Domaine de 1 ' invention

La présente invention concerne le domaine de la médecine régénératrice permettant de produire artificiellement des organes et des tissus biologiques, désigné par « ingénierie tissulaire». Le besoin en transplantation de tissus et d'organes a considérablement augmenté dans le monde entier au cours de la dernière décennie. Les principales raisons sont l'augmentation de l'espérance de vie, l'incidence du dysfonctionnement d'organes vitaux et des maladies dégénératives, et des besoins pour pallier aux conséquences de l'exérèse de tumeurs. En raison de cette pénurie d'organes, rien que dans l'Union Européenne, plus de 63 000 patients attendent une transplantation d'organes (rein, foie, cœur, cornée...) , et 6 nouveaux patients sont ajoutés toutes les heures aux listes d'attente. À l'opposé, seulement environ 33 000 donneurs étaient identifiés en 2016. Alors que certains pays prennent des mesures pour augmenter le nombre de dons d'organes, de nombreux patients en attente d'une greffe n'en recevront pas à temps. Les cliniciens ont donc besoin de substituts de tissus et d'organes qui sont parfaitement caractérisés et sécurisés, spécifiques à un patient donné et potentiellement «disponibles sur étagère».

Dans cette perspective, les scientifiques et industriels du domaine de 1 ' ingénierie tissulaire appliquent les principes de la biologie et de 1 ' ingénierie pour développer des substituts fonctionnels qui restaurent, maintiennent ou améliorent la fonction tissulaire .

D'un point de vue réglementaire, les produits d'ingénierie tissulaire appartiennent à la catégorie des Médicaments de Thérapie Innovante (MTI). Ils sont distincts des produits pharmaceutiques classiques et présentent donc des défis uniques. Ils nécessitent une assurance qualité et une logistique complexe, et doivent être transplantés chez des patients par des chirurgiens qualifiés, tout en répondant à des exigences réglementaires importantes telles que la réglementation des Médicaments de Thérapies Innovantes (MTI) ainsi que les Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) et de Fabrication (BPF).

Les approches d'ingénierie tissulaire reposent traditionnellement sur l'utilisation de matériaux biocompatibles, façonnés pour former un échafaudage 3D (« scaffold ») sur lequel sont ensemencées des cellules vivantes avant leur maturation dans un bioréacteur. Alors, à mesure que les cellules se multiplient, elles peuplent l'échafaudage et synthétisent une matrice extracellulaire pour créer un tissu 3D.

En dépit d'investissements substantiels réalisés pour répondre aux attentes cliniques et commerciales, et alors que les réalisations scientifiques au stade de recherche préclinique ont été impressionnantes, ces approches traditionnelles d'ingénierie tissulaire peinent à la fois à fournir des résultats cliniques et à devenir rentable. En effet, un nombre très réduit de produits d'ingénierie tissulaire ont obtenu à ce jour leur autorisation de mise sur le marché, et même dans ces cas, le bénéfice thérapeutique n'a pas répondu aux attentes et la commercialisation n'était pas rentable. Ceci est illustré par le fait que trois de ces MTI ont été retirés du marché, malgré une sécurité et une efficacité suffisantes : Provenge® (2015), Chondrocelect® (2016) et MACI® (en suspension) . Pour répondre aux attentes cliniques et commerciales, la fabrication de produits d'ingénierie tissulaire fait donc l'objet de plusieurs défis qui doivent être résolus. Ceux-ci concernent :

- l'industrialisation et l'automatisation des procédés de fabrication afin d'accroître leur robustesse sachant que la fabrication des MTI est encore principalement manuelle, non supervisée et avec de multiples étapes ouvertes,

- la conformité avec les exigences réglementaires,

l'amélioration de la rentabilité et du rapport coût- efficacité en réduisant par exemple les coûts élevés de fourniture des consommables, d'installation et de possession des infrastructures (par exemple des salles blanches) et des équipements, et de main-d'œuvre spécialisée nécessaires à la réalisation des différentes opérations de préparation, fabrication et contrôle qualité de petits lots individuels en faibles volumes,

- la capacité à reproduire la complexité des tissus humains natifs (c'est-à-dire la distribution spatio-temporelle des cellules et des stimuli biochimiques, mécaniques et physiques qui contrôlent le micro-environnement cellulaire et gouvernent le comportement cellulaire et la fonction tissulaire),

- la nécessité de favoriser une vascularisation rapide après implantation afin de maintenir la viabilité cellulaire pendant la croissance des tissus, et

- dans certains cas, la capacité de personnalisation des produits d'ingénierie tissulaire afin de proposer des traitements spécifiques à un patient (par exemple en intégrant des cellules autologues et/ou des données anatomiques d'un patient).

Pour faire face aux limites des approches traditionnelles d'ingénierie tissulaire, différentes approches de bio-impression ont été proposées. Selon les ouvrages, ces procédés d'impression sont appelés bio-impression, microimpression d'éléments biologiques ou bioprinting en anglais. Celles-ci utilisent les principes de l'impression 3D, et procèdent par l'assemblage couche- par-couche des constituants des tissus biologiques (telles que les cellules et la matrice extracellulaire) selon des organisations prédéfinies par conception numérique. En dépit des analogies de principe, il convient de préciser que la bio-impression diffère de la fabrication de prothèses par impression 3D par la nature de la matière déposée (vivante et non pas inerte) ainsi que par les technologies employées.

L'utilisation principale de la bio-impression concerne la préparation de tissus vivants synthétiques pour la recherche expérimentale, en remplacement de tissus prélevés sur des êtres vivants, afin d'éviter les problèmes réglementaires et éthiques. A plus long terme, la bio-impression permettra la réalisation d'organes pour la transplantation sans risque de rejets, par exemple d'épiderme, de tissus osseux, de parties de rein, de foie ainsi que sur d'autres organes vitaux, de valves cardiaques ou de structures creuses telles que des structures vasculaires.

Le marché mondial de la bio-impression 3D a été estimé à 450 millions d'euros en 2014 et devrait augmenter de manière significative au cours de la prochaine décennie à un taux de croissance annuel d'environ 16,7%, pour atteindre 8,2 milliards d'euros d'ici 2025 1. Selon les analystes 2, le segment médical du marché de la bio-impression devrait dominer en 2022 avec plus de 30,0% grâce à l'introduction de bio-imprimantes compatibles avec la fabrication de MTI.

Etat de la technique

On connaît dans l'état de la technique la demande de brevet US2017335271 décrivant un dispositif portatif comprenant un premier élément de distribution d'un matériau structural et un second élément à usage unique de distribution d'un matériau biologique.

Le système de distribution comprend aussi une enceinte pouvant être stérilisée et au moins un ensemble bras robotique et un dispositif de distribution à 1 ' intérieur de la chambre pouvant être stérilisée. Le bras robotique est configuré pour déplacer le dispositif de distribution comprenant un premier élément de distribution et un second élément de distribution, le premier élément de distribution pouvant être raccordé de manière amovible au second élément de distribution.

Les figures 10 et 11 de ce brevet concernent principalement la manipulation de plaques à puits, avec une tête d'impression et le module d'activation logé tous les deux dans l'enceinte stérile contrairement à l'invention.

Cette solution ne permet pas la fabrication par impression additive de tissus biologiques dans des conditions optimales de stérilité .

On connaît aussi la demande de brevet américaine US2010206224 qui concerne un dispositif pour le dépôt de couches, comportant :

- un bâti muni d'une enceinte et portant en outre :

• une table destinée à supporter un objet à fabriquer,

• un dispensateur de matériau destiné à disposer ledit matériau sur la table pour former ledit objet,

• des moyens de compactage

et un organe de commande destiné à commander le dépôt de matériau sur la table,

A l'intérieur de l'enceinte sont disposés au moins ledit plateau et l'extrémité de ladite buse, et à l'extérieur de l'enceinte sont disposés au moins les moyens de déplacement de la table et du dispensateur et l'organe de commande.

Ce document ne concerne pas de pas un système de bioimpression d'un tissu biologique. La demande de brevet US2018290386 décrit un procédé de l'art antérieur avec des étapes pour créer des produits pharmaceutiques par une imprimante 3D. Un produit est imprimé en fonction des instructions. Au moins un attribut du produit est mesuré et comparé aux attributs souhaités du produit final souhaité. S'il existe une différence entre les attributs du produit et les attributs souhaités, des modifications sont apportées au jeu d'instructions et un nouveau produit est imprimé. Lorsqu'il existe une correspondance entre les attributs du produit et les attributs souhaités, un produit médical sûr et précis a été créé.

Il ne s'agit pas d'une solution pour la fabrication de tissus biologiques .

La demande de brevet US2017320263 décrit un procédé d'impression d'au moins une encre biologique, ledit procédé utilisant au moins une tête d'impression de type laser pour déposer au moins une gouttelette d'au moins une encre biologique sur une surface de dépose d'un substrat receveur, caractérisé en ce que le procédé d'impression utilise au moins une tête d'impression à buse pour déposer au moins une gouttelette d'au moins une encre biologique sur une surface de dépose du même substrat receveur que la tête d'impression de type laser. Il s'agit sans doute de l'état de la technique le plus proche, mais nécessitant un environnement de type salle blanche très contraignant pour les opérateurs.

La demande de brevet US2016297152 concerne un contenant stérilisable destiné à recevoir un ou plusieurs fluide(s) bioactif (s) et/ou un ou plusieurs fluide(s) préparatoire ( s ) comprenant :

une zone à l'intérieur du contenant configurée pour recevoir au moins un ensemble d'imprimante 3D stérilisable;

- un ensemble d'imprimante 3D stérilisable comprenant:

• au moins une plateforme d'impression;

• au moins une tête d ' imprimante permettant de distribuer un matériau structurel sur la/les plateforme ( s ) d'impression afin de former sur celle(s)-ci une structure tridimensionnelle ; et

• un mécanisme de déplacement permettant un déplacement relatif entre la/les tête(s) d'impression et la/les plateforme ( s ) d'impression, la zone étant configurée de sorte que le fluide puisse atteindre l'ensemble d'imprimante.

Inconvénient de l'art antérieur

La solution présentée par la demande internationale US2017320263 présente l'inconvénient d'impliquer le traitement d'un grand volume d'air nécessaire pour contenir l'équipement de bio-impression dans un régime aseptique, ce qui implique des débits d'air importants pour créer une surpression, avec un risque élevé de turbulences dans la zone de bio-impression, particulièrement rédhibitoire pour la reproductibilité des impressions quelle que soit la technique de bio-impression utilisée.

De plus, un tel débit nécessite un ventilateur puissant, source de vibrations et de nuisances sonores, et un filtre élaboré pour permettre le passage d'un flux d'air important tout en retenant toutes les particules.

Par ailleurs, la présence dans la chambre stérile d'équipements mécaniques conduit à la production de microparticules qui sont véhiculées par le flux d'air dans l'espace de bioimpression, ce qui va à l'encontre de l'objectif visé. Ainsi, dans les deux exemples cités dans l'art antérieur, on peut souligner que les moyens d'impression sont directement intégrés à la zone stérilisable . Or, ces éléments font partie des principaux contributeurs à la pollution particulaire dans les espaces confinés .

Enfin, lors du changement de séquence de bio-impression, le risque de pollution ou de contamination croisée entre échantillons est important, car les différents échantillons se succèdent dans la même chambre et sont interchangés en dehors des phases de stérilisation .

Solution apportée par l'invention

Afin de remédier à ces inconvénients, la présente invention concerne un procédé et une installation de fabrication par bioimpression d'un tissu biologique mettant en œuvre trois modules distincts :

• Un module d'impression intégrant la tête d'impression, impérativement placé à l'intérieur de l'enceinte stérilisable

• Un module d'activation (un laser, un transducteur,...) du transfert vers une cible des objets biologiques via la tête d'impression, impérativement placé à l'extérieur de l'enceinte stérilisable

• Un module de déplacement de la tête d'impression par rapport à la cible, positionné soit à l'intérieur, soit à l'extérieur de l'enceinte stérilisable.

L'enceinte comporte une zone d'interaction avec le module d ' activation .

L'invention concerne particulièrement un procédé et une installation d'impression additive de tissus biologiques par dépôt unitaire sur une cible d'éléments comprenant des cellules vivantes, ainsi que d'autres constituants permettant de reconstituer un tissu biologique vivant.

Selon son acception la plus générale un système de bioimpression selon la revendication 1, et optionnellement incluant des caractéristiques techniques d'une revendication dépendante, prise isolément ou en combinaison techniquement réalisables d'autres caractéristiques décrites ci-après. L'objet de l'invention est de transférer depuis une source vers une cible des objets d'intérêt biologique, comprenant des cellules vivantes (par exemple des cellules souches pluripotentes ou toutes autres cellules différenciées), parfois de types différents, ainsi que des produits biologiques tel que du collagène et plus généralement des matériaux matriciels extracellulaire.

Les objets d'intérêt biologique peuvent être réunis dans un fluide pour former une « bio-encre » contenant des particules biologiques comme par exemple des cellules vivantes. Ces bio-encres sont alors préparées et conditionnées sous une forme stérile, pour pouvoir être utilisées pour imprimer un tissu biologique le moment venu .

La bio-impression désigne au sens du présent brevet la structuration spatiale de cellules vivantes et d'autres produits biologiques, par un procédé réalisant une structuration géométrique, notamment un empilement de couches formées par des dépôts individualisés d'objets d'intérêt biologique, assistée par ordinateur pour développer des tissus vivants et des organes pour l'ingénierie tissulaire, pour la médecine régénérative, la pharmacocinétique et plus généralement la recherche en biologie. La bio-impression consiste à déposer simultanément des cellules vivantes et des biomatériaux couche par couche pour fabriquer des tissus vivants tels que des structures artificielles de la peau, de valves cardiaques, de cartilages, de tissus du cœur, des reins, du foie ainsi que sur d'autres organes vitaux ou des structures creuses telles que la vessie ainsi que des structures vasculaires.

L'invention concerne aussi une cassette pour un système de bio-impression susvisé caractérisé en ce qu'elle est constituée par une enceinte fermée stérilisable constituant l'enveloppe d'un module d'impression.

L'invention concerne encore un procédé de bio-impression pour la fabrication d'un matériau biologique structuré, à partir de matériaux dont une partie au moins est constituée de particules biologiques (cellules et dérivés cellulaires) consistant à commander le déplacement d'au moins une cible par l'intermédiaire d'un robot dans trois dimensions en regard d'au moins une tête d'impression placés dans une enceinte fermée et stérile, ladite tête d'impression étant alimentée et commandée depuis l'extérieur de ladite enceinte afin de garantir la sécurité du tissu fabriqué au regard des exigences réglementaires du domaine clinique.

Description détaillée d'un exemple non limitatif de

1 ' invention

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de l'invention qui suit, se référant aux dessins annexés où :

- la figure 1 représente une vue schématique d'une première variante d'une bio-imprimante selon l'invention ;

- la figure 2 représente une vue schématique d'une deuxième variante d'une bio-imprimante selon l'invention ;

- la figure 3 représente une vue schématique d'une troisième variante d'une bio-imprimante selon l'invention ;

- la figure 4 représente une vue schématique d'une quatrième variante d'une bio-imprimante selon l'invention ;

- la figure 5 représente une vue schématique d'une cinquième variante d'une bio-imprimante selon l'invention ;

- la figure 6 représente une vue selon en perspective, de face d'un exemple de réalisation de l'invention ;

- la figure 7 représente une vue selon en perspective, de coté d'un exemple de réalisation de l'invention ;

- la figure 8 représente une vue schématique d'une variante de réalisation sous la forme d'une cassette rigide ; - la figure 9 représente une vue schématique d'une variante de réalisation sous la forme d'une cassette souple

- la figure 10 représente une vue d'une installation selon l'invention avec une boîte à gants stérile

- la figure 11 représente une vue d'une installation selon l'invention avec une boîte à gants stérile

- la figure 12 représente une vue d'une installation selon l'invention avec un système alpha de transfert avec inter verrouillage sécurisé avec un conteneur de type Béta.

Description schématique de la bio-imprimante

Les figures 1 à 5 représentent des vues de variantes de réalisation de l'architecture matérielle d'une bio-imprimante selon l'invention. Elle est composée de plusieurs organes essentiels :

• Une tête d'impression additive (1) dont la configuration dépend de la technologie mise en œuvre, comprenant une zone de transfert de la bio-encre constituée d'objets d'intérêt biologique et une cible (6).

• Une ou plusieurs sources (2) d'alimentation de la tête d'impression additive (1) en bio-encre constituée d'objets d'intérêt biologique.

• Un ensemble mécatronique (3) assurant le déplacement relatif de la zone de transfert par rapport à la cible (6).

• Éventuellement, une zone de maturation (4).

• Un moyen d'activation de l'impression (5) dont la configuration dépend de la technologie mise en œuvre.

On entend par « tête de bio-impression » la partie du système de bio-impression formée par le support recevant la bio- encore ou plus généralement les objets d'intérêt biologique à transférer vers la cible, et présentant la zone de sortie des objets d'intérêt biologiques vers la cible, mais ne comprenant pas les moyens d'activation, par exemple :

- Pour la bio-impression laser, la tête de bio-impression ne comprend pas le laser et les composants optiques pour une bioimpression par laser impulsionnel

- Pour la bio-impression par jet d'encre ou microvanne, la tête de bio-impression ne comprend pas les moyens de génération électrique qui permettent d'activer l'actionneur (vanne / piezo)

- Pour la bio-impression par micro-extrusion, la tête de bioimpression ne comprend pas les pousses-seringues

De façon générale, on distinguera dans un équipement de bioimpression biologique deux parties :

- Une partie désignée au sens du présent brevet par « tête d'impression (1) », constituée par la partie terminale de l'équipement, recevant la bio-encre et/ou les objets d'intérêts biologiques à transférer ainsi que les interfaces pour les organes d'activation du transfert

Une partie désignée au sens du présent brevet par « moyen d'activation (5) », physiquement séparable de la tête d'impression (1), et couplable mécaniquement, électriquement, acoustiquement ou optiquement avec la tête de bio-impression (1), comportant l'ensemble des moyens permettant de commander le transfert physique d'un objet d'intérêt biologique présent dans la tête de bio-impression vers la cible.

L'invention vise à optimiser la zone stérile, et pour cela : a) la tête d'impression (1) est impérativement placée dans une enceinte (10) stérilisable,

b) le moyen d'impression (5) est impérativement placé à l'extérieur de l'enceinte (10) stérilisable, c) une zone d'interaction étanche (20) permet l'activation de la tête d'impression (1) par le moyen d'impression (5).

Les autres composants de la bioimprimante peuvent être placés dans l'enceinte stérilisable (10) ou en dehors de cette enceinte (10).

En particulier, la source d'alimentation (2) peut être associée à la tête d'impression (1) dans l'enceinte stérilisable (10), qui forme alors une cassette pouvant être introduite dans une bioimprimante, puis retirée pour la maturation du tissu imprimé .

L'ensemble mécatronique (3) de déplacement de la cible (6) par rapport à la source peut également être associé à la tête d'impression (1) à l'intérieur de l'enceinte (10) stérilisable, avec ou sans la source d'alimentation (2).

La chambre de maturation (4) peut également être associée à la tête d'impression (1) à l'intérieur de l'enceinte (10), avec ou sans la source d'alimentation (2) et/ou l'ensemble mécatronique (3) de déplacement.

Alternatives réalisation

L ' invention peut être implémentée de dif férentes manières .

La figure 1 représente une vue générique où l'enceinte stérilisable (10) contient :

- Obligatoirement la tête d'impression (1) et optionnellement une enceinte de maturation (4) dans laquelle est disposée la cible recevant les objets d'intérêt biologique transférés

- Optionnellement la source d'alimentation (2), par exemple le réservoir de bio-encre et le système d'alimentation, qui, selon l'invention peut aussi être disposé dans une zone non stérile, avec un connecteur pour le transfert stérile des objets d'intérêt biologique dans l'enceinte stérilisable (10) - Optionnellement , le moyen de déplacement (3) de la tête d'impression (1) qui, selon l'invention peut aussi être disposé dans une zone non stérile, avec un connecteur mécanique stérile .

Le moyen d'activation (5), par exemple le laser et les composants optiques associés est disposé en dessous de cette enceinte stérilisable (10), une fenêtre transparente (20) formant l'interface permettant le passage des faisceaux lumineux. Le moyen d'activation (5) n'est pas disposé dans une zone stérile.

La figure 2 représente une variante où tous les constituants, à l'exception du moyen d'activation (5), sont placés dans l'enceinte stérilisable (10).

La figure 3 représente une variante où tous les constituants, à l'exception du moyen d'activation (5) et du moyen de déplacement (3) de la tête d'impression (1), sont placés dans l'enceinte stérilisable (10). Le couplage entre la tête d'impression (3) et le moyen de déplacement (3) est réalisé par exemple par une transmission magnétique ou par une articulation stérile traversant la paroi de l'enceinte stérilisable (10).

La figure 4 représente une variante où seule la tête d'impression (1) et une zone de maturation (4) sont placées dans l'enceinte stérilisable (10). Tous les autres constituants, notamment le moyen d'activation (5) et le moyen de déplacement (3) ainsi que la source d'alimentation (2) sont en dehors de l'enceinte stérilisable .

La figure 4 représente une variante où seule la tête d'impression (1) et une zone de maturation (4) sont placées dans l'enceinte stérilisable (10), ainsi que le moyen de déplacement (3). Tous les autres constituants, notamment le moyen d'activation (5) et ainsi que la source d'alimentation (2) sont en dehors de l'enceinte stérilisable. La figure 5 représente une variante où la tête d'impression (1), une zone de maturation (4) et le bras robotisé (3) assurant le déplacement relatif de la tête d'impression (1) par rapport à la cible, sont placées dans l'enceinte stérilisable (10. Seuls le moyen d'activation (5) et la source d'alimentation (2) sont en dehors de l'enceinte stérilisable.

Description d'un exemple de réalisation

La bioimprimante est constituée par un châssis dont la partie inférieure (11), non stérilisable, contient le moyen d'activation (5), par exemple la tête optique, le laser et les systèmes d'imagerie pour une imprimante laser.

Ce bâti est surmonté par une enceinte stérilisable (10) constituée par une chambre en pression positive alimentée par une soufflerie (15) par l'intermédiaire d'une cartouche filtrante (16). Un bras robotisé (3) placé dans cette enceinte stérilisable (10) assure le déplacement d'une cible (6) par rapport à une tête d'impression (1). Une fenêtre étanche (20) permet la transmission du faisceau laser et des faisceaux d'imagerie entre l'enceinte stérilisable (10) et le moyen d'impression (5) placé en zone non stérilisable .

L'enceinte (10) est fermée par une paroi vitrée (22) traversées par des interfaces (21) pour des gants de manipulation stériles .

Elle présente un système de transfert (23) fermé par une partie alpha (24), qui permet de déplacer un matériau, par exemple une cartouche de bio-encre, d'une zone stérile à l'autre en passant par une zone non stérile, grâce à un raccordement étanche et sans risque .

Un tel système permet de répondre aux exigences relatives aux bonnes pratiques de fabrication (BPF, en anglais Good Manufacturing Practices ou GMP) établies par la Commission européenne dans le cadre du développement des "démarches qualité" et qui s'attachent à limiter deux catégories de risques :

•les risques de contamination croisée des produits (par un autre produit, ou un contaminant interne et externe) ; •les risques de confusion notamment au niveau des étiquetages et de l'identification des composants.

Elles insistent sur les pratiques d'hygiène et d'organisation qui doivent être mises en place à tous les niveaux.

Variante mettant en œuyre une « boite à gant » ou une trappe étanche

L'enceinte stérilisable (10) présente selon une variante non illustrée un mécanisme de commande d'un dispositif étanche permettant d'effectuer ces tâches dans une atmosphère aseptique ou exempte de poussière, à l'intérieur de cette enceinte, pour la manipulation manuelle d'objets ou de produits. La paroi de l'enceinte (10) présente par exemple une bride dont la périphérie extérieure est équipée d'oreilles destinées à coopérer avec une empreinte de la bride de la boîte à gant.

La bride de l'enceinte (10) est introduite dans la bride de la boîte à gant.

L'enceinte stérilisable (10) peut aussi comporter une trappe montée dans une bride pour la communication avec une autre enceinte stérilisable, par exemple pour la maturation après impression.

Variante mettant en œuyre une cassette

Selon une variante de la présente invention, le système d'isolation de la bio-impression est basé sur une cassette stérilisable contenant la cible (6) et la tête d'impression. Elle est constituée d'interfaces stériles / étanches (porte DPTE, beta- bag, fenêtre optique, injecteur ) permettant de la connecter à au moins une source d'alimentation en objets d'intérêt biologique transférables pour l'impression, à un ou plusieurs moyens d'activation, à un moyen de couplage mécanique pour le déplacement de la cible (6) par rapport à la tête et à des éléments nécessaires pour la maturation (milieux de culture, C02 , 02, ...). La cassette peut servir à la maturation. Elle est transportable entre le système d'impression et un incubateur.

La source d'alimentation en objets d'intérêt biologique transférables pour le procédé d'impression peut être connectée à un automate de culture cellulaire constitué par un réservoir dédié.

Cette solution permet la biofabrication selon un procédé conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF, en anglais Good Manufacturing Practices ou GMP) dans une enceinte confinée permettant d'éviter les risques de pollution biologique.

La cassette est couplée à des moyens de caractérisation du tissu ou de l'organe (caractérisation en ligne du tissu en cours de fabrication ou après sa fabrication (imagerie, spectroscopie Raman, OCT, analyse physico-chimique).

La cassette peut prévoir une seule fenêtre, plusieurs fenêtres, des fenêtres des deux côtés (faces avant et arrière) etc.

Le système comporte optionnellement pour la phase de maturation (bioréacteur) des moyens de contrôle et de régulation des éléments suivants:

- pH (plage de détection de pH 0-14 et précision 0,01 par régulation Na0H/C02),

- Température (contrôlée avec Peltier, double enveloppe, cryostat ) ,

- 02 dissous (par mesure de débit de gaz par exemple),

- hygrométrie, - moyens permettant de prélever ou changer le milieu de culture ,

moyens d'agitation et de perfusion,

- etc ...

La cassette comporte optionnellement un identifiant du tissu à imprimer et des paramètres d'impression associés (séquence, sources, modèle CAO...) en lien avec des bases de données (cassette connectée). L'identifiant peut être de type graphique (par exemple code barre ou code matriciel QRcode) ou numérique, par exemple sous forme d'une séquence numérique enregistrée dans une mémoire d'une étiquette radiofréquence de type RFT. Une telle solution permet de sécuriser le processus d'impression. La cassette est optionnellement équipée d'une carte interface réseau, type port Ethernet, pour le contrôle du procédé de fabrication et d'acquisition de données, pour la gestion des alarmes, pour la sauvegarde de l'expérience sur disque dur local, pour informer l'utilisateur en temps réal par SMS, e-mail...

Installation avec boite à gants

Les figures 10 et 11 illustrent des exemples d'installation avec boîtes à gants (25).

La mise en oeuvre des modalités d'impression dans le contexte d'une boite à gants équipée de trappes étanches (21) peut prendre la forme suivante:

• Impression par laser: Le module d'impression par laser (1) est constitué d'au moins une tête laser et d'une cible (6). La tête laser est constituée d'une surface plane transparente (appelée aussi donneur) sur laquelle un film d'encre est déposé. La source d'alimentation en encre (2) de ladite tête est constituée soit par un réservoir qui a été placé dans l'enceinte stérile grâce à l'utilisation d'un SAS (étalement manuel de l'encre sur la surface du donneur grâce au gant étanche ou grâce au robot associé à un pipetteur) soit par un réservoir et une pompe (travaillant en pression ou en débit) localisés en dehors de l'enceinte (étalement automatique de l'encre par des moyens fluidiques). Le moyen d'activation (5) du transfert de l'encre vers la cible (6) est constitué par un laser situé à l'extérieur de l'enceinte. Le moyen d'interaction étanche (20) est dans ce cas un hublot optique étanche transparent à la longueur d'onde du laser. Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé 6 axes.

• Impression par microvanne: Le module d'impression par microvanne (1) est constitué par une cible et une ou plusieurs vannes équipées d'une aiguille pouvant avoir différentes formes, longueurs et diamètres d'ouverture (6). La source d'alimentation (2) en encre de ladite vanne est constituée par un réservoir et une pompe de mise sous pression situés en dehors de l'enceinte. Le moyen d'activation (5) du transfert de l'encre vers la cible (6) est constitué par un obturateur, de type piézoélectrique ou un solénoïde. Le moyen d'interaction étanche (20) peut être dans ce cas un connecteur, un opercule (septum) perforable ou un joint étanche. Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé 6 axes.

• Impression par extrusion: Le module d'impression par extrusion (1) est constitué par une cible et un réservoir final équipé d'une aiguille pouvant avoir différentes formes, longueurs et diamètres d'ouverture (6). La source d'alimentation (2) en encre de ladite extrudeuse est constituée par un réservoir initial et une pompe de mise sous pression situés en dehors de l'enceinte. Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est constitué par le système de mise en pression. Le moyen d'interaction étanche (20) peut être dans ce cas un connecteur, un opercule (septum) perforable ou un joint étanche. Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé 6 axes.

Grâce à ce genre de configuration, la fabrication de tissus répondant aux exigences de fabrication GMP est possible. Ainsi, des lots cliniques peuvent être produits en toute sécurité pour le patient. A titre illustratif, on peut citer l'exemple de la fabrication d'un substitut de peau autologue ou allogénique pour des applications de médecine régénérative . Ainsi, les différentes modalités citées ici permettent tour à tour de fabriquer :

• un derme constitué d'une alternance de couches de biomatériaux (type collagène) imprimés soit par microvanne soit par extrusion et de couches cellulaires (type fibroblastes) imprimées par laser. La précision des patterns cellulaires permet d'assurer une structure et une fonction du derme proche de celle d'une peau native après maturation.

• Un épiderme constitué d'une couche à confluence de cellules (type kératinocytes) imprimée par laser.

La maturation de ce derme est réalisée en incubateur soit à l'intérieur soit en dehors de l'enceinte stérile en fonction de la disposition dudit incubateur. A la fin de cette étape, la peau a atteint sa maturité et peut être implantée chez un patient.

Applications à la fabrication de tissus biologiques

La configuration cassette est particulièrement adaptée à la fabrication d'un ou plusieurs tissus ou organes biologiques, destinés par exemple à la fabrication de tissus autologues.

Un tissu ou un organe peuvent être basés sur l'utilisation de plusieurs cassettes pour des raisons de maturation différenciée, de compatibilité du module d'impression avec un seul type cellulaire,...

Un autre intérêt de la cassette réside dans le fait qu'elle peut être introduite dans le bloc opératoire après une ultime étape de stérilisation et ouverte au plus près du patient.

Le substrat pourrait être encapsulé dans un module retirable de la cassette afin d'être placé dans un bioréacteur dédié.

La cassette peut être pour tout ou partie à usage unique.

La cassette peut être réutilisable après stérilisation interne et externe.

L'enveloppe de la cassette peut être rigide ou souple (éthylène vinyle acétate, PVC, thermoplastiques de type PU, Polyéthylène basse densité, de type matériaux de transfusion, silicone, métalliques (inox 304L, 316L) ou plastique ( polycarbonate par exemple).

Cassette rigide

La figure 4 représente un exemple de réalisation de l'invention sous la forme d'une cassette rigide. Elle permet d'utiliser un équipement principal constitué par les parties complexes et coûteuses, à savoir le moyen d'activation avec une ou plusieurs têtes d'impression par exemple laser, un moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) et l'ensemble des moyens informatiques et optiques.

La cassette est constituée par une enceinte fermée stérilisable (10) configurée pour permettre son positionnement sur cet équipement pour une opération spécifique.

La cassette renferme dans l'enceinte fermée et stérilisable

(10) les moyens spécifiques à savoir : - le module d'impression (100) constitué par la cible (6) (110) sur laquelle sont déposés les objets d'intérêt biologique constituant les tissus à fabriquer,

- des tiges de liaison (131, 132, 133) assurant le couplage avec les moyens de déplacement relatifs et traversant l'enceinte (10) par des joints étanches (134, 135, 136). Ces tiges de liaison (131, 132, 133) sont destinées à transmettre les mouvements des organes de déplacement relatifs de la cible (6) par rapport à la source selon les trois axes X, Y, Z,

- le module d'impression (1) qui est constitué par un support d'écoulement d'un fluide portant les objets d'intérêt biologique transférables avec un conduit d'alimentation (141) et un conduit de sortie (142), raccordés à des réservoirs (143, 144) extérieurs à l'enceinte (10).

Ledit moyen d'activation (5) est situé à l'extérieur de ladite enceinte fermée stérilisable (10) et interagit avec le module d'impression (1) par l'intermédiaire d'une fenêtre (140).

L'accouplement entre la cassette et l'équipement fixe est assuré par des aimants entourant la fenêtre (140).

Cette cassette permet de préparer un tissu en la positionnant sur l'équipement principal, puis d'assurer la maturation des tissus bioimprimés dans un autre site, par exemple dans une enceinte de maturation .

Cassette souple

La figure 5 représente un exemple de réalisation de l'invention sous la forme d'une cassette souple. Elle diffère de la cassette rigide par le fait que l'enceinte stérilisable présente des parois (200) souples reliant une face supérieure (210) rigide et une face inférieure (220) rigide, présentant la fenêtre (140).

La face supérieure présente deux griffes (211, 212) situées à l'intérieur de l'enceinte stérilisable, pour recevoir la cible (6) sur laquelle se déposent les éléments biologiques transférés depuis la bioencre constituée d'objets d'intérêt biologique transférables (148).

Alternatives de réalisation

Quelle que soit la technologie de bio-impression employée, une bio-imprimante est traditionnellement composée de plusieurs organes essentiels :

- une ou plusieurs têtes d'impression comprenant une zone de transfert de la bio-encre constituée d'objets d'intérêt biologique,

- une ou plusieurs sources (2) d'alimentation de la tête d'impression (1) en bio-encre constituée d'objets d'intérêt biologique,

- une cible ( 6 ) ,

un ensemble mécatronique (3) assurant le déplacement relatif de la zone de transfert par rapport à la cible (6),

- un moyen d'activation (5).

- éventuellement, une zone de maturation (4).

Selon une première variante, l'encre biologique est stockée dans un réservoir et passe à travers des buses ou des capillaires pour former des gouttelettes qui sont transférées sur une cible ( 6 ) .

Cette première variante d'impression dite à buse regroupe la bioextrusion, l'impression jet d'encre ou l'impression par microvanne. Pour pouvoir notamment atteindre un niveau de résolution plus élevé et accroître la viabilité des cellules imprimées, un procédé d'impression d'éléments biologiques sans buse a été développé. Ce procédé d'impression appelé bio-impression par laser, est également connu sous le nom de « Laser-Assisted Bioprinting » (LAB) en anglais.

Concernant la bioextrusion, différents moyens d'activation de l'impression ont été mis en œuvre : une vis sans fin, un piston ou encore un système pneumatique. Elle permet de travailler avec une densité cellulaire importante de l'ordre de 100 millions de cellules par millilitre et une résolution de l'ordre du millimètre. La bioextrusion consiste à pousser mécaniquement des éléments biologiques placés dans une micro-seringue à travers une buse ou une aiguille de quelques centaines de micromètres de diamètre. L'avantage de cette technologie repose sur son faible coût et sa simplicité de mise en œuvre. Par contre, elle souffre de limites associées à une résolution grossière et une mortalité cellulaire non négligeable liée au cisaillement imposé aux cellules lors de leur passage à travers la buse.

Concernant la bio-impression par jet d'encre, elle consiste à projeter des micro-gouttelettes d'un liquide contenant des cellules ou un biomatériau sur un substrat. La projection est provoquée par un procédé thermique ou piézoélectrique. L'impression jet d'encre thermique fonctionne via l'activation transitoire d'une résistance électrique (à fort effet thermique) qui produit une bulle de vapeur qui propulse une gouttelette au travers d'un orifice de 30 à 200 mpi de diamètre. Les imprimantes jet d'encre piézo-électriques utilisent une impulsion électrique qui génère une modification de forme d'un cristal piézo-électrique qui contracte le réservoir d'encre. La détente du cristal entraîne l'éjection de la goutte. Cette technique présente l'avantage d'être rapide, que ce soit au niveau du temps de préparation ou de la vitesse d'impression. En revanche, les principaux inconvénients de cette technologie concernent la concentration cellulaire à ne pas dépasser lors de l'impression (inférieure à 5 millions de cellules/mL) pour prévenir l'obstruction des têtes d'impression, ainsi que la mortalité cellulaire qui résulte de la contrainte de cisaillement sur les cellules au moment du passage par l'orifice. L'impression jet d'encre, qu'elle soit par technologie piézoélectrique ou thermique, permet d'obtenir une résolution meilleure de l'ordre de 10 mpi.

Concernant l'impression par microvanne le moyen d'activation de l'impression est la mise sous pression du liquide par de l'air comprimé. Le liquide à imprimer est libéré par actionnement d'une valve solénoide. La bio-impression par micro-vanne est proche des technologies jet d'encre mais diffère par le fait que le jet d'encre se forme par la mise sous pression de l'encre puis l'ouverture rapide d'une électrovanne. Présentant les mêmes contraintes que la bio-impression jet d'encre, cette technologie présente par contre l'avantage de pouvoir imprimer des solutions plus visqueuses que les systèmes jet d'encre. Typiquement la pression est de quelques centaines de mbars à quelques bars et permet d'obtenir une densité cellulaire moindre de l'ordre de quelques millions de cellules par millilitre et une résolution de l'ordre de quelques dizaines de miki.

La bio-impression par laser permet d'imprimer des encres présentant une forte densité cellulaire de l'ordre de 100 millions de cellules par millilitre avec une résolution de 10 mpi. Un dispositif d'impression d'éléments biologiques par laser qui repose sur la technique dénommée « Laser-lnduced Forward Transfer » (LIFT) en anglais, comprend une source laser pulsée émettant un faisceau laser, un système pour focaliser et orienter le faisceau laser, un support donneur qui comporte au moins une encre biologique et un substrat receveur positionné de manière à recevoir des gouttelettes émises depuis le support donneur. Selon cette technique d'impression, le faisceau laser est pulsé et à chaque impulsion une gouttelette est générée. L'encre biologique comprend une matrice, par exemple un milieu aqueux, dans laquelle sont présents des éléments, par exemple des cellules, à déposer sur le substrat receveur. Le support donneur comprend une lame transparente à la longueur d'onde du faisceau laser qui peut être revêtue d'une couche absorbante (métallique, polymère, etc) ou pas (« sacrificial layer free LIFT » en anglais) selon les configurations sur laquelle est apposée l'encre biologique sous la forme d'un film.

D'autres procédés optiques /laser peuvent être mis en œuvre en substitution ou en complément de la bio-impression par laser (imagerie de la surface du donneur / système de viser - tirer / photo-polymérisation, texturation, cavitation, découpe...) combiné à un balayage laser à l'aide de miroirs galvanométriques afin de réaliser des motifs sur le substrat receveur.

Quelle que soit la technologie employée, la fabrication d'un tissu biologique par bio-impression se décompose en cinq étapes :

- un prétraitement pour la Conception Assistée par Ordinateur (CAO) d'un modèle numérique qui va définir l'architecture du tissu biologique, c'est à dire la position dans l'espace (x, y, z) de l'ensemble des constituants du tissu,

la programmation des paramètres d'impression des bioencres (contenant des cellules et/ou des biomatériaux) qui conduit à définir les paramètres physiques de l'imprimante et la trajectoire des têtes d'impression,

- la préparation et la formulation des bio-encres constituées d'objets d'intérêt biologique transférable,

l'impression automatisée, couche-par-couche, des bioencres à l'aide de bio-imprimantes utilisant diverses technologies, la maturation du tissu imprimé qui s'effectue en bioréacteur pour permettre aux cellules de s ' auto-organiser jusqu'à faire émerger les fonctions biologiques spécifiques recherchées. En amont de cette séquence, des reconstructions tomographiques peuvent être réalisées, par exemple, grâce aux imageries microscopiques, histologiques ou médicales ; en aval, les tissus biologiques bio-imprimés sont conditionnés avant d'être acheminés vers l'utilisateur.

Les trois dernières étapes de la séquence de fabrication ci- dessus, ainsi que l'étape de conditionnement, doivent être menées dans un environnement parfaitement stérile et libre de toute particule susceptible de contaminer le tissu bio-imprimé, ce qui risquerait d'altérer sa croissance lors de la maturation et sa fonctionnalité, et/ou d'infecter le patient après implantation du tissu.

Pour cette raison, ces étapes sont réalisées dans une enceinte fournissant une atmosphère stérile contrôlée et un environnement propice au développement des tissus.

Impression par laser

L'ensemble d'impression (1) est constitué par une ou plusieurs têtes laser et une cible (6).

La ou les têtes laser sont constituées d'une surface plane transparente sur laquelle un film d'encre est déposé soit manuellement par le biais d'une boite à gants, soit par le robot, soit par des moyens fluidiques liés à la source d'alimentation (2).

La source d'alimentation (2) de ladite tête est constituée par un réservoir et une pompe de mise sous pression ou travaillant en débit.

Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est constitué par un laser situé à l'extérieur de l'enceinte. Le moyen d'interaction étanche (20) est dans ce cas un hublot optique étanche transparent à la longueur d'onde du laser.

Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé ou un actionneur mécatronique .

L'enceinte fermée stérilisable correspond à l'une quelconque des configurations précédemment décrites.

Impression par vanne

L'ensemble d'impression (1) est constitué par une ou plusieurs vannes et une cible (6).

La source d'alimentation (2) de ladite vanne est constituée par un réservoir et une pompe de mise sous pression.

Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est constitué par un obturateur, de type piézoélectrique ou un solénoïde.

Le moyen d'interaction étanche (20) est dans ce cas un opercule perforable ou un joint étanche.

Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé ou un actionneur mécatronique.

L'enceinte fermée stérilisable correspond à l'une quelconque des configurations précédemment décrites.

Impression par extrusion

L'ensemble d'impression (1) est constitué par une ou plusieurs buses d'extrusion, et une cible (6).

La source d'alimentation (2) de ladite buse est constituée par un réservoir et une pompe de mise sous pression.

Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est une commande d'alimentation de la buse, par exemple une commande mécanique par une vis sans fin, ou un piston, ou une commande pneumatique directe.

Le moyen d'interaction étanche (20) est dans ce cas un opercule perforable ou un joint étanche.

Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé ou un actionneur mécatronique .

L'enceinte fermée stérilisable correspond à l'une quelconque des configurations précédemment décrites.

Impression par jet d'encre

L'ensemble d'impression (1) est constitué par une ou plusieurs têtes d'impression par jet d'encre, et une cible (6).

La source d'alimentation (2) de ladite tête d'impression par jet d'encre est constituée par un réservoir et une pompe d ' alimentation .

Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est une commande piézoélectrique, acoustique, thermique, laser,...

Le moyen d'interaction étanche (20) est dans ce cas un opercule perforable ou un joint étanche.

Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé ou un actionneur mécatronique.

L'enceinte fermée stérilisable correspond à l'une quelconque des configurations précédemment décrites.

Impression par ondes acoustiques

L'ensemble d'impression (1) est constitué par une ou plusieurs têtes d'impression acoustiques, et une cible (6).

La source d'alimentation (2) de ladite tête d'impression acoustique est constituée par un réservoir et une pompe d ' alimentation .

Le moyen d'activation (5) du transfert desdits objets biologiques vers la cible (6) est un transducteur, un laser, etc...

Le moyen (3) de déplacement relatif de la tête d'impression par rapport à la cible (6) est constitué par un bras robotisé ou un actionneur mécatronique .

L'enceinte fermée stérilisable correspond à l'une quelconque des configurations précédemment décrites.

Bien entendu, ces variantes de réalisation ne sont pas limitatives, l'invention s'étendant à toute technique de dépose d'un élément biologique vers une cible (6) de manière contrôlée pour la fabrication d'un tissu biologique.