCRs und mißt die Wechselwirkung zwischen dem aktivierten Rezeptor und beta-Arrestin. Dazu werden inaktive sich komplementierende beta- Galactosidasefragmente an den C-Terminus des Rezeptors und an beta-Arrestin fusioniert. Durch die Aktivierung des Rezeptors wird beta-Arrestin rekrutiert. Dadurch werden die zwei Hälften der beta-Galactosidase zusammengebracht so daß ein funktionierendes beta-Galactosidaseenzym entsteht, das entsprechende substrate umsetzen kann, die als Meßsignal dienen (ICAST System). Prinzipiell kann dieser Assay mit allen Enzymen durchgeführt werden, die als Fusionsproteine von zwei sich komplementierenden Hälften exprimiert werden können und eine durch gängige Meßmethoden erfaßbare Substratreaktion durchführen.

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungsgemäßer Sequenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinsequenz, insbesondere der Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz mit der Numerierung 1 bis 4 bzw. 5 bis 8, oder einer Variante- wie oben definiert-hiervon, insbesondere eines Fragments, zur Gentherapie bei Säugetieren, z. B. beim Menschen bzw. auch derartige gentherapeutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapieformen, die entweder erfindungsgemäße Sequenzen nach einem der Ansprüch 1 bis 4 in den Körper oder Teile davon, bspw. einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfindungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem Fachmann geläufigen Modifikationen im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z. B. antisense- oder Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikationen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden. Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DNA-Sequenzen, kommen im Rahmen der Gentherapie in Betracht. Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozyme) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.

Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnostische Verwendungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien

(Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositionen, bspw. auch im Rahmen von Schwangerschaftsuntersuchungen. Bei diesen Erkrankungen oder Prädispositionen handelt es sich insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen, vor allem neurologische, immunologische oder Tumorerkrankungen, genannten Erkrankungen. Diese diagnostischen Verfahren können als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausgestaltet sein. Ex vivo wird eine typische Anwendung eines diagnostischen erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches Verfahren umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte : (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, (b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteinheteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt : (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das

Proteinheteromer oder gegen das erfindungsgemäße Protein/Polypeptid gerichtet ist, (b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes, (c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard. Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen. Insbesondere zu diagnostischen Zwecken kann hierbei die Eigenschaft eines erfindungsgemäßen Gens, bspw. des ee3 1-Gens, benutzt werden, daß nach charakteristischen pathophysiologischen Stimuli (Schlaganfall, Herzinfarkt, Tumorerkrankung etc.) die mRNA-Menge von erfindungsgemäßen Sequenzen in Zellen sich verändert, z. B. sich erhöht. Auf diese Art kann erfindungsgemäß z. B. eine Verlaufsbeurteilung (Prognose) von mit Veränderungen von Expressionsraten erfindungsgemäßer Proteine einhergehender Krankheiten (wie z. B. des Schlaganfalls), die Beurteilung von Therapieerfolgen oder die Graduierung einer Krankheit vorgenommen werden.

Schließlich kann mit erfindungsgemäßen Verfahren ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung von Polymorphismen derselben z. B. bei Menschen verwendet werden. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer Sequenzen unterfallen nicht nur der Offenbarung der vorliegenden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunktionale Expression erfindungsgemäßer Sequenzen, durch Expression infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder deren Überexpression dienen. Darüber

hinaus ist erlauben erfindunsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankheiten, und zwar sowohl monogener als auch polygener Erkrankungen.

Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwecken im Bereich der Human-und/oder Tiermedizin kommt auch die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide zum wissenschaftlichen Einsatz in Betracht. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann bekannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequenzen bei ein- oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren oder aber im humanen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisieren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere die Sequenzen mit der Numerierung 1 bis 4 (einschließl. aller Varianten), können also dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im bspw. murinen oder anderen Tiergenomen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren, zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Diese Vorgehensweise erlaubt bspw. die ursächliche Korrelation der chromosomalen Loci von Sequenzen der ee3-Familie beim Menschen (Chromosom 2 (2ql4. 2) ; X- Chromosom (Xq28, LocusID : 84548) ; Chromosom 5, Chromosom 8, Chromosom 3 ; Chromosom 7) zu bestimmten phänotypisch bekannten erblichen Erkrankungen, insbesondere auch Tumorerkrankungen (bspw. hepatozelluläres Carcinom), was ihre Diagnose erheblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht. Gleiches gilt für die erfindungsgemäßen Proteine.

Mit Hilfe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren lassen sich damit insbesondere humane Erbkrankheiten diagnostizieren, und zwar sowohl monogene als auch polygene Erkrankungen, weswegen sie als Marker Verwendung finden, wobei hieraus ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche- Erkrankungen erwächst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen Aminosäure-und/oder Nukleotid-Sequenzen beruht. In diesem Zusammenhang können die cDNA, die genomische DNA, die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Ein solches erfindungsgemäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder aktivierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Proteine, insbesondere der Sequenzen 5 bis 8 (bzw. deren Derivate oder Fragmente), haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die ee3-

assoziierte Signaltransduktion wirken. Insbesondere werden hierbei Testsysteme zur Verfügung gestellt, die die bekannten Eigenschaften von G-Protein gekoppelten Proteinen benutzen, bspw. die weiter unten offenbarten Testsysteme.

Eine Inhibition der biologischen Aktivität von erfindungsgemäßem Protein, insbesondere von Proteinen gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18, typischerweise der biologischen Aktivität im Zusammenhang mit der Apoptose, Proliferation, Regeneration, Zellwachstum, wie sie bspw. beim Schlaganfall, dem septischen Schock, GvHD (graft versus host disease), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, akuter Hepatitis oder anderen vorliegend offenbarten Indikationen erwünscht ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fachmann geläufige Verfahren Oligonukleotide von typischerweise mindestens 10 Nukleotiden Länge, die für ein (Teilstück eines) Antisense-Strang (s) der nativen Sequenzen der Proteine mit den Sequenznummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11 codieren, in die betroffenen Zellen einzuschleusen.

Hierdurch wird die in den entsprechend transformierten Zellen die Translation der nativen mRNA von erfindungsgemäßen Proteinen der ee3-Familie, bspw. ex3_1 oder ee32 blockiert, was im Ergebnis vorzugsweise die Oberlebensfähigkeit der transfizierten Zelle steigert oder modulierend auf Zellwachstum, Zellplastizität, Zellproliferation wirkt. Auch in diesem Fall kann das oben beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinanter Viren eingesetzt werden.

Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose, Zellproliferation bei Erkrankungen, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruhen (bspw. bei den vorgenannten Indikationen), kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar, die native ee3-mRNA, bspw. von ex3_1 oder ee3 2, spalten können.

Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Ziel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. ex3_1 oder ee32 zu blockieren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifizierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der biologischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesondere der Genprodukte gemäß Figuren 13,14, 15A, 15B, 15C, 16 oder 18, typischerweise der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte bei der apoptotischen oder nekrotischen, proliferativen oder wachstumsindizierenden Signaltransduktion ist dies auch mit Hilfe eines weiteren Gegenstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung wird insbesondere die intrazelluläre Funktion der erfindungsgemäßen Proteine der ee3-Familie modulieren, typischerweise inhibieren oder auch aktivieren, oder auf der Ebene der zugrundeliegenden

erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, bspw. durch Bindung an die DNA (bspw. den Promotorbereich) oder durch Bindung an einen der ein erfindungsgemäßes Gen steuernden Transkriptionsfaktoren, die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungsgemäße Verbindungen werden typischerweise spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein,- insbesondere an ein Protein mit einer der Aminosäuresequenzen 1 bis 4, bzw. an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, insbesondere an eine Nukleinsäuresequenz mit einer der Sequenzbezeichnungen 5 bis 8, binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere neuroprotektive oder immunmodulierende oder antiapoptotische oder anti-proliferative Wirkung, hervorrufen.

Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offenbart, vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung, mit einem Molekulargewicht von <5000, insbesondere <3000, vor allem <1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs-und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die C-terminale, cytosolische Domäne oder an die extrazelluläre Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, mindestens 107 mol-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra) membranöse Transportproteine,

ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten AS-Sequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die die Interaktion von erfindungsgemäßen Proteinen der ee3-Familie mit Bindungspartnern, insbesondere für die Transduktion eines apoptotischen oder nekrotischen, proliferativen oder wachstumsindizierenden oder regenerativen Signals, inhibiert oder verstärkt.

Insbesondere besetzen derartige Verbindungen Positionen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformationswechsel hervor, so daß die Bindung eines nativen Bindungspartners an ein erfindungsgemäßes Protein verhindert wird.

Über Strukturanalysen eines erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt erfindungsgemäße Verbindungen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen (Rationales Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur, Derivat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen von einem der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere von einem der Proteinen mit den Sequenzen 5 bis 8, über NMR-oder Röntgenkristallographie-Verfahren (nach entsprechender Kristallisierung, z. B. nach der Methode des "hängenden Tropfens") ermittelt oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen ein Strukturmodell eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. auch mit Hilfe von homologen bereits strukturell aufgeklärten Proteinen (z. B. von Rhodopsin), erstellt, und diese (s) benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen

Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten wirken können, zu identifizieren, für die sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vorhersagen läßt. Ggf. Lassen sich die oben bezeichneten Verfahren zur Strukturaufklärung auch miteinander kombinieren. Geeignete Kraftfelder werden zur Simulation der Affinität einer potentiell affinen Verbindung an eine interessante Substrukur eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. das aktive Zentrum, eine Bindungstasche oder eine"hinge"-Region, eingesetzt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und in geeigneten Testverfahren auf ihr Bindungsvermögen und ihre therapeutische Nutzbarkeit getestet. Derartige in silico Verfahren zur Identifizierung potentieller Wirkstoffe, die ihre Wirkung durch Bindung an erfindungsgemäße ee3-Proteine entfalten, sind gleichfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen ein erfindungsgemäßes Protein der ee3-Familie, bspw. eue3-1, ee32 oder eue35, gerichteter Antikörper oder auch gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als"intrabody"nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße"Intrabodies"können die Zellen vor einer fehlgeleiteten apoptotischen Reaktion, bspw. durch Oberexpression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise

für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zeigen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Keratinozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskelzellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen"Intrabodies"gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blockade, ggf. aber auch Aktivierung der biologischen Funktion von nativem erfindungsgemäßem ee3-Protein, bspw. von Sequenzen mit den Nummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11, oder entsprechender nativer Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der apoptotischen Funktion, kann als Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organisch-chemische Verbindungen, Antikörper, anti-sense Oligonukleotide, Ribozyme. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere für neurologische, immunologische oder proliferative Erkrankungen, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (insbesondere ein Intrabody), ein Ribozym, anti-sense RNA, dominant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten ggf. inhibitorischen organisch-chemischen Verbindungen, vorzugsweise eine hochaffine Verbindung, bspw. erhältlich aus einem der vorgenannten Verfahren) der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen nativen Proteins, insbesondere eines Proteines mit den Sequenzen 5 bis 8, oder

seiner nativen Varianten, also bspw. der apoptotischen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden : Krankheiten, bei denen chronische oder akute Hypoxiezustände auftreten können, oder beteiligt sind, z. B. Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, Kardiomyopathien, Myokarditis, Perikarditis, Perimyokarditis, Koronare Herzerkrankung, Kongenitale Vitien mit Rechts-Links-Shunt, Fallot-Tetralogie/Pentalogie, Eisenmenger-Syndrom, Schock, Mangeldurchblutungen von Extremitäten, Arterielle Verschlußkrankheit (AVK), periphere AVK (pAVK), Carotisstenose, Nierenarterienstenose, Störungen der Mikrozirkulation im Gehirn (small vessel disease), Intrazerebrale Blutung, Hirnvenen-und Sinusthrombosen, Gefässfehlbildungen, Subarachnoidalblutungen, vaskuläre Demenz, M. Biswanger, subkortikale arteriosklerotische Enzephalopathie, multiple kortikale Infarkte bei Embolien, Vaskulitis, diabetische Retinopathie, Folgeerscheinungen von Anämien unterschiedlicher Ursachen (z. B. aplastische Anämien, myelodysplastisches Syndrom, Polyzythämia vera, megaloblastische Anämien, Eisenmangelanämien, renale Anämien, Sphärozytose, hämolytische Anämien, Thalassämien, Hämoglobinopathien, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasemangel, Transfusionszwischenfälle, Rhesus-Inkompatibilitäten, Malaria, Herzklappenersatz, Blutungsanämien, Hyperspleniesyndrom), Lungenfibrosen, Emphysem, Lungenödem : ARDS, IRDS, Rezidivierende Lungenembolien.

Tumorerkrankungen (z. B. Coloncarcinom, Mammacarcinom, Prostatacarcinom, Lungencarcinom), Erkrankungen des

Immunsystems (z. B. Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, Immundefizienzen, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Atopien, Asthma), virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV, Hepatitis B oder Hepatitis C Infektionen, bakterielle Infektionen (z. B.

Streptokokken-oder Staphylokokken-Infektionen), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), aber auch neurologische Erkrankungen (insbesondere, aber nicht ausschließlich : Schlaganfall, Multiple Sklerose, Morbus Parkinson, Subarachnoidalblutungen, Amyotrophe Lateralsklerose, Heredodegenerative Ataxien, Morbus Huntington, Neuropathien, Epilepsien, Hirntraumata, Morbus Alzheimer) ; Muskelrelavantien (bspw, zur Narkoseeinleitung), endokrinologische Erkrankungen (z. B. Osteoporose oder Schildrüsenfehlfunktion) und dermatologische Erkrankungen (Psoriasis, Neurodermitis) ; Bekämpfung von chronischen oder akuten Schmerzzuständen, Erbkrankheiten, auch Erkrankungen im psychischen Bereich (z. B. Schizophrenie oder Depressionen), Wundheilung, Unterstützung der Sexualfunktion, Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z. B. ischämischer Infarkt, Herzinsuffizienz, Arrythmien, Bluthochdruck), Hirnleistungssteigerung.

Die vorgenannten Indikationsfelder kommen sämtlich auch bei der Verwendung erfindungsgemäßer Genprodukte oder erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen zur Herstellung eines Arzneimittels in Betracht.

Die vorgenannten erfindungsgemäßen Substanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger-Hilfs-und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammensetzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die- biologische Verfügbarkeit und/oder die Pharmakodynamik zu verbessern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen, insbesondere mit inhibitorischen Eigenschaften, in Hinblick auf die Auslösung oder Weiterleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftretende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelösten Reaktionen, in Zusammenhang stehen. Derartige pharmazeutisch wirksame Substanzen können sowohl am extrazellulären Terminus erfindungsgemäßer Rezeptoren, deren TM-Domänen (hier bspw. deren Di-oder Multimerisierung beeinträchtigen), als auch intrazellulär die Signalweiterleitung blockieren, bspw. die Interaktion zwischen ee3-Proteinen und intrazellulären Signalproteinen blockieren oder aktivieren, insbesondere die Interaktion mit dem intrazellulären Proteinen ranbpm und/oder MAPla/MAPlb beeinflussen (aktivieren oder inhibieren).

Erfindungsgemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid, bspw. für ein Polypeptid mit den Sequenznummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 bzw. 11, codiert, und ggf. mindestens einem

Expressionsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert werden, und (b) ein zur Beobachtung der durch erfindungsgemäße Proteine vermittelten Funktion, bspw. der Signaltransduktion für regenerative oder proliferative Prozesse, geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer- Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird. Hierzu werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen Wirksamkeit, bspw. die Apoptose inhibierenden Wirkung, der Testsubstanz deren IDso- Wert bestimmen zu können.

Die Kenntnis der Primärsequenz von ee3 Proteinen kann benutzt werden, um rekombinante Konstrukte herzustellen, die die Eigenschaften schon charakterisierter und nach dem Stand der Technik bekannter GPCRs ausnutzen. So können z. B. bestimmte Sequenzbereiche von erfindungsgemäßen ee3- Proteinen gegen bestimmte Sequenzbereiche eines bekannten, gut charakterisierten GPCRs ausgetauscht werden. Das resultierende Konstrukt kann herangezogen werden, um mit bekannten Liganden oder Agonisten, die G-Proteinkopplung, und die benutzten second messenger Systeme zu identifizieren, oder bekannte G-Proteinkopplung für die Auffindung von Liganden, Agonisten oder Antagonisten zu benutzen. Die Herstellung chimärer erfindungsgemäßer Rezeptoren bspw. zu den vorgenannten Verwendungen kann bspw. nach einem Verfahren, wie von Kobilka et al. Beschrieben (und zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung gehörig), durchgeführt werden (Kobilka BK, Kobilka TS, Daniel K, Regan

JW, Caron MG, Lefkowitz RJ (1988) Chimeric alpha 2-, beta 2- adrenergic receptors : delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240 : 1310-1316).

Weiterhin können erfindungsgemäß konstitutiv aktive Rezeptormutanten der ee3-Familie zur Charakterisierung der Wirkung dieser Rezeptoren auf Signaltransduktionswege und zum"Screening"nach Liganden eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Rezeptoren als Vertreter der 7TM- Proteinklasse können auf bestimmte Weise mutiert werden, um Veränderungen des physiologischen und pharmakologischen Verhaltens dieser Rezeptoren hervorzurufen. Dies kann beispielsweise dazu benutzt werden, intrazelluläre Signalwege zu identifizieren, wenn der natürliche Ligand oder ein Agonist unbekannt sind. Insbesondere sind Mutationen in der DRI consensus Sequenz von ee3-Proteinen geeignet, solche Veränderungen herbeizuführen, bspw. die Mutation von R in der DRY Sequenz (Scheer A, Costa T, Fanelli F, De Benedetti PG, Mhaouty-Kodja S, Abuin L, Nenniger-Tosato M, Cotecchia S (2000) Mutational analysis of the highly conserved arginine within the Glu/Asp-Arg-Tyr motif of the alpha (lb)-adrenergic receptor : effects on receptor isomerization and activation. Mol Pharmacol 57 : 219- 231)) zu Lys, His, Glu, Asp, Ala, Asn, und Ile führt im Falle der Mutation zu Lys zu einer starken Zunahme der konstitutiven Aktivierung. Mutation zu His oder Asp führen zu einer geringeren Zunahme der konstitutiven Aktivierung.

Interessanterweise führt die Mutation zu Arg zu einer Zunahme der Agonistenaffinität, so daß auch solche Mutanten für HTS screens interessant sind

Ähnlich ist ein konserviertes Arg in der dritten TM-Domäne ein möglicher Mutationsort (Ballesteros J, Kitanovic S, Guarnieri F, Davies P, Fromme BJ, Konvicka K, Chi L, Millar RP, Davidson JS, Weinstein H, Sealfon SC (1998) Functional microdomains in G-protein-coupled receptors. The conserved arginine-cage motif in the gonadotropin-releasing hormone receptor. J Biol Chem 273 : 10445-10453).

Alternativ können zur Identifikation von endogenen oder surrogaten Liganden Verfahren eingesetzt werden, die auf der Verwendung immobilisierter funktioneller erfindungsgemäßer Rezeptoren beruhen. Erfindungsgemäße Rezeptoren der ee3- Familie werden hierbei als Fusionsproteine mit GST, dem Flag-Tag oder dem TAP-Tag, wie erfindungsgemäß offenbart, exprimiert. Die entsprechenden Zellen werden entweder nach gängigen Methoden zu Membranen verarbeitet oder direkt zur Solubilisation eingesetzt. Mit geeigneten Detergenzien, z. B.

Dodecylmaltosid, Digitonin, Cholat oder Detergenzmischungen, werden die Rezeptoren solubilisiert und an die entsprechenden Affinitätsmatritzen wie GST-Sepharose, Anti- Flag-M2-Agarose oder IgG-Sepharose etc. gebunden. Nach Waschen der Matritzen werden sie mit Gewebsextrakten oder Zellüberständen inkubiert und wieder gewaschen. Enthält der Extrakt einen aktiven Liganden, z. B. ein Peptid, so bindet dieser an den immobiliserten Rezeptor und kann nach Elution durch analytische Methoden identifiziert werden, z. B. mittels Massenspektrometrie.

Sog. Internalisierungsassays stellen erfindungsgemäß eine weitere Vorgehensweise dar, um natürlichen oder insbesondere

Surrogatliganden für erfindungsgemäße Rezeptoren, bspw. ee3l, identifizieren zu können. Hierbei werden ebnfalls die unterschiedlichen Eigenschaften eines Proteins der GPCR- Klasse ausgenutzt. Bspw. kann das Internalisierungsverhalten von Proteinen der GPCR-Klasse herangezogen werden. Dies ist als Regulationsmechanismus nach Aktivierung des Rezeptors zu vertehen. Der Vorteil einer"Screening"-Methode die auf diesem Verhalten aufbaut, ist, daß eine genauere Kenntnis der Physiologie des jeweiligen Rezeptors nicht nötig ist.

Insbesondere muß keine Kenntnis über die koppelnden G- Proteine, und die benutzten Signaltransduktionswege vorhanden sein.

Ein solcher Assay wird z. B. von Lenkei et al. (2000, J Histochem Cytochem, 48,1553-64) beschrieben und kann erfindungsgemäß analog bei den erfindungsgemäßen Rezeptoren eingesetzt werden. Hierzu wird erfindungsgemäß zunächst ein C-terminales Fusionskonstrukt erfindungsgemäßen Proteins mit EGFP hergestellt. Danach werden stabile CHO-Zellen hergestellt nach Standardverfahren. Stabile Klone werden mit Hilfe eines FACS-Sorters nach EGFP-Fluoreszenz selektiert.

Die endgültige Auswahl erfolgte mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Beurteilung auf Oberflächenexpression. Die Zellen werden danach mit HPLC- Fraktionen von Gewebeextrakten inkubiert, und die Internalisierung mit Hilfe eines Konfokalen Mikroskops bestimmt. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe morphometrischer Software (NIH Image) nach dem Prinzip der Distanz fluoreszenter Signale vom Zellmittelpunkt. Eine Häufigkeits/Distanzverteilung ergab eine gute Diskrimination für die Internalisierung.

Zur Auffindung unbekannter Liganden werden sukzessive Fraktionierungen durchgeführt, und das entsprechende Peptid bis zur Reinheit zu isolieren, und danach bspw. durch Sequenzierung oder MALDI-TOF zu identifizieren. Eine andere Anwendung des prinzipiell gleichen Verfahrens wird von Ghosh et al. (2000, Biotechniques, 29,170-5 ; Conway et al., 1999, J Biomol Screen, 4,75-86) beschrieben, die beide vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind.

Aber auch ein funktioneller Ca-Assay kann zur Identifizierung von Liganden und/oder ggf. auch zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Rezeptors herangezogen werden. Hierbei macht man sich erfindungsgemäß zunutze, daß eine Vielzahl von 7TM-Rezeptoren (Rezeptoren mit 7 Transmembran-Domänen), die in HEK293 Zellen, in CHO Zellen oder anderen Zellen produziert werden, über die Kopplung an G Proteine der Gq Klasse zur Aktivierung der PLC und zur Mobilisation von intrazellulärem Ca führen. Für den Fall, daß gewisse erfindungsgemäße Rezeptoren nicht an G Proteine der Gq Klasse koppeln sollten, können diese durch Co-expression von chimären G Proteinen oder den relativ unspezifisch mit Rezeptoren koppelnden G Proteinen G15 oder G16 zur Signaltransduktion über PLC, d. h. zur Ca- Freisetzung, gezwungen werden. Die erfindungsgemäßen Rezeptoren der ee3-Familie werden typischerweise in HEK293 und in CHO Zellen sowohl stabil als auch transient allein und zusammen mit dem chimären G Protein Gqi5 und alternativ mit dem G Protein Gql5 exprimiert. Die Zellen werden dann vorzugsweise mit einem membranpermeablen Ca-bindenden

Fluoreszenzfarbstoff, z. B. Fura-2 oder Fluo-3 bzw.-4 beladen und nach dem Waschen der Zellen mit verschiedenen Testsubstanzen versetzt und gleichzeitig die Ca-Freisetzung gemessen, z. B. mit einem FLIPR Gerät der Firma Molecular Devices. Testsubstanzen, die ein positives Signal ergeben, werden schließlich vorzugsweise in Kontrollzellen (nur mit dem Vektor transfiziert) getestet und wenn das Signal sich als spezifisch herausstellt pharmakologisch, d. h. mit Konzentrations-Response-Kurven charakterisiert.

Alternativ kann jedoch die durch einen Liganden hervorgerufene Ca-Antwort auch durch andere Ca-Detektoren gemessen werden, z. B. über AequoScreen von Euroscreen (Brüssel, Belgien ; siehe z. B. http : //www. pharmaceutical- technology. com/contractors/compoundman/euroscreen/). Dabei werden Zellen eingesetzt, die das Gen des Proteins Apoaequorin exprimieren. Nach beladung der Zellen mit Coelenterazin, das an Apoaequorin bindet, entsteht Aequorin.

Wird durch einen Liganden Ca freigesetzt, aktiviert das Ca das Aequorin zur Oxidation von Coelenterazin, wodurch Licht freigesetzt wird. Die Intensität der Lichtemission ist der Erhöhung der intrazellulären Ca-Konzentration proportional und, damit ein Maß für die Aktivität des gefundenen Liganden (unter Berücksichtigung der entsprechenden Kontrollen).

Um erfindungsgemäß Antagonisten zu identifizieren, werden die Rezeptoren in Gegenwart genügend hoher Konzentrationen verschiedenster Liganden mit einem bekannten Agonist stimuliert. Ein gegenüber der Kontrolle (nur Agonist, ohne weiteren Liganden) verändertes Signal, bspw. ein niedrigeres Ca-Signal, deutet auf einen kompetitiven Antagonisten hin.

Weiterhin können auch cAMP-Assays zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Rezeptoren der ee3-Familie und zur Identifikation von Liganden dienen. Hintergrund dieses erfindungsgemäßen Ansatzes zur pharmakologischen Charakterisierung von ee3-Rezeptoren bzw. zur Identifizierung von Liganden (Agonisten oder Antagonisten)- ist die Eigenschaft von Rezeptoren der Klasse der GPCRs, bspw. also von erfindungsgemäßen Proteinen, entweder stimulierend oder inhibierend auf Adenylatzyklasen wirken zu können, in der Regel durch Aktivierung von sog. stimulierenden Gs oder inhibierenden Gi Proteinen. Abhängig von der Wirkung von Testsubstanzen, bspw. in einem Hochdurchsatz-"Screening", kann über direkte oder indirekte Messungen die damit verbundene Änderung des cAMP-Spiegels in der Zelle untersucht werden werden. Die Rezeptorgene werden hierbei stabil oder transient in Säugerzellen exprimiert (s.

Ausführungsbeispiel 2). Bei GPCRs, die Adenylatzyklasen aktivieren, wodurch der cAMP Spiegel in der Zelle steigt, wird ein potentieller Agonist unter den Testsubstanzen durch eine gegenüber Kontrollzellen erhöhte cAMP-Konzentration identifiziert. Antagonisten unter den Testsubstanzen, bespw.

In einem HTS-Ansatz, werden durch ihre Blockierung der durch einen Agonisten hervorgerufenen Erhöhung der cAMP- Konzentration identifiziert. Bei Gi-gekoppelten erfindungsgemäßen ee3-Rezeptoren wird im Test die Adenylatzyklase entweder direkt mit Forskolin oder durch Aktivierung eines Gs-gekoppelten Rezeptors stimuliert, wodurch der cAMP-Spiegel steigt. Ein Agonist des Gi- gekoppelten Rezeptors hemmt diesen Anstieg. Für direkte cAMP-Messungen können eine Anzahl käuflicher Assays, wie bspw. des CAMP E3H1Assay-Systems der Firma Amersham, verwendet

werden, die z. B. auf dem Prinzip der kompetitiven Verdrängung von endogen gebildetem cAMP durch zugegebenes radioaktiv markiertes (Tritium) cAMP beruhen. Indirekte cAMP-Messungen werden in der Regel durch Reporter-Assays durchgeführt. Dazu werden die Rezeptoren in Zellinien exprimiert, die Reportersysteme enthalten, z. B. das CRE- Luziferase-System. cAMP aktiviert die Expression der Luziferase, deren Aktivität durch Umsetzung entsprechender Substrate und luminometrische Messung der Produkte gemessen wird. Reporter-Assays eignen sich ganz besonders für Massen- Screening-Methoden.

Schließlich sind-neben den vorangehend beschriebenen Assays-erfindungsgemäß auch die folgenden Assay-Systeme zur Charakterisierung von second-messenger Systemen erfindungsgemäßer Rezeptoren bzw. zur Identifizierung von Liganden erfindungsgemäßer ee3-Rezeptoren möglich, erfindungsgemäß insbesondere zur Bestimmung der Adenylatzyklase-Aktivität in Zellen oder Membranen nach Salomon (Salomon et al., (1979). Adv. Cyclic Nucleotide Res.

10,35-55), zur Bestimmung der Inositol-3-phosphat- Konzentration oder zur Messung einer veränderten Arachidonsäurefreisetzung. Beispielsweise kann ee3 1 in gängigen Zellinien überexprimiert werden, und nach Aktivierung durch Gewebeextrakte kann die Aktivität der o. a. second messenger Systeme bestimmt werden. Im einzelnen sind Assays für second messenger Systemen von GPCR-Klasse dem Fachmann wohl bekannt, und im Einzelfall der Literatur zu entnehmen, z. B. Signal Transduction : A practical approach, G. Milligan, Ed. Oxford University Press, Oxford, England.

Weitere Reporter-Assays zum"Screening"umfassen MAP kinase/Luziferase und NFAT-Luziferase Systeme.

Beruhend auf der erfindungsgemäßen Erkenntnis, daß die Signalweiterleitung des ee3-Rezeptors auch über MAP-Kinase Signaltransduktionswege erfolgt, kann auch dazu verwendet werden,"Screening Assays"für Ligandensuche oder Inhibitorenidentifikation aufzubauen, z. B. über einen NF-kB- Reportersysteme oder Luciferase-Systeme.

Wie oben erwähnt, dient die Aktivierung von second messenger auch zur Identifikation von Liganden, Agonisten oder Antagonisten, die an erfindungsgemäße Rezeptoren binden und derart ihre agonistische und/oder antagonistische Wirkung für gewisse zelluläre Prozesse entfalten können. Bspw. können Microphysiometern zur Identifikation von Liganden, Agonisten, oder Antagonisten eingesetzt werden. Durch Ligandenbindung an einen Rezeptor der ee3-Familie ausgelöste Signale stellen energieverbrauchende Prozesse dar. Deshalb gehen derartige Vorgänge immer mit geringen metabolischen Veränderungen, unter anderem einer geringen pH Verschiebung, einher. Diese können extracellulär von bspw. einem Microphysiometer (Cytosensor, Molecular Devices) erfaßt werden.

Nach Identifizierung von Liganden, Agonisten oder Antagonisten mit Bindungspotential an erfindungsgemäße Proteine der ee3-Rezeptorfamilie können erfindungsgemäß zu deren näherer Charakterisierung Ligandenbindungstests durchgeführt werden. Ligandenbindungstests ermöglichen in direkter Weise die Pharmakologie eines Rezeptors, d. h. die

Affinität verschiedenster Liganden für diesen Rezeptor, zu messen. Für Bindungsstudien wird hierbei typischerweise ein nach einem der vorgenannten Verfahren identifizierter oder auf andere Weise bekannter chemisch reiner Ligand mit einer hohen spezifischen Aktivität (30-2000 Ci/mmol) radioaktiv markiert, so daß die radioaktive Markierung die Aktivität des Liganden bezüglich des Rezeptors nicht verringert. Die Testbedingungen werden sowohl für die Verwendung von den Rezeptor exprimierenden Zellen wie auch von daraus hergestellten Membranen bezüglich Pufferzusammensetzung, Salz, Modulatoren wie z. B. Nukleotiden oder Stabilisatoren, wie z. B. Glyzerin, so optimiert, daß die Messung ein brauchbares Signal-zu-Hintergrund Verhältnis ergibt. Für diese Bindungstests wird die spezifische Rezeptorbindung definiert als die Differenz von der gesamten mit der Rezeptorpräparation (Zellen oder Membranen) assoziierten Radioaktivität, d. h. gemessen in Gegenwart von nur einem spezifischen, nämlich des Radioliganden und der Radioaktivität, die in Gegenwart sowohl des Radioliganden als auch eines Überschusses an nicht radioaktiv markiertem Ligand gemessen wird. Der nicht markierte Ligand verdrängt dabei kompetitiv den Radioligand. Wenn möglich, werden mindestens zwei chemisch verschiedene kompetitierende Liganden verwendet, um die nicht spezifische Bindung festzulegen. Eine spezifische Bindung die mindestens 50% der Gesamtbindung beträgt, ist optimal. Der Bindungstest wird entweder inhomogen als Filtrationstest durchgeführt oder homogen als"Scintillation Proximity Assay".

Im ersten Fall wird die Rezeptor enthaltende Präparation (Zellen oder Membranen) mit den Liganden in einer geeigneten

Pufferlösung inkubiert bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, typischweise 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht, und dann über geeignete Filter, z. B. Whatman oder Schleicher&Schuell Glasfaserfilter, die gegebenenfalls vorbehandelt wurden, z. B. mit Polyethylenimin, abfiltriert, um den nicht-gebundenen von dem gebundenen Radioliganden zu trennen. Nach Waschen der Filter werden diese getrocknet oder feucht mit geeignetem Szintillator versetzt und nach eventuell nötiger Inkubation im Szintillationszähler die enthaltene Radioaktivität gemessen. Beim"Scintillation Proximity Assay"werden geeignete Szintillation-Kügelchen, z. B. WGA-Kügelchen, mit den Liganden und Rezeptor enthaltenden Membranen in geeigneter Pufferlösung inkubiert, bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, und dann die Radioaktivität in einem geeigneten Szintillationszähler gemessen. Beide Bindungstests sind im HTS-Format durchführbar.

Solubiliserte oder gereinigte Rezeptoren werden mit dem "Scintillation Proximity Assay"gemessen oder mit gängigen inhomogenen Tests wie dem Filtrationstest nach PEG-Fällung, dem Adsorptions-oder dem Gelfiltrationstest (Hulme E, Birdsall N (1986) Distinctions in acetylcholine receptor activity. Nature 323 : 396-397).

Anstelle eines Radioliganden kann auch ein fluoreszierender Ligand, z. B. ein Ligand der kovalent einen fluoreszierenden Farbstoff wie BODIPY gebunden hat, eingesetzt werden. Die Bindung des fluoreszierenden Liganden an den Rezeptor wird mittels Fluoreszenzpolarisation gemessen. Die Methode eignet

sich sowohl für primäre Screenings im HTS-Format wie auch in Sekundärtests.

Weiterhin werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung"Hochdurchsatz-Suchverfahren" ("High- throughput screening assays", HTS) zur Identifikation von Liganden (Agonisten oder Antagonisten), insbesondere Inhibitoren von erfindungsgemäßen ee3-Sequenzen, offenbart.

Ganz besonders bevorzugt ist dabei der Einsatz von (allen bekannten) Komponenten des MAP-Signaltransduktionswegs im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Inhibitoren, insbesondere zur Identifikation kleiner organischer Verbindungen an. Vorzugsweise bieten sich Systeme mit dem"Scintillation Proximity Assay" (SPA) an (Fa. Amersham Life Science, MAP kinase SPA (s. McDonald et al., 1999, Anal Biochem, 268, 318-29)). Vorgenannte Druckschrift gehört vollinhaltlich zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung. Die MAP-Kaskade wird hierbei in vitro rekonstituiert, mit den einzelnen Bestandteilen als GST-Fusionsproteinen (E. coli exprimiert) oder im Falle von cRAF1 mit dem Baculovirussystem hergestellt. Das erste Element der Kaskade (MAP-KKK) muss hierbei ständig gleichmäßig aktiviert sein, um verläßlich Inhibitoren testen zu können. Typischerweise wird dies wird durch Coexpression von src im Baculovirussystem erreicht. Dadurch wird eine ras-analoge Aktivierung von cRaf sichergestellt. Nach Transfektion von erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen wird eine Modulierung der Kaskade hervorgerufen, die herangezogen wird, um in einem HTS durch Zugabe von zu testenden Substanzen eine Beeinflussung dieser Modulation messen zu können.

Nach Identifizierung hochaffiner, selektiver Substanzen nach vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren werden diese auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlaganfall und andere neurologische, immunologische oder proliferative Erkrankungen (Tumorerkrankungen) getestet.

Darüber hinaus können die Bindungsplätze der identifizierten und pharmakologisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen ee3-Genprodukte, insbesondere den Sequenzen mit den Nummern 5,6, 7A, 7B, 7C, 8 oder 11, mit Hilfe des yeast-two-hybrid Systems oder anderen Assays ermittelt werden, d. h., daß die für die Interaktion, bspw. auch für die Interaktion zwischen nativen Proteinen, verantwortlichen Aminosäuren eingegrenzt werden. In einem nächsten Schritt können hochaffine Substanzen (Surrogatliganden), die speziell an die zuvor identifizierten für die Bindung der nativen Interaktionspartner verantwortlichen Aminosäuren (Strukturbereiche) aufweisen, durch die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen"Screening"-Verfahren identifiziert werden. Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflußt, insbesondere inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein offenbart. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Verfahren, wie bei Klein et al. (1998, Nat Biotechnol, 16,1334-7) beschrieben, verwiesen. Die bekannten Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Proteins, das zur Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehört (Kopplung

an G-Proteine, Signalweitergabe), können zudem benutzt werden, um erfindungsgemäß Inhibitoren zu identifizieren.

Aufgrund der pharmakologischen Bedeutung von erfindungsgemäßen Genen oder erfindungsgemäßen Genprodukten der ee3-Familie, insbesondere den in den ee3_1-bzw. ee3_2- Sequenzen, bzw. deren nativen Varianten für zahlreiche Erkrankungen, bspw. in neurodegenerativen, proliferativen, also insbesondere neoplastische Erkrankungen (Tumorerkrankungen bspw. solide Tumore (Sarkome (Hautsarkome (Kaposi-Sarkom), Blastome, Carcinome der Leber, des Darms, der Bauchspeicheldrüse, des Magens oder der Lunge) oder Tumore des blutbildenden Systems, ganz besonders Lymphome oder Leukämien), oder hypoapoptotische oder hyperapoptotische Erkrankungen, haben gemäß erfindungsgemäßem Verfahren identifizierte pharmazeutisch wirksame Substanzen ein weites Anwendungsspektrum. Neben der Inhibierung einer Interaktion mit einem oder mehreren anderen Molekülen, z. B. im Signaltransduktionsweg downstream befindlichen Proteinkinasen, oder Adaptoren kann insbesondere auch eine Beeinflussung der Transkription oder der Transkriptmenge von erfindungsgemäßen Proteinen in der Zelle Ursache pharmazeutischer Wirksamkeit sein.

Beispielhaft wäre die Suppression der schnellen Hochregulation von Transkripten erfindungsgemäßer DNA- Sequenzen nach pathologischen Prozessen durch erfindungsgemäße Verbindungen zu nennen, insbesondere im Falle einer sehr raschen Regulation derselben durch transkriptionelle Aktivierung. Vorzugsweise ist ein Angriffsziel für eine pharmazeutisch wirksame Verbindung daher die Regulation der Transkription, bspw. durch

spezifische Bindung der Substanzen an eine Regulatorregion (bspw. Promotor-oder Enhancer-Sequenzen) eines erfindungsgemäßen Genprodukts, Bindung an einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren eines erfindungsgemäßen Genprodukts (mit dem Resultat einer Aktivierung oder Inhibierung des Transkriptionsfaktors) oder eine Regulation der Expression (Transkription oder Translation) eines solchen Transkriptionsfaktors selbst.

Neben der transkriptionellen Regulation, d. h. Regulation der mRNA-Menge eines erfindungsgemäßen Gens in der Zelle, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutisch wirksame Verbindung auch in andere Kontrollprozesse der Zelle eingreifen, die bspw. die Expressionsrate eines erfindungsgemäßem Proteins beeinflussen können (z. B. Translation, Spleißvorgänge, native Derivatisierung von erfindungsgemäßem Genprodukt, bspw. Phosphorylierungen, oder Regulation der Degradation von erfindungsgemäßem Genprodukt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktionspartnern von erfindungsgemäßen Polypeptiden aus der ee3-Familie, also insbesondere der Proteine ee3_1, ee3_2 oder ee35 bzw. deren nativ auftretenden Varianten (Isoformen, Allele, Spleißformen, Fragmente). Auf diese Weise können als Interaktionspartner Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Zelluläre Interaktionspartner von Proteinen der

erfindungsgemäßen ee3-Proteinklasse können z. B. andere GPCRs oder Ionenkanäle sein.

Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide, erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen und/oder erfindungsgemäßer Nukleinsäurekonstrukte zur Durchführung derartiger Verfahren wird vorzugsweise mit Hilfe einer"Yeast-two-hybrid"- Durchmusterung (y2h-"Screens") allein oder in Kombination mit anderen biochemischen Verfahren durchgeführt (Fields and Song, 1989, Nature, 340,245-6). Derartige Screens finden sich auch bei Van Aelst et al. (1993, Proc Natl Acad Sci U S A, 90,6213-7) und Vojtek et al. (1993, Cell, 74,205-14) beschrieben. Typischerweise können anstelle von Hefesystemen auch Säugetiersysteme zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, bspw. wie bei Luo et al. (1997, Biotechniques, 22,350-2) beschrieben. Die entsprechenden vorgenannten experimentellen Ansätze werden dabei typische Eigenschaften der Klasse der GPCR-Proteine nutzen, bspw. die Signaltransduktion, z. B. über G-Proteine, also bspw. auch die bekannten intrazellulären Interaktionspartner.

Für einen y2h-Screen wird das offene Leseraster von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere von Sequenzen mit den Nummern 1 bis 4, oder einer nativen Variante, ganz besonders bevorzugt intrazelluläre Bereiche von erfindungsgemäßen Sequenzen, bspw. ee3-1 oder ee3-2, bspw. in einen sog. bait-Vektor"in-frame"mit der GAL4- Bindungsdomäne kloniert (z. B. pGBT10 oder pGBKT7, Fa.

Clontech). Damit kann vorzugsweise eine sog."prey-library"

in einem Hefestamm nach gängigem Protokoll auf interagierende Proteine durchsucht werden. Darüber hinaus können mit y2h-Systemen auch sog. Mapping-Experimente durchgeführt werden, um spezifische Interaktionsdomänen zu identifizieren.

Gleichwertig bevorzugt sind auch two-hybrid-Systeme, die andere Fusionspartner oder andere Zellsysteme benutzen, z. B. das BacterioMatchsystem der Fa. Stratagene, oder das CytoTrapsystem der Fa. Stratagene. Erfindungsgemäß können alternativ zu den y2h-Verfahren auch entsprechende Systeme von Säugetierzellen verwendet werden, wie bspw. bei Luo et al. (1997, Biotechniques, 22,350-2) als Bestandteil der vorliegenden Offenbarung beschrieben.

Erfindungsgemäß können Interaktionspartner auch über Co- Immunpräzipitationen aus mit erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfizierten Zellen isoliert werden, um daran bindende Proteine aufzureinigen, und über Proteinsequenzierungsmethoden (z. B. MALDI-TOF, ESI-tandem- MALDI) nachfolgend die dazugehörigen Gene zu identifizieren.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des yeast-two-hybrid-Systems oder entsprechender im Stand der Technik bekannter Verfahren oder anderer biochemischer Verfahren zur Identifizierung von Interaktionsdomänen von erfindungsgemäßen ee3-Proteinen bzw. nativ auftretender Varianten derselben und die Verwendung dieser Interaktionsdomänen (Fragmente der nativen Sequenzen) zur pharmako-therapeutischen Intervention.

Weitere erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von endogenen oder surrogaten Liganden, also nicht-nativen Verbindungen mit Bindungseigenschaften an die erfindungsgemäßen Rezeptoren der ee3 Familie, können mit Hilfe von Assays mit folgendem Ausgangsmaterial durchgeführt werden : (a) Gewebsextrakte verschiedenster Art und Zellkultur-Überstände verschiedenster Zellen, die auch mit Substanzen wie Erythropoetin vorbehandelt sein können, können eingesetzt werden. Die Extrakte werden dann fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wiederum im Assay eingesetzt bis der Ligand isoliert ist. (b) Es wird eine kommerziell erworbene Substanzbank eingesetzt, z. B. LOPAC von Sigma, die potentielle Liganden für Orphan-Rezeptoren enthält, insbesondere (Neuro) transmitter, bioaktive Peptide, Hormone, Chemokine, und sonstige natürlich vorkommende Substanzen, die an 7TM-Rezeptoren nach dem Stand der Technik binden könnten und daher auch Bindungsfähigkeit an die erfindungsgemäßen Rezeptoren der ee3-Familie besitzen könnten. (c) Es wird eine kombinatorische Peptidbibliothek eingesetzt. Oder (d) : Es wird eine käuflich erwerbbare Substanzbibliothek der unterschiedlichsten Zusammensetzung eingesetzt.

Die Hochregulation von bspw. ex3_1 durch EPO zeigt, daß bspw. ex3_1 mit dem Überleben von Zellen in Zusammenhang steht, da EPO neuroprotektive Wirkungen hat. Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere nativ auftretende Formen oder aber auch nicht-native, artifiziell erzeugte Varianten, deren biologische Funktion untersucht werden soll, können daher erfindungsgemäß in einem Apoptoseassay verwendet werden bzw. in einem Verfahren zur

Untersuchung der Funktion und/oder Wirksamkeit erfindungsgemäßer Polypeptide bei Induktion, Transduktion oder Inhibition von Zelltodsignalen oder anderen zellphysiologischen Prozessen zum Einsatz kommen. Die Beteiligung von erfindungsgemäßen Proteinen der ee3-Familie oder vorgenannten erfindungsgemäßen Varianten an bspw.- apoptotischen Kaskaden kann untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit erfindungsgemäßen ee3-Sequenzen, insbesondere Sequenzen mit den Nummern 1 bis 4, oder Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden (weswegen auch deren Verwendung für derartige Untersuchungen offenbart wird), und danach die Induktion von Apoptose untersucht werden kann. Dies kann z. B. durch Anfärbung mit Annexin geschehen (Fa. Roche Diagnostics), durch Antikörper, die die aktive Form von Caspase-3 erkennen (Fa. New England Biolabs), oder durch ELISAs, die DNA-Histon-Bruchstücke erkennen (cell-death elisa, Roche Diagnostics). Diese Induktion von Apoptose ist ggf. zelltyp-spezifisch, weswegen erfindungsgemäß vorzugsweise mehrere Zelllinien und primäre Zellen untersucht werden. Die Induktion von Apoptose kann ggf. auch Stimulus-spezifisch sein. Daher werden in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere Streß- Situationen zugrundegelegt, z. B. Hitzeschock, Hypoxiebedingungen, Cytokinbehandlungen (z. B. IL-1, IL-6, TNF-alpha) oder H202-Behandlung. Als typische Zelltypen für ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren kommen gebräuchliche Zellinien, z. B. Cos-Zellen, HEK-Zellen, PC12- Zellen, THP-1-Zellen, oder primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder erfindungsgemäßer Genprodukte zur Durchführung eines Proliferationsassays bzw. derartige Verfahren unter Verwendung der vorgenannten erfindungsgemäßen Gegenstände. In analoger Weise wie zuvor für Apoptoseassays kann bspw. die Beteiligung von ee3- Sequenzen, insbesondere ex3 1 oder ee32, sowie nativer oder nicht nativer Varianten derselben beim Wachstum von Zellen, beim Durchlauf des Zellzyklus oder bei tumorigener Transformation untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit erfindungsgemäßen ee3- Polynukleotiden, bspw. ex3_1 oder ee32, oder entsprechender Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden und danach bspw. die Induktion von Tumorigenizität untersucht wird, z. B. mit Hilfe eines Soft-Agar-Tests (Housey, et al., 1988, Adv Exp Med Biol, 234,127-40). Als bevorzugte Zelltypen kommen gebräuchliche Linien, z. B. Cos-Zellen, HEK- Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, und primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.

Insbesondere kann mit Hilfe eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens die Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte am ras-Signalübertragungsweg und die Wechselwirkung erfindungsgemäßer Genprodukte mit anderen Komponenten des ras-Signalübertragungswegs, insbesondere in Hinblick auf proliferative Prozesse, untersucht werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10

als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen. Insbesondere in Hinblick auf die biologische Funktion von erfindungsgemäßem Protein bei der Signaltransduktion von apoptotischen und/oder nekrotischen Signalen kann auf diese Weise in Wirtszellen der Zelltod gezielt ausgelöst werden. Vorzugsweise wird hierbei die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. eines erfindungsgemäßen Proteins so ausgestaltet sein, daß das Suizidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird. Insbesondere kann nach Transplantation von Patienten-Zellen ex vivo oder in vivo im Rahmen einer Gentherapie gezielt die transfizierte Zelle ausgeschaltet werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß erfindungsgemäß eine eine neue Familie von membranständigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) im Säugetiersystem identifiziert wurde, die sich von den den aus dem Stand der Technik bekannten Familien deutlich abgrenzen läßt. Die erfindungsgemäße Identifizierung einer neuen Proteinklasse und der zugrundeliegenden DNA-Sequenzen erfolgte aufgrund einer differentiellen Regulation derselben im zentralen Nervensystem und erlauben die Aufklärung und Charakterisierung einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse.

Die Identifizierung gelang erfindungsgemäß durch die EPO- induzierte (auf direkte oder indirekte Weise) transkriptionelle Hochregulation des erfindungsgemäßen

Proteins eue3-1. Dies bedeutet, daß bspw. Agonisten und Antagonisten von ex3_1 Wirkungen von EPO verstärken, ersetzen oder unerwünschte Wirkungen antagonisieren können.

Möglicherweise sind bestimmte Wirkungen von EPO selektiv zu beeinflussen, z. B. eine neuroprotektive Wirkung (z. B bei neurodegenerativen Erkrankungen), oder eine Hirnleistungssteigerung, (z. B bei Demenzen).

Das vorgestellte Gen ist ein neues 7-Transmembran-Protein bei Maus und Mensch, die v. a. im Gehirn exprimiert wird. Es handelt sich um einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor.

Eine Homologiesuche in der EMBL Sequenzdatenbank ergab eine entfernte Ähnlichkeit zu GPCRs der Familie A, insbesondere Peptidrezeptoren.

Darüber hinaus wird ex3_1 nicht oder nur eingeschränkt durch folgende neurologische Krankheitsmodelle reguliert : Kindling (Hippocampus, seizure stage 5,2 h post seizure), Kortikaler Schlaganfall (Cortex, 2.5 h occlusion und 2 und 6h Reperfusion), globale Ischämie in Ratten (Gesamthirn, 3 und 6 h post Ischämie). Dies zeigt eine hohe Spezifität der Regulation durch EPO, im Gegensatz z. B. zu"immediate early"-Genen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert :

Fig. la zeigt eine Darstellung der Transkriptionsanalyse im Gehirn von Epo-Mäusen. Die Graphik stellt die Daten eines DNA-Array-Hybridisierungsexperimentes dar. Aufgetragen ist das Signal bei den EPO-transgenen Tieren (y-Achse) gegenüber dem Signal bei Wildtyp-Mäusen (x-Achse). Bei dem Signal handelt es sich um ein Fluoreszenzsignal (relativ). Die Punkte oberhalb der Diagonalen repräsentieren hochregulierte Genprodukte im Gehirn von EPO-transgenen Tieren. Oberhalb der Diagonale 2 (2-fache Überexpression im transgenen Tier gegenüber dem WT sind acht positive Signale zu beobachten.

Fig. lb stellt die Ergebnisse von Microarray-Experimenten dar. Es handelt sich um eine Auftragung des Induktionsfaktors (rel. ) von Mäuse-eel im Gehirn von EPO- transgenen Mäusen (rechts) in Relation zur Induktion im Gehirn von WT-Tieren, und zwar als gemittelte Induktionswerte aus 2 unabhängigen Hybridisierungsexperimen- ten. Ein Induktionsfaktor von 1 entspricht der Konzentration im Gehirn der Littermate-Kontrolltiere. Die Expression einer erfindungsgemäßen Sequenz erreicht fast den vierfachen Wert.

Fig. 2 zeigt die Resultate von Experimenten mit Mäusen, die zur Verifikation der erhöhten Induktion von erfindungsgemäßem ex3_1 im EPO-transgenen Tier und des ebenfalls im EPO-transgenen Tier hochregulierten Genproduktes alpha-Globin herangezogen wurden, und zwar mit Hilfe der quantitativen PCR (LightCycler). Die Daten repräsentieren gepoolte RNA-Proben aus 6 Hirnen (transgen (tg) oder Wildtyp (wt)). Auf der y-Achse ist die relative Induktion aufgetragen. Gegenüber der Kontrollmessung (rel.

Induktion =1) ergibt sich für die erfindungsgemäße Sequenz eine 11-fache Erhöhung der Induktion.

Figur 3 gibt die Expression von erfindungsgemäßem ex3 1 in der Maus (LightCycler) während der Entwicklung (Embryo nach 7,11, 15 und 17 Tagen) und in verschiedenen adulten Geweben wieder (Gehirn, Herz, Leber, Niere, Lunge, Skelettmuskel, Milz und Testis). Aufgetragen auf der y-Achse ist die relative Abundanz von ee3 Transkripten. Im Ergebnis zeigt sich eine relativ ubiquitäre Expression von ex3 1 in allen Stadien der murinen Embryonalentwicklung und in allen untersuchten Geweben. ee32 wird in der Maus nach EST-Daten in embryonalem Carcinom, Niere, Leber, B-Zellen, Lunge, Mamma und Uterus exprimiert.

Figur 4 zeigt die Expression von erfindungsgemäßem humanem ee3_1, ee3_2, und ee3c5 im Menschen in adulten Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse). Daten stammen aus quantitativen PCR- Experimenten (LightCycler). Die Auftragung auf der y-Achse entspricht jener in Figur 3. Es zeigt sich eine nahezu ubiquitäre und parallele Expression von Genen der erfindungsgemäßen ee3-Familie in den untersuchten Geweben. Besonders auffällig ist die stark erhöhte Expression der ee3-Familie in der Nieren und der Bauchspeicheldrüse, während die Expression in Hirn und im Skelettmuskel geringer ausfällt. Die Expression von ex3 1 und ee32 stimmt weitgehend überein, so daß ggf. von einer redundanten Funktion dieser beiden erfindungsgemäßen Proteine auszugehen ist.

Beim Menschen finden sich ESTs mit ex3_1 Sequenzen in folgenden Organen : Gehirn, Auge, Keimzellen, Herz, Niere, Lunge, Placenta, Prostata, Gesamtembryo, Nebenniere, Mamma, Colon, Magen, Hoden. Dies lässt auf eine relativ breite Expression schliessen. Es finden sich ESTs von ee32 beim Menschen in Gehirn, Colon, Herz, Niere, Lunge, Pancreas, Parathyroidea, Prostata, Testis, Uterus, Blase, Mamma, Haut.

Figur 5 stellt das Ergebnis eines Northern-Blots dar, der die Expression von erfindungsgemäßem humanem ex3 1 in verschiedenen humanen Tumorzellinien dar. Zur Hybridisierung auf dem Northern-Blot (Fa. Clontech) wurde eine Maussonde eingesetzt, die den ORF von humanem ee3_1 umfaßt. Es zeigt sich eine ubiquitäre Expression eines erfindungsgemäßen humanen ee3-1-RNA-Transkriptes.

Figur 6 stellt die Expression von ee3 1 in verschiedenen Hirnarealen (Ratte). Auch hier gibt es eine ubiquitäre Verteilung in verschiedenen Hirnarealen, etwas stärker in Cerebellum und Rückenmark. Benutzte Sonde : Maus eue3 1.

Darunter abgebildet ist das Bild des Ethidiumbromid- gefärbten Gels als Ladekontrolle.

Figur 7 zeigt ein Modell der Proteintopologie von ee3_1_m anhand von Strukturvorhersagen unter besonderer Berücksichtigung der Transmembrandomänen (TM-Domänen). Es zeigt sich eine typische Topologie der GPCR-Proteine mit 7 TM-Domänen (horizontal nebeneinander dargestellt, einem kurzen extrazellulären N-Terminus (oberhalb von TM-Domäne 1 liegend) und einem intrazellulären C-Terminus (Unterhalb von

TM-Domäne 7 abgebildet). Hydrophobe Aminosäuren sind grün gekennzeichnet.

Fig. 8 zeigt ein"Alignment" (Sequenzvergleich) von erfindungsgemäßem Proteinen ee3_1 ("human pro"), ee32 und einem Proteinfragment von ee3 5 mit verschiedenen aus dem Stand der Technik vorbekannten GPCR-Proteinen (bspw. dc32bio, ccr5-human oder dop21_human), und Konsensusmotiven der nach dem Stand der Technik bekannten GPCR-Familien A, B, und C (in Figur 8 als cons fam A, cons fam B)."Pfam" bedeutet"protein family"und beschreibt eine Gruppe von Konsensusmotifen, die sich aus dem"Clustering"von Proteinen ergeben. Die aufgeführten Motive sind aus den pfam-Datenbanken entnommen. Es wird deutlich, daß die erfindungsgemäße Familie der ee3-Proteine die stärkste Ähnlichkeit zu den GPCR-Proteinen der Familie A hat.

Besonders charakteristisch für die erfindungsgemäße Proteinfamilie gegenüber vorbekannten GPCR-Proteinen sind die (nachfolgende AS-Numerierung entspricht jener von Figur 8) folgenden Sequenzabschnitte für humanes ex3 1 und ee32 : AS 75-85, AS 129-135 (insbesondere Glycin und Serin an Positionen 129 bzw. 132, Glycin an Position 174, AS 193-200 (insbesondere Glycin an Position 198), AS an den Positionen 260 und 261, AS an Position 308 (Cys), AS 334-340, AS an Position 539 (His), AS an Position 608 (His), AS an Position 611 (Asp), und schließlich der gesamte C-terminale Sequenzabschnitt ab Position 637 (insbesondere mit dem sauren Motiv zwischen den Positionen 640 und 655, dem basischen Motiv zwischen 666 und 670 und dem prolinreichen Motiv zwischen Position 680 und 685).

Fig. 9A stellt unter der Bezeichnung ee3_cl (ee3_1) eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz der Maus (Sequenz 1) dar, die den translatierten Bereich umfaßt (Lesart bei allen dargestellten Sequenzen : durchlaufend von links nach rechts und von oben nach unten, also mit Fortsetzung nach dem Zeilenende an der nächstunteren Zeile, links). Das Start- und das Stopcodon auf diesem Sequenzbereich sind durch Fettdruck hervorgehoben. Figur 9B enthält eine weitere erfindungsgemäße Sequenz, die einen Unterbereich (im 3' nicht-translatierten Bereich) der Sequenz gemäß Figur 9A darstellt.

Fig. 10 stellt unter der Bezeichnung ee32 eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz der Maus (Sequenz 2) dar, die auch den translatierten Bereich umfaßt Das Start-und das Stopcodon auf diesem Sequenzbereich sind durch Fettdruck hervorgehoben.

Fig. 11A stellt unter der Bezeichnung ex3_1 eine erfindungsgemäße humane DNA-Sequenz (Sequenz 3) dar, die auch den translatierten Bereich umfaßt. Das Start-und das Stopcodon auf diesem Sequenzbereich sind durch Fettdruck hervorgehoben. Darüber hinaus ist das putative Polyadenylierungssignal durch Fettdruck und Unterstreichung hervorgehoben. Figuren 11B und 11C stellen alternative C- terminal Spleißformen dar, die für ein C-terminal trunkiertes erfindungsgemäßes Protein kodieren. Neben den in beiden Figuren im Fettdruck hervorgehobenen Start-und Stopcodons ist in Figur 11B außerdem die Konsensussequenz der Spleißstelle hervorgehoben.

Figur 12 stellt unter der Bezeichnung ee32 eine erfindungsgemäße humane DNA-Sequenz (Sequenz 4) dar, die auch den translatierten Bereich umfaßt. Das Start-und das Stopcodon auf diesem Sequenzbereich sind durch Fettdruck hervorgehoben (ATG bzw. TAA). Darüber hinaus ist das putative Polyadenylierungssignal im Fettdruck hervorgehoben.- Die untere Sequenz in Figur 12 setzt den ersten Sequenzteil fort (überlappender Bereich des ersten bzw. zweiten Teils im Kursivdruck).

Figur 13 stellt eine erfindungsgemäße murine AS-Sequenz unter der Bezeichnung ee3_1 dar (Sequenz 5), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 9) Figur 14 stellt eine erfindungsgemäße murine AS-Sequenz unter der Bezeichnung ee3_2 dar (Sequenz 6), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 10) Figur 15A stellt eine erfindungsgemäße humane AS-Sequenz unter der Bezeichnung ex3 1 dar (Sequenz 7), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 11A). Figur 15B stellt eine erfindungsgemäße humane AS-Sequenz unter der Bezeichnung ee3_lb_h dar (Sequenz 7b), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 11B). Figur 15C stellt eine erfindungsgemäße humane AS- Sequenz unter der Bezeichnung ee3_1c_h dar (Sequenz 7c), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 11C). Die Sequenzen

gemäß Figuren 15B und 15C sind die AS-Sequenzen alternativer Spleißprodukte der gemäß Fig. 11A dargestellten DNA-Sequenz.

Figur 16 stellt eine erfindungsgemäße humane AS-Sequenz unter der Bezeichnung ee3_2 dar (Sequenz 8), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende- DNA-Sequenz gemäß Figur 12).

Figur 17 bildet unter der Bezeichnung ee3_5 eine erfindungsgemäße humane cDNA-Sequenz (Sequenz 10) ab, die auch den translatierten Bereich umfaßt. Das Start-und das Stopcodon (ATG bzw. TAA) auf diesem Sequenzbereich sind durch Fettdruck hervorgehoben.

Figur 18 stellt eine erfindungsgemäße humane AS-Sequenz unter der Bezeichnung ex3_5 dar (Sequenz 11), und zwar durchlaufend vom N-zum C-Terminus (s. auch zugrundeliegende DNA-Sequenz gemäß Figur 19).

Figur 19 zeigt das Ergebnis einer quantitativen PCR für ex3_1 im Gehirn von Mäusen, die intraperitoneal mit 5000 U Erythropoetin (EPO) /kg Körpergewicht behandelt wurden, und 6 oder 24 Stunden danach perfundiert und untersucht wurden. si-6-1, si-24-1 : Kochsalz-injizierte Tiere nach 6 bzw. 24 Stunden. ei-6-1, ei-6-2 EPO-injizierte Tiere nach 6 Stunden ; ei-24-1, ei-24-2 : EPO-injizierte Tiere nach 24 Stunden. Es zeigt sich eine erhöhte ee3 RNA-Expression, die im Zeitverlauf ansteigt. Die Werte der EPO-behandelten Tiere sind statistisch signifikant von denen der Kochsalz- behandelten verschieden (ANOVA gefolgt von Newman-Keuls post hoc Test).

Figur 20 zeigt die Abbildung einer in situ Hybridisierung auf einen horizontalen Schnitt durch ein Mäusegehirn. Mit der eingesetzten radioaktiv markierten Sonde (ee31. 3as AACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCATAGATGAGG) konnte die Expression von ee3_1 im Cerebellum (ce), Hippocampus (hc), Gyrus Dentatus (dg) und im Cortex (co), insbesondere im entorhinalen Cortex (ent), im Bulbus olfactorius (olf) sichtbar gemacht werden. Eine entsprechende sense Kontrolle (ee31. 3s, CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTT ) ergab kein spezifisches Signal (nicht gezeigt).

Figur 21 veranschaulicht die Herstellung eines C-terminalen polyklonalen Antiserums gegen das ex3_1 Protein (Mensch). a : Auswahl eines Peptidepitops am Carboxyterminus mit hohem Antigenizitätspotential (CLHHEDNEETEETPVPEP). b : Immunoblot, der den spezifischen Nachweis von ex3_1 in transient transfizierten HEK293 Zellen zeigt. Aufgetragen wurden jeweils gleiche Lysatmengen aus HEK293 Zellen, die mit dem Konstrukt Exp. ee3-1-h-Nter-myc transfiziert wurden, was zur Produktion von ex3 1 Protein mit-N-terminal fusioniertem myc-tag führte. Spurl : Nachweis des ex3 1 Proteins mit N- terminal fusioniertem myc-tag über einen myc-spezifischen Antikörper (Firma Upstate Biotechnology (vertrieben über Biomol Feinchemikalien GmbH), eingesetzt in einer Verdünnung von 1 : 2000). Spur 2-8 : Nachweis von ex3 1 mit verschiedenen Verdünnungen des ee3 1-spezifischen Antiserums AS4163 (1 : 500 - 1 : 12000). Das Antiserum detektiert spezifisch und hochsensitiv die ee3_1-spezifische Bande (ca. 35 kDa). Spur 9 : Das entsprechende Präimmunserum (PIS) detektiert in einer Verdünnung von 1 : 500 keine Bande.

Figur 22 zeigt die immunhistochemische Detektion von ex3 1 in verschiedenen Geweben mittels des Antiserums AS4163. A : Spezifische Anfärbung von Neuronen des Layers V im somatosensorischen Cortex. B : Vergrösserung von A. C : Neurone im entorhinalen Cortex. D : Expression von ex3_1 im Gyrus dentatus und in der CA3 Region des Hippocampus, E, Vergrösserung der CA3 Region des Hippocampus. F : Grenze der Expression von ee3_1 im Hippocampus zwischen CA3 und CA2. G : Cerebellum, spezifische immunhistochemische Färbung in der Purkinjezellschicht und in Kleinhirnkernen. H : Purkinjezellen im Kleinhirn. I : Bulbus olfactorius. J : Vergrösserung, Anfärbung der grossen Mitralzellen. K : Retina, Anfärbung der Ganglienzellen und der Sinneszellen der Retina. L : Vergrösserung von K. Anfärbung der Sinneszellen der Retina. M : Expression von ee3_1 in den grossen Motoneuronen des Vorderhorns im Rückenmark. N : Expression von ee3 1 im motorischen Kern des Ncl. trigeminus. 0 : Anfärbung der Substantia nigra, pars reticulata. P : Vergrösserung von Q. Substantia nigra. Q : ex3_1 wird extraneural in der Lunge exprimiert. Anfärbung basaler Zellen in den Bronchioli. Anfärbung der Arteriolen, keine Färbung der Venolen. R : Darstellung der typischen pulmonalen Trias Bronchus, Arterie und Vene. S : Vergrösserung der Bronchioli. Expression in spezifischen, noch nicht näher definierten basalen Zellen. T : Vergrösserung mit Arteriolenwand (links oben) und Brochioluswand (rechts unten). U : Darstellung einer Arteriole im Verlauf. Anfärbung des Endothels und einzelner glatter Muskelzellen in der Gefässwand. V : Arteriole im Querschnitt mit immunhistochemischer Färbung glatter

Muskelzellen und einzelner Endothelzellen. W : Dünndarm mit Krypten-und Zottenstruktur. Anfärbung basaler Kryptenanteile durch den Antikörper gegen eue3-1. In den Zotten sind einzelne vegetative Nerven angefärbt. X : Vergrösserung von W. Y : Darstellung von Nervenfasern in der Dünndarmwand, die zum darmeigenen vegetativen Plexus myentericus gehören. Z : Querschnitt eines peripheren Nerven im subkutanen Fett-/Bindegewebe. AA : Herzmuskel mit spezifisch angefärbten Nervenfasern. BB : Quergestreifte Muskulatur (Skelettmuskel). Die immunhistochemische Färbung in der Bildmitte ist gut vereinbar mit einer motorischen Endplatte. Im Perimysium einzelne periphere Nervenfasern (rechts unten).

Figur 23 zeigt die Gegenüberstellung einer immunhistochemischen Färbung von ex3 1 im Rückenmark einer Wildtyp-Maus (oberer Bildteil) und einer Maus, die transgen Erythropoetin überexprimiert [ (tg6) unterer Bildteil]. Bei gleichen Färbebedingungen findet sich ein deutlich stärkeres Signal in den transgenen Mäusen. Dieser Befund liess sich an je zwei weiteren Mäusen verifizieren.

Figur 24 zeigt eine Doppelimmunfluoreszenz für ee3_1 und maplb in der Maus. Diese beiden Proteine wurden als Interaktionspartner in einem y2h System detektiert. Es findet sich eine erstaunliche Übereinstimmung der Lokalisation der beiden Proteine im ZNS. Grün : ex3 1 Färbung ; Rot : Maplb Färbung ; Gelb : elektronische

Überlagerung beider Signale. Gezeigt sind Beispiele aus dem Rückenmark (spinal cord ; sc) und aus dem Cerebellum (cb).

Figur 25 zeigt immunhistochemische Färbungen aus einer Mausmutante für das maplb Gen (Meixner, et al. (2000), J Cell Biol, 151,1169-78.). Es zeigt sich, daß in den maplb homozygoten ko Tieren nur noch Spuren von ex3 1 nachzuweisen sind. a : : Hippocampus, b : Cortex, c : Cerebellum Figur 26 zeigt eine PCR auf ex3 1 in adulten neuralen Stammzellen (nsc) aus dem Rattenhippocampus. Es lässt sich kein Signal in der Negativspur (N) nachweisen. ex3_1 wird von diesen neuralen Stammzellen exprimiert.

Figur 27 zeigt das Proteinalignment für ee3 Proteine aus verschiedenen Spezies unter Berücksichtigung der Sequenzen aus X. laevis und D. rerio.

Die vorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert :

Ausführungsbeispiel 1 Identifizierung und Molekulare Klonierung von ee3 1_m und Homologen (a) Identifizierung von ee3 1 m Das Gehirn transgener Erythropoietin-überexprimierender Mäuse wurde in Narkose nach transkardialer Perfusion entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. RNA wurde nach der Methode von Chomczynski und Sacchi (Anal Biochem (1987), 162, 156-9) gewonnen.

Hybridisierungsexperimente von 2 transgenen und 2 Littermate-Kontrollen auf einem Maus-cDNA-Array ("Chip") wurden nach der Vorgehensweise von Incyte (s. http : //www. incyte. com/reagents/lifearray/lifearray service. s html) durchgeführt. Hierbei wird eine kompetitive Hybridisierung mit Hilfe zweier unterschiedlich markierter Proben (mit Cy5 und Cy3 markiert) durchgeführt. Das Hybridisierungsexperiment ergab eine Reihe von hochregulierten Sequenzen. Insbesondere wurde der EST-Klon AA185432 identifiziert, der in einem Wiederholungsexperiment ebenfalls in den Epo-transgenen Mäusen hochreguliert war.

Der relative Induktionsfaktor betrug +3,9 0,1 gegenüber den nicht-trangenen Littermates (Fig. 1). Diese Hochregulation wurde mit Hilfe einer quantitativen PCR mit dem Lightcyclersystem bestätigt (Fig. 2, Vorwärts-Primer : 5'-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3', Rückwärts-Primer : 5'- ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3').

(b) Klonierung von ee3-Sequenzen Die identifizierte EST-Sequenz konnte mit Hilfe von BLASTN- Suchen in EST-Datenbanken verlängert werden. Auf diese Weise wurde eine weitere homologe Sequenz der Maus, ee32m, identifiziert. Durch Benutzung von Homologiesuchen unter Einsatz entsprechender Programme (BLAST, TBLASTN) konnten in EST-und genomischen Datenbanken (ensembl) humane Homologe identifiziert werden.

Zur Bestätigung der erhaltenen Sequenzen wurden Durchmusterungen ("screens") mit Hilfe des PCR- Klonierungsverfahrens von Shepard (Shepard AR, Rae JL (1997) Magnetic bead capture of cDNAs from double-stranded plasmid cDNA libraries. Nucleic Acids Res 25 : 3183-3185) durchgeführt, und zwar in Maus-und humanen Sequenzbanken.

Die vorgenannte Veröffentlichung und der dort zitierte Stand der Technik ist vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung für die vorliegende Erfindung. Dieses Verfahren beruht auf Hybridisierung von cDNA-Molekülen aus einer Plasmid- Bibliothek an eine Biotin-gekoppelte Oligonukleotidsequenz, nachfolgende Extraktion der Plasmide mit Hilfe von Streptavidin-gekoppelten magnetischen Perlen ("beads"), Kontrolle des Ergebnisses mittels diagnostischer PCR, und zweimaliger Wiederholung der Schritte nach Retransformation der erhaltenen Plasmidselektion, bis zur Erhaltung der Einzelklone. Folgende Primer-Kombinationen wurden verwendet : (1) Oligonukleotide, mit denen die volle Länge des Genabschnitts kloniert wurde : Für eeth :

(2) Darüber hinaus wurde der kodierende Bereich der ee3- Sequenzen in GATEWAY (tm) kompatible Vektoren einkloniert, um funktionelle Analysen durchführen zu können. Folgende Oligonukleotide wurden hierfür verwendet :

(c) Herstellung der humanen cDNA-Bibliothek Mit dem cDNA-Synthese Kit der Fa. Stratagene (Amsterdam, Niederlande) wurden ausgehend von 2 pg humaner fötaler Gehirn-mRNA (Fa. Clontech, Heidelberg, Deutschland) und von 5 pg mRNA aus adultem Mausgehirn entsprechende cDNA- Bibliotheken hergestellt. Dabei wurde im wesentlichen entsprechend der Angaben des Herstellers verfahren. Zur Synthese der Erststrang cDNA wurde nach den Herstellerangaben ein oligodT-Primer verwendet. Die klonierungs-kompatiblen (EcoRI/XhoI) doppel-strängigen cDNA Fragmente wurden größenselektioniert (nach Herstellerangaben/Fa. Stratagene) und in den Plasmidvektor

pBluescript SKII (Stratagene) ligiert. Die Ligation wurde durch Elektroporation in E. coli (DH1OB, Gibco) transformiert und auf LB-Ampizillin Agar-Platten amplifiziert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Ionenaustauscher-Chromatographie isoliert (QIAfilter-Kit, Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland).

Die Komplexität an Einzelklonen betrug für die fötale humane Gehirn-cDNA-Bank 4 Millionen. Von jeder cDNA-Bank wurden nach dem Zufallsprinzip 24 Einzelklone nach Insertgrößen analysiert, die eine Größenverteilung von 800 bp bis zu 4.5 kB zeigten, die durchschnittliche Länge der cDNA-Inserts betrug für die humane Bank ca. 1,2 kB.

Ausführungsbeispiel 2 Regulation von ee3 1 durch Erythropoetin (EPO) ex3_1 wurde als hochreguliertes Genprodukt in Gehirnen von Epo-transgenen Mäusen identifiziert (Maus-Linien tg6 und tg21).

Die für die erfindungsgemäßen Experimente eingesetzten Mäuse wurden zuvor mehrmals hinsichtlich ihrer Konstitution charakterisiert (Ruschitzka, et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 97,11609-13. ; Wagner, et al., 2001, Blood, 97, 536-42. ; Wiessner, et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21,857-64.). Die Mäuse wurden mit einem transgenen Konstrukt nach dem bei Hergersberg (Hergersberg et al., Hum.

Mol. Genet. 4,359-366) beschriebenen Verfahren hergestellt.

Diese Konstrukt bestand aus einem PDGF Promotor und der

kodierenden Sequenz für Erythropoetin. Dabei entstanden mehrere transgene Linien, von denen vorliegend tg6 und tg21 untersucht wurden. Nur tg6 wies eine systemisch erhöhte EPO- Expression auf, was durch Serumuntersuchungen nach der Methode von Ruschitzka, et al. (2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 97,11609-13) belegt wurde. Die Linie tg21 wies keine erhöhten sytemischen EPO-Level aus. In Analogie zu den Ergebnissen von Sasahara, et al. (1991, Cell, 64,217-27.) kann davon ausgegangen werden, daß das verwendete PDGF- Promotorfragment eine Expression des transgenen EPO vor allem in neuronalen Zellen bewirkt.

Bei den Mäusen der Linie tg6 führt die erhöhte systemische Expression von EPO zu einer deutlichen Steigerung der Erythropoese mit der Folge einer Polyglobulie bis zu einem Hämatokrit von 0.8 und einem deutlich gesteigerten Blutvolumen (bis 4.0 ml) (Wagner, et al., 2001, Blood, 97, 536-42. ). Die Linie tg21 weist demgegenüber keine starken phänotypischen Auffälligkeiten auf.

Die RNA-Produkte bspw. des Gens ex3 1 wurden im Gehirn von Mäusen, die transgen Erythropoietin (Linien tg6 und tg21 (Ruschitzka, et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 11609-13., Wagner, et al., 2001, Blood, 97,536-42., Wiessner, et al., 2001, J Cereb Blood Flow Metab, 21,857- 64.)) überexprimieren, verstärkt exprimiert, und wurden durch ein DNA-Array-Experiment identifiziert. Die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der transkriptionellen EE3_1-Regulation durch die Überexpression von EPO wurde durch das Auffinden eines anderen regulierten Genproduktes, nämlich alpha-Globin, belegt. Dieses wurde

ebenfalls mit Hilfe einer Transkriptionsanalyse mit Microarrays in beiden transgenen Linien reguliert gefunden.

Dies konnte mit Hilfe des Lightcyclersystems belegt werden (Fig. 2). Die Erhöhung zeigte sich v. a. in hippokampalen Arealen (in situ Hybridisierung).

Ausführungsbeispiel 3 Expression erfindungsgemäßer Sequenzen in Säugetierzellen und Herstellung stabiler Zellinien Das offene Leseraster der Gene der ee3-Familie wurde in einen gängigen eukaryotischen Expressionsvektor aus der pcDNA-Reihe von Clontech (Heidelberg, Deutschland), kloniert. Mit den so entstehenden Expressionsplasmiden wurden humane embryonale Nierenzellen (HEK293) insbesondere nach der Calciumphosphat-Methode, CHO-Zellen und CHO-dhfr-- Zellen mittels Lipofectamin oder COS-Zellen mittels DEAE- Dextran-Kügelchen transfiziert und mit 400-500 mg/ml G418 selektioniert. Drei Wochen nach der Selektion wurden individuelle Klone gepickt und zur weiteren Analyse expandiert. Etwa 30 Klone wurden durch Northern-Blot-und Western-Blot-Verfahren analysiert. Zur Selektion von transfizierten CHO-dhfr--Zellen in Nukleotid-freiem Medium wurde das offene Leseraster der Gene der ee3-Familie in einen eukaryotischen Expressionsvektor mit dem Dihydrofolatreduktase-Gen als Selektionsmarker kloniert und das entstehende Expressionsplasmid zur Transfektion eingesetzt. Derart transfizierte CHO-dhfr~Zellen, aber auch andere derart transfizierte Zellen können mit zunehmenden Konzentrationen an Methotrexat behandelt werden und wurden

derart behandelt, wodurch Zellen selektioniert wurden, die erhöhte Mengen and Dihydrofolatreduktase und somit auch erhöhte Rezeptormengen exprimieren.

Ausführungsbeispiel 4 Yeast-2-hybrid-Experiment mit einem carboxyterminalen Abschnitt von ee3 1 Im yeast-2-hybrid-System wurde zur Identifizierung potentieller Interaktionspartner der carboxyterminale Teil von erfindungsgemäßem ex3_1 in den"bait"-Vektor pGBKT7 (Clontech) kloniert.

Die benutzte Proteinsequenz war : KGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLHHEDNEETEETPVPEPPKIAPMFRK KARWITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD, Die korrespondierende Nukleinsäuresequenz war : Die Suche nach Interaktionspartnern wurde mit einer humanen Gehirnbibliothek durchgeführt, und zwar nach dem Fachmann geläufigen Standardverfahren (Mating Verfahren, Fa.

Clontech). Dabei wurden 2 Klone (Klon 11 und 36) erhalten, die überlappende Sequenzen enthielten.

Die Sequenz im identifizierten Rlon 11 lautete : Das interagierende Genprodukt konnte als RANBPM oder RANBP9 identifiziert werden (Nishitani H, Hirose E, Uchimura Y, Nakamura M, Umeda M, Nishii K, Mori N, Nishimoto T (2001) Full-sized RanBPM cDNA encodes a protein possessing a long stretch of proline and glutamine within the N-terminal region, comprising a large protein complex. Gene 272 : 25-33).

Ebenso konnten zwei weitere interagierende Proteine identifiziert werden, nämlich Mapla und Maplb.

Interessanterweise wurde bei beiden Proteinen der carboxyterminale Teil als interagierend identifiziert. Darin findet sich ein homologer Bereich in beiden Proteinen.

Gezeigt ist ein Alignment von Mapla und Maplb in diesem Bereich, wobei die obere Sequenz Mapla und die untere Maplb darstellt : ALIGN calculates a global alignment of two sequences version 2. 0uPlease cite : Myers and Miller, CABIOS (1989) 4 : 11-17 Sequence 1 212 aa vs.

Sequence 2 177 aa scoring matrix : BLOSUM50, gap penalties :-12/-2 43. 6% identity ; Global alignment score : 614 10 20 30 40 50 /tmp/f KEKVQGRVGRRAPGKAKPASPARRLDLRGKRSPTPGKGPADRASRAPPRP--RSTTSQVT Sequen ---------------------------------------KKESVEKAAKPTTTPEVKAAR GEEK 10 20 60 70 80 90 100 110 /tmp/f PAEEKDGHSPMSKGLVNGLKAGPMALSSKGSS----GAPVYVDLAYIPNXCSGKTADLDF Sequen DKETKNAANASASKSAKTATAGPGTTKTTKSSAVPPGLPVYLDLCYIPNHSNSKNVDVEF 30 40 50 60 70 80 120 130 140 150 160 170 /tmp/f FRRVRASYYVVSGNDPANGXPSRAVLDALLEGKAQWGENLQVTLIPTHDTEVTREWYQQT Sequen FKRVRSSYYVVSGNDPAAEEPSRAVLDALLEGKAQWGSNMQVTLIPTHDSEVMREWYQET 90 100 110 120 130 140 180 190 200 210 /tmp/f HEQQQQLNVLVLASTXTVVMQDESFPACRLSSEKPPSL Sequen HEKQQDLNIMVLASSSTVVMQDESFPACKIEL------ 150 160 170 Ausführungsbeispiel 5 Humane homologe Sequenzen von ee3 1/ee3 2 (a) auf Chromosom 5q33.1 Mit Hilfe von Tblastn wurde eine weitere homologe Sequenz auf Contig AC11406.00015 ermittelt : >AC011406. 00015 Length : 40,820 Minus Strand HSPs : Score = 389 (136.9 bits), Expect = 1. 3e-41, Sum P (3) = 1.3e-41 Identities = 72/303 (71%), Positives = 78/303 (77%), Frame =-1 Query : 224 LLTFEILLVHKLDGHNAFSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLL 283 LLTFE+LLVH+LDG N FSCI I VPLWL L+TLM TTF K GNHWWFGIR+DFCQFLL Sbjct : 14312 LLTFEVLLVHRLDGRNTFSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLL 14253 Query : 284 EIFPFLREYGNISYDLHHEDNXXXXXXXXXXXXKIAPMFRK 324 EIFPFLREYGNISYDLH ED+ KIAP+F K Sbjct : 14252 EIFPFLREYGNISYDLHQEDSEGAEETLVPEAPKIAPVFGK 14010

Score = 86 (30.3 bits), Expect = 1.3e-41, Sum P (3) = 1.3e-41 Identities = 15/51 (88%), Positives = 16/51 (94%), Frame =-3 Query : 334 PGKYVLPPPKLNIEMPD 350 PGKYV PPPKLNI+MPD Sbjct : 13992 PGKYVPPPPKLNIDMPD 13942 Score = 67 (23.6 bits), Expect = 1.3e-41, Sum P (3) = 1.3e-41 Identities = 12/57 (63%), Positives = 17/57 (89%), Frame =-2 Query : 206 QRRTHITMALSWMT-IWP 223 Q RTH+TMA+SW+T ++VP Sbjct : 14368 Q*RTHVTMAISWITTVIVP 14312 Die entsprechende cDNA konnte erhalten werden, allerdings ergibt die Translation nur ein carboxyterminales Bruchstück, das homolog zu den ee3 Proteinen ist.

Der Sequenzvergleich mit ee3_1_m sieht folgendermaßen aus : ALIGN calculates a global alignment of two sequences version 2. 0uPlease cite : Myers and Miller, CABIOS (1989) 4 : 11-17 Sequence 1 350 aa vs.

Sequence 2 148 aa scoring matrix : BLOSUM50, gap penalties :-12/-2 29. 4% identity ; Global alignment score : 649 10 20 30 40 50 60 /tmp/f MNLRGLFQDFNPSKFLIYACLLLFSVLLALRLDGIIQWSYWAVFAPIWLWKLMVIVGASV Sequen------------------------------------------------------ ------ 70 80 90 100 110 120 /tmp/f GTGVWARNPQYRAEGETCVEFKAMLIAVGIHLLLLMFEVLVCDRIERGSHFWLLVFMPLF Sequen------------------------------------------------------ ------ 130 140 150 160 170 180 /tmp/f FVSPVSVAACVWGFRHDRSLELEILCSVNILQFIFIALRLDKIIHWPWLWCVPLWILMS Sequen-----------------------_______________________________ ______ 190 200 210 220 230 240 /tmp/f FLCLWLYYIVWSVLFLRSMDVIAEQRRTHITMALSWMTIWPLLTFEILLVHKLDGHNA Sequen----------------MRTTRAV-KNTRDH-GHQLD-NDCHRALLTFEVLLVHR LDGRNT 10 20 30 40 250 260 270 280 290 300 /tmp/f FSCIPIFVPLWLSLITLMATTFGQKGGNHWWFGIRKDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH

Sequen FSCISISVPLWLLLLTLMTTTFRPKRGNHWWFGIRRDFCQFLLEIFPFLREYGNISYDLH 50 60 70 80 90 100 310 320 330 340 350 /tmp/f HEDSEETEETPVPEPPKIAPMFRKKARWITQSPGKYVLPPPKLNIEMPD Sequen QEDSEGAEETLVPEAPKIAPVF-GKTRVVLI--PGKYVPPPPKLNIDMPD 110 120 130 140 Die Generierung nur eines GPCR-Bruchstückes ist sicher, da die erhaltenen cDNA Sequenzen völlig mit genomischen Daten übereinstimmen, und die Präsenz eines in-frame Stopcodons vor dem ATG zeigen (siehe Sequenz) : Minus Strand HSPs : Score = 6976 (1046.7 bits), Expect = 0.0, Sum P (2) = 0.0 Identities = 1396/1397 (100%), Positives = 1396/1397 (100%), Strand = Minus/ Plus Query : 2499 AGGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 2440 ! !) mmmmmm) mmmmmmmHmm) m) m Sbjct : 13048 AAGTTTAGACCTTAAAATAATACCTGATTGTTGGCCACTTCTGGTTAAGGCCACTCTCTC 13107 Query : 2439 CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 2380 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII) Sbjct : 13108 CAGCTTTCCAGTGACAGGTAATGCTTTACATTACAACCAACTAATATTCTAAGATTCTTA 13167 Query : 2379 GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 2320 Illllllillllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct : 13168 GAAATGGACAAACCACTTGTTGCTTATTTTGATTGTTTCTGGACAGTTACTACCTGTGTG 13227 Query : 2319 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 2260 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13228 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 13287 Sbjct : 13228 GAAAAATTCAGGGTGCTAAACAACAGTGTCACTTTATGGCCTGGTACTACACTAGAGCAT 13287 Query : 2259 GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 2200 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Query : 13288 GTCACAAGTTCGCAAGGGCGGTGGCTGCTCCCTCTACTAACGGATACTACCAGAGACCTT 13347 Query : 2199 CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 2140 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Query : 13348 CACACAGTGCAGACCTCGGTTACTAACACCTAAATATTAACACCCATGGGATTTGCAGTC 13407 Query : 2139 CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACCAGGCACATATTGTTTTATGCAA 2080 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct : 13408 CCTATGTTCATGTCTAGTACTTGGGTAAGCTCCACACQGGCACATATTGTTTTATGCAA 13467 Query : 2079 TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 2020 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13468 TCTTTAAAGACATCTGCAATAGACAATATGCAGTTTAAACAAACTGTGAGGTTTATAAAC 13527 Query : 2019 AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 1960 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13528 AGAGAATTCTTTACGTTTGCTATTATGTCATAACAGGCACAATCTGAAATACAATTTTGT 13587

Query : 1959 ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 1900 IIIIIIIIIIIIilllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll Sbjct : 13588 ACTAGCAGTGTATAAAAATACTTTTAAACGATACTTTCGATAGGTACAGTAGCACTTTAA 13647 Query : 1899 AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAAAACAGTTCAACTTACTGCC 1840 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13648 AGAAAACCACTGTGTAGTTATTCCTTTTGAGGACCTACTAAAACAGTTCAACTTACTGCC 13707 Query : 1839 CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 1780 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13708 CCCAGCTACATCTAAAGCACGAATGTGGAAAGCAAGTTCTCTTACCCAGGTACACACCAC 13767 Query : 1779 ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 1720 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13768 ACACACCCACATGCTGAAACAGTCTCCATTTATGATGCATGCTGATGAGGCATCAATCTC 13827 Query : 1719 AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 1660 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13828 AAACAGGGTATGAGATGACAGTGTTTGGTGCCTGTTTCCATTTCCAGGTTTGGTATGAAT 13887 Query : 1659 GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 1600 Illlllllllllllllillllllllllllllllllllllllllllllllillllllllll Sbjct : 13888 GAACAAGAGGCAAAGGCAAGGTGGAGTCTGTGTATGGGCCCTCTCTAGGAGTTTAATCTG 13947 Query : 1599 GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 1540 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 13948 GCATATCAATATTTAACTTGGGAGGTGGGGGAACATATTTCCCAGGGATTAAAACTACCT 14007 Query : 1539 GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 1480 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 14008 GGTCTTCCCAAACACTGGAGCAATTTTCGGAGCTTCTGGAACCAATGTTTCTTCAGCACC 14067 Query : 1479 TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 1420 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 14068 TTCGCTATCTTCCTGATGGAGATCATATGAAATGTTCCCATATTCTCTTAAAAATGGGAA 14127 Query : 1419 AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACCAAACCACCAATGATTGCCCCT 1360 Illllllllllllllllllllllllllllillllllllllllllllllllllllllllll Sbjct : 14128 AATTTCAAGCAGAAACTGGCAGAAGTCTCTGCGAATACCAAACCACCAATGATTGCCCCT 14187 Query : 1359 TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 1300 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 14188 TTTTGGCCTAAATGTTGTGGTCATTAAAGTTAGTAACAAAAGCCAAAGGGGGACAGATAT 14247 Query : 1299 GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT 1240 Illllllllllllllllllllllllllllllllllllllillllllllllllllllllll Sbjct : 14248 GGAGATACAGGAGAATGTATTGCGGCCATCCAGTCTGTGAACCAGCAGGACTTCAAAGGT 14307 Query : 1239 GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 1180 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 14308 GAGCAGGGCACGATGACAGTCGTTATCCAGCTGATGGCCATGGTCACGTGTGTTCTTCAC 14367 Query : 1179 TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 1120 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct : 14368 TGCCCTGGTAGTTCTCATTTGTTCTTTTTCTAGTTTCTTAAGGTAGAAGCTGATGTCATT 14427 Query : 1119 GATTCAAAACCTTTCTT 1103 11111111111111111 Sbjct : 14428 GATTCAAAACCTTTCTT 14444

(b) auf Chromosom 8q11. 22 Es findet sich eine weitere homologe Sequenz auf Ensembl Contig Ac034174.

Die Proteinsequenz eines homologen Nukleotidabschnittes lautet : (c) auf Chromosom 3p25.3 Es findet sich eine homologeSequenz auf Chromosom 3 : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CCACCTTGGGCACCTTGGTGTCTTTCAAAAGTGCCAGGCTCCTTCCTGCCTCAGGGCCTT TGCACTTGCTGCTCCCTCCG<BR> <BR> <BR> TTTGAAATACTGTATCCCAGAGAGTCCCATTTCTGGCTCCTAATTCAGACTGA (d) auf Chromosom Xp21.1 : >AC027722.00010 Length : 3,576 Minus Strand HSPs : Score = 65 (22.9 bits), Expect = 4. 1e+02, Sum P (2) = 1.0 Identities = 11/90 (37%), Positives = 19/90 (63%), Frame =-1 Query : 159 RLDKIIHWPWLWCVPLWI-LMSFLCLWL 187 R+ ++W L C+P+W+ +SF CL+ L Sbjct : 1848 RIMSSLNWDSLTSCLPIWMTFISFSCLIAL 1759 Score = 57 (20.1 bits), Expect = 4. 1e+02, Sum P (2) = 1.0 Identities = 16/147 (33%), Positives = 24/147 (49%), Frame =-2 Query : 88 VGIHLLLLMFEVLVCDRIERG-SH-FWLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF 134 +G L++ F V D++ G H FW L +PLF VS C + + Sbjct : 2507 IGCCFLIVCFVCFVEDQMYVGLQHYFWALYSVPLFCVSVFVPVPCSFSY 2361 Entsprechende Nukleotidsequenzen zu diesen Homologieabschnitten lauten :

ATCATGTCATCTCTAAACTGGGATAGTTTGACTTCCTGTCTTCCTATTTGGATGACTTTT ATTTCTTTCTCTTGCCTGAT TGCTCTGG Und <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> ATAGGGTGTTGTTTCCTCATTGTTTGTTTTGTCTGCTTTGTGGAAGATCAGATGTATGTA GGTTTGCAGCATTATTTCTG<BR> <BR> GGCTCTCTATTCTGTTCCTTTGTTCTGTGTGTCTGTGTTTGTACCAGTACCATGTTCTTT TAGTTACT Allerdings fehlt die Konsensussequenz DRI.

(d) Alternative Spleißprodukte ee3 1b h und ee3 lc h Es findet sich ein alternatives Spliceprodukt zum humanen Genprodukt ee3_1_h, nämlich ee3lbh (s. Fig. 11B, Seqenznummer 3B). Dieses resultiert aus einer Konsensus- Spleiß-Donorsite im Exon 3, und führt zu einem geänderten offenen Leseraster ("open reading frame") mit geändertem Carboxyterminus, und früherem Translationsstop. Es resultiert daraus ein Protein (166 Aminosäuren, Molgew. : 19,2 kD), das nach der vierten TM-Domäne abbricht (s. Fig.

15B, Sequenznummer 7B). Darüber hinaus wurde ein weiteres alternatives Spleißprodukt identifiziert, nämlich ee3 1c h (s. Fig. 11C, Sequenznummer 3C) mit der dazu gehörigen Proteinsequenz gemäß Figur 15C (Sequenznummer 7C), die nach der zweiten TM-Domäne trunkiert ist. Die Spleißprodukte konnten im Zuge der Klonierungen und Sequenzierungen mit Hilfe des Klonierungsverfahrens von Shepard et al. (siehe Beispiel 1) identifiziert werden.

Eine Vorhersage der TM-Bereiche für ee3 lb h sieht folgendermaßen aus : STRONGLY prefered model : N-terminus outside 4 strong transmembrane helices, total score : 6315 # from to length score orientation

1 15 33 (19) 2066 o-i (o : outside, i : inside) 2 40 56 (17) 1143 i-o 3 83 102 (20) 1765 o-i 4 112 134 (23) 1341 i-o.

Dieses Spleißprodukt hat eine funktionelle Bedeutung bei der Regulation der Funktion der Vollängen-Rezeptoren, vgl. bspw.- V2-Vasopressin-Rezeptor (Zhu und Wess, 1998, Biochemistry, 37,15773-84 ; Schulz, et al., 2000, J Biol Chem, 275,2381- 9)). Da GPCR-Proteine Homo-oder Heterodimerisierungen unterliegen (Bouvier, 2001, Nat Rev Neurosci, 2,274-86.), können derartige trunkierter Formen erfindungsgemäßer Sequenzen eine dominant negative Rolle einnehmen.

Damit wird erfindungsgemäß insbesondere die Verwendung derartiger Spleißformen (bspw. als nackte DNA, in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, als erfindungsgemäße Proteinsequenz etc. ) erfindungsgemäßer ee3-Proteine sowie Varianten solcher Spleißformen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, wie vorliegend offenbart, offenbart. Ebenso umfaßt die Offenbarung auch deren Verwendung zur Untersuchung der pharmakologischer Beeinflußbarkeit von erfindungsgemäßen Rezeptoren der ee3-Familie.

Ausführungsbeispiel 6 Proteintopologiedaten von Proteinen der ee3-Familie Eine TM (Transmembran) -Suche mit dem Programm TMPred ergibt folgendes stark favorisiertes Modell :

(a) ee3_1 -----> STRONGLY prefered model : N-terminus outside 7 strong transmembrane helices, total score : 11863 # from to length score orientation 1 15 33 (19) 2066 o-i FLIYACLLLFSVLLALRLD 2 40 56 (17) 1143 i-o YWAVFAPIWLWKLMVIV 3 83 102 (20) 1765 o-i AMLIAVGIHLLLLMFEVLVC 4 112 134 (23) 1341 i-o WLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF 5 168 191 (24) 2978 o-i WLWCVPLWILMSFLCLWLYYIV 6 211 227 (17) 1070 i-o ITMALSWMTIWPLLTF 7 240 258 (19) 1500 o-i AFSCIPIFVPLWLSLITLM Abstände der Segmente zwischen den TM-Domänen beträgt 15,7, 27,10, 34,20, 13 AS, der intracelluläre Rest hat eine Länge von 92 AS.

(b) für ee32 ergibt sich ein identisches Bild : STRONGLY prefered model : N-terminus outside 7 strong transmembrane helices, total score : 12351 # from to length score orientation 1 15 36 (22) 1811 o-i 2 32 50 (19) 1219 i-o 3 83 102 (20) 1733 o-i 4 112 134 (23) 1330 i-o 5 168 191 (24) 3068 o-i 6 211 227 (17) 1239 i-o 7 243 260 (18) 1951 o-i Abstände der Segmente zwischen den TM-Domänen beträgt 15,0, 33,10, 34,20, 16 AS und der Rest hat eine Länge von 90 AS.

(c) Als Kontrollexperiment dient zum Vergleich die Topologie des CCR-5 Rezeptors (gehört ebenfalls zur Klasse der 7TM-Rezeptoren) aus dem Stand der Technik : 1 51 76 (26) 2895 o-i

2 89 108 (20) 1155 i-o 3 124 145 (22) 1163 o-i 4 163 187 (25) 1415 i-o 5 220 239 (20) 2183 o-i 6 260 281 (22) 1782 i-o 7 298 325 (28) 1325 o-i Die Abstände der Segmente zwischen den TM-Domänen betragen 51,13, 16,18, 33,21 und 17 AS, und der intrazelluläre Rest hat eine Länge von 46 AS.

Ein Vergleich der generellen Topologie (gezeigt ist die Anzahl der Aminosäuren in den jeweiligen nicht- transmembranen Anteilen der Proteine, d. h. N-Terminus und C- Terminus und die Loop-Anteile) der entfernt verwandten 7TM- Rezeptoren Bradykinin-2, CXCR5, Galaninrezeptor-2 und Anaphylotaxin C5a ergibt folgendes Bild im Vergleich zum erfindungsgemäßen ex3_1 : rezeptor n-terminus 1 2 3 4 5 6 rest C5a 39 12 14 22 28 16 20 45 BK-2 63 13 14 20 27 26 24 56 galanin2 28 10 17 19 24 25 1 105 cxcr-5 55 11 14 21 30 18 23 46 mw 43.3 11. 7 15.0 20.3 26.3 22.3 15. 0 63.0 ee31 15 7 27 10 34 20 13 92 Es findet sich eine deutliche Ähnlichkeit der generellen Topologie in diesen Proteinen.

Ausführungsbeispiel 7 Ermittlung von Motiven und Signalsequenzen bei ex3 1 Unter Verwendung des Programms Prosite : Matching pattern PS00001 ASNGLYCOSYLATION AS 294 : NISY Total matches : 1 Matching pattern PS00006 CK2PHOSPHOSITE AS 77 : TCVE Total matches : 1 Matching pattern PS00008 MYRISTYL AS 57 : GASVGT AS 263 : GQKGGN Total matches : 2 Damit befinden sich eine CK2-Phosphorylierungsstelle an Position 77, eine Asparagin-Glykosilierungsstelle an Position 294 und 2 Myristylierungsstellen an den Positionen 57 und 263 (durchgezählte Numerierung gemäß Figur 7). Es findet sich keine typische Phosphorylierungsstelle im Carboxyterminus.

Ausführungsbeispiel 8 Induktion von ee3 durch eine einmalige Gabe von Erythropoetin Wie in Fig. 19 gezeigt wurde, wird ex3 1 in der Ratte durch eine einmalige intraperitoneale Injektion von Erythropoetin (Erypo, Janssen ; 5000 U/kg Körpergewicht) auf transkriptioneller Ebene induziert. 6 und 24 h nach Injektion von Erythropoetin wurde die Ratte durch Injektion von Rompun/Ketanest terminal betäubt, und das Gehirn schonend entnommen. Kontrollratten wurden mit Kochsalz

behandelt. Zur Messung der ee3-1-Boten-RNA in der Ratte wurde die semiquantitative RT-PCR auf dem LightCycler (Roche, Mannheim, Germany) eingesetzt. Die Quantifizierung erfolgte durch den Vergleich der relativen Fluoreszenz der Probe mit einer Standardkurve für Cyclophilin.

Gesamt-RNA wurde aus Rattenvorderhirn (ohne Cerebellum und Bulbus olfactorius) isoliert mit der Methode von Chomczynski/Sacchi (saure Phenol-Extraktion) gefolgt von einer Aufreinigung mit dem RNeasy-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt und die Qualität der Gesamt-RNA über Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Die RNA wurde bis zum Gebrauch bei-80 °C aufbewahrt.

Nach reverser Transkription mit Superscript II (Invitrogen- Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurden die Reaktionsprodukte durch Real-time online PCR mittels der LightCycler-Technologie relativ quantifiziert. Dafür wurden Gesamt-RNA Proben aus dem Gehirn von drei Wildtyp-Mäusen und drei transgenen tg6-Mäusen eingesetzt. Die spezifischen Sequenzen der Oligonukleotid-Primer lauteten für Cyclophilin 5'ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-3' für den Vorwärts-und 5'CATTTGCCATGGACAAGATG-3' für den Rückwärts-Primer bei einer Bindungstemperatur von 60 OC und für Ratten ex3 1 : Vorwärts-Primer : 5'-GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3', Rück-wärts- Primer : 5'-ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3'.

Zur Quantifizierung wurden serielle cDNA-Verdünnungen von 1 : 3,1 : 9,1 : 27, 1 : 81 und 1 : 243 nach folgendem Schema amplifiziert : Initiale Denaturierung 5 min bei 94°C, Amplifizierung über 50 Zyklen bestehend aus 5 s Denaturierung bei 94°C, 10 s Bindung bei 55°C oder 60°C-je nach spezifischen Primer (s. o. )-und 30 s Extension bei 72°C. Am Ende jedes Zyklus wurde die Fluoreszenz jeder Probe bei 80°C für 10 s gemessen. Die Spezifität des Reaktionsproduktes wurde durch Agarose-Gelelektrophorese und Schmelzkurvenanalyse (nicht gezeigt) nachgewiesen. Jede PCR- Reaktion brachte genau ein Reaktionsprodukt hervor.

Für die Quantifizierung wurde die logarithmische Phase der PCR-Reaktion benutzt. Dabei wird eine Asymptote durch die entsprechende Kurve gelegt. Für Hämoglobin ergab sich ein nahezu paralleler Anstieg der Geradenschar, so daß die Steigungen dieser Kurven zum Vergleich mit den Standardkurven für Cyclophilin herangezogen werden konnten.

Mittelwerte i Standardabweichung wurden für jede cDNA- Verdünnung aus dem normalisierten PCR-Produkt bestimmt. Die so erhaltenen quantitativen Unterschiede entsprechen relativen Veränderungen der RNA-Expression in transgenen und Wildtyp-Tieren. Alle Reaktionen führten zu einem einzigen Reaktionsprodukt. Der mittlere Induktionsfaktor betrug für ee3 nach 6 Stunden 1,35, und nach 24 h 1,44-fach.

Ausführungsbeispiel 9 Verteilung von ee3_1 RNA im Gehirn

Mittels in-situ-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Oligosonde wurde die Lokalisation des Transkriptes von ee3_1 bei der Maus untersucht. Dazu wurden 15 pm dicke Gehirnschnitte mit einem Kryostat bei-20° geschnitten, auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger aufgezogen und in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7. 4)- fixiert. Das Oligonukleotid wurde mittels Terminaler Transferase (Roche Diagnostics, Mannheim) mit a-35S-dATP radioaktiv markiert. Markierung wie anschließende Hybridisierung erfolgten nach einem Protokoll von Wisden & Morris (In situ-Hybridization Protocols for the brain, Academic Press 1994).

Mit der eingesetzten radioaktiv markierten Sonde (ee31. 3as AACGAAGGGCCAGTAGCACAGAGAACAGCAGCAGACAGGCATAGATGAGG) konnte die Expression von ee3_1 im Cerebellum (ce), Hippocampus (hc), Gyrus Dentatus (dg) und im Cortex (co), insbesondere im entorhinalen Cortex (ent), im Bulbus olfactorius (olf) sichtbar gemacht werden. Eine entsprechende sense-Kontrolle (ee31. 3s, CCTCATCTATGCCTGTCTGCTGCTGTTCTCTGTGCTACTGGCCCTTCGTT ) ergab kein spezifisches Signal (nicht gezeigt) (Fig. 20).

Ausführungsbeispiel 10 Immunohistochemische Darstellung der ex3 1 Verteilung in Mausgewebe Paraffin-eingebettetes Gewebe wurde geschnitten (2 um), auf vorbehandelte Objektträger (DAKO, Glostrup, Denmark) aufgezogen, über Nacht luftgetrocknet, und anschliessend deparaffiniert (Xylol und absteigende Alkoholreihe). Nach

Mikrowellenbehandlung in Zitratpuffer bei 500W für 10 min wurden die Schnitte mit Anti-ee3 1-serum (AS4163) in einer Verdünnung von 1 : 500 für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Immunreaktion wurde durch ABC Technik mit DAB als Chromogen entsprechend den Angaben des Herstellers (DAKO, Glostrup, Denmark) sichtbar gemacht.- Negativkontrollen beinhalteten gleichermassen behandelte Schnitte, bei denen jedoch der Erstantikörper weggelassen wurde sowie Schnitte, bei denen statt des ersten Antikörpers das entsprechende Präimmunserum verwendet wurde.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen sind in Fig. 22 dargestellt. Insgesamt zeigt sich eine weitgehend neuronenspezifische Lokalisation von ee3, mit Ausnahme einiger Strukturen in Darm und Lunge. Häufig wird ee3 von Neuronen exprimiert, die integrative Aufgaben haben (die grossen Pyramidenzellen der corticalen Schicht (Layer) V, Mitralzellen im Bulbus olfactorius, Purkinjezellen im Kleinhirn). Die Bilder A-C zeigen kortikale Lokalisationen von ee3 im Layer V, mit deutlicher Anfärbung der Neuronenfortsätze. Im entorhinalen Kortex ist eine intensivere Immunfärbung zu sehen (C). Aus physiologischer Sicht gehen vom entorhinalen Cortex Informationen zum Hippocampus und tragen zu Lernen und Gedächtnis bei.

Alterationen des entorhinalen Cortex werden häufig bei Patienten mit Schlaganfall, Alzheimerscher Erkrankung oder nach Schädel-Hirn-Trauma gefunden. Durch Störungen des entorhinalen Cortex können Verhaltensänderungen auftreten, die mangelnde Verarbeitung sensorischer Eindrücke und Lernschwächen einschließen. (Davis et. A1, Nurs Res 50 (2)

77-85 (2001)). Die Bilder D-F zeigen das hippocampale Verteilungsmuster von ee3. Dabei ist die scharfe Grenze zwischen der Expression im CA3 Sektor, und der fehlenden Expression in den Sektoren CA2 und CA1 auffällig. Neurone der CA1-Region und in geringerem Ausmaß auch der CA4-Region sind besonders anfällig für den nekrose-und entzündungsfreien physiologischen Zelltod (Apoptose), insbesondere dann wenn eine allgemeine zentralnervöse Schädigung besteht (z. B. (Hara, et al., Stroke, 31,236-8, (2000)). Im Gegensatz dazu scheint der Gyrus dentatus eher von einer nekrotischen Schädigung betroffen zu sein. Der Gyrus dentatus wird mit Neuronenneubildung nach pathologischen Stimuli in Verbindung gebracht (Takagi, et al., Brain Res, 831,283-7, (1999)) (Parent, et al., J Neurosci, 17,3727-38, (1997)). In Gebieten nicht neokortikaler Genese findet sich ee3 ebenfalls : Im Kleinhirn in den Purkinjezellen (G, H), die dort als integrierende Neurone wirken, und im Bulbus olfactorius in den Mitralzellen (I, J). Eine intensive Expression von ee3 findet sich in den Ganglienzellen und in den Sinneszellen der Retina (K, L).

Kürzlich wurde die neuroprotektive Wirkung von Erythropoetin in der Retina gezeigt (Junk et al., Erythropoietin administration protects retinal neurons from acute ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A.

2002 Aug 6 ; 99 (16) : 10659-64. ; Grimm et al., HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light- induced retinal degeneration. Nat Med. 2002 Jul ; 8 (7) : 718- 24. ) Diese Befunde legen nahe, daß ein Zusammenhang zwischen EPO-Induktion und ee3-Expression besteht. EE3 ist

ebenfalls stark in Neuronen exprimiert, die dem motorischen System angehören. So findet sich im Rückenmark eine spezifische Expression in den grossen Motoneuronen des Vorderhorns (Fig. 22 M) und in den funktionell gleichwertigen Neuronen des motorischen Kerns des Nucleus trigeminus (Fig.. 22 N).

Diese Verteilung von ee3 im Rückenmark kann möglicherweise zur therapeutischen und diagnostischen Intervention bei Amyotropher Lateralsklerose ausgenutzt werden. Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS ; Lou-Gehrig's disease ; Charcot'sche Erkrankung) ist eine neurodegenerative Erkrankung mit einer jährlichen Inzidenz von 0.4 bis 1.76 pro 100.000 (Adams et al., Principles of neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). Es ist die häufigste Form der Motoneuronerkrankungen mit typischen Manifestationen wie generalisierten Faszikulationen, progressiver Atrophie and Schwäche der Skelettmuskulatur, Spastizität und positiven Pyramidenbahnzeichen, Dysarthrie, Dysphagie, and Dyspnoe.

Die Pathologie besteht hauptsächlich im Verlust von Nervenzellen im Vorderhorn des Rückenmarks und in den Motorkernen des unteren Hirnstammes, kann aber auch die Motoneuronen erster Ordnung im Kortex betreffen. Die Pathogenese dieser Erkrankung ist grösstenteils unbekannt, obwohl die Rolle von Superoxiddismutasemutationen in familiären Fällen sehr gut herausghearbeitet wurde. Bis jetzt wurden über 90 Mutationen im SOD1 Protein beschrieben, die ALS auslösen können (Cleveland and Rothstein (2001), Nat Rev Neurosci, 2,806-19.). Auch Neurofilamente scheinen bei dieser Erkrankung eine Rolle zu spielen.

Exzitotoxizität, ein Mechanismus der durch einen Oberschuss

an Glutamat ausgelöst wird, ist ein weiterer pathogenetischer Faktor, was durch die Wirkung von Riluzol in humanen Patienten belegt werden kann. Aktivierung von Caspasen und Apoptose scheint die gemeinsame Endstrecke der Pathogenese der ALS zu sein (Ishigaki, et al. (2002), J Neurochem, 82,576-84., Li, et al. (2000), Science, 288,- 335-9. ). Die Lokalisation des ee3 Proteins auf den bei ALS betroffenen Neuronen zeigt eindeutig die potentielle therapeutisch-funktionell/diagnostische Anwendbarkeit von ee3 Agonisten oder-Antagonisten bei dieser Erkrankung.

Die Lokalisation von ee3 in der Substantia nigra des Mittelhirns (Fig. 22 O, P) eröffnet möglicherweise therapeutische und diagnostische Möglichkeiten beim Morbus Parkinson. Die Parkinsonsche Erkrankung ist die häufigste Bewegungserkrankung (movement disorder) mit ungefähr 1 Million Patienten in Nordamerika. Ca. 1% der Bevölkerung über 65 Jahre ist betroffen. Die Hauptsymptome sind Rigor, Tremor, Akinesie (Adams et al., Principles of neurology, 6th ed., New York, pp 1090-1095). Die Ursache der Erkrankung ist nicht bekannt. Trotzdem weisen Analysen von post mortem Gewebe und von Tiermodellen auf einen fortschreitenden Prozess von oxidativem Stress in der Substantia nigra hin, der die dopaminerge Neurodegeneration unterhalten könnte.

Oxidativer Stress, der durch die Neurotoxine wie 6- Hydroxydopamin und MPTP (N-Methyl-4-phenyl-1, 2,3, 6- tetrahydropyridin) hervorgerufen werden kann, wird in Tiermodellen benutzt, um den Vorgang der Neurodegeneration zu untersuchen. Obwohl eine symptomatische Therapie existiert (e. g. L-DOPA plus einen Decarboxylase Inhibitor ; Bromocriptin, Pergolid als Dopamin Agonisten und

anticholinerge Substanzen wie Trihexyphenidyl (Artane)), gibt es klaren Bedarf für eine kausale, d. h. neuroprotektive Therapie, die den Krankheitsprozess aufhalten kann. Apoptotische Mechanismen sind eindeutig an der Pathogenese im Tiermodell wie im Menschen beteiligt (Mochizuki, et al.

(2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 98,10918-23, Xu et al. (2002), Nat. Med., 8,600-6, Viswanath, et al. (2001), J. Neurosci., 21,9519-28, Hartmann, et al. (2002), Neurology, 58,308-10).

Die Lokalisationvon ee3 im Nervensystem ist in hohem Maße evident für einen Zusammenhang zwischen der Expression dieses Proteins und neuronalem Zelltod, Neurogenese und neuraler Plastizität.

In der Lunge findet sich ee3 in distinkten Strukturen (Fig.

22 Q-V). Es finden sich basale Zellen in den termianlen Bronchioli, die ee3 exprimieren. Möglicherweise handelt es sich dabei um neuroendokrin aktive Zellen. Diese Lokalisation legt eine therapeutische Bedeutung für ee3 für Erkrankungen der Bronchien nahe. Ebenso gibt es eine Expression n den Endothelien und glatten Muskelzellen von Arteriolen (12 U, V). Dahingegen zeigen Venolen keine immunhistochemisch faßbare Expression von ee3 (Fig. 22 Q und R). Die Expression bestimmter Rezeptoren durch Endothelzellen ist von grosser pharmakologischer Bedeutung, da Therapeutika sofortigen Kontakt mit dieser Zellschicht im Blut haben. Wichtige kreislaufwirksame Medikamente greifen an den Arteriolen an, inbesondere dem Endothel oder der glatten Muskulatur. Deshalb ist ee3 ein sehr attraktives

Zielprotein zur Beeinflussung von Erkrankungen des Kreislaufs, z. B. dem arteriellen Hochdruck.

Im Darm findet sich ee3 basal in den Krypten (Fig. 22 W, X) und in Nervenzellen, die vermutlich zum darmeigenen Plexus gehören (Fig. 22 Y). In den meisten histologisch untersuchten Organen findet sich keine spezifische Anfärbung organspezifischer Zellen, sondern vielfach nur eine deutliche Anfärbung von Nerven (siehe z. B. im Herzmuskel Fig. 22 AA, oder im Bindegewebe Fig. 22 Z). Diese klare Lokalisation von ee3 auf Axonen prädisponiert das Molekül für die Diagnostik und Therapie von Erkrankungen der peripheren Nerven (Neuropathien), zu denen z. B. die weit verbreitete diabetische Polyneuropathie zählt. Ebenso könnten häufige erbliche Erkrankungen des peripheren Nervensystems, z. B. die HMSN Gruppe (hereditary motor- sensory neuropathies) davon profitieren.

Im Skelettmuskel schliesslich fand sich ein Expressionsmuster, das am ehesten mit der Lokalisation auf motorischen Endplatten zu vereinbaren ist (Fig. 22 BB). Dies ist potentiell interessant für Erkrankungen der motorischen Endplatte, z. B. der Myasthenia gravis.

Ausführungsbeispiel 11 ee3 wird auf Proteinebene in EPO-überexprimierenden Mäusen hochreguliert Durch die Immunhistochemie (Antiserum AS 4163) konnte auch klare Hochregulation des ee3 Proteins durch Erythropoetin gezeigt werden (Fig. 23). Parallel behandelte Schnitte aus

dem ZNS weisen klar verstärkte Signale für ee3 auf. Dies ließ sich an insgesamt je 3 Mäusen (Wildtyp und EPO überexprimierend (tg6)) zeigen, die jeweils geblindet gegenüber dem Genotyp gefärbt und beurteilt wurden.

Ausführungsbeispiel 12 Kolokalisierung von ee3 und maplb, und Abwesenheit von ee3 Expression in maplb defizienten Mäusen In einem yeast-two-hybrid Screen mit dem Carboxyterminus von ex3_1 wurden die leichten Ketten von Mapla und Maplb als interagierende Proteine identifiziert (siehe vorhergehende Beispiele, Ausführungsbeispiel 4). Figur 24 zeigt eine Doppelimmunfluoreszenz für ex3_1 und maplb in der Maus, und demonstriert die unerwartete Überlappung der Expression von ee3_1 und maplb in der Maus.

Für Doppelimmunfluoreszenzfärbungen wurden entparaffinierte Schnitte nach Mikrowellenbehandlung (Zitratpuffer, 500W, 10 min) simultan mit dem ex3_1 Antikörper aus Kaninchen (AS4163) und einem gegen map la gerichteten Antikörper aus Ziege (MAP-1B (C20) : sc-8971 ; Santa Cruz ; Santa Cruz, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach entsprechenden Waschschritten wurde mit einem Gemisch der sekundären Antikörper FITC anti-Kaninchen und TRITC anti-Ziege für 30 min inkubiert (beide Antikörper jeweils 1 : 30 verdünnt in PBS, bezogen von Dianova, Hamburg, Deutschland). Nach erneutem Waschen der Schnitte mit PBS wurden die Päparate mit Histosafe eingedeckelt und in einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX81, Olympus, Deutschland)

unter Verwendung entsprechender Barrierefilter analysiert.

Signalüberlagerungen wurden mit Hilfe der Software Analysis (soft imaging systems, Stuttgart, Deutschland) angefertigt.

In parallelen Fluoreszenz-Einzelfärbungen zeigte sich jeweils die Abwesenheit von Signal im anderen Kanal, was das Phänomen des"Überstrahlens"von Signalen in den jeweils anderen Kanal, z. B. durch Insuffizienz der Filter, ausschließt. Ebenso ergibt eine Doppelfärbung mit vertauschten Chromophoren für den Zweitantikörper dasselbe Bild (nicht gezeigt).

Figur 24 zeigt eine erstaunliche Übereinstimmung der Lokalisation der beiden Proteine im ZNS. Grün : ex3 1 Färbung ; Rot : Maplb Färbung ; Gelb : elektronische Überlagerung beider Signale. Gezeigt sind Beispiele aus dem Rückenmark (spinal cord ; sc) und aus dem Cerebellum (cb).

Maplb ist ein wichtiges neuronales Protein. Es ist eines der ersten microtubule associated proteins (maps), die während der Entwicklung des zentralen Nervensystems der Säuger exprimiert werden. Eine Beteiligung an der Axongenese in Neuronen ist wahrscheinlich (Gonzalez-Billault, et al.

(2001), Mol Biol Cell, 12,2087-98., Gonzalez-Billault, et al. (2002), Brain Res, 943, 56-67.). Eine funktionell wichtige Rolle von maplb für die Interaktion von Neuronen wird durch jüngste Studien gestützt, die zeigen, daß maplb in die Pathogenese des Fragilen X Syndroms involviert ist.

Dies ist die häufigste vererbbare Form von mentaler Retardierung. Die mRNA von maplb wird von FMRP, einem Protein, das direkt von der Fragile X mRNA reguliert wird, kontrolliert. In einer Arbeit in Drosophila wurde eine

zentrale Rolle für maplb (futsch in Drosophila) für die Ausprägung des Fragile-X analogen Phänotyps gefunden (Sohn (2001), Science, 294,1809., Zhang, et al. (2001), Cell, 107,591-603.). Ebenso bindet maplb an gigaxonin, ein Protein dessen mutiertes Gen für die rezessive erbliche Erkrankung Giant axonal neuropathy (GAN) verantwortlich ist (Ding, et al. (2002), J Cell Biol, 158,427-33.). Nach Läsion peripherer Nerven wird maplb verstärkt in den auswachsenden Neuronen myelinisierter Nerven induziert, und ist wahrscheinlich am axonalen Sprouting beteiligt (Soares, et al. (2002), Eur J Neurosci, 16,593-606.). Schliesslich lokalisiert maplb wahrscheinlich den GABA-C Rezeptor an seine synaptische Lokalisation (Pattnaik, et al. (2000), J Neurosci, 20,6789-96.).

Das Maplb Gen wurde in Mäusen genetisch inaktiviert (knock- out). Der beste verfügbare Knock-out ist die Maus die in Meixner et al. beschrieben ist (Meixner, Haverkamp, Wassle, Fuhrer, Thalhammer, Kropf, Bittner, Lassmann, Wiche and Propst (2000), J Cell Biol, 151,1169-78.). Mäuse mit homozygoter Inaktivierung des maplb Gens wurden immunhistochemisch auf ee3 Expression untersucht. Es zeigte sich eine sehr stark reduzierte Anfärbbarkeit von ex3 1 (Figur 25), was auf eine Abhängigkeit der ee3_1 Proteinexpression oder-stabilität von der Interaktion mit maplb hindeutet. Ein Inhibitor dieser Interaktion würde also eine deutlich verringerte Expression von ee3 zur Folge haben.

Ausführungsbeispiel 13 Herstellung eines Antiserums für den Nachweis von ex3 1 Die Proteinsequenz des humanen ex3_1 Proteins wurde mit dem Teilprogramm Protean des Programmpackets DNAStar (Lasergene) analysiert und entsprechend der Sekundärvorhersage sowie hoher vorhergesagter Oberflächenwahrscheinlichkeit und hoher Antigenizität das im intrazellulären C-Terminus gelegene Epitop LHHEDNEETEETPVPEP entsprechend den Aminosäuren 299- 315 ausgewählt. Diese Peptidsequenz wurde mit N-terminal angehängtem Cystein synthetisiert (CLHHEDNEETEETPVPEP) um eine kontrollierte spezifische Kopplung an das Trägerprotein KLH (keyhole limpet hemocyanine) zu ermöglichen. Mit dem Peptid-KLH-Konjugat wurden zwei Kaninchen nach einem optimierten Plan immunisiert. Die Peptidsynthese, die anschließende Kopplung an KLH sowie die Immunisierung von zwei Kaninchen wurden bei der Firma BioTrend Chemikalien GmbH in Auftrag gegeben. Vor der Erstimmunisierung wurde das Präimmunserum mehrerer Kaninchen in Western Blot Analysen von mock-transfizierten Zellen und Gehirnextrakten auf ihre Kreuzreaktivität getestet. Zwei Kaninchen mit vernachlässigbarem Hintergrund erhielten 3 Wochen nach der Erstimmunisierung den ersten und weitere 4 Wochen später den zweiten Boost. Eine Woche später wurden den Kaninchen 20 ml Blut entnommen und die Seren in Western Blot Analysen und immuncytochemischen Färbungen von transient transfizierten Zellen (HEK293, CHO-dhfr-) getestet. Nach dem 3. bzw. 4.

Boost wurden die Kaninchen ausgeblutet.

Die Seren beider Kaninchen waren positiv. Insbesondere das Antiserum AS4163 erkannte mit beiden Methoden sehr

spezifisch in verschiedenen Zellen transient exprimiertes humanes ex3_1 Protein und konnte in Western Blot Analysen bis zu einer Verdünnung von 1 : 12000 eingesetzt werden. Das Antiserum AS4163 eignet sich auch zur Immunpräzipitation von ex3 1 Protein und kann daher zur Präzipitation von ex3 1 und damit interagierender Proteine aus transfizierten Zellen oder nativem Gewebe verwendet werden. Insbesondere erkennt das Antiserum AS4163 das entsprechende Epitop in der ex3 1 Sequenz der Maus, das sich von der humanen Sequenz nur durch eine Aminosäure, nämlich die Mutation von N304 zu Serin unterscheidet. Das Antiserum AS4163 eignet sich daher sehr gut zur immunhistochemischen Analyse der ee3 1 Proteinexpression in Wildtyp, transgenen und knock-out Mäusen, wie Figuren 22-24 zeigen.

Ausführungsbeispiel 14 ee3 1 wird von neuralen Stammzellen exprimiert Neurale Stammzellen wurden aus dem Hippocampus von 4-6 Wochen alten männlichen Wistar Ratten isoliert wie vorbeschrieben (Ray et al., 1993). Die Protokolle genügen deutschem Recht. Die Tiere wurden mit 1 % (v/v) Isofluran, 70 % N20,29 % Sauerstoff betäubt und durch Dekapitation getötet. Die Hirne wurden präpariert und gewaschen in 50 mL eiskaltem Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) mit 4.5 g/L glucose (DPBS/Glc). Der Hippocampus wurde aus 6 Tieren herauspräpariert, gewaschen in 10 mL DPBS/Glc und 5 min lang zentrifugiert bei 1600 x g bei 4 °C. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Gewebe homogenisiert mit Schere und Skalpell. Die Gewebestücke wurden mit DPBS/Glc Medium

gewaschen, 5 min bei 800 g zentrifugiert, und das Pellet resuspendiert in 0.01 % (w/v) Papain, 0.1 % (w/v) Dispase II (neutrale Protease), 0.01 % (w/v) DNase I, and 12.4 mM Mangansulfat in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Das Gewebe wurde mit Pipettenspitzen trituriert, und 40 min bei Raumtemperatur inkubiert, unter gelegentlichem Mischen der Lösung (alle 10 min). Die Suspension wurde anschließend bei 800 x g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert, und das Pellet dreimal in 10 mL DMEM-Ham's F-12 Medium mit 2 mM L-Glutamin, 100 units/mL Penicillin und 100 units/mL Strepotomycin gewaschen. Danach wurden die Zellen in 1 mL Neurobasalmedium mit B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 mM L-Glutamin, 100 units/mL Penicillin und 100 units/mL Strepotomycin, 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, und 2 ug/mL Heparin resuspendiert. Die Zellen wurden unter sterilen Bedingungen in 6-well Platten in einer Konzentration von 25,000-100, 000 Zellen/mL ausgesät. Die Platten wurden bei 37 °C in 5 % C02 inkubiert. Zellkulturmedium wurde einmal in der Woche gewechselt, wobei ungefähr nur 2/3 des Mediums ausgetauscht wurden. (Ref : Ray J, Peterson DA, Schinstine M, Gage FH (1993) Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 90 : 3602-6.).

RNA wurde nach Standardprotokollen (RNeasy kit, Qiagen) aus hippocampalen Stammzellen isoliert, die 3 Wochen in Kultur gehalten wurden, nachdem sie aus gefrorenen Stocks aufgetaut waren. cDNA wurde unter Benutzung von oligodT Primern und Superscript II Reverser Transcriptase (Gibco) nach Standardprotokollen synthetisiert. PCR wurde mit den folgenden Reaktionsparametern durchgeführt : Denaturierung 94

°C 10 min, 30 Zyklen zu 94 °C 30 s, 55 °C 50 s, 72 °C 60 s ; 72 °C 5 min 4 °C mit folgenden Primerpaaren : ee3_plus 5'- GGTGTGGGAGAAATGGCTTA-3'und ee3minus 5'- ATACCAGCAGAGCCTGGAGA-3'.

Während der letzten Jahre wurde die Bedeutung der Neubildung von Nervenzellen (Neurogenese) im Verlauf neurologischer Erkrankungen erkannt. Im Gegensatz zu vielen anderen Geweben hat das reife Gehirn begrenzte regenerative Kapazitäten, und der ungewöhnlich hohe Grad an zellulärer Spezialisierung schränkt die Möglichkeiten ein, durch gesundes verbleibendes Gewebe die Funktion des zerstörten Gewebes zu übernehmen.

Nervenzellen die aus Vorläuferzellen im erwachsenen Gehirn entstehen haben jedoch prinzipiell das Potential, solche Funktionen zu übernehmen.

Neurogenese kommt in diskreten Regionen des erwachsenen Hirns vor, (die rostrale subventricular Zone (SVZ) der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) im Gyrus dentatus (DG). Es wurde von vielen Gruppen gezeigt, daß Neurogenese insbesondere durch neurologische Schädigungen induziert wird (z. B.. cerebral ischemia (Jin, et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98,4710-5, Jiang, et al.

(2001), Stroke, 32,1201-7, Kee, et al. (2001), Exp. Brain.

Res., 136,313-20, Perfilieva, et al. (2001), J. Cereb.

Blood Flow Metab., 21, 211-7)). Neurogenese kommt auch beim Menschen vor (Eriksson, et al. (1998), Nat Med, 4,1313-7.

), und führt tatsächlich zu funktionellen Neuronen (van Praag, et al. (2002), Nature, 415,1030-4). Insbesondere die Subgranularzone des Gyrus dentatus und der Hilus haben das Potential neue Neuronen während des Erwachsenenlebens zu

generieren (Gage, et al. (1998), J Neurobiol, 36,249-66). Es ist auffällig, daß ee3 auf neuronalen Stammzellen aus dem Hippokampus zu detektieren ist (Fig. 25). Dies impliziert eine wichtige Bedeutung von ee3 für die Neurogenese. Diese Bedeutung in der Neurogenese bedeutet einen weiteren Beweis für die Nützlichkeit von ee3 für generell alle neurodegenerativen Erkrankungen.

Im Gegensatz zur Wirkung auf endogene Stammzellen im Hirn können Therapeutika, die mit ee3 interferieren für die in vitro Manipulation von Stammzellen (z. B. in vitro Differenzierung und Proliferation). Stammzellen werden im Moment für ihre Verwendbarkeit in einer Anzahl neurodegenerativer Erkrankungen exploriert, insbesondere die Parkinsonsche Erkrankung und Schlaganfall. Es ist z. B. wünschenswert, Zellen in vitro für die Transplantation bei Parkinson-Patienten zu differenzieren, und damit nach Injektion das dopaminerge Defizit auszugleichen ("replacement therapy") (Arenas (2002), Brain Res. Bull, 57, 795-808, Barker (2002), Mov. Disord., 17, 233-41). Eine andere Möglichkeit zum Einbringen von Stammzellen sind z. B. i. a. oder i. v. Injektionen bei Schlaganfall oder Hirntrauma (Mahmood, et al. (2001), Neurosurgery, 49, 1196-203 ; discussion 1203-4, Lu, et al. (2001), J Neurotrauma, 18, 813-9, Lu, et al. (2002), Cell Transplant, 11,275-81, Li et al. (2002), Neurology, 59,514-23). Eine andere Möglichkeit der Verwendung von ee3 in der Stammzelltherapie wäre die Herstellung von Zellen, die konstant einen Agonisten oder Antagonisten für ee3 sezernieren.

Ausführungsbeispiel 15 Klonierung zusätzlicher Verwandter der ee3-Rezeptorfamilie aus Xenopus laevis und Dario rerio Es konnten zusätzlicher Mitglieder der ee3-Proteinfamilie- aufgrund der erfindungsgemässen Homologiekriterien kloniert werden. Mit TBLASTN wuredn mit Proteinsequenzen aus dem humanen ex3 1 Protein EST-Datenbanken durchsucht. Dabei fanden sich ESTs aus X. laevis (Krallenfrosch) und aus D. rerio (Zebrafisch). Diese ESTs wurden mit Standardverfahren sequenziert, und es ergaben sich folgende Sequenzen : Vollänge-Sequenz von xl ee3 (Xaenopus laevis) : Das offenen Leseraster ("open reading frame") von xlee3 : <BR> <BR> ATGAATCTTAGGGGCCTCTTCCAGGATTTTAACCCCAGTAAATTTCTCATCTACGCATGT TTGTTGCTCTTTTCTGTTCT<BR> CCTTTCCCTGCGACTGGATAATATTATTCAGTGGAGTTACTGGGCGGTGTTTGCTCCAAT ATGGTTGTGGAAACTAATGG<BR> TTATTGTGGGAGCCTCAGTTGGTACAGGTGTATGGGCACGTAACCCTCAATACAGGGCAG AAGGTGAAACATGTGTGGAG

und die Proteinsequenz vonxlee3 : Für D. rerio lauten diese Sequenzen (dr_ee3) : Das offene Leseraster von dr_ee3 (#open reading frame"): und die Proteinsequenz von dree3 :

Figur 27 verdeutlicht noch einmal die hohe evolutionäre Konservierung der ee3 Familie unter Zuhilfenahme der beiden Proteine aus X. laevis und D. rerio.