Hintergrund der Erfindung Für den diagnostischen Nachhweis von Substanzen und deren Konzentrationsbestimmung werden heute in vielen Fällen in-vitro diagnostische Meßverfahren angewendet, die auf biolo- gischen Molekülen, wie z. B. Peptiden, Proteinen, Antikörpern oder Oligonukleotiden, beru- hen, die eine hohe Affinität für eine zu bestimmende Substanz haben. Bevorzugt werden hier- für Proteine und Peptide und besonders bevorzugt Antikörper und Antikörperfragmente ver- wendet.

Bestimmte in-vitro diagnostische Verfahren, wie z. B. die Elektrochemiluminienz basieren auf der Kombination verschiedener Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz, wobei der eine Antikörper für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Untersuchungs- probe dient und der andere Antikörper das diagnostisch nachgewiesene Signalmolekül trägt.

Im Falle des diagnostischen Verfahrens der Elektrochemolumineszenz wird der markierte Antikörper optisch detektiert [Grayeski, M. L., Anal. Chem. 1987,59, 1243].

Neben der Elektrolumineszenz kann auch die lichtinduzierte Phosphoreszenz und die Fluores- zenz als optische Eigenschaft von Molekülen für diagnostische Meßverfahren verwendet wer- den. Gegenüber der Elektrolumineszenz und Phosphoreszenz bietet insbesondere die Fluores- zenz als optische Eigenschaft von Molekülen den Vorteil der hohen Nachweisempfindlichkeit und eine hohe Linearität des Meßsignals über einen großen dynamischen Bereich hinweg.

Zum Nachweis der Fluoreszenz eines Fluorophors wurden verschiedene Meßverfahren ent- wickelt, die unterschiedliche Prinzipien innerhalb der Fluoreszenzprozesse ausnutzen. Eta- blierte Meßverfahren nutzen z. B. die Abschwächung polarisierten Lichtes (Fluoreszenzpola- risierung-FP), die Messung der Photonenlebensdauer (Fluoreszenzlebensdauermessung- FLM), die Ausbleicheigenschaften (Fluoreszence-Photobleaching Recovery-FPR) und den Energietransfer zwischen verschiedenen Fluorophoren (Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer-FRET) [Williams, A. T., et al., Methods Immunol. Anal. 1993, 1, 466 ; Youn, H. J. et al., Anal. Biochem. 1995 Oswald, B. et al., Anal. Biochem. 2000,280, 272 ; Szollosi, J. et. al., Cytometry 1998,34, 159].

Andere Nachweisverfahren basieren auf einer Veränderung der Polarisationsebene oder dem Nachweis einer Phosphoreszenz.

Bei den oben genannten Verfahren erfüllen die verwendeten Anti-Substanz-Antikörper unter- schiedliche Zwecke. Einerseits werden sie für die Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Probe verwendet, andererseits erfüllen sie aber auch die Aufgabe der Lokalisierung bzw. Positionierung unterschiedlicher verwendeter Signalgeber an der zu untersuchenden Substanz. Zum Nachweis z. B. eines Antikörpers in einer Probe haben sich vor allem optische und radioaktive Meßverfahren etabliert, aber auch akustische [siehe z. B. Cooper MA, et al.

Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nat Biotechnol.

2001 Sep ; 19 (9) : 833-7. ] und magnetische Meßverfahren sind bekannt. Die größte Verbreitung haben die optischen Meßverfahren erlangt [Nakamura, R. M., Dito, W. R., Tucker, E. S.

(Eds. ). Immunoassays : Clinical Laboratory Techniques for the 1980s. A. R. Liss, New York.<BR> <P>Edwards, R. (ed. ). Immunoassays : Essential Data, 1996, Wiley Europe.].

Bei der Mehrzahl der bereits verfügbaren Meßverfahren wird der Anti-Substanz-Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Diese Markierung erfolgt durch spezifische und unspezifische chemische Kopplung. Der markierte Antikörper wird im Überschuß zu der Untersuchungs- probe zugegeben. Dies ist erforderlich, um alle zu untersuchenden Substanzmoleküle zu bin- den. Diesen Verfahren liegt weiterhin allgemein zu Grunde, daß der eine Anti-Substanz- Antikörper der Abtrennung der zu untersuchenden Substanz dient und der zweite Anti- Substanz-Antikörper, der an einer anderen Bindungsstelle der Untersuchungssubstanz er- kennt, mit einem signalgebenden Molekül markiert ist. Auf diese Weise kann eine Verfäl- schung des Messergebnisses durch den nicht gebundenen, aber signalgebenden Antikörper vermieden werden. Diese Verfahrensweise ist jedoch, bedingt durch den Abtrennungsschritt, mit einem erhöhten methodischen und technischen Aufwand und höheren Kosten verbunden.

Besonders nachteilig erweist sich jedoch der hohe technische Aufwand, der eine Etablierung dieses Verfahrens für die Schnelldiagnostik verhindert.

Antikörper und Peptide, die gegen Moleküle kleinen Molekulargewichts gerichtet sind, sind bereits bekannt. Darunter fallen auch Antikörper und Peptide gegen Farbstoffmoleküle. So beschreiben Simeonov A. et al. in Science 2000,290, 307-313 Antikörper gegen Stilbene ("Blue-fluorescent antibodies"). Diese Antikörper katalysieren spezifisch photochemische Isomerierungsvorgänge und führen zu rotverschobenen Absorptions-und Fluoreszenzmaxima im UV-VIS Spektralbereich (Absorptionsverschiebung maximal 12 nm, Fluoreszenzverschie- bung 22 nm). Simeonov et al. geben jedoch keinen Hinweis auf eine Rotverschiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellenlängenbereich von 600-1200 nm.

Watt R. M. et al. (Immunochemistry 1977,14, 533-541) beschreiben die spektralen Eigen- schaften von bereits bekannten anti-Fluorescein-Antikörperkonstrukten. Der Antikörper be- wirkt nach Bindung des Fluoresceins eine Verschiebung des Absorptions-und Fluoreszenz- maximums im sichtbaren Spektralbereich, jedoch nur um 12 nm bzw. 5 nm. Zusätzlich erfolgt eine starke Verringerung der Fluoreszenzquantenausbeute um ca. 90%.

Rozinov M. N. et al. (Chem. Biol. 1998,5, 713-728) beschreiben die Selektion 12-merer Pep- tide aus Phagenbibliotheken, die die Farbstoffe Texas Red, Rhodamine Red, Oregon Green 514 und Fluorescein binden. Für Texas Red wurde eine Rotverschiebung der Absorption und Fluoreszenz beobachtet, jedoch nur um 2.8 nm bzw. 1. 4 nm.

Des weiteren sind Antikörper gegen verschiedene Farbstoffe bereits kommerziell erhältlich, z. B. gegen Fluorescein, Tetramethylrhodamin, Texas Red, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, Lucifer yellow and Cascade Blue, Oregon Green (Fa. Molecular Probes, Inc., USA). Hierbei handelt es sich jedoch um polyklonale IgG Antikörper für bioanalytische Zwecke, die zum Teil unkontrollierbare Kreuzreaktivitäten aufweisen und nicht aus einem strikten Selektions- prozess hervorgegangen sind.

Es besteht somit ein weiterer Bedarf an verbesserten Emitter-bindenden Peptiden und insbe- sondere spezifischen Antikörpern, die besser für die oben genannten Meßverfahren geeignet werden. Vorteilhaft wären dabei insbesondere Emitter-bindende Peptide, die eine Rotver- schiebung unter Beibehalt der Fluoreszenzquantenausbeute bei Cyaninfarbstoffen im Wellen- längenbereich von 600-1200 nm bewirken würden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Emitter-bindendes Peptid gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters bewirkt, einem Verfahren zur Herstellung eines Emitter-bindenden Peptids gemäß der Erfindung, um- fassend die Immunisierung eines geeigneten Organismus mit einem Emitter, umfassend einen Farbstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium-und Oxonolfarbstof- fen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin-oder Phenothiazinfarbstoffen und entsprechenden Verwendungen eines Emitter-bindenden Peptids, einer Nukleinsäure, einer Wirtszelle oder eines Antikörpers oder Konjugats gemäß der Erfindung als Diagnostikum für die in vitro Dia- gnostik. Zweckmäßige Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen aufgeführt Ein erster Aspekts der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Emitter-bindendes Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß dieses bei einer Wechselwirkung seiner Antigenbindungstasche mit dem Emitter eine Veränderung der spektralen Emissionseigenschaften des Emitters be- wirkt.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorpti- onsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist.

Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Emitter-bindendes Peptid, wobei die Verände- rung der Emissionseigenschaften des Teils des Emitters ausgewählt ist aus einer Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluores- zenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaximums. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Phänomene beschränkt, der Begriff"Veränderung der Emissionseigenschaften"im Rahmen der vorlie- genden Erfindung soll alle physikalischen Phänomene oder Effekte umfassen, bei dem die auf den Emitter treffende energiereiche Strahlung in ihrer Eigenschaft verändert wird und diese Veränderung dabei von der Bindung/nicht-Bindung des Substanz-Emitter-Konjugats oder Substanz-erkennendes Mittel-Emitter-Konjugat mit seinem Emitter-Bindungspartner und der Substanz quantitativ abhängig ist. In einer Ausführungsform ist die Substanz zum Beispiel ein Peptid, Protein, Oligonukleotid und insbesondere ein Antikörper oder ein Antikörperfrag- ment. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Antikörperfragmenten um Fragmente, die zumindest die Antigen-bindenden Bereiche umfassen, die die sogenannten "complementarity-determining regions" ("CDRs") enthalten. Bevorzugterweise umfassen die Antigen-bindenden Bereiche dabei die vollständigen variablen Ketten VL und VH.

In einem besonders bevorzugten Aspekt des Emitter-bindenden Peptids gemäß der vorliegen- den Erfindung ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten, insbesondere monomeren Fab-Fragmenten, scFV-Fragmenten, synthetischen und rekombinanten Antikör- pern, scTCR-Ketten und Gemischen davon.

Insbesondere bevorzugt sind dabei im Falle der synthetischen und rekombinanten Antikörper oder Antikörperfragmente diejenigen aus einer HuCAL-Bibliothek (WO 97/08320 ; Knapp- pik, (2000), J. Mol. Biol. 296,57-86 ; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1 ; 254 (1- 2) : 67-84). Diese können entweder als vollständige Immunoglobuline oder Antikörper in ei- nem der natürlich vorkommenden Formate (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) oder als Antikörper- fragmente vorliegen, wobei die Antikörperfragmente zumindest die Aminosäurepositionen 4 bis 103 für VL und 5 bis 109 für VH, bevorzugt die Aminosäurepositionen 3 bis 107 für VL und 4 bis 111 für VH und besonders bevorzugt die vollständigen variablen Ketten VL und VH (Aminosäurepositionen 1 bis 109 für VL und 1 bis 113 für VH) umfassen (Numerierung nach WO 97/08320).

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Antikörper oder das Antikörperfragment dabei zumindest einen der in den Sequenzen SEQ-ID NOs : 1, 2,5, 6,9, 10,13, 14,17, 19, 21, 23,25, 27,29, 31,33, 35,37 und 39 enthaltenen CDR-Bereiche (VL : CDR1 Positionen 24- 34, CDR2 Positionen 50-56, CDR3 Positionen 89-96 ; VH : CDR1 Positionen 26-35, CDR2 Positionen 50-65, CDR3 Positionen 95-102), insbesondere VL CDR3 oder VH CDR3. Be- sonders bevorzugt ist dabei ein Antikörper, der eine der in den Sequenzen SEQ-ID NOs : 2,6, 10,14, 17,19, 21,23, 25,27, 29,31, 33,35, 37 und 39 enthaltenen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs : 1, 5,9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH umfaßt (oder ein Fragment eines solchen Antikörpers). Am meisten bevorzugt ist ein Antikörper, der eines VH/VL-Paare umfaßt, die in den folgenden Sequenzpaaren enthalten sind : SEQ-ID NOs : 1+2 ; SEQ-ID NOs : 5+6 ; SEQ-ID NOs : 9+10 ; SEQ-ID NOs : 13+14 ; SEQ-ID NOs : 5+17 ; SEQ-ID NOs : 5+19 ; SEQ-ID NOs : 5+37 ; SEQ-ID NOs : 9+21 ; SEQ-ID NOs : 9+23 ; SEQ-ID NOs : 9+25 ; SEQ-ID NOs : 9+27 ; SEQ-ID NOs : 9+29 ; SEQ-ID NOs : 9+31 ; SEQ-ID NOs : 9+33 ; SEQ-ID NOs : 9+39 ; SEQ-ID NOs : 13+35 (oder ein Fragment eines solchen An- tikörpers). Insbesondere bevorzugt sind dabei die Fab-Fragmente MOR02628, MOR02965, MOR02977, MOR02969, MOR03263, MOR03325, MOR03285, MOR03201, MOR03267, MOR03268, MOR03292, MOR03294, MOR03295, MOR03309, MOR03293 und MOR03291. Ausgehend von den so beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörpern ergeben sich für den Fachmann in naheliegender Weise verschiedene Möglichkeiten, neue modifizier- te Antikörper zu erhalten, die die erfindungsgemäßen Eigenschaften ebenfalls zeigen.

Dem Fachmann ist bekannt, daß für die Affinität sowie Selektivität und Spezifität insbesonde- re die CDR-Bereiche sowohl der schweren als auch der leichten Kette verantwortlich sind.

Dabei spielen insbesondere der CDR3-Bereich von VH und der CDR3-Bereich von VL ein Rolle, gefolgt von CDR2 von VH und CDR1 von VL, während CDR1 von VH und CDR2 von VL zumeist eine untergeordnete Rolle spielen. Zur Optimierung von Affinität sowie Se- lektivität und Spezifität von Antikörpern bieten sich daher insbesondere die CDR-Bereiche an (s. auch z. B. Schier et al., J. Mol. Biol. (1996) 263,551). Dabei können zum Beispiel ein oder mehrere der CDR-Bereiche ausgetauscht werden, zum Beispiel gezielt gegen CDR- Bereiche von anderen, die erfindungsgemäßen Eigenschaften bereits zeigenden Antikörpern, oder aber durch Bibliotheken von entsprechenden CDR-Sequenzen (siehe hierzu die Optimie- rung in Beispiel 1), die entweder vollständig zufällige Variationen erzeugen oder einen mehr oder weniger starke Bevorzugung (Tendenz) in Richtung von bestimmten Aminosäuren oder Kombinationen davon enthalten. Der Fachmann ist darüber hinaus auch in der Lage, ganze variable Ketten in gleicher Weise gegen entsprechende Ketten anderer definierter Antikörper oder gegen diverse Bibliotheken solcher Ketten auszutauschen. Des weiteren sind dem Fach- mann Verfahren bekannt, gezielt durch Mutagenese eine oder mehrere Aminosäurereste in den CDRs auszutauschen. Die Identifikation derartig zu verändernder Aminosäurereste er- folgt dabei z. B. auf Basis eines Vergleichs der Sequenzen verschiedener Antikörper und die Identifikation von konservierten oder zumindest hoch homologen Resten an den entsprechen- den Positionen. Bei den Veränderungen an den CDRs verfügt der Fachmann dabei auch über Kenntnisse zu den sogenannten"kanonischen Strukturen" (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. (2000) 295,979) ; Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296,57), die einen Einfluß auf die drei- dimensionale Anordnung der CDR-Bereiche haben und die beim Design entsprechender Op- timierungsstrategien berücksichtigt werden können.

Darüber hinaus sind dem Fachmann Techniken vertraut, auch die Gerüstregionen von Anti- körpern oder Antikörperfragmenten zu verändern, um zu stabileren oder besser exprimierba- ren Molekülen zu gelangen (WO 92/01787 ; Nieba et al. (1997) Protein Eng. 10, 435 ; Ewert et al. (2003) Biochemistry 42,1517).

Über diese bereits beschriebenen Strategien zur Modifikation von Antikörpern oder Antikör- perfragmenten hinaus, ist der Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Antikörper und der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Meßverfahren auch in der Lage, weitere Veränderung an der Aminosäuresequenz oder der Zusammensetzung der beschriebenen Anti- körper vorzunehmen und durch Anwendung der beschriebenen Assays und Meßverfahren zu entscheiden, ob modifizierte Antikörper entstanden sind, deren Eigenschaften mit denen über- einstimmen, die die erfindungsgemäßen Antikörper auszeichnen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die einen der erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Antikörperfragment kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um Nukleinsäuremoleküle, die eine der in den Se- quenzen SEQ-ID NOs : 2,6, 10,14, 17,19, 21,23, 25,27, 29,31, 33,35, 37 und 39 enthalte- nen variablen Ketten VL oder eine in den Sequenzen SEQ-ID NOs : 1, 5,9 und 13 enthaltenen variablen Ketten VH kodieren. Besonders bevorzugt sind dabei die Sequenzen gemäß der SEQ-ID NOs : 3,4, 7,8, 11,12, 15,16, 18,20, 22,24, 26,28, 30,32, 34,36, 38 und 40.

Das Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung weist optimalerweise eine Bin- dungsaffinität von kleiner als 50 nM und bevorzugt von kleiner als 10 nM auf.

Ein weiterer Aspekt ist ein Emitter-bindendes Peptid der vorliegenden Erfindung, wobei der Emitter einen Farbstoff umfaßt, der mindestens ein Absorptionsmaximum und/oder Fluores- zenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm, bevorzugt mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 750 bis 900 nm aufweist. Die bathochrome Verschiebung des Farbstoffs ist so gewählt, daß die Verschiebung des Absorptions-und/oder Fluoreszenzmaximums zu höheren Wellenlängen nach Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters um einen Wert von größer 15 nm, bevorzugt größer 25 nm, und am meisten bevorzugt um ungefähr 30 nm erfolgt. Dabei muß nicht unbedingt eine Verschiebung als solche betrachtet werden, die eine Eigenschaft des Farbstoffs ist. Üblicherweise würde die Verschiebung als Veränderung eines an den Farbstoff angepaßten Emissionswertes gemessen werden, also bei einer bestimmten singulären Wellen- länge. Dafür sind geeignete optische Mitteln zur Messung vorgesehen, die dem Fachmann bekannt sind. Dies gilt ebenfalls für die Messung der Veränderung der Polarisationsebene, der Fluoreszenzintensität, der Phosphoreszenzintensität, der Fluoreszenzlebensdauer und einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums und/oder des Fluoreszenzmaxi- mums.

Für die erfindungsgemäßen Emitter-bindenden Peptide ist es bevorzugt, daß der verwendete Emitter einen Farbstoff umfaßt, der ausgewählt ist aus der Gruppe von Polymethinfarbstoffen, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Indotricarbocyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Squarilium- und Oxonolfarbstoffen und Rhodaminfarbstoffen, Phenoxazin-oder Phenothiazinfarbstoffen.

Allgemein kann der Emitter des erfindungsgemäßen Substanz-Emitter-Konjugats einen Cya- ninfarbstoff der allgemeinen Formel (I) umfassen, in der D für einen Rest (II) oder (III) steht, wobei die mit dem Stern markierte Position die Verknüpfungsstelle mit dem Rest B bedeutet und für die Gruppe (IV), (V), (VI), (VII) oder (VIII) stehen kann, in denen Rl und R2 unabhängig voneinander eine Cl-C4-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder geradekettige Cl-Cso-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls mit von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, bedeutet, R3 und R4 unabhängig voneinander für die Gruppe-COOE',-CONElE2,-NHCOEI,-NHCONHE',- NElE2,-OEI,-OS03E',-SO3E1,-SOaNHE'oder-El stehen, wobei El und E2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Cl-C4-Sulfoalkylkette, eine gesättigte oder ungesättig- te, verzweigte oder geradekettige C1-C5o-Alkylkette darstellt, die gegebenenfalls von 0 bis 15 Sauerstoffatomen und/oder von 0 bis 3 Carbonylgruppen unterbrochen ist und/oder mit 0 bis 5 Hydroxygruppen substituiert ist, RS für ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl-oder Pro- pylgruppe oder ein Fluor-Chlor, Brom-oder Jodatom steht, b die Zahl 2 oder 3 bedeutet, und X und Y unabhängig voneinander für O, S, =C (CH3) 2 oder- (CH=CH)- steht, sowie Salze und Solvate dieser Verbindungen.

Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß nach hochaffiner Bindung eines Antikör- pers an einen Cyaninfarbstoff mit Absorption und Fluoreszenz im Nahinfraroten Spektralbe- reich (> 750 nm) eine Verschiebung des Absorptionsmaximums und Fluoreszenzmaximums um ca. 30 nm zu höheren Wellenlängen erfolgte (bathochrome Verschiebung). Unter Ausnut- zung dieses Prinzips ist es somit zum Beispiel möglich, über einen großen Konzentrationsbe- reich ein Signal aus einer Vollblutprobe direkt und spektral getrennt zu detektieren, wobei sich das Signal linear zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz verhält.

Die Emitter können mit Substanzen Konjugate bilden. Im Rahmen der vorliegenden Erfin- dung werden als Substanz-Emitter-Konjugate solche der allg, Formel S-E verwendet, worin S für eine zu untersuchende Substanz und E für einen Emitter steht, der einen Teil umfaßt, der auf eine Wechselwirkung mit dem Mittel zur Erkennung des Emitters mit einer Veränderung der Emissionseigenschaften reagiert. Als struktureller Bestandteil der erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich u. a. Farbstoffe, die mindestens ein Absorptions- maximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 600 bis 1200 nm besitzen. Bevorzugt sind dabei Farbstoffe mit mindestens ein Absorptionsmaximum und Fluoreszenzmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 700 bis 1000 nm besitzen. Farb- stoffe, die diese Kriterien erfüllen, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen : Poly- methinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin-und Oxonolfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin-oder Phenothiazinfarbstoffe, Tetrapyrrolfarbstoffe, insbe- sondere Benzoporphyrine, Chorine, Bacteriochlorine, Pheophorbide, Bacteriopheophorbide, Purpurine und Phthalocyanine.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine. Struktureller Bestandteil der erfin- dungsgemäßen Konjugate sind auch die Substanzen, deren Konzentrationsbestimmung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen soll.

Diese sind beispielsweise ausgewählt aus Antigenen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, Blutkomponenten, Serumkomponenten, Lipiden, Pharmaka und Verbin- dungen niederen Molekulargewichts, insbesondere Zuckern, Farbstoffen oder anderen Ver- bindungen mit einem Molekulargewicht von unter 500 Dalton.

Bevorzugte Farbstoffe sind die Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 750 und 900 nm, mit besonderem Vorteil Indotricarbocyanine.

Die Farbstoffe enthalten Strukturelemente, über welche die kovalente Kopplung an die Sub- stanzstrukuren erfolgt. Dieses sind z. B. Linker mit Carboxygruppen, Aminogruppen, Hydro- xygruppen.

Im Falle einer optischen Messung kann diese in unterschiedlicher Weise erfolgen und richtet sich hauptsächlich nach der Art der charakteristischen Veränderung der spektralen Eigen- schaften des Emitters (z. B. Fluorophors). Generell bevorzugt ist eine Erfassung der Verschie- bung der Absorptionswellenlänge und Emissionswellenlänge oder die Messung der Absorpti- on und/oder Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge, die zum größten Teil den am Anti- körper gebundenen Anteil des Fluorophors erfaßt. Je nach Veränderung der spektralen Eigen- schaften des antikörpergebundenen Fluorophors können auch andere Eigenschaften, wie z. B. die Photonenlebensdauer, die Polarisation und das Ausbleichverhalten zur optischen Messung verwendet werden.

Der besondere Vorteil von Fluorophoren im spektralen Bereich des nahinfraroten Lichtes liegt in der geringen Überdeckung durch Bestandteile des Blutes. Hierdurch wird eine Tiefen- eindringung ermöglicht, ohne daß das zu detektierende Signal unverhältnismäßig stark verän- dert wird.

Dem Fachmann sind darüber hinaus auch bereits Antikörper gegen Fluorophore bekannt, die in der Lage sind, nach Bindung des Fluorophors dessen spektrale Eigenschaften im UV- Bereich zu verändern. Durch Bindung eines Fluorophors in die Antigenbindungstasche eines Antikörpers können vor allem die Fluoreszenzintensität, das Absorptionsmaximum, das Emissionsmaximum, und die Photonenlebensdauer verändert werden [Simeonov A., et al., Science (2000) 307-313]. Diese bekannten Antikörper sind jedoch gegen Emitter (Fluoropho- re) gerichtet, die ihre Absorption und Fluoreszenzemission im sichtbaren und UV-Bereich des Lichts haben.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsge- mäßen Emitter-bindenden Peptids für die in vitro Diagnostik.

Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Emitter-bindende Peptid auch in einem dia- gnostischen Kit vorliegen, gegebenenfalls zusammen mit anderen Hilfsstoffen. Alle erfin- dungsgemäßen Kits können weiterhin spezielle Instruktionen und Unterlagen (z. B. Eichkur- ven, Anweisung zur Quantifizierung, usw. ) enthalten.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand von Beispielen und den beigefügten Figuren und Sequenzen näher beschrieben werden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Es zeigen : Figur 1 : Den CysDisplay-Screening Vektor pMORPH23 (Vektorkarte und Sequenz), Figur 2 : Den Expressionsvektor pMORPHX9 MS (Vektorkarte und Sequenz), und Figur 3 : Absorptionspektrum (links) und Fluoreszenzspektrum vom Farbstoff aus Bei- spiel 2 in Abwesenheit und in Gegenwart von Antikörper MOR02965 in PBS.

Beispiele : Beispiel 1 : Selektionierung, Herstellung und Charakterisierung von Emitter-bindenden Antikörpern : Selektion von HuCAL GOLD Fab Antikörper-Fragmenten gegen den Cyanin-Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468) [Trinatrium-3, 3-dimethyl-2- {4-methyl-7- [3, 3- dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl] hepta-2, 4, 6-trien-1-yliden}- 1- (2-sulfonatoethyl)-2, 3-dihydro-1H-indol-5-sulfonat, inneres Salz] HuCAL GOLD Antikörperbibliothek : Antikörperbibliothek HuCAL GOLD : HuCAL GOLD ist eine vollsynthetische, modulare humane Antikörperbibliothek im Fab Antikörperfragmentformat. HuCAL GOLD basiert auf den HuCAL-Konsensus-Antikörpergenen, die für die Bibliothek HuCAL-scFvl beschrieben wurden (WO 97/08320 ; Knappik, (2000), J. Mol. Biol. 296,57-86 ; Krebs et al. J Immunol Methods. 2001 Aug 1 ; 254 (1-2) : 67-84). In HuCAL GOLD sind alle sechs CDR-Bereiche durch den Einsatz der sogenannten Trinukleotidmutagenese (Virnekäs et al. (1994) Nucleic Acids Res. 1994 Dec 25 ; 22 (25) : 5600-7) entsprechend der Zusammensetzung dieser Bereiche in menschlichen Antikörpern diversifiziert, während in früheren HuCAL-Bibliotheken (Hu- CAL-scFvl und HuCAL-Fabl lediglich die CDR3-Bereiche in VH und VL entsprechend der natürlichen Zusammensetzung (s. Knappik et al., 2000) diversifiziert worden waren. Darüber hinaus findet in HuCAL GOLD auch ein abgewandeltes Screening-Verfahren Verwendung, das sogenannte CysDisplay (WO 01/05950). Der für das Screeningverfahren verwendete Vektor pMORPH23 findet sich in Figur 1.

VA Positionen 1 and 2. Die ursprünglichen HuCAL Mastergene wurden mit ihren authenti- schen N-Termini konstruiert : VLA1 : QS (CAGAGC), VLk2 : QS (CAGAGC), and VLk3 : SY (AGCTAT). Diese Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Herstellung der HuCAL- scFvl-Bibliothek wurden diese beiden Aminosäurereste in"DI"geändert, um das Klonieren zu erleichtern (EcoRI site). Diese Reste wurden bei der Herstellung von HuCAL-Fabl und HuCAL GOLD beibehalten. Daher enthalten alle HuCAL-Bibliotheken VL2"-Gene mit derE- coRS-Schnittstelle GATATC (DI) am 5'-Ende. Alle HuCAL kappa Gene (Mastergene und alle Gene in den Bibliotheken) enthalten ohnehin DI am 5'-Ende, da dies die authentischen N- Termini darstellen (WO 97/08320).

VH Position 1. Die ursprünglichen HuCAL-Mastergene wurden mit ihren authentischen N- termini hergestellt : VH1A, VH1B, VH2, VH4, und VH6 mit Q (=CAG) als erstem Amino- säurerest und VH3 sowie VH5 mit E (=GAA). Die entsprechenden Sequenzen finden sich in WO 97/08320. Bei der Klonierung der HuCAL-Fabl sowie der HuCAL GOLD Bibliothek wurde an dieser Position 1 die Amiosäure Q (CAG) in allen VH-Genen eingebaut.

Phasemid-Produktion Durch Infektion von E. coli TOPlOF'-Zellen aus der HuCAL GOLD Antikörper-Bibliothek bzw. aus den Maturierungsbibliotheken mittels Helferphagen wurden große Mengen an Pha- gemiden produziert und angereichert. Dazu wurden die HuCAL GOLD bzw. die Maturie- rungsbibliotheken (in den TOPlOF'-Zellen) in 2xYT-Medium mit 34 ug/ml Chlorampheni- col/10 ug/ml Tetrazyklin/1% Glucose bei 37°C bis zu einer OD600 von 0.5 kultiviert. An- schließend erfolgte die Infektion mit VCSM13 Helferphagen bei 37°C. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 2xYT/34 pg/ml Chloramphenicol/10 g/ml Tetrazyklin/50 llg/ml Kanamycin/0.25 mM IPTG resuspendiert und bei 22°C über Nacht kultiviert. Aus dem Über- stand wurden die Phagen 2x mit PEG ausgefällt und durch Zentrifugation geerntet (Ausubel (1998) Current protocols in molecular biology. John Wiley Sons, Inc., New York, USA). Die Phagen wurden in PBS/20% Glyzerin resuspendiert und bei-80°C gelagert.

Die Phagemid-Amplifikation zwischen den einzelnen Selektionsrunden erfolgte folgender- maßen : log-Phase E. coli TG1-Zellen wurden mit den selektionierten Phagen infiziert und auf LB-Agar-Platten mit 1% Glucose/34 llg/ml Chloramphenicol ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Bakterienkolonien abgekratzt, neu kultiviert und mit VCSM13 Hel- ferphagen infiziert.

Primäre Selektion von Antikörpern gegen den Farbstoff Fuji 6-4 (ZK203468) Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide der HuCAL GOLD Antikörper-Bibliothek wurden in ein Standard-Selektionsverfahren eingesetzt. Als Antigene wurden BSA-bzw.

Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Die Antigene wurden in PBS aufgenommen und in Konzentrationen von 50 Rg/ml auf Maxisorplm Mikrotiterplatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisorp-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating").

Nach Abblocken der Maxisorp-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+13 Hu- CAL GOLD-Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gegeben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, die mit fortschreitenden Selektionsrunden stringenter wurden, wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT bzw. 100 u. M unkonjugiertem ZK203468 eluiert. Insgesamt wurden drei aufeinan- derfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte, wie oben beschrieben.

Sub-Klonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression Nach der drei Runden umfassenden Antikörper-Selektion wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten HuCAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS (s. Figur 2) sub- kloniert, um die anschließende Expression der Fab-Fragmente zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten HuCAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI verdaut. Die Fab-codierenden Inserts wurde aufgereinigt und in den entspre- chend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert. Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS. Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreini- gung und Detektion.

Screening und Charakterisierung von ZK203468-bindenden Fab-Fragmenten Mehrere tausend Klone wurden nach der Selektion und Sub-Klonierung vereinzelt und mittels ELISA im 384-well-Format auf spezifische Erkennung der im Panning verwendeten Antigene ZK203468-BSA und-Transferrin getestet. Hierbei identifizierte Klone wurden in einem In- hibitions-ELISA auf effiziente Bindung des unkonjugierten Farbstoffs untersucht.

Dies führte zu den parenteralen Fab-Fragmenten MOR02628 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO : 1 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 2 (VL-CL) ; DNA-Sequenzen SEQ-ID NO : 3 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 4 (VL-CL)), MOR02965 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO : 5 (VH-CH) und SEQ- ID NO : 6 (VL-CL) ; DNA-Sequenzen SEQ-ID NO : 7 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 8 (VL-CL)), MOR02977 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO : 9 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 10 (VL-CL) ; DNA-Sequenzen SEQ-ID NO : 11 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 12 (VL-CL)) und MOR02969 (Proteinsequenzen SEQ-ID NO : 13 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 14 (VL-CL) ; DNA- Sequenzen SEQ-ID NO : 15 (VH-CH) und SEQ-ID NO : 16 (VL-CL)), die den unkonjugierten Farbstoff ZK203468 effizient binden.

Beispiel 2 : Optimierung der parentalen Antikörper-Fragmenten durch Austausch der LCDR3-Resion Clonierung der LCDR3-Bibliotheken Die Plasmid-DNA der vier parenteralen Klone MOR02628, MOR02965, MOR02969 und MOR02977 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI verdaut und das entstande- ne, vollständige Fab-Insert vom Expressionsvektor pMORPHX9_MS in den entsprechend geschnittenen Display-Vektor pMORPH23 sub-kloniert. Dieser Schritt ist nötig, um das Ge- nIII bereitzustellen, das der Präsentaion des Fab-Fragments auf der Phagenoberfläche dient.

In einem weiteren Schritt wurden die vier parenteralen Klone (nun in pMORPH23) mit BpiI und SphI verdaut. Hierbei wurden die LCDR3-Region und der konstante Clambda-Bereich aus dem Vektor-Rückgrat entfernt. Das entsprechende Vektor-DNA-Fragment wurde isoliert und aufgereinigt. Parallel dazu wurde aus der HuCAL-Fab 2 Bibliothek das komplementäre BpiI/SphI-Fragment isoliert, welches eine diversifizierte LCDR3-Region (mit einer Variabili- tät von etwa 3E+8) plus konstanten Clambda-Bereich enthält (= Insert-DNA). Mehrere Fg Vektor-DNA und kompatible Insert-DNA wurden im molaren Verhältnis von 1 : 2 mit T4- DNA-Ligase ligiert und nach einem Aufreinigungsschritt in elektrokompetente TOP1OF'- Zellen transformiert. Dabei wurden pro parenteralem Antikörper Bibliotheksgrößen von SE+8 bis etwa lE+9 Klonen erzielt.

Die Bibliotheken, denen die Klone MOR02628, MOR02969 und MOR02977 zugrunde lagen, wurden vereinigt ("Pool"). Die MOR02965-Bibliothek wurde separat behandelt ("Lead"). Wie bereits beschrieben, wurden mittels dieser TOPlOF'-Maturierungs-Bibliotheken die entspre- chenden Phagemide durch Infektion mit VCSM13 Helferphagen produziert.

Antikörper-Selektionen auf Maxisorp Mikrotiterplatten Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von"lead"-und"pool"-Bibliotheken wur- den in ein Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen eingesetzt (lange Waschperioden, Verdrängung durch gereinigte, parentale Fab-Proteine). Als Antigene wurden BSA-bzw. Transferrin-gekoppeltes ZK203468 alternierend verwendet. Diese Antigene wur- den in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 100-250 ng/ml auf Maxi- sorpTM Mikrotiterplatten F96 (Nunc) aufgebracht. Die Maxisorp-Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert ("coating"). Nach Abblocken der Maxisorp-Platten mit 5% Milchpulver in PBS wurden ca. 2E+11 HuCAL Phagen in die Antigen-beladenen, abgeblockten Wells gege- ben und dort über Nacht bzw. zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 100 nM bzw. 500 nM gereinigte Fab-Fragmente der parentalen Klone zugegeben. Nach mehreren ausgedehnten Waschschrit- ten wurden gebundene Phagen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinander- folgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selek- tionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.

Antikörper-Selektionen auf Neutavidin-Strips Die gereinigten und aufkonzentrierten Phagemide von"lead"-und"pool"-Bibliotheken wur- den weiterhin in ein zweites Maturierungs-Selektionsverfahren unter stringenten Bedingungen (lange Waschperioden, Verdrängung durch aufgereinigte, parentale Fab-Proteine bzw. freien Farbstoff) eingesetzt. Als Antigene wurde Biotin-conjugiertes ZK203468 (alternierend mit Alkyl-bzw. Ether-Linker) verwendet. Diese Antigene wurden in PBS aufgenommen und in geringen Konzentrationen von 60 bzw. 12 ng/ml mit den ca. 2E+11 Phagen versetzt. Die An- tigen-Phagen-Lösungen wurden über Nacht bzw. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Um die Stringenz zu erhöhen, wurden während dieser Inkubation zusätzlich 0. 5 ug/ml gerei- nigte Fab-Fragmente der parentalen Klone bzw. 40 ng/ml ZK203468 zugegeben. Die Anti- gen-gebundene Phagen enthaltenden Lösungen wurden anschließend auf geblockte Neutravi- din-Strips aufgebracht und 30 min inkubiert, um die Bindung an die Festphase über den Bio- tinrest des Antigens zu ermöglichen. Nach mehreren Waschschritten wurden gebundene Pha- gen mit 20 mM DTT eluiert. Insgesamt wurden zwei aufeinanderfolgende Selektionsrunden durchgeführt, wobei die Phagenamplifikation zwischen den Selektionsrunden erfolgte wie oben beschrieben.

Sub-KIonierung selektionierter Fab-Fragmente zur Expression Nach der Selektion ("Maturierung") wurden die Fab-codierenden Inserts der isolierten Hu- CAL-Klone in den Expressionsvektor pMORPHX9_MS sub-kloniert, um die anschließende Expression zu erleichtern. Dazu wurde die gereinigte Plasmid-DNA der selektionierten Hu- CAL Fab-Klone mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI verdaut. Das Fab-codierende Insert wurde aufgereinigt und in den entsprechend verdauten Vektor pMORPHX9_MS ligiert.

Dieser Klonierungsschritt führt zu dem Fab-exprimierenden Vektor pMORPHX9_Fab_MS.

Fab-Fragmente, die von diesem Vektor exprimiert werden, tragen zwei C-terminale Tags (Myc-Tag und Strep-Tag II) zur Aufreinigung und Detektion.

Identifikation optimierter Antikörper-Fragmente Um Antikörper mit verbesserten Affinitäten zum Farbstoff Fuji 6-4 zu identifizieren, wurden die Klone aus den Selektionen vereinzelt und in ELISAs im 384-well-Format gescreent. Dazu wurde auf die ELISA-Mikrotiterplatten ZK203468-BSA aufgebracht. Die zu untersuchenden Fab-Fragmente wurden als nicht-aufgereinigte Bakterienlysate zugegeben. Um zusätzlich zur Bindung an das Antigenkonjugat die Bindung an den freien Farbstoff zu untersuchen, wurden ausserdem identische Screeningplatten mit Bakterienlysat und zusätzlich freiem Farbstoff in zwei unterschiedlichen Konzentrationen versetzt. Die hierbei entstehende Inhibition der Fab- Bindung an die Festphase durch den unkonjugierten Farbstoff zeigte Antikörper an, die nicht das Farbstoff-Konjugat sondern nur den freien Farbstoff spezifisch erkennen. Hierbei isolierte Klone wurden in Solution-Inhibition-Tests im ELISA-Format und dem Luminex-Gerät genau charakterisiert und deren Affinitäten zu Fuji 6-4 bestimmt.

Die folgenden Klone zeigten verbesserte Affinitäten im Vergleich zu den parenteralen Anti- körpern : Name Parenteraler LCDR3-Sequenz Fab MOR02969-SSYTYRVGGM MOR03291 MOR02969 ASYDYKSKNI MOR02965-SSWDSSFSW MOR03263 MOR02965 SSWDVSLEW MOR02977-QSWTTRPLNR MOR03201 MOR02977 SSWTSYFHIR MOR03267 MOR02977 QAWDSNFKNR MOR03292 MOR02977 QSWAPLFKMR MOR03295 MOR02977 QSWDSALSNR Zusammenfassend konnte die Affinität des parenteralen MOR02977 im Vergleich zu MOR03267 um den Faktor 140 verbessert werden. Alle weiteren identifizierten Klone zeigten Verbesserungen von Faktor 2-70 im Vergleich zum jeweiligen parenteralen Fab.

Beispiel 3 : Photophysikalische Charakterisierung der Farbstoff-Antikörper-Komplexe und Bestimmung der spektralen Verschiebungen/Fluoreszenzquantenausbeuten Es wurden Farbstoff-Antikörper-Komplexe basierend auf Antikörpern mit Bindung an den Indotricarbocyaninfarbstoff Trinatrium-3, 3-dimethyl-2- {4-methyl-7- [3, 3-dimethyl-5- sulfonato-1- (2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl] hepta-2,4, 6-trien-1-yliden}-1- (2- sulfonatoethyl) -2, 3-dihydro-lH-indol-5-sulfonat, inneres Salz untersucht (siehe Beispiele 1 und 2). Es wurden Lösungen der Konzentration von 1 pmol/L des o. g. Farbstoffes und 2,4 , umol/L des jeweiligen Antikörpers in PBS hergestellt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Absorptionsmaxima wurden mit einem Spektralphotometer (Perkin-Elmer, Lambda2) bestimmt. Die Fluoreszenzmaxima und Fluoreszenzquantenausbeuten wurden mit einem SPEX Fluorolog (wellenlängenabhängige Empfindlichkeit von Lampe und Detektor kali- briert) relativ zu Indocyaningrün bestimmt (Q = 0,13 in DMSO, J Chem Eng Data 1977,22, 379, Bioconjugate Chem 2001,12, 44). Aus den Absorptions-und Fluoreszenzmaxima wur- den die spektralen Verschiebungen relativ zu den Maxima einer Lösung des o. g. Farbstoffes ohne Antikörper in PBS (1 umol/L) berechnet (Absorptionsmax. 754 nm, Fluoreszenzmax.

783 nm, Fluoreszenzquantausbeute 10 %). Name Parenteraler LCDR3-SEQ-ID SEQ-ID SEQ-ID SEQ-ID Fab Sequenz NO. VH NO. VL NO. VH NO. VL Protein Protein DNA DNA AAWDFRKRL 1 2 3 4 MOR02628 N MOR02965 SSWDSSFSW 5 6 7 8 QSWTTRPLN 9 10 11 12 MOR02977 R SSYTYRVGG 13 14 15 16 MOR02969 M MOR02965-SSWDSSFSW 5 6 7 8 MOR03263 MOR02965 SSWDVSLEW 5 17 7 18 ASWDKSLQ 5 19 7 20 MOR03325 MOR02965 W MOR03285 MOR02965 QAWTGSYAT 5 37 7 38 QSWTTRPLN 9 10 11 12 MOR02977- R MOR03201 MOR02977 SSWTSYFHIR 9 21 11 22 QAWDSNFKN 9 23 11 24 MOR03267 MOR02977 R RSWDSNLSY 9 25 11 26 MOR03268 MOR02977 S QSWAPLFKM 9 27 11 28 MOR03292 MOR02977 R R MOR03294 MOR02977 QTWTSSFSSR 9 29 11 30 QSWDSALSN 9 31 11 32 MOR03295 MOR02977 R QTWDHGFTH 9 33 11 34 MOR03309 MOR02977 R SSWTTIYRN 9 39 11 40 MOR03293 MOR02977 R SSYTYRVGG 13 14 15 16 MOR02969- M ASYDYKSKN 13 35 15 36 MOR03291 MOR02969 1 Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt : Antikörper Parenteraler Absorpti-Fluores-Absorp-Fluores-Fluores- Antikörper ons-zenz-tions-shift zenz-zenz- maximum maximum (nm) shift quantenaus- (nm) (nm) (nm) beute (%) freier Farbstoff 754 783 10, 0 MOR02965 799 815 45 32 13, 0 MOR03263 MOR02965 798 810 44 27 10, 0 MOR03325 MOR02965 803 819 49 36 18, 0 MOR02977 773 788 19 5 24, 5 MOR03201 MOR02977 786 804 32 21 21, 0 MOR03267 MOR02977 783 802 29 19 38, 5 MOR03268 MOR02977 786 805 32 22 30, 0 MOR03292 MOR02977 781 800 27 17 25, 0 MOR03294 MOR02977 783 803 29 20 22, 0 MOR03295 MOR02977 784 803 30 20 23, 0 MOR03309 MOR02977 784 803 30 20 21, 5 Beispiel 4 : Konstruktion von Expressionsvektoren für die Expression von HuCAL Im- munoglobulinen Klonierung der schweren Kette : Die"multiple cloning site"des Vektors pCDNA3. 1+ (Invi- trogen) wird entfernt (NheI/ApaI), und ein Platzhalter, der mit den Restriktionsschnittstellen aus dem HuCAL-Design kompatibel ist, wird eingesetzt für die Ligation der Leader-Sequenz (NheI/EcoRI), der VH-Domäne aus dem Fab-Fragment (MunI/), und die konstanten Immuno- globulinregionen (BIpI/ApaI). Die Leadersequenz (EMBL 83133) wird mit einer Kozakse- quenz ausgestattet (Kozak, 1987). Die konstanten Regionen von humanem IgG (PIR J00228), IgG4 (EMBL KO1316), und Serum-IgAl (EMBL J00220) werden in überlappende Oligonu- cleotide von einer Länge von etwa 70 Basen aufgeteilt. "Silent Mutations"werden eingeführt, um Restriktionsschnittstellen zu entfernen, die nicht mit dem HuCAL-Design kompatibel sind. Die Oligonukleotide werden durch"overlap extension-PCR"verknüpft.

Während des Subklonierens von den Fab-Fragmenten in ein IgG-Molekül wird die schwere Kette des Fab-Fragments über MfeI/BlpI ausgeschnitten und in den Vektor, der mit Eco- RI/BlpI geöffnet wird, ligiert. EcoRI (g/aattc) und MfeI (c/aattg) besitzten beide kompatible kohäsive Enden (aatt), und die Sequenz der ursprünglichen MfeI-Schnittstelle in den Fab- Fragmenten ändert sich von : c/aattg nach g/aattg nach der Ligation in den IgG- Expressionsvektor, wodurch zum Einen sowohl die MfeI-als auch die EcoRI-Schnittstelle zerstört werden, und zum Anderen eine Aminosäurenaustausch von Q (Kodon : caa) nach E (Kodon : gaa) statt findet.

Klonierung der leichten Kette. Die"multiple cloning site"von pCDNA3. 1/Zeo+ (Invitrogen) wird duch zwei unterschiedliche Platzhalter ersetzt. Der k-Platzhalter enthält Restriktions- schnittstellen für den Einbau einer k-Leadersequenz (NheI/EcoRV), der HuCAL Fab Vk- Domäne (EcoRV/BsiWI), und der konstanten Region der k-Kette (BsiWI/Apal). Die entspre- chenden Schnittstellen im 1-Platzhalter sind NheVEcoRV (1-Leader), EcoRV/HpaI (VI- Domäne), and HpaI/ApaI (konstante Region 1-Kette). Der k-Leader (EMBL Z00022) sowie der 1-Leader (EMBL J00241) sind beide mit Kozak-Sequenzen versehen. Die konstanten Re- gionen von humanen k- (EMBL L00241) und 1-Ketten (EMBL M18645) werden beide durch "overlap extension-PCR"assembliert, so wie oben beschrieben.

Generation von IgG-exprimierenden CHO-Zellen. CHO-K1 Zellen werden mit einer äquimo- laren Mischung von Expressionsvektoren für die schwere und leichte IgG-Ketten co- transfiziert. Zweifach resistente Transfektantent werden mit 600 mg/ml G418 und 300 mg/ml Zeocin (Invitrogen) gefolgt von limitierender Verdünnung selektioniert. Der Überstand von Einzelklonen wird auf IgG-Expression durch"capture-ELISA"überprüft. Positive Klone werden in RPMI-1640 Medium, das mit 10%"ultra-low IgG-FCS" (Life Technologies) ver- sehen ist, angezogen. Nach Einstellung des pH-Werts des Überstands auf 8.0 und Sterilfiltra- tion, wird die Lösung einer Standard-ProteinA-Säulenchromatographie unterzogen (Poros 20 A, PE Biosystems).