Die Endometriose ist die zweithäufigste Frauenkrankheit und wird als das Vorkommen von Gebärmutterschleimhautzellen außerhalb der Gebärmutter definiert. Von der Endometriose ist etwa jede fünfte Frau im reproduktions- fähigen Alter betroffen, bei Frauen mit Fruchtbarkeitsproblemen sogar jede zweite.

Unter normalen Umständen findet sich Gebärmutterschleimhaut (Endometri- um) auschließlich in der Gebärmutter. Bei der Endometriose-Erkrankung findet man außerhalb der Gebärmutter Gewebe, das histologisch wie Gebärmutterschleimhaut aussieht, beispielsweise außen an der Gebärmutter, am Darm oder sogar in der Bauchspeicheldrüse oder Lunge. Obwohl diese Endometriose-Herde außerhalb der Gebärmutter lokalisiert sind, bluten sie ebenfalls während der Menstruation, werden also durch die Hormone des weiblichen Zyklus beeinflußt. Da die Endometriose-Herde ebenso wie die Gebärmutterschleimhaut im Zyklus Volumenänderungen durchlaufen, können je nach Lokalisation durch diese Veränderungen Schmerzen verursacht werden. Darüber hinaus reagiert der Körper mit einer Entzün- dungsreaktion auf die Endometriose-Zellen, was wiederum Schmerzen auslöst. Weiterhin führt die Entzündung zu Verwachsungen im Bereich der Eierstöcke und Eileiter und ist hierdurch verantwortlich für eine sog. mechanische Sterilität der betroffenen Frauen. Offenbar werden bei der Endometriose jedoch auch Botenstoffe (z. B. Zytokine, Prostaglandine)

freigesetzt, die selbst bei nichtvorhandenen Verwachsungen die Fertilitat der betroffenen Frauen mindern können.

Aufgrund ihrer patho-biologischen Eigenschaften könnte man Endometriose- Zellen zwischen normale Zellen und Tumorzellen einordnen : Einerseits zeigen sie kein neoplastisches Verhalten, andererseits haben sie jedoch wie metastasierende Tumorzellen die Fähigkeit, sich organgrenzüberschreitend im Organismus zu bewegen und in andere Organe einzuwachsen, d. h. sie zeigen invasives Verhalten. Aus diesem Grunde werden Endometriose-Zellen in der Literatur als"gutartige Tumorzellen"definiert, obwohl in derartigen Zellen bisher keine tumorspezifischen Mutationen in Proto-Onkogenen gefunden wurden.

Da bis heute die Pathogenese der Endometriose noch völlig ungeklärt ist, gibt es bisher noch keine wirksame Therapie-oder Präventionsmöglichkeiten von Endometriose-assoziierten Krankheiten.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Gene zu identifizieren, die bei invasiven Prozessen eine Rolle spielen und die mit dem pathophysiologi- schen Phänotyp der Endometriose assoziiert sein können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelost durch die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens, das als Endometriose- assoziertes Gen bezeichnet wird und für ein Polypeptid kodiert. Diese Gensequenz wurde mit Hilfe der Differential-Display-RT-PCR (Liang und Pardee, Science 257 (1992), 967-971) entdeckt. Hierzu wurden invasive und nichtinvasive Varianten einer Endometriosezellinie miteinander ver- glichen. Dabei stieß man auf eine cDNA-Sequenz, welche spezifisch für die invasive Variante der Endometriose-Zellen ist. Man fand eine zugehörige RNA von 4 kb Länge. Eine entsprechende aus einer cDNA-Phagenbank isolierte cDNA weist einen offenen Leserahmen (ORF) von 302 Aminosäuren auf.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, welche (a) die in SEQ ID NO. 1,3 oder/und 5 dargestellte Nukleotidsequenzen, eine Kombination oder einen Protein-kodierenden Abschnitt davon, (b) eine der Sequenz aus (a) im Rahmen der Degeneration des geneti- schen Codes entsprechende Nukleotidsequenz oder (c) eine mit den Sequenzen aus (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz umfaßt.

Diese Nukleinsäuren kodieren vorzugsweise für ein Polypeptid, das mit invasiven Prozessen assoziiert ist, oder einen Abschnitt davon.

In der EMBL-EST-Datenbank sind die folgenden Nukleotidsequenzen mit den folgenden Zugriffsnummern abgelegt : Z98886, Ac003017, AL023586, Aa452993, Aa452856. Diese Sequenzen stellen keine erfindungsgemäßen Nukleinsäuren dar. Die ersten beiden dieser Sequenzen sind DNAs, die aus Menschenhirn isoliert wurden und jeweils mit den Abschnitten von Nukleotid 970 bis ca. 2000 und von 760 bis ca. 1450 eine über 90% ige Basenidentität zeigen mit SEQ ID NO. 1, bzw. mit den Abschnitten von Nukleotid 1054 bis zu 2084 und von 844 bis ca. 1534 bezogen auf SEQ ID NO. 3, welche am 5'-Ende 84 zusätzliche Basen aufweist. AL023586 ist ebenfalls eine meschliche Sequenz, die Z98885 sehr ähnlich ist und ebenfalls mit SEQ ID NO. 1 im Bereich von 970 bis ca. 2000 Homologie aufweist.

Die Sequenzen Aa452993 und Aa452856 stammen aus Mausembryonen und zeigen Basenidentität mit den Nukleotiden (nt) von ca. 1060 bis ca.

1450 bzw. von ca. 24 bis 440 von SEQ ID NO. 1 bzw. von ca. 1144 bis ca. 1534 bzw. von ca. 108 bis ca. 524 gemäß den Nukleotidpositionen in SEQ ID NO. 3. Keiner dieser 4 Sequenzen ist bisher ein Leseraster oder eine Funktion zugeordnet worden.

Die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nukleotidsequenz enthalt einen offenen Leserahmen, welcher einem Polypeptid mit einer Länge von 302 Aminosäu- ren entspricht. Dieses Polypeptid ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz angegeben. SEQ ID NO. zeigt eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO. 1, weist jedoch am 5'-Ende 84 zusätzliche Nukleotide auf. Dadurch verschieben sich die Positionen der einander entsprechenden Nukleotide um jeweils 84 Nukleotide. Das von SEQ ID NO. 3 kodierte Polypeptide weist somit am N-Terminus 28 zusätliche Aminosäuren auf und ist mit seinen insgesamt 330 Aminosäuren in SEQ ID NO. 4 dargestellt. SEQ ID NO. 2 und 4 stellen einen Abschnitt des C-terminalen Endes des nativen Polypeptids dar.

Zur Veranschaulichung wird auf Figur 1 verwiesen, welche eine schema- tische Darstellung der cDNA des erfindungsgemäßen Endometriose- assoziierten Gens zeigt. Zu sehen sind 5 Exons E1 bis E5 sowie die Position des in der DDRT-PCR als Sonde verwendeten Fragments 1 (394 nt).

Ebenfalls dargestellt sind die Positionen der PCR-Primer (siehe Beispiel 4, Tabelle 1), die für die RT-PCR verwendet wurden.

In Figur 1 nicht dargestellt ist ein weiteres Exon 4a, dessen Nukleotidse- quenz in SEQ ID NO. 5 gezeigt ist. Dieses Exon 4a kann vorhanden sein.

Falls es vorhanden ist, findet es sich zwischen Exon 4 und Exon 5. Dies entspricht der Position zwischen nt1054 und nt 1055 in SEQ ID NO. 3. Eine Kombination der Sequenzen SEQ ID NO. 1/3 mit SEQ ID NO. 5 ist demnach z. B. eine Sequenz, welche die Sequenz des Exon 4a an der genannten Position enthält.

Neben den in SEQ ID NO. 1,3 und 5 gezeigten Nukleotidsequenzen, sowie Kombinationen davon, wie etwa die Sequenz von SEQ ID NO. 3, die zwischen nt1054 und 1055 die Sequenz der SEQ ID NO. 5 aufweist, und einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch

Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisieren. Der Begriff"Hybridisierung"gemäß vorliegender Erfindung wird bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) verwendet. Vorzugs- weise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 X SSC und 0,1 % SDS bei 50°C, vorzugsw- eise bie 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h in 0,2 X SSC und 0,1 % SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer oder mehreren der in SEQ ID NO. 1,3 und 5 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einer diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes ent- sprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Nukleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, wie etwa eine peptidische Nukleinsäure, umfassen. Besonders bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure einen Protein-kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 1,3 oder/und 5 dargesteltten Nukleotidsequenzen oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 90 % und besonders bevorzugt mehr als 95 % zu der in SEQ ID NO. 1,3 oder 5 dargesteliten Nukleotidsequenzen oder einen vorzugsweise mindestens 20 Nukleotide (nt) und besonders bevorzugt mindestens 50 nt langen Abschnitt davon aufweist. Das gleiche gilt auch für Nukleinsäuren, welche, wie oben beschrieben, die Sequenz der SEQ ID NO. 5 zusätzlich zu denen der SEQ ID NO. 1 oder 3 aufweisen. Die Homologie wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier Nukleinsäuren (bzw. Peptidketten) angegeben, wobei 100% Homologie die völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet (Herder : Lexikon der Biochemie und Molekularbio- logie, Spektrum Akademischer Verlag 1995).

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind vorzugsweise aus Säugern und insbesondere aus dem Menschen erhältlich. Sie können nach bekannten Techniken unter Verwendungen kurzer Abschnitte der in SEQ ID NO. 1,3 oder/und 5 gezeigten Nukleotidsequenzen als Hybridisierungssonden und/oder als Amplifikationsprimer isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbausteine, z. B. 2'-O-alkylierte Nukleotidbausteine eingesetzt werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukieinsäuren oder Abschnitte davon können somit zu Herstellung von Primern und Sonden verwendet werden, die bevorzugt mit Markern oder Markierungsgruppen versehen sind. Bevorzugt sind auch Intron-überspannende Oligonukleotidprimer, die besonders zur Identifizierung verschiedener mRNA-Spezies geeignet sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die von den wie oben definierten Nukleinsäuren kodierten Polypeptide. Diese Polypeptide enthalten vorzugsweise (a) die in SEQ ID NO. 2 oder 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder (b) eine Homologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von mehr als 80 % und besonders bevorzugt von mehr als 90 % zu der Aminosäu- resequenz gemäß (a).

Neben den in SEQ ID NO. 2 oder 4 dargestellten Polypeptiden betrifft die Erfindung auch Muteine, Varianten und Fragmente davon. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von den in SEQ ID NO. 2 oder 4 dargestellten Aminosäuresequenzen unterscheiden.

Unter den Begriff"Variante"fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen des Endometrioseproteins, sowie durch

rekombinante DNA-Technologie (insbesondere in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden) erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunolgischen Aktivität den in SEQ IN NO. 2 oder 4 dargesteliten Proteinen im wesentlichen entsprechen.

Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide.

Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung, z. B. Acetylierung oder Amidierung, modifiziert sind. Zu den erfindungsgemäßen Aminosäurese- quenzen gehören auch Polypeptidfragmente (Peptide), die einen mindestens 10 Aminosäuren langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 2 oder 4 gezeigten Aminosäuresequenz darstellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegender Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält.

Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz vorzugs- weise in Verbindung mit Expressionssignalen, wie etwa Promotor, Operator, Enhancer etc. befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., supra, Kapitel 1-4, beschrieben. Besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäße Vektor ein eukaryontischer Vektor, z. B. ein Hefevektor, oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor, z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor oder Pflanzenvektor. Derartige Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig, so daß hier nicht näher darauf eingegangen werden muß. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Sambrook et al., supra, Kapitel 16, verwiesen.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der einen mindestens 21 Nukleo- tide langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1,3 oder/und 5 dargestellten Sequenzen oder eine Kombination davon erhält. Vorzugsweise besitzt dieser

Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-kodierenden Bereich der genannten Sequenzen oder einem für die Expression des Proteins bzw. Polypeptids wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense- Nukleinsäuren, die vorzugsweise bis zu 50 Nukleotide lang sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nukleinsäuren sind aligemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Beispiele für bevorzugte Zellen sind eukaryon- tische Zellen, insbesondere tierische und besonders bevorzugt Säugerzellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper oder ein Fragment eines solchen Antikörpers gegen das (die) vom Endometriose- gen kodierte (n) Polypeptid (e) oder Varianten davon. Besonders bevorzugt sind derartige Antikörper gegen die gesamten davon kodierten Polypeptide oder gegen eine Peptidsequenz gerichtet, die den Aminosäuren 1-330 der in SEQ ID NO. 4 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.

Die Identifizierung, Isolierung und Expression eines erfindungsgemäßen Gens, das speziell mit invasiven Prozessen und insbesondere mit der Endometriose assoziiert ist, liefert die Voraussetzungen für die Diagnostik, Therapie und Prävention von Erkrankungen, die auf derartigen oben genannten Störungen beruhen.

Mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen wird es möglich, Antikörper gegen derartige Polypeptide herzustellen. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem voll- ständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung

der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach der Methode von Köhler und Milstein und deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzierenden Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zellfusion monoklonale Antikörper erhalten werden. Ebenso können nach bekannten Methoden humane monoklonale Antikörper hergestellt werden. Derartige Antikörper könnten dann sowohl für diagnostische Tests, insbesondere von Endometriosezeligewebe, oder auch für die Therapie verwendet werden.

Beispielsweise mit Hilfe der ELISA-Technik können Proben, wie etwa Körperflüssigkeiten, besonders humane Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Lymphe oder Liquor), einerseits auf das Vorhandensein eines vom Endome- triosegen kodierten Polypeptides, andererseits auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen ein solches Polypeptid untersucht werden. Vom Endometriosegen kodierte Polypeptide oder Fragmente davon können in solchen Proben dann mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers, z. B. eines erfindungsgemäßen Antikörpers, nachgewiesen werden. Für den Nachweis von Autoantikörpern können bevorzugt rekombinante Fusionsproteine eingesetzt werden, welche einen Teil oder eine Domäne oder auch das gesamte Polypeptid, das vom Endometriosegen kodiert wird, enthalten, und die fusioniert sind mit einer Proteindomäne, die einen Nachweis ermöglicht, beispielsweise das Maltose-bindende Protein (MBP).

Diagnostische Untersuchungen können auch mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z. B. auf Gen- oder Transkriptebene, durchgeführt werden.

Weiterhin ermöglicht die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen und Antikörpern eine gezielte Suche nach Effektoren der Polypeptide/Proteine. Effektoren sind Stoffe, die auf das erfindungsgemäße Polypeptid inhibitorisch oder aktivierend wirken, und die in der Lage sind, die durch die Polypeptide gesteuerten Zellfunktionen

selektiv zu beeinflussen. Diese können dann bei der Therapie von ent- sprechenden Krankheitsbildern, wie etwa solchen, die auf invasiven Prozessen beruhen, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der Endometrio- seproteine, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiede- nen potentiellen Effektorsubstanzen, z. B. niedermolekularen Stoffen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z. B. zellaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Auf diese Weise lassen sich auch Bindetargets der Endometriose- proteine identifizieren.

Da viele Tumorerkrankungen mit invasiven Prozessen einhergehen, liefert die Entdeckung des Gens gemäß der Erfindung zusätzlich Möglichkeiten für die Diagnose, Prävention und Therapie von krebsartigen Krankheiten.

Die Entdeckung eines Gens, welches für invasive Prozesse mit verantwort- lich ist, eröffnet nicht nur Möglichkeiten zur Behandlung von Krankheiten, die auf derartigen Zeliveränderungen beruhen, sondern es können die erfindungsgemäßen Sequenzen auch verwendet werden, um sich derartige Prozesse nutzbar zu machen. Dies könnte beispielsweise bei der Im- plantation von Embryonen von Bedeutung sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponenten Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Peptide und/oder Antikörper, wie zuvor angegeben, umfaßt.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs-und/oder Zusatzstoffe, sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit invasiven

Prozessen assoziiert sind. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Zusammen- setzung auch zur Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen eingesetzt werden, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Endometriose.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren, Sequenzprotokolle und Beispiele näher erläutert.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der cDNA des Endome- triose-assoziierten Gens, wobei lediglich Exons Et bis E5 gezeigt sind.

SEQ ID NO. 1 stellt eine Nukleotidsequenz dar, die für das Endome- triose-assoziierte Gen kodierende genetische Information enthält, wobei ein offener Leserahmen von Nukleotid 3 bis 911 reicht, und SEQ ID NO. 2 stellt die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Nukleotidsequenz dar, wobei die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens von Aminosäure 1 bis 302 reicht.

SEQ ID NO. 3 stellt eine Nukleotidsequenz wie die von SEQ ID NO. 1 dar, jedoch enthält sie zusätzliche 84 Nukleotide am 5'- Ende, der offene Leserahmen reicht von Nukleotid 3 bis 995.

SEQ ID NO. 4 stellt die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens der in SEQ ID NO. 3 gezeigten Nukleotidsequenz dar, wobei diese Aminosäuresequenz 320 Aminosäuren aufweist, von denen die C-terminalen 302 identisch sind mit denen in SEQ ID NO. 2.

SEQ ID NO. 5 stellt die Nukleotidsequenz des ggf. vorhandenen zusätzlichen Exons 4a dar, bestehend aus den gezeigten 218 nt, wobei Exon 4a zwischen Nukleotid 1054 und

1055 (bezogen auf SEQ ID NO. 3) liegt, wenn es vorhanden ist.

BEISPIELE Beispiel 1 Kultivierung von Zellen Zur Identifizierung eines Endometriose-assoziierten Gens wurden invasive und nicht-invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T+ verwendet. Die Zellen wurden in Dulbecco-Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserumg kultiviert und 2 x pro Woche 1 : 5 verdünnt (Passage). Für den Vergleich der Expressionsmuster mittels DDRT-PCR (siehe unten) wurden invasive Zellen der Passage 17 und nicht invasive Zellen der Passage 33 verwendet. Die Zellen wurden mit SV40 transformiert und durch Differential Display Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) analysiert.

Beispiel 2 DDRT-PCR Bei dieser von Liang und Pardee entwickelten Methode handelt es sich um ein Verfahren zur Unterscheidung der Expressionsmuster verschiedener Zellarten oder des wechselnden Expressionsmusters einer Zellart unter verschiedenen Lebensbedingungen oder während wechselnder Entwick- lungsstadien (Liang und Pardee (1992), Science 257,967-971). Die Grundlage der DDRT-PCR-Technik basiert auf der Überlegung, dal3 in jeder Zelle etwa 15 000 Gene exprimiert werden und prinzipiell jedes einzeine mRNA-Molekül mittels reverser Transkription und Amplifikation mit zufälligen Primern dargestellt werden kann.

In diesem Beispiel wurde die zelluläre PolyA+-RNA zunächst mit Hilfe mehrerer verschiedener dT"VX-Primer (Downstream-Primer, Ankerprimer) in cDNA umgeschrieben. Die resultierenden cDNA-Populationen wurden

dann mit 4 Downstream-und 20 Upstream-Primern aus dem RNA-MapT""-Kit der Firma Genhunter, Nashville (1994), unter Zugabe eines radioaktiv markierten Nukleotids PCR-amplifiziert. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionsansätze im Vakuum eingeengt und die erhaltenen cDNA-Fragmente in einem sechsprozentigen nativen PAA-Gel (Polyacrylamid) aufgetrennt. Die DNA-Detektion erfolgte durch Autoradiographie. PCR-Ansätze, die für die beiden zu untersuchenden Zelivarianten deutliche Unterschiede im Bandenmuster zeigten, wurden zweifach wiederholt, um die Reproduzier- barkeit zu überprüfen. Bestätigten sich die zuvor gefundenen Unterschiede, wurden die Banden nach bekannten Verfahren aus dem Gel eluiert, reamplifiziert, kloniert und sequenziert.

Durch diese Methode fand man ein 394 bp langes Fragment (Fragment 1, Nukleotide 1235 bis 1628 der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz, siehe auch Figur 1), welches für die invasive Zelivariante spezifisch war. Dieses Fragment 1 wurde in der Northern Blot Analyse (siehe unten) als Sonde verwendet.

Beispiel 3 Analyse des Fragment 1-Expressionsprofils im Menschen Northern Blot Analysen Zur Überprüfung des Expressionsmusters für das DDRT-PCR-Fragment 1 wurden Northern Blot Analysen durchgeführt. Dazu wurden 20 nu Gesamt- RNA bzw. 4 Ng PolyA+-RNA in 1% igen denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt und über Nacht auf eine Nylonmembran übertragen. Die RNA wurde durch Bestrahlung mit UV-Licht auf der Membran fixiert. Die Hybridisierung mit 32P-markierten Sonden (Markierung mittels RPL-Kit der Firma Amersham) erfolgte über Nacht in einer formamidhaltigen Hybridi- sierungslösung bei 42°C. Anschließend wurde die Membran mit steigender Stringenz gewaschen, bis eine punktuelle Intensität der radioaktiven Strahlung meßbar war. Die Darstellung des Hybridisierungsmusters erfolgte durch Auflegen eines Röntgenfilms (NEF-NEN : Firma DuPont) und Exposition

über mehrere Tage. Zur Bestimmung des Expressionsmusters für DDRT- PCR-Fragment 1 wurden Northern Blot Analysen mit RNA aus folgenden Zellen bzw. Geweben durchgeführt : -invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T+ (Passage 17) -nicht invasive Zellen der epithelialen Endometriosezellinie EEC145T+ (Passage 33) -Zellen der peritonealen Zellinie EEC143T+ Endometriumgewebe -Zellen der invasiven humanen Blasenkarzinomzellinie EJ28 -Zellen der nichtinvasiven humanen Blasenkarzinomzellinie RT112 Nach Hybridisierung mit der Sonde für DDRT-PCR-Fragment 1 konnte eine etwa 4 kb große mRNA detektiert werden, die ausschließlich in der invasiven Variante der Endometriosezellinie EEC 145T+ nachgewiesen werden konnte.

Es wurden weitere humane Gewebe getestet. In der Milz fand sich eine mRNA von 4 kb Länge, die mit Fragment 1 eindeutig hybridisierte, und in Hirn mRNAs von jeweils 4 kb und > 9 kb Länge.

Die Northern-Blot-Analysen wurden unter Verwendung zweier humaner Multiple Tissue Northern (MTN) Blots der Fa. Clontech nach Hersteller- protokoll durchgeführt. Dabei wurde die Expression in folgenden Geweben überprüft : Dickdarm, Dünndarm, Herz, Hirn, Hoden, Leber, Lunge, Milz, Niere, Ovarien, Pankreas, periphere Blutleukozyten, Plazenta, Prostata, Skelettmuskel, Thymus. Das mit der radioaktiv markierten 3'-Sonde"DDRT- PCR-fragment1"erhaltene Expressionsmuster stellt sich wie folgt dar : 4 kb mRNA (erwartete Größe) : Hirn Milz Pankreas 9,5 kb mRNA : Hirn

In den übrigen Geweben konnte keine spezifische Hybridisierung nach- gewiesen werden.

In situ Hybridisierung Zur Aufklärung des zellulären Expressionsmusters wurden mRNA in situ- Hybridisierungen an 10 Nm Paraffinschnitten verschiedener Gewebe durchgeführt. Dazu wurde das"DDRT-PCR-Fragment1"als Digoxigenin- markierte RNA-Sonde eingesetzt. Die Nachweisreaktion erfolgte mittels eines Digoxigenin spezifischen, an Alkalische Phosphatase (A) gekoppelten Antikörpers. Als Substrat der AP diente BM Purple, aus dem nach De- phosphorylierung ein blaues Präzipitat entsteht. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle aufgeführt und zeigen eine überwiegende Expression in invasiven/migrierenden Zellen. Starke Expression schwache, nicht ganz eindeutige Expression Epitheizellen aus Endometrioseläsionen Skelettmuskel Karzinome Herz Lymphatische Infiltrate Sarcome Thymus Keimzentren der Lymphfollikel (Milz) etwas schwächer: Epithelzellen des Endometriums angiogenetische Endothelzellen migrierende Nervenzellen Beispiel 4 RT-PCR Eine sensible Methode zur Überprüfung des Expressionsmusters bietet die RT-PCR (Reverse Transkription PCR).

Dazu wurden 1 Ng der jeweiligen PolyA+-RNA mit Hilfe von 400 U M-MLV Reverse Transkriptase (Firma Gibco-BRL) in einem Gesamtvolumen von

30 µl in cDNA umgeschrieben. 1, ul davon wurde zur anschließenden PCR mit unterschiedlichen Primerkombinationen eingesetzt.

Die verwendeten PCR-Primer P1 bis P7 sind in Tabelle 1 dargestellt (siehe Figur 1).

Tabelle 1 Nummer Sequenz (Nukleotidposition bezogen auf SEQ ID N0.1) P1 5'-CCAGCTGCTGCCAAATCC-3' (36-53) P2 5'-CATCATGGTCATAGCTGC-3' (545-562) Rückwärtsprimer)P35'-AGCGTCTCATCGGTGTAC-3'(793-776, P45'-AACAGAAGTGGTAGGTGC-3'(1080-1063, Rückwärtsprimer) P5 5'-AAAGGGACGGGAGGAAGC-3' (1243-1260) P6 5'-CCAAAGTAGAAAACACTG-3' (1612-1595, Rückwärtsprimer) 5'-GCTTGTATGACACACACG-3' (2150-2133, Rückwärtsprimer) Es wurden mit PolyA+-RNA aus verschiedenen Zellinien und Geweben RT- PCR-Experimente unter Verwendung verschiedener Primerkombinationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2 P33PerEMEJ28RT112EEEPEEPKP17 P1-P4 + n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. P2-P6 + n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. P5 + P7 + n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. n. g. -+--+++P5+P6+ P1 +P3+-+-+++ PK = Primerkombination P17 = Endometriosezellinie EEC145T, Passage 17, invasiv

P33 = Endomteriosezellinie EEC145T, Passage 33, nicht invasiv Per = Peritoneumszellinie Per143T EM = Endometriumgewebe EJ28 = invasive Blasenkarzinomzellinie RT112 = nicht invasive Blasenkarzinomzellinie E = Endometriumgewebe EE = Endometriumgewebe einer Endometriosepatientin PEE peritoneale Endometriosebiopsie n. g. = nicht getestet Die RT-PCR Ergebnisse bestätigten die für Fragment 1 spezifische Ex- pression in den frühen Passagen (Passage 17, Passage 20) der Endometrio- sezellinie EEC145T+. Abweichend zu den Northern Blot Analysen konnte zusätzlich eine schwache Expression im Endometrium gezeigt werden.

RT-PCR Analysen mit intronüberspannenden Primern Zur Überprüfung eventueller alternativer Exons wurden RT-PCR Experimente mit intronübespannenden Primern durchgefüht. Dabei konnte gezeigt werden, daß neben der beschriebenen mRNA mindestens eine weitere mRNA-Spezies exisitiert, die zwischen dem 4. und 5. Exon ein weiteres Exon (4a) mit einer Länge von 218 bp enthält. Dieses Exon befindet sich im 3'-UTR (untranslatierte Region), das heißt im Anschluß an die kodierende Region. Die Sequenz des Exons 4a ist nachstehend aufgeführt. gcggttgtcc ggaatgccag tggctcctgg gcagatgtgc accccagatt cagcctttgt gatagattcc aacacgttct ggcctcagac cacctttgtg gtggggccag actgctctgg gcaaagtgaa gctggccttt atgctccaag gaagggggcc tcgagagcag gcctgcattg gctctcggac taattcgcga tcatctttca tacagcag Nukleotidsequenz des alternativen Exons 4a

Beispiel 5 Herstellung der cDNA-Phagenbank EEC14 Die cDNA-Phagenbank EEC14 wurde nach der Methode von Short, J. M. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16 : 7583-7600, hergestellt.

Zunächst erfolgte die Reverse Transkription von PolyA+-RNA invasiver Zellen (Passage 17) der epithelialen Endometriosezellinie EEC 45T+. Der hierzu verwendete Primer setzt sich aus einer Xho/-Schnittstelle sowie einer 18 Nukleotide langen poly (dT)-Sequenz zusammen. Ein Adaptor, der eine EcoR/-Schnittstelle beinhaltet, wurde an die enstandenen cDNA-Fragmente ligiert. Die beiden Restriktionsschnittstellen erlauben eine gerichtete Insertion der cDNA-Fragmente in den ZAP ExpressT" Vektor. Inserts können in Form eines Kanamycin-resistenten pBK CMV Phagemids aus dem Phagen herausgeschnitten werden.

Beispiel 6 Phagenbankscreening Das DDRT-PCR-Fragment 1 (394 bp) wurde als Sonde verwendet, um 106 pfu (plaque forming units) der cDNA-Phagenbank EEC14 laut Hersteller- protokoll (Firma Stratagene) zu durchmustern. Die Markierung der Sonde mit Digoxigenin (Firma Boehringer Mannheim) erfolgte mit Hilfe der PCR. Die nach Infektion des Bakterienstamms XL lblue MRF'entstandenen Plaques wurden auf eine Nylonmembran übertragen und auf dieser mit der o. g.

Sonde hybridisiert. Der Nachweis der hybridisierten, Digoxigenin-markierten Sonde erfolgte nach dem Chemilumineszenz-Protokoll der Firma Boehringer Mannheim.

Positive Plaques wurden ausgewähtt und einem Rescreening unterzogen.

Die im Rescreening positiven Plaques wurden zur Excision eingesetzt. Durch Herausschneiden des Vektoranteils aus dem Phage mittels ExAssist Helferphagen entstanden Kanamycin-resistente pBK CMV Phagemide, die nach Vermehrung im Bakterienstamm XLOLRT" isoliert und sequenziert

werden konnten. Der isolierte Phagemidklon Q2A enthielt mit einer Größe von 2,3 kb das längste Insert, dessen Sequenz bestimmt wurde und SEQ ID NO. 1 gezeigt ist. Die Sequenz des DDRT-PCR-Fragments 1 findet sich in den Nukleotiden 1235 bis 1628 bezogen auf SEQ ID NO. 1.

Beispiel 7 Southern Blot Analyse 1 oing genomische DNA von weiblichen und männlichen Personen wurde mit unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen geschnitten. Die Fragmente wurden im Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen.

Auf dieser Membran erfolgte die Hybridisierung mit dem Digoxigenin markierten DDRT-PCR-Fragment1.

Die Hybridisierung konnte durch Chemilumineszenz laut Protokoll der Firma Boehringer nachgewiesen werden. Bei Verwendung unterschiedlicher Restriktionsendonukleasen wurde sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen DNA-Proben nur jeweils eine Bande detektiert. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß das dem Fragment 1 zu Grunde liegende Gen ein singuläres, geschlechtsunspezifisches Gen ist. Mittlerweile wurden mit dem DDRT-PCR-Fragment 1 zwei genomische Klone PAC J 1472 und PAC N 1977 isoliert.

Beispiel 8 Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) Die in Beispiel 7 gewonnen genomischen Klone wurden mittels der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung auf Chromosom 1 (1 p36) lokalisiert (Lichter et al. (1990), Science 247 : 64-69).

Beispiel 9 Herstellung spezifischer Antikörper Die Nukleotide 584 bis 909 der o. g. cDNA-Sequenz wurden über geeignete Restriktionsschnittstellen in den Expressionsvektor pMAL cRI kloniert. Zur

Expression der Sequenz wurde das Konstrukt in E. coli DH5 a-Zellen trans- formiert. Das translatierte Proteinfragment wurde aus dem SDS-Poly- acrylamid-Gel ausgeschnitten und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.

Beispiel 10 RACE (rapid amplification of cDNA ends) Da die Länge des cDNA-Klons Q2A (siehe Beispiel 6) von der Größe der detektierten mRNA (ca. 4 kb) abweicht, wurden zum Erhalt weiterer Sequenzinformationen RACE-Experimente durchgeführt. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, cDNA-Sequenzen von einer mRNA-Matrize zwischen einer definierten internen Sequenz und unbekannten Sequenzen am 5'-bzw. 3'-Ende zu erhalten. Durch 3'-RACE Experimente aus dem 5.

Exon heraus konnte das 3'-Ende des Klons Q2A bestätigt werden.

Für das 5'RACE wurde die cDNA-Erststrangsynthese mit einem gen- spezifischen Primer durchgeführt, der im 1. Exon hybridisiert, und an- schließend mit Hilfe des Enzyms Terminale Transferase ein homopolymerer Nukleotidschwanz angehängt. Diese angehängte Sequenz erlaubte eine Amplifikation des Sequenzbereichs, der sich zischen dem genspezifischen Primer und dem homopolymeren Nukleotidschwanz befindet. Dabei konnte folgende zusätzliche Sequenz erhalten werden, die sich 5'der Q2A-Sequenz befindet und dem ersten Exon angehört : <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> cc cgg ccg ccc cga gtg gag cgg atc cac ggg cag atg cag atg cct 47 Arg Pro Pro Arg Val Glu Arg Ile His Gly Gln Met Gln Met Pro 1 5 10 15 cga gcc aga cgg gcc cac agg ccc cgg gac cag gcg gcc gcc ctc qtq... 95 Arg Ala Arg Arg Ala His Arg Pro Arg Asp Gln Ala Ala Ala Leu Val...

20 25 30 Die unterstrichene Sequenz stellt die ersten Nukleotide der Q2A-Sequenz dar, die Sequenz davor entspricht der durch 5'RACE erhaltenen neuen

Sequenz. Der offene Leserahmen fügt sich in den bereits für Fragment abgeleiteten ein und beinhaltet zwei putative Startcodons (unterstrichen).

Die Nukleotidsäuresequenz, welche die zuvor erhaltene und im SEQ ID NO.

1 dargestellte Sequenz sowie die zusätzlichen 84 nt am 5'-Ende aufweist, ist in SEQ ID NO. 3 dargestellt.