DE ÁCIDOS OReÁM COS

CAMPO BE LA NVE CIÓN

La presente invención se refiere a un método para la síntesis de amidas de ácidos orgánicos con vatnillínsmina {valniinamidas} dentro de las que se encuentran los capsaidnoides γ análogos de capsaicina, responsable del poder pungente de los c il s {ca sicum wnum). La presente invención se refiere a la producción de sales orgánicas de vainilíinamina con ácidos orgánicos y su condensación enzimátsca para generar vainiiiioamidas. £1 mé odo puede iniciarse a partir de ia síntesis química de la sai orgánica de vainiíiínamina y continuar e forma secuencia! con la condensación anximática de dicha sal orgánica para dar lug r a la correspondiente vainiinamida, o bien puede iniciar directamente a partir de ia condensación enzin ática de una sal orgánica de vainiiinamina, para dar lugar a la correspondiente vainiinamida, cuando la sai orgánica de vainiiinamina haya sido previa o independientemente sintetizada conforme se propone en la presente invención o cuando llegue a ser sintetizada a partir do otras reacciones que lleguen a surgir. & paso de síntesis da ia sal orgánica de vaMIlinamina puede realizarse mediante la hidrogenacióo de ia vaMinoxiroa en presencia de un ácido orgánico, o bien, a partir de la liberación cié sales Inorgánicas de vainiiinamina en presencia de un ácido orgánsco.

A TECEDENTES

Los capsaicinoides constituyen una familia de amidas de interés particula para la industria de alimentos. Estos compuestos son responsables del efecto pungente de los chiles. De esta familia, la capsaioina {ím?is-$~metii-N~v¾iniliin-6-nonenamida} es el capsaicinoide natural de mayor pungencia. Se han identificado tres características estructurales que confieren la actividad pungente a estos compuestos: el enlace amida, el residuo adió y el anillo vatnilloíde. A los capsaicinoides se les atribuyen diversas actividades farmacológicas dentro de las cuales des acen la capacidad para estimular e! sistema respiratorio, cardiovascular y digestivo, por lo que se aplican corno promotores del metabolismo energético. Más aún, se ha demostrado que los capsaicinoides tienen actividad farmacológica aníi-Mamaíoria y bioqueadora da la transmisión del dolor; sin embargo, este última está limitada debido a ia irritación que ocasionan al contado con la piel. También se ha observado en cultives in v$ , que ia capsaicina es capaz de inhibir el crecimiento de diversas lineas celulares cancerígenas,

Típicamente, las vainiinamrctas suelen prepararse por síntesis química a partir de vaíníinamina, comúnmente empleada como ciorohídrato da vain feamína, y ácidos orgánicos activados, normalmente cloruros de ácido. Sin embargo, previo a la reacción de aeiiación, es necesario liberar la vainlllina nina de su dorohidrato empleando diferentes tipos de bases. Existen diversos antecedentes en la literatura relacionados con la producción de sales de vainiinamina y de su condensación con ácidos orgánicos, metodologías que a continuación se describen.

Para la producción de sales de vainiliínamina en la patente US 4,388,250 se protege yn método para la preparación de p sdroxibenzii~nitn!os a partir dei correspondiente p-ftidroxi benzatóehido, en donde primero se reduce el p»tsidroxi- bensald hido a p-hidraxi-bencilamína con hidrógeno en un medio acuoso con amoniaco. De preferencia, esta reacción se lleva a cabo a baje presión con pequeñas cantidades de alcohol con níquel de Raney como catalizador. En las patentes ÜS 8,329,948 B2 y US 8,329,948 se presenta un método para la síntesis de f rmamidas y aminas sustituidas al acelerar la reacción de leuokart Esta reacción se acelera ai reaccionar la formamida o /^afquíSformamtda y ácido fórmico con un aldehido o una cetona. En particular, para ia producción del clorohidrato de vainiioamina se produce primeramente la vainiinformamida, a partir de vainillina. Posteriormente se disuelve la vasniinfermamida en ácido clorhídrico diluido y metanol, y la reacción se calienta rápidamente a 12CTC, Inmediatamente después de alcanzar esta temperatura ia reacción se enfría a 6 C para obtener rendimientos cuantitativos del clorohidrato de vaínlinamina. En la peíante US 6,968,418 82 se describe un método para producir vainiinamina, o sales de ia misma, llevando a cabo primero una reacción con vainillina e hídroxiiamina o una de sus sales, en presencia de una eal orgánica para forma ia vainiiooxima, Posteriormente se lleva a cabo una reacción de hidrogenación en presencia de un catalizador adecuado y un ácido, orgánico o inorgánico.

Por otro lado, para ia síntesis de capsaicina, capsaicinoides, análogos de capsaicina y en general vainiinamidas, existen va ias alternativas reportadas en ia literatura. En ia patente US 4,S32,139 se describe un método para preparar N~ fenilmetíialquinamidas con actividad analgésica. Las aiquinamidas pueden ser lineales o ramificadas, de 11 a 23 átomos de carbono, preferentemente fV-vainiin- alquinamidas. El método de síntesis de estas amidas consiste, una vez sintetizado ai ácido saturado o insaturado, en activar el residuo atólo como cloruro del ácido y disolver ei oiorohidrafo de vainlliinamina en agua con hidroxido de sodio para liberar la vainlinamina de su clorohidrato y permitir asi que se lleve a cabo la reacción de amidación. La patente US §,094,782 incluye un método para producir el succlnato de nonanoil-vainiiiinamida, un éster del ácido suceíníco m posición 4 de la capsaicina slntéfica {nonanoli yainiiiinamida). La esterificación requiere del ann drkfo succínieo. En las patentes US 8,322,862 y US 5,488,910 se describe un método para sintetizar capsaicina en un medio de reacción bifásico, normalmente agua-benceno, en el que se emplea el cloronidtato de vainlliinamina y ei ácido orgánico activado en fo m de cloruro da acslo. Para liberar la vainíliinamina de su tíorohldrato es necesario disolverlo en la fase acuosa que debe contener carbonato de potasio. En la solicitud de patente US 2007/0293703 Ai se describe un método para producir ei Isómero i de la capsaicina. Lo novedoso de este método es que ia coniguración tra del ácido orgánico se define desde el principio del proceso de síntesis y se mantiene así riasta el final. Este solicitud de patente también refiere al uso del cloruro de ácido como agente acilante. La patente US 7,446,226 B2 hace referencia a nuevos compuestos denominados "derivados de capsaitóna", a su método de producción y a su uso como agentes anfimicrobianos, De acuerdo a las reivindicaciones de es invención, se pretende proteger un método para producir nuevos derivados de capsaicina llamados análogos ai uino o bien, íenii-capsaicirta. La salación de la vaMSnamlna m lleva a cabo por medio del cloruro del ácido, mismo que se forma a partir de cloruro de tionílo.

Un punto importante en común de estas metodologías que las diferencia de la presente invención, es ei requisito de emplear clorohidraío de vainiilinamína como materia prima para la obtención de vainlioamídas. De hecho, para facilitar la liberación, de la valnSinamína de m dorohidrato, comúnmente la producción química de capsaieinoides se lleva a cabo en sistemas bifásicos. Bajo estas condiciones, la vainiinamina es liberada en medio acuoso mientras que la acilaeion se lleva a cabo un disolvente Inmiscibl en ei medio acuoso. Por otro lado, un común denominador de las metodologías anteriormente descritas para ia síntesis de vaínitlinamidas es el uso de derivados de ácido, normalmente cloruros de acilo, Para producir los derivados de ácido es normal recurrir al cloruro de tioniio como precursor de los cloruros de ácido. Este agente, además de ser tdxico. resulta de alio riesgo dada su reactividad. Otra herramienta empleada como alternativa para la producción de capsaieinoides, análogos e capsaicina y vainlinamidas es la síntesis enzimáica. Para este procedimiento se han utilizado enzimas hidrolstteas da! tipo amídasa en disolventes orgánicos para desplazar el equilibrio de ia reacción hacia la síntesis. Sin embargo, estas enzimas presentan desventajas entre las que se encuentra su baja estabilidad en disolventes orgánicos. Una herramienta enziniática muy exitosa debido a su alta estabilidad en medios orgánicos y su eficiencia en la síntesis de amidas es el uso de üpasas. Para i síntesis de capsaieinoides por medio de üpasas se hao propuesto varias estrategias como ia condensación de la vainlitinamina y distintos ácidos orgánicos empleando como catalizador a la lipasa B de Candida antárctica (CaL-8) en buffer de fosfatos como medio de reacci n (a- Kenji Kobata ®t sí b- Kenji Kobata é ai). Otro método para ia producció de estos análogos de capsaicina también empleando Cal«8 _« describe ia traosaciiación de la capsaicina con varios aceites de origen natural en dos medio de reacción distintos, β-hexano y CC¾ supefcrl ioo (c~ Kenji Kobata el al, ú- Kenji Kobata el af). En este sentido, se Ha demostrado qm en la producción enziniática de análogos de capsaicina» ios rendimientos son mucho mayores en disolventes polares hidrópicos que en apelares hidrofobieos (Dolores Reyes-Duarte ef BÍ, Edmundo Castillo oí ¡3$,

En la solicitud de patente US 2003/01 S787Q Al se protege a enzimas presentes en extactos enzimáíicos de Sírapíomyüús g us, que tienen la capacidad de hsdroiizar y/o sintetizar capsaiana. la solicitud d patente cubre el uso de estas enzimas para ia síntesis de análogos en una hilase agua:n-hexano. Un caso muy similar al anterior, es el de la solicitud de patente US 2004/0 06172 Al que protege el uso de ensarnas de do cepas de Si ptomyces para la síntesis de análogos de capsaicina empleando varios ácidos orgánicos,, también en medios de reacción bifásico agua: n-hexano.

A pesar de que en la síntesis enamática de vainiiíinamidas se prescinde de la activació de los ácidos orgánicos y por consiguiente de cloruros de ácido, un gran Inconveniente que limita ia reacción es la necesidad de liberar la valnillinamína de su ciorohidrato. Una altemaísva es llevar a cabo ia acilacíón en sistemas bifásicos. Sin embargo, la presencia de agua debe evitarse dada la naturaleza hidroiitica de las enzimas empleadas. Dada esta restricción, en las propuestas en las que se describe el uso de disolventes distintos al agua se requiere de ia adición de aminas terciarias para liberar la valnillinamlna de su ciorohidrato. A pesar de cj e esta forma de liberación de la vainiinamína de su ciorohídraio m factible, para alcanza un alto rendimiento en la reacción se reporta la necesidad de emplear un exceso de la amin terciana (relaciones molares de clorhidrato y amina terciaria de hasta 1 18). Lo anterior, dificulta la aplicación comercial y la viabilidad económica del método, no solo por el exceso de amtññ terciaria empleada, sino también por la dificultad para su recuperación y reciciado,

B EVE DESCRIPCIÓN DE LAS FISURAS

Figur 1» Esquema de las reacciones secuenciales involucradas m el método químico aromático propuesto para la síntesis ele vainiinamldas de ácidos orgánicos, la) Esquema general de la reacción secuencia! d producción de vainiinamidas de ácidos orgánicos precedida por la formación de sales orgánicas de vainillinarnina obtenidas a partir de la hidrogenacíón de la vainiinoxtma en presencia de un ácido orgánico, 1b) Esquema general de la reacción secuencia! de producción de vainiinamidas de ácidos orgánicos precedida por la formación de sales orgánicas de vaini^namina obtenidas por la liberación de sales Inorgánicas de vain inarnina mediante el uso de alguna base con la posterior adición de un ácido orgánico. Donde, C t» Catalizador; Pis ^™ Disolvente: Ez~ Enzima; A~ ácido; 8~ base; C™ sal formada entre A y B; D™ agua ø ácido formado entre A y 8.

Figura 2. Esquema de la reacción del método de síntesis químico enzimátíca de vainiinamidas de ácidos orgánicos, a partir de sales orgánicas de vainillinarnina. Donde, Dis* Disolvente; Ez~ Enzima.

Figura 3, Esquema de las reacciones Involucradas en las rutas de síntesis propuestas para la síntesis química de sales orgánicas de vainsllinamina. 3a) Ruta de síntesis para la producción de sales orgánicas de vainillinarnina obtenidas mediante ia ñidrogenaclón de la vainiilinoxima en presencia de u ácido orgánico. 3b) Ruta de síntesis para la producción de sales orgánicas de vainünamina mediante ia liberación de sales inorgánicas de vainiinamina con una base y la posterior adición de un ácido orgánico. Donde, Dís- Disolvente; Ez» Enzima.

Figura 4. Gromatograma de HPLC en ai que pueden observarse dos picos correspondientes a la vainiinamirsa en dos estados de protonación distintos {TR 2.7 y 3.8 min) y el pico correspondiente a la caprilvainiliinamlda {TR 10,3 min), ta línea obscura pertenece a una muestra al inicio de la reacción del ejemplo 12, mientras que la linea gris pertenece a una muestra tomada ai cabo de 48 h de iniciada la reacción. Donde, V» Vaírilinamfna; O Caprilvalniinamida. F¾M 5. Perfil de absorción de luz ultravioleta típico cié las vainiinamidas en donde se pueden observar máximos de absorción a -230 y ~28G nm En este caso la figura corresponde a la absorción de la eapriivatníinamida obtenida con el método de síntesis de Sa presente invención.

Figura 8. Cfomaiograma de HPLC en el que pueden observarse dos picos correspondientes a la vasnlinamína e dos estados de prctonacíón distintos (T 2.7 y 3.6 m-n) y ti pico correspondiente a la iaurilvainílnamida (TR 10.8 mín). La linea obscura pertenece a una muestra al inicio de le reacción de! ejemplo 15, mientras que la línea clara pertenece a una muestm tomada al cabo de 48 h de iniciada la reacción.

DESCRIPC ÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a un método químioo-ensimitieo para la síntesis de vaíniinamidas a partir de sales orgánicas de vainillinamina. Estas sales orgánicas de vainíííinamina actualmente no están disponibles comercialmente y no se han encontrado métodos d síntesis en eí estado de la técnica. Para resolver el problema de su falta de disponibilidad, los inventores proponen dos rutas alternas de síntesis de tales safes orgánicas de vainiinamina, pero es pasible que con si tiempo surjan otras rutas de síntesis, cuyos productos, puedan ser utilizados como insumes en ai método de síntesis de vainiíiinaniidas de la presente invención. De este modo _¡ el método de síntesis de vaínilisnamidas puede realizarse: i) a partir de una sai orgánica de vainíílinamína obtenida mediante la hídrogenacíón de la vainíííinoxima en presencia de un ácido orgánico, seguida de ía condensación enzimática de dicha sai (Figura la); íi) a parti de una sal orgánica de vainiinamina obtenida por ia liberación de sales inorgánicas de valniHinarnina mediante el uso de alguna bas y ía posterior adición de un ácido orgánico, seguida de la condensación enzirnátíca de dicha sai (Figura Ib) o bien, 111} medíante la condensación enElmática directa de una sai orgánica de vairaííinamioa obtenida mediante cualquier otra ruta de síntesis (Figura 2). En cualquiera de los casos, el producto final de la condensación enzímática es una vainii amida. Las reacciones de producción da sales orgánicas de vainiilínamina (Figura 3a y 3fc) y la condensación de las mismas puede llevarse a cabo independientemente, o bien, de manera secuencia!.

Corno se describió m ios antecedentes, los actuales métodos de síntesis química de vainiínamídas requieren del uso d cloruro de tfoníio y otros activadores de ácidos orgánicos y la solubslitación de las sales de vainiinamina en agua para su disociación. Por otro lado, los métodos cíe síntesis enxfmátrca, requieren del uso de aminas terciarias para la liberación de la vainiinamina de su sal o ie de medios de reacción bifásicos, en tos que la presencia de agua impide una eficiente reacción de síntesis.

Como habrá de quedar claro, en la presente invención se evita el uso de cloruro de tionilo y otros activadore de ácidos orgánicos, se prescinde de la sdubi&aeióii de tas sales de vainiiíinamina en agua para su disociación y se evita de ¡a adición de aminas terciarias para la liberación de la vaínilrsarnina durante la síntesis enzimátlca de las vainiinamidas.

Es importante notar que la presente invención tiene diferencias sustanciales con las solicitudes y patentes descritas en ios antecedentes y representa una Innovación fundamental en la síntesis de vainiinamidas. Las diferencias se refieren particularmente a la condensación directa de la sai inorgánica de vainiinamina y el ácido orgánico sin la necesidad de una amina terciaria para la liberación de m sal, en una de sus modalidades, así como al uso de alcoholes {lineales o ramificados) corno medio de reacción durante la hidrogenaciórs de la vainlilinoxima y la liberación de las sales inorgánicas como condición necesaria para la formación de sales orgánicas de vaini iínamina con ácidos orgánicos insoluoles en agua en otra de sus modalidades, para cuando se parte de sales Inorgánicas de Vainiinamina o de vainlinoxima, respectivamente.

En la presente invención se describe un método químíce»anzimáfico para la síntesis da vainiinamidas a partir de sales orgánicas de vainiinamina con ácidos orgánicos, sales que a su z pueden ser procedentes de la h¾rcgenaeién de vainliiinoxime o de la liberación de sales inorgánicas de vainiinamina en presencia de un ácido orgánico o por otras ruta que lleguen a proponerse. Cabe insistir sobre el hecho de que en este método se evite el uso de cloruro de tionilo y otros activadores de ácidos orgánicos, se prescinde de la soiubiiteaeión de las sales de vainiliínamina en agua para su disociación y se evita la adición de aminas terciarias para la liberación de las sales de vainiliínamina, elementos que son imprescindibles en los métodos de síntesis descritos en el estado de la técnica y que constituyen la principal diferencia del m todo de la presente invención respecto del estado de la técnica,

la presente invención resuelve los problemas descritos anteriormente gracias a la innovación que implica el poder llevar a cabo la condensación enzlmática de una sai orgánica efe vainiinamina en la respectiva amida; previamente dicha sal orgánica puede sintetizarse a partir de vainlinoxíma, a partir de sales inorgánicas de la vainiinamfrsa (ambas rutas de síntesis descritas en la presente invención) o por otras rutas sintéticas que (leguen a surgir y ambos pasos; síntesis de ías sales orgánicas de vainiinaminas (por las rutas de síntesis acp ^" descritas) y su condensación ensmática pueden llevarse a cabo en fornia secuencia o independiente. Asi, ei método para la síntesis quimíco-enzimátíca de vatniinarnidas a partir dé una sai orgánica de vainiinamina comprende los pasos de:

Poner en contacto una sai orgánica de vainiinamina con una enstima perteneciente a la clasificación enzimática EC 3.1.1 3 y o cionaímeníe un disolvente orgánico o m medio no convencional,

Incubar la memela a una temperatura adecuada para el funcionamiento te la enzima, permitiendo la condensación enzimática de ía sal orgánica en una vaíniinamida,

Gpaonaímente la purífíeacidn de la vaíniinamida obtenida.

Con estos pasos se logra la condensación de la sal orgánica le vainiinamina por efecto de la enzima, obteniéndose la vaíniinamida correspondiente. La reacción se puede llevar a cabo en presencia de un disolvente orgánico, en un medio no convencional o bien empleando directamente a ia sal orgánica de vainiinamina como medio de reacción, siempre que la temperatura sea la de su punto de fusión o por arriba de este. Los ejemplos 2-8, 12, 13, 1S-1S y 21-26 ilustran la aplicación de estos pasos para ía síntesis aromátic de diversas vaínífíinamidas a partir d la sai orgánica de vainiinamina correspondiente, previamente sintetizada por alguna de las rutas de síntesis descritas en la presente invención.

Como ya se mencionó, ia sal orgánica de vainiinamina, como un paso previo a su condensación en ímática para ía producción de ía correspondiente vaíniinamida, puede ser obtenida aplicando una de las rutas de síntesis A1 ó A2, empleando diversos catalizadores, temperaturas, bases y disolventes de ia reacción, las cuales se describen a continuación.

L ruta de síntesis A1) comprende la producción de sales orgánicas de vainiinamina por hídrogenación de valníílinoxima en presencia de ácidos orgánicos, tos ejemplos 1, 0, 14 y 20, ilustran la aplicación de esta etapa para la producción de sales orgánicas a partir de vainilnoxima y diferentes ácidos orgánicos. Dic os eem los presentan variaciones en función te a presió de hidrógeno, el tiempo cte reacción y el disolvente de la reacción. En iodos estos casos, el proceso de obtención de la sal orgánica de vainillinamina es un paso previo a la condensación enzimática (arriba descrita). Esta ruta consiste en los pasos de:

Ala) Poner en contacto la vainillinoxima y un ácido orgá ico en aigón disolvente orgánico o la mezcla de dos o más disolventes, en atmósfera de hidrógeno molecular en presencia de algún metal de transición como catalizador,

Aib) inouba la mésela a una temperatura adecuada permitiendo transcurrir ia reacción hasta la obtención de la sal orgánica de vaintinamina,

A1e) ta recuperación del metal de transición empleado como catalizador y,

Mú) Opcio almente la purificación de la sai orgánica de vainillinamina obtenida.

Como ya se mencionó, alternativamente a la ruta de síntesis Al , la sal orgánica de vaíniinamina puede ser obtenida por la ruta de síntesis A2) que comprende la producción de sales orgánicas de vainillinamina mediante ia liberación de las sales inorgánicas de vainillinamina con alguna base y la posterior adición de ácidos orgánicos, los ejemplos 10, 11 y 28 ilustran la aplicación de este primer paso para la producción de sales orgánica a partir de una sal inorgánica de vainillinamina, en este caso el clorohidrato de vainillinamina, y un ácido orgánico, en este caso el ácido eeíanóico, en función de fa concentración de ia base y el disolvente de la reacción, como un paso previo a la condensación erszimáfica, o bien mostrando que ia presencia de la sal inorgánica o,ue se forma no impide dicha condensación (ejemplo 25} Esta etapa consiste en los pasos de:

A2a Poner en contacto la sal inorgánica de vainillinamina con una base en un disolvente orgánico o la mezcla de dos o más disolventes,

tbf incubar la mezcla permitiendo transcurrir la reacción de liberación de la vainillinamina,

Ate Agrega un ácido orgánico,

A2d incubar la mezcla permitiendo transcurrir la reacción de formación de la sal orgánica de vainillinamina,

A2e Opcioñálmente la separación de la sal orgánica de vainillinamina obtenida, A2f Opcionalrnsnte la purificación de la sal orgánica de vainiinamina obtenida.

Las reacciones de producciéri de la sal orgánica de vainiliinamina, ya sea por la s ruta Ai ó A2, y la condensación en imática de dicha sal pueden ll vame a cabo de manera independiente, o bien tía manera secuencia!. En este sentido, en caso de que las reacciones se lleven a cabo de manera secuencia!, en la ruta A1 o A2 habrá de emplearse un disolvente, o mezcla de disolventes, apropiado para la condensación ensmáliea de la sai orgánica de vainiinamina. El ejemplo 13

10 describe un proceso secuencia! para la producción de una vainiilinamida.

La procedencia de la vainillinoxima asi como al del eloroMdrato de vainiinamina o alguna de sus sales inorgánicas no pertenece al campo de esta invención y puede ser obtenida per métodos de química tradicional del dominio público, a parir de la vainillina o bien adquirida comercialmente en empresas tales como Advanced l§ Syrrthesis (Estados Unidos, CA).

Para la producción de las sales orgánicas de vainiinamina por la ruta de síntesis A1), se requiere de una reacción de hidroge aron en un disolvente orgánico m ei que se disuelve la vainiinoscima y ei ácido orgánico que formará la sal orgánica de vainiliinamina. E! ácido orgánico será seleccionado con base en la vainillínamlda

20 que se desea sintetizar en la paso b) del método de obtención de ia vainiinamlda de la presente invención.

Para las rutas de síntesis Al) ó A2) pueden emplearse diversos disolventes orgánicos, preferentemente alcoholes lineales o ramificados o mezclas de los mismos (Ejemplos 1 9, 14 _» 20 y 26), Se recomiendan alcoholes de 1 a 6 átomos

25 de carbono, ya sean lineales o ramificados. Por ejemplo es usual, aunque no indispensable, que para las reacciones de hidrogenados se utilicen mezclas de metano! y tenvamii-aioonol con proporciones de metano! que pueden variar entre 10 y 90% v/v. Por otro lado, es recomendable, aunque no indispensable, que para las reacciones de liberación de ia sal inorgánica de vainiinamina de ia etapa A2 se

30 utilicen metano!, etanol y meadas de ambos en distintas proporciones (Ejemplos 10, 11 y 26}.

81 la reacción de producción de sai orgánica de vainiliinamina y la condensación enz mátiea de dicha sal se llevará a cabo de manera secuencia!, pueden emplearse disolventes adecuados para el correcto funcionamiento de ia enzima 35 (Ejemplo 13). En estos casos no es recomendable emplear alcoholes primarios ni n

secundarios asi corno evitar las aminas primarías.

Los ácidos orgánicos adecuados para la formación de las sales o gánic s ele vainilfinamina, son ácidos orgánicos saturados, lineales o ramificados de 6 a 22 átomos de carbono. Ejemplo de elfos son los ácidos oaproioo (o exanóteo), caprflico (u octanólco cáprico {& decanóico), léurico (o dodeeanósco), esteárico {u octadecanóíco), pelargónico (o n nanóic ), S-metil-nonanóico, araquidoníco y oleico, en re otros.

Dependiendo del ácido orgánico utilizado para la formación de la sal orgánica de vaMiiínamina y del disolvente o mezcla de disolventes empleados corno medio de m c ó , fe concentración efe vainíllirtoxima empleada en la ruta de síntesis A1) _> asi como la concentración de la sal inorgánica de vainiinamtna y fa base para la ruta de síntesis A2}, pueden encontrarse entre 0.1 y 2M, e incluso exceder loe limites de solubilidad (quedando una parte insoluole, misma que se disolverá paulatinamente conforme avance la reacción). El ácido orgánico seleccionado puede emplearse a cualquier concentración con raspéete- a la valnillinoxima o sal inorgánica de vainiinamína {entre 0.5:1 y 2 1), pero preferentemente a la misma concentración molar evitando asi sustratos residuales a! término de la reacción.

La reacción da hidregenaoión de vaíniifeoxíma par la síntesis de sales orgánicas de vainiílínamlna en la ruta de síntesis A1 se lleva a cabo en presencia de idrógeno a presiones entre 1 y 10 atmósferas y empleando algún metal de transición como catalizador. Los catalizadores adecuados para ia reacción a) son Pd/C, Pt, i¾ Ru o Ni de Raney. Es preferible emplear Pd/C a una relación entre 2 y 20% en peso (basado en l cantidad d vainiinoxlma),

La reacción de hidrogenacíón requiere de un tiempo de entre 0.5 y 48 horas dependiendo deí tipo de ácido orgánico utilizado para formar la sal orgánica, del disolvente o de la mezcla de disolventes empleados como medio de reacción, asi como del sistema de agitación y su eficiencia. Normalmente ia vainiliinoxlma es hidrogenada totalmente a! caoo de 3 horas de reacción (Ejemplos 1, 9, 4 y 20), La hídrogenación de ia vainiinoxima para ia proífycción de las sales orgánicas de vainiinamina de la ruta de síntesis Al) ocurre preferentemente entre 25 *C y 46 ^* C aunque se sabe que la reacción puede darse entre 0 ^* C y 70 "C

Las reacciones sacuenesaies Involucradas en el método químico ensmáííco propuesto para la síntesis de vainiinarnidas de ácidos orgánicos partir de l valnillinoxima se esquematiza en la Figura 3a. Una vez llevada a cabo ta hidrogenaeión de la vainilünoxima por la ruta de síntesis Ai se recupera el metal d transición empleado como catalizador, cíe la mezcla de reacción. Para evitar la pérdid o merma de la sal orgánica de vaMlnamína, antes de separar el catalizador de la solución, es recomendable elevar la temperatura a más de 50 , de preferencia a βθ ^B C. Una vez alcanzada esta temperatur se separa el catalizador de ia solución. La separación se puede llevar a cabo por procesos conocidos del estado de la técnica, tales como la filtración, decantación o centrifugación, entre otros.

Una vez Iterada a cabo la producción de ia sal orgánica de vainsinamina por la ruta de síntesis A1), se recomienda llevar ia mezcla de reacción a temperatura ambiente ( ^« 25 °€). Una ez alcanzada esta temperatura se separa ei catalizador. La separació se puede llevar a cabo por procesos conocidos del estado de la técnica, tales como la filtración, decantación o centrifugación, entre otros,

En caso de que sea necesario y de manera opcional, es posifcla purificar ia sal orgánica de vainilíinamína. mediante la evaporación del disolvente o de la mezcla de disolventes empleados. Hecho lo anterior se recomienda lavar la sal orgánica producida que se encuentra en estado sólido usando tiesta 8 volúmenes {referidos a ia cantidad de disolvente evaporado) de un disolvente que no disuelva ia sai, por ejemplo acetato de etilo, separando ia sal del disolvente por decantación, centrifugación o filtrado o alguna otra operación conocida en el estado de la técnica. Es recomendable que los lavados se lleven a cabo a una temperatura entre 10 y 30 *C, con lo que se evita la disolución de ia sal orgánica. Preferentemente en torno a 20 *C. La sai orgánica puede entonces secarse y almacéname indefinidamente.

La reacción de liberación de ia sai inorgánica de vainílSinamina para la síntesis de sales orgánicas de vainiinamina de la ruta de síntesis A2 se lleva a cabo en presencia de bases como NaOH, OH, UOH, amoniaco y carbonates alcalinos (de ü, a, K, eíe). tas bases preferibles para ia aíta de síntesis A2 son NaOH y KOH. Es preferible empiear KOH a una relación equimoiar con respecto a la sai inorgánica de vainillinarnina (Ejemplos 10, 11 y 28).

La reacción de liberación de la sal inorgánica de la mía de síntesis A2 requiere de un tieroiKí de e e 0,5 y 6 horas dependiendo del tipo de sai inorgánica de vainiinamína, antes de proceder con la adición del ácido orgánico. Dependiendo del ácido orgánico ufifteado para formar ia sal orgánica de vasníiiinamina, del disolvente o de la mésela de disolventes empleados como medio de reacción, asf como del sistema d agiación y su eficiencia, ei tiempo de reacción requiere entre 1 y 8 horas. Normalmente la sai orgánica de vainilinamina es producida ai cabo de 3 horas de reacción.

La temperatura de la reacción de liberación de la sai inorgánica de vainiiíinamína para la producción de las sales orgánicas de vainiinam na por la ruta de síntesis A2) depende é de la base y al disolvente empleado. Mormafmente, la m zcl de bases fuerte® en disolventes son reacciones exotérmicas por lo ue las reacciones de ia ruta de síntesis Á2 suelen ocurrir entre 35 °C y 80 ^e C aunque se sabe que la reacción puede dame entre 20 ^* C y 80 X.

La ruta de síntesis mediante ia liberación de la sal Inorgánica de vaíniillnamina se esquematiza en la Figura 3b.

Una vei llevada a cabo la producción de la sal orgánica de vaíntinamína por la ruta de síntesis A2), a fin de evitar la pérdida o merm de la sal orgánica de vaini$namina _; es recomendable enfriar ia mezcla de reacción para inducir ia precipitación de cualquier sal inorgánica, de preferencia a 15 ^* C. Una alcanzada esta temperatura las sales inorgánicas (la formada entre ia base y el ácido correspondiente a la sai inorgánica de vainiíiínantína, así como ia sal Inorgánica de vainillinamina residual) se separan. La separación se puede llevar a cabo por procesos conocidos del estado de ia técnica, tales como a filtración, decantación o centrifugación, entre otros. Esta separación es opcional ya que la sal Inorgánica no impide la reacción posterior de condensación erszimática {ejemplo 28),

En caso de que sea necesario y de manera opcional, es posible purificar la sal orgánica de vainillinamina, mediante ía evaporación del disolvente o de ia mezcla de disolventes empleados. Hec o lo anterior se recomienda lavar te sal orgánica producida que se encuentra en estado sólido usando hasta 6 volúmenes (referidos a la cantidad d disolvente evaporado) de un disolvente que no disuelva la sal, por ejemplo acetato de etilo, separando la sai del disolvente por decantación, centrifugación ø irado o alguna otra operación conocida en ei estado de ia técnica. Es recomendable que ios lavados se lleven a caco a una temperatura entre 10 y 30 *C, con lo que se evita ía disolución de la sal orgánica. Preferentemente a 20 °C. La sai orgánica puede entonces secarse y almacenarse indefinidamente.

Como ya se mencionó, ei método de síntesis de vainlllinamida de la presente invención puede llevarse a cabo de manera secuencia! con cualquiera de las rutas de síntesis A1 o A2. Sí se desea hacer de esta forma {secuencia!}, para proseguir con f$ síntesis de la vainiinamída por ei método de la presente Invención, en caso de haber empleado un alcohol primario, un alcohol secundario o u a amina primarla como disolvente en la ruta de síntesis A1 ó A2, será necesario evaporarlo para evitar la aeración enzimática del alcohol. Este requisito se elimina si no se emplea un alcohol primario o secundario o una amina primarla para ta ruta de síntesis A1 ó A2, y particularmente si se empleó el mismo disolvente que se emplean! e el método de la presente invención para la síntesis de vainiliinamidas de ácidos orgánicos (Ejemplo 13).

La condensación enzímátioa de fas sales orgánicas de vainiillnamina del método de la presente invención preferentemente es realizada a temperaturas de entre 15 y 85 X. temperaturas a fas que obtienen los mejores desempeños de fas enzimas pertenecientes a a clasificación engimática EC 3.1. 3.

Para la condensación enzlmática de las sales de valniinamina dei método de la presente invención la sal de valnünamlna seleccionada puede usarse a cualquier concentración o incluso por arriba de la saturación m el disolvente o medio no convencional, ya que fa sal insoluole se irá disolviendo a medida que la enzima produzca la vainilílnamida. Típicamente, el método de la presente invención puede ser llevado a cabo a una concentración de sales de vaíniHinamina aq l tente de entre 0.02 M y 2 , preferentemente a la mayor concentración posible.

El método de síntesis de vainiinamidas de la present invención puede ser llevado a cabo llore de disolvente o medio o convencional, utilizando como medio de reacción a las mismas sales orgánicas de vainlilinamma en estado líquido a las temperaturas de su punto de fusión o por arriba de él, en la medida que dicha temperatura sea compatible con la estabilidad de la enzima utili ada.

Existe una amplia gama de disolventes orgánicos adecuados para el método de síntesis de vainülinamidas de la presente invención, aunque se emplean preferentemente los alcoholes terciarios. Particularmente se recomienda emplear 2-meíil~2-ouíanof (Ejemplo 5} ó 2-metíi-2-.propanoi, aunque la síntesis también poede llevarse a cabo en otros disolventes orgánicos tales corno pirldina; dimetiisulfóxido; dioxano; trlerilamina; dí-ísopropilamina; benceno; ciciohexano; acetona (Ejemplo 8), aoetonlthlo; tetrahidrofurano (Ejemplo 2); hidrocarburos como el n-hexano y n-heptano, o bien en mezclas de disolventes. Asi mismo, se pueden emplear en lugar de disolventes orgánicos algunos medios no convencionales como el CO2 supercrítlco y líquidos iónicos. Para llevar a cabo el método de síntesis de vainilünamidas de ia presente invención m as indispensable la previa deshidratación del disolvente, sin embargo es preferente eliminar el agua ya sea por evaporación, pervaporación, adsorción tamiz molecular, en resinas de intercambio iónico o por adición de sales.

Las enzimas adecuadas para para ser utilizadas en ei método de síntesis de vairtiiliriamídas de la presente invención pertenecen a la clasificación enzimátlca EC 3.1.1.3 y son conocidas simplemente como lipasas o iriaciigiicerol ispasas o tnacílgíicerol hidrofasas. Pueden emplearse en cualquiera de sos presentaciones comerciases, en solución, iiofiilzadas, formando agregados, cristeles catalíticos o bie« inmovilizadas en algún soporte. Particularmente, es recomendable emplear las siguientes enzimas: lipasa A de Candida antárctica, lipasa 8 de C Kikfa antárctica, lipasa de Candida üytktdracea, iipasa de Candida rugosa, lipasa de Burk oide a pacia, lipasa de Pssudo onas aenigínosa, lipasa de Ps dormms sp., lipasa de Pseudomonas fluo sc&ns, iipasa de Rhszomuwr mieftei, lipasa 621 de Ustílago ma is y lipasa de Yar wm !ipoiytica. L mejores resultados se han obtenido con la lipasa 8 de Candida antárctica en su forma comercial conocida como ovo2ym43¾. En la literatura se encuentra ampliamente documentado que estos b ooatalteadores tienen ía capacidad de sintetizar amidas (Sol im et ai, d uñ ú Castillo et al, Florían Le Joubíoux eí ai, Xiang~£3uo Li eí a/, T íerry Maugard ei ai, Abui Asim e a y las citas q se encuentran en esas publicaciones).

La cantidad de enzima en el biocataNzador o de eraSma libre empleada para el método de síntesis de vainiüínamidas de la presente invención dependerá de la concentración de las sales de vainiliinamina, de ia actividad enzimátiea de la enzima o del biocatallzador y del tiempo ue se requiera para la reacción. Para el método de síntesis de vainiilinamídas de ia pr te invención es recomendable emplear de 2 a 50 mg ml de enzima o biocafafeador, equivalentes a una actividad de entre 2 LU rrsl y 50 LU/mL (donde LU son las Unidades de actividad lipasa, definidas co o la cantidad de enzima necesaria para ia síntesis de 1 ^mol/mln de propiMaurato a partir de ácido iáurico y 1-propanol a 60 ^* C). Es preferible emplear de 10 a 20 lü/ml.

Las sales orgánicas de vainiliinamina a ser empleadas en ei método de síntesis de vainillinamidas de ia presente invención pueden ser de ácidos orgánicos saturados, lineales o ramificados de 6 a 22 átomos de carbono. Ejemplo de ellas son las sales orgánicas de vainiliinamina y ácidos capróico (o hexanóico), caprieo (u octanoles): cáprico (o decanóico), iáurlco (o dodecanolco), esteárico (y octadecanóico), pelargénico (o nonanóico), 8-meiif~nQnanóÍeo _; araquidónic© y oíeioo, entre otros. El método de síntesis de vainiilinamidas de la presente invención a partir de sales orgánica de vainiliinaminas se encuentra asquesriatodo en la Figura 2, mientras que en la Figura 1 (a y ø) se muestra e método de síntesis de vainiinamidas de la presente invención acoplado secuencialmente a las rutas de síntesis A1 , en donde se parte de vainiinoxirna, y A2, en donde se parte de sales inorgánicas de vainiinamina,

Pyrficaciérs da vainiifinarnidas. Las vaioiinamidas suelen ser mu solubles en alcoholes y acetato de etilo por lo que el producto de la reacción se puede concentrar por evaporación del medio de reacción y purificar por extracción con dichos disolventes o bien por extracción bifásica con mezclas da disolventes inmiscibles, aunque de esto último los rendimientos sustos ser bajos. También pueden ser purificadas por c matografía HPLC preparativa o bien par cromatografía Flash.

MATERIALES Y «ÉTOOOS

La vainliiifioxima 95% fue adquirida de Advanced Synthesls (Estados Unidos, CA), el dofof idrate de vainsifinamína 99%, los ácidos eaproico {o rtexanóíco), eapri ico (u octanóico), láurico (o dodecanóico), esteárico (u octad candico) y tñftuoíoacético (TFA) asi como el Pd C al 5% y 10% fueron adquiridos en $¡gma~A!drich (Edo. d© México, México), Se emplearon ios siguientes disolventes orgánicos: metano! 99%, etanol %, tert-amii-alcohol 99% y terbutanol 99% de la marca J.T. Baker, la acetona 99% y el tetrahídrofúrano 99% de Budríok & Jaeson y ei aceionitrilo 99% de Boney eií. Se analizaron también las enzimas R 4M pasa de Rh&omumr míete ^" movflkaáa m resina de intercambio ansónico, Duoilte% Ύ14Μ (lipasa de Th@rmomym$ imugmos s inmovilizada en sica granulada) y Novozym 435 (lipasa B de Candida antárctica inmovilizada en Lewatit) de Nevozymes®. ta columna Coagertt (Bidentate C18 2S0 mm x 4.0 mm) de MXC MieroSoiv Technology Corporation.

Cyantifleación por HPLC par estimar % «la conversión y enáto ento

Para la cuantilcación por HPLC se ut lizó un equipo Ultímate 3000 equipado con un detector con arreglo de dioclas (Dsonex). En iodos ios casos los datos ele conversión y rendimiento están basados en le cuanSficaciÓn de la desaparición de vainiííinamina, aunque es posible también observar ia aparición de los productos de la reacción. Se empleó una columna Coagent Bidantate C18 y se utlzó un gradiente en te fase móvil compuesta por {A) una solución ta ón de fosfatos {25 mM _s pH 3,8} y (B) acetonitriio a razón de 1 mfJmín. El gradiente se muestra en ia Tabla La identidad de las vainslnamfdas obtenidas corresponda a lo reportado (John . Janusz et al 1993, Edmundo Castillo eí al 2007).

Ta&la 1 Proporciones del gradiente empleado para et análisis en HPLG. La fase A refiere a ia solución tampón de fosfatos (25 rn , pH 3.S) y la fase 8 refiere al acetonitriio.

Para comprender mejor ia inve ión a continuaclórí se presentan algunos ejemplos sin qm elfos limiten ei alcance de la presente invención, Ca¾e mencionar qu« diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en este documento, serán evidentes para los expertos en la técnica. Sin embargo, en este documento los inventores procurarnos dejar claro que dichas modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En la caracterización de las reacciones, se empieó ia metodología que a continuación s describe.

EJEMPLOS

Ejeitspf 1 Síntesis de capmat de vainlilinamina. (Ruta de síntesis Ai)

En una botella de idrogenaclón de 500 mi m disolvió 1 § (6 ramales) de vainiinoxima en 15 mL de una mezcl metanol-terbuíanol {8:2) logrando una disolución clara y transparente; se adicionaron 0,7 g (11.96 mmoles) de ácido hexanóico y 100 mg de catalizador Pd C, La reacción se llevó hasta completo consumo de hidrógeno, aproximadamente en 1 hora y 15 minutos a 60 psi de hidrógeno. Al término de ia misma, para recuperar ia sai orgánica, la meada de reacción se concentró en un rotavapor a presión reducida hasta que alcanzó una consistencia de asta a la que se adicionaron 10 mL de acetato de etilo. Esta operación {c ncentración-adición de disolvente) se repitió una vez más, antes de enfriar la meada a § *C para recuperar la sal precipitada por filtración al vacio. Los sólidos se lavaron con 1S mL de acetato de etilo y se secaron a temperatura ambiente hasta peso constante. De esta reacción se obtuvo 1 g del caproato de vainiinarnina.

Ejem lo 2 Síntesis enzimática de la caproilvainiliinamida. Variante 1

A partir de 0.1 M de caproato de vainiinarnina, como puede ser el obtenido en el ejemplo 1 , se llevó a cabo una reacción enaimá ica en yn tubo eppendorf de 1 ,5 mt, en un agitador térmico (Themiomixer compaet, eppendor1¾S> con ai fin cíe agitar el sistema y mantener la temperatura controlada, la reacción contenía 1 mi de tetra idrofurano (THF), 10 mg de Novo ym 435 (lipasa B de Candida antárctica inmovilizada en Le aíii fíovGzymes®} y se llevó a cabo a 55 ^e C con agitación de 1400 rpm. Tmnscyrridas las 48 ñoras de reacción el tubo fue removido del termo ^» agitador y se analizaron las muestras ai tiempo inicial y fina! de la reacción, por HP C, en donde se cisaníificó la desaparición de vainiinarnina y se observó un 92% de conversión de caproato de vaíniinamina a caproílvainiliinamida, Ejemplo 3 Síntesis enamática de la caproifvaíniítinamMa. Variante 2

Se procedió de manera similar al ejemplo 2 salvo que se sustituyó el biocataiteador por Upozyme RU4M (lipasa de R iiomuoor m inmovilizada en resina de intercambio amónico Duoiite®, Novoz mes®}, obteniéndose una conversión del 70% de caproato de vaíniinamina a caprolivainiliinamida,

Ejem lo 4 Síntesis ermmáiica de la caproiívainilllnamida. Variante 3

Se procedió de manera similar ai ejemplo 2 salvo que s sustituyó ei iocatalizador por Upozyme ΤΙΛΜ (lipasa de Ttwmomyces lanugmosm inmovilizada en sílica granulada, Novozymes©), obteniéndose una conversión del 82% de caproato de vainiflinamina a caprolivainiliinamida.

Ejemplo S Síntesis enzimática de la caprolivainiliinamida. Variante 4

Con 0.1 de caproato de vaíniinamina obtenido en ei ejemplo 1 se llevó a cabo «na reacción enzímatfea en un tubo eppendorf de 1.S mL, en un agitador térmico (Thermomixer compact, eppendorü) con el fin de agitar el sistema y mantener la temperatura controlada. L reacción ceñíanla 1 m de 2-metii-2-butanol (2M2B} _; 20 mg de Novoar m 435 y se ¡levó a cabo a 3S ^* C con agitación de 1400 rpm. Transcurridas 48 horas de reacción ei tubo fue removido de! termo-agitador y se analizaron por HPLC muestras tomadas ai tiempo inicial y final de la reacción, para cuantifícaf la desaparición de vairtiinamina. Despyés de 48 de reacción se obtuvo un 95% de conversión de oaproaío de valnitSinamina a caproiívainiinamida.

Ejemplo 8 Síntesis enzímá&ca de la caproiivainiliinamida Variante 5

Se procedió de manera similar ai ejemplo 5 salvo que se sustituyo a! disolvente 2 2B por acetona. Después de 48h de reacción s© obtuvo un 14% de conversión de caproaio de vainiinamína a caproiívs inamida. ejemplo 7 Sín esis enzimática de la caproilvainiinamída. Variante 8

Se procedió de manera similar ai ejemplo 5 salvo que se sustituyó al disolvente 2M2& por acetona y al feiGeatafízaefor Novozym 435 por üpoz me R$ *M obteniéndose en 48h de reacción una conversión del 25%,

Ejemplo 8 Síntesis enzlmátiea de la caprofivaMiiínaíBída. Variante 7

Se procedió de manera similar al ejemplo 5 salvo ue se sustituyó al biocaiafeador Novozym 435 por üpozyme Tt~, obteniéndose después de 48h de reacción una conversión del 10%.

EJenspí® § Síntesis de capriato de vainslíinamina. (Ruta de síntesis Al)

S disolvieron 4 g de valnillnoxíma (24 rrsmoles} en 20 mi de metano! y 3.8 mi de ácido octanóíco (1 eq.) en 30 mi de metano!. Ambas soluciones se mezclaron y colocaron en la botella de! hldrogenador (Parr 3918EG). Posteriormente se adicionaron 200 mg de Pd C al 5%. Una ez colocada la botella en ei hidrogenador, el sistema se purgó con hidrógeno para después llevarlo hasta una presión de 60 psi óe hidrógeno a temperatura ambiente (25 *C). Se mantuvo m agitación hasta completo consumo de hidrógeno. Aproximadamente en 3 horas se liberó la presión del del hidrogenado? y la solución se filtró ai vacío sobre pape! Whatman 1 para recuperar ei catalizador. Después de separar el catalizador, se concentró la solución evaporando el metano! a presión reducida en un rctavapor hasta llegar a un volumen final de 16 mi. A esta solución se le agregaron 30 mt de acetato de etilo y se llevó a Ú ^* C para cristalizar fa sal. La reacción se mantuvo 2 horas a está temperatura y se filtraron los cristales de capriiato de vaimliinam na. Al filtrar esta mezcla heterogénea se obtuvieron 4.9 g de la sal, lo que equivale a un rendimiento del 89%. Ejemplo 10 Síntesis de capriiato de vainii amtna. (Ruta de síntesis A2)

En un vaso de 1.2 L se disolvieron S8.1 g {1 mol) de hidróxido de potasio en 1 t de meíanol. logrando una disolución clara y transparente. La temperatura de la solución alcanzó los 55 ^e C. A esta solución se le agregaron 189.8 g (1 mol) de dore-hidrato de vainiinamlna y se agitó vigorosamente por 30 min. Posterior a ello, se agregaron 144.1 g (1 mol} de ácido octanóico. En la reacción se mantuvo una agitación vigorosa por 2 hr, tiempo suficiente para que la reacción alcanzara una temperatura ambiente (~28°C). Posteriormente, la solución se ro en un embudo Büchner con papel filtro, paso del se obtuvo el KCI precipitado y una solución homogénea. Después de la separación de los sólidos, se evaporó el metano! a sequedad y se obtuvieron 270 g de octanoato de vainiinamina (0.9 mol),

Ejemp 11 Síntesis de caproaio de vaisnamina. (Ruta de síntesis A2)

En u vaso de 0.6 L m disolvieron 10 g (0.S mol) de hidróxido de sodio en 0.5 L de etanol, logrando una disolución clara y transparente, la temperatura de la solución alcanzó los 38 ^a C. A esta solución se le agregaron 47.3 9 (0.5 mol) de ciorohidrato de valnidlnamlna y se agitó vigorosamente por 30 min. Posterior a ello, se agregaron 38 g (0.5 mol) de ácido octanóico. En la reacción se mantuvo una agitación fgomsa por 2 hr, tiempo suficiente para que la reacción alcanzara una temperatura ambiente (* ^» 28*€). Posteriormente, la solución se fiitrd en un embudo büehner con papel filtro paso del se obtuvo el NaC! precipitado y una solución homogénea. Después de la separación de los sólidos, se evaporó el metano! a sequedad y se obtuvieron 63.8 g da octanoato de vainÉ Bnamína (0.43 mol).

Ejemplo 12 Síntesis enximática de la caprilvainíllínarnida. Variante 1

Con el capriiato de vainlinamina obtenido en el ejemplo 9 se llevaron a cabo 4 reacciones enzimátíeas diferente concentración de la sai (0.02 M, 0,1 M, 0,5 U y 1.0 M) en viales de 1S mL sellados, m un Nbridaador (Thermo Scientific® S ake 'n Steck) con el fin de agitar el sistema y mantener la temperatura controlada, Las reacciones contenían 10 mi de tert-amiiaicohol (2Μ2Β), 200 mg de bíocatalszador Novozym 435 y se llevaron a cabo a 55 ^a C con agitación a 280 rpm. Las soluciones a 0.02 y 0.1 eran mezclas homogéneas desde el inicio de ia reacción; por el contrario,, las reacciones a 0.5 y 1,0 M, eran heterogéneas al Irtelo dé la reacción, pero se ©roogene&aron al cabo de 12 horas de proceso. Transcurridas las 48 horas de reacción los viales fueron removidos del ibridízador y se analizaron por S HPLC las muestras a los tiempos inicíales y finales de las 4 reacciones, para cuanijfícar la desaparición de vainlinamina. Las reacciones a 0.02 y 0,1 M de la sal alcanzaron un 99% de conversión de cap lalo de vaireifinamina a capriívainiinamida, mientras que las reacciones que Iniciaron con de O.SM y 1.0M de sal, alcanzaron 95 y 93% de conversión a la amida respectivamente.

10 Para la purificación de la caprilvainiilinamida se mezclaron los productos do las 4 reacciones, se separó el biocataüzador por filtración y se evaporó tocio el 2M2B m un mtavapor Büchi 461 (a 80 ^e C, 100 rpm y -60 Pa), hasta obtener un aceite viscoso y de color café. Posteriormente, con 1 g de dicho aceite, se llevó a cabo una purificación por cromatografía flash ( eveleris® Preparativo Flash

] 5 Chrornatograp y System) con un gradiente de 0 a 0.S n-hexano/acetato de etilo de lo cual se obtuvieron 0.92 g de caprilvaMIfoamida, Jamplo 13 Síntesis química do la sal caprilato de vainlinamina (Rula de síntesis A1} y síntesis enzlmá ica secuencia! de la eaprivainíllinamida.

20 Se disolvieron 1.57 g {9.4 mmdos) de valnilnoxima y 1.62 g de ácido octanóico (1.2 eo) en 15 mi de 2 28. La solución se colocó en la botella del fiidrogenador {Parr 391 £ø) y se adicionaron 78,6 mg de Pd/C al 5%. Una vez colocada la botella en el hidrogenador, al sistema se purgó 3 veces con nitrógeno y 3 veces con hidrógeno después de lo cual el sistema se llevó a 45 *C y 80 psí de hidrogeno, Al

25 cabo de 12 horas sa retiró la reacción del iiidrogenador y la solución se filtró ai vacio sobre papel atman 1 para recuperar el catalizador. Do esta muestra se tomó una alícuota do 200 μΐ, añadieron 200≠~ e agua y se cuantificó la cantidad de vamiílinamina por HPLC, determinándose un rendimiento de 81,8% en la reacción.

30 Posterio a ia hidrogenadóo, la solución filtrada se transfirió a un frasco do 40 mi ai que se adicionaron 226 mg de ovozym 43S y se llevó a una Incubadora a 80 ^* 0 agitada a 300 rpm, Al caoo de 72 horas de transcumda ia reacción el frasco fue retirado de la incubadora. De esta solución se tomó una muestr y por HPLC se determinó un 92,1% de conversión en la reacción enzimiiea de condensación

35 para la obtención de la caprilvalniilinamida. La evolución de esta reacción se <><) muestra en la Figura 4,

Ejemplo 14 Síntesis de laurato de vainiinamtna, (Ruta de síntesis A1)

Se colocaron 2 g (12 mrooles} de vainillinoxíma m la botella para hidrogenación de 800 mL y se accionaren 30 mL una mezcla de mefanoi:ierbutano! (8:2). A esta solución se adicionaron 2.4 g (1eq) de ácido íáurico y 200 mg de Pd/C, Posteriormente el sistema se purgó 3 veces con nitrógeno y 3 veces con hidrógeno después de lo cual el sistema s llevó a 60 psi de hidrógeno y se mantuvo con agitación aproximadamente 1 hora hasta el completo consumo de hidrógeno,, Al cabo de este tiempo, se filtró al vacio el catalizador sobre papel V¾haímar¾ 1 y se evaporó eí medio de reacción hasta sequedad por destilación a presión reducida en un rotavapor. Una vez que el medio de reacción adquirió la consistencia de una pasta, se adicionaron 10 mL de acetato de eíiío y se deslió de nuevo a presión reducida para eliminar las trazas d metano!. Después de la destilación, se adicionaron 10 mL de acetato d etilo y se enfrió la mezcla en baño de hielo por 2 horas. Por último, se filtró al vacio sobre papel y se secó temperatura ambiente hasta obtener un peso constante de lo cual se obtuvieron 2.8 g del laurato de valniinamina. EJ roplo 1S Síntesis enzsmátlca de la lauriivasnilriamida. Variante 1

Con 0.1 de laurato de vamillinamina obtenido en el ejemplo 14 se llevó a cabo una reacción enzimática en un tuoo eppendorf de 1.5 mL, en un agitador térmico (Tbermomixer cornpaet, eppendorf® con el fin de agitar el sistema y mantener la temperatura controlada. La reacción contenía 1 mL de tert-amilafcohol (2M2B), 10 mg de Movozyrn 435 y se llevó a cabo a SS *C co agitación a 1400 rpm. Transcurridas 48 horas de reacción el tubo fue removido del termo-agitador y se analizaron por HPLC muestras ai tiempo inicial y final de la reacción, para cuanüficar la desaparición de vainiilinamina (Figura 6). Se encontró un 9í% á& conversión de laurato de vainiilinamína a fauri!valni!!inarnida,

Ejemp o 1§ Síntesis enamática de la lauri!vainiilinarrt¾a. Variante 2

Se procedió de manera similar al ejemplo 5 salvo que se sustituyó a! disolvente

2M2B por THF y se obtuvo una conversión del 97%. Ejemplo 1? Síntesis enzimáttea de ia laurilvainiinamida. Variante 3

Se procedió de manera similar ai ejemplo 16 salvo que se sustituyó al bíoeaíaí&ador Movozym 43S por üpozyme JL-M, obteniéndose una conversión del

30%.

Ijampfo 18 Síntesis enzimática de la laurilvainiinamida. Variarte 4

Se procedió de manera similar ai ejemplo 15 salvo que se sustituyó al disolvente 21^28 por THF y ai bioeatateador por Upozyme -i , obteniéndose una conversión del 83%

Ejem lo 10 Síntesis en&mática de ia lauñivainilinamkia. Variante 5

Se procedió de manera similar ai ejemplo 16 salvo que se sustituyó ai disolvente 2M2B por acetona, ei iocataliiador Hovozym 435 por UpoEyme T14U y se la reacción se llevé a cabo a 35 ^* C. Después de 48h de esta reacción, se obtuvo una conversión del 12%.

Ejemplo 30 Síntesis de estearato de vainiínamina. (Huta de síntesis A1)

En la botella de hídrogenaeión de 600 mi se disolvieron 3,4 § ( 11.96 mmoies) de ácido esteárico en 50 mi de una mezcla metanoi-terbutanol (50:50) logrando una disolución clara y transparente, a la que se adicionaron 2 g {11.96 nimoies) de vainiinoxsma y 200 mg de FW. el sistema se purgó 3 veces con niírógeno y 3 veces con hidrógeno después de lo cual el sistema se llevó a 60 psi de hidrógeno y se mantuvo con agitación aproximadamente 2 horas, hasta completo consumo de hidrógeno, tiempo para el cual se concluyó la reacción.

La mezcla de reacción se concentró hasta alcanzar una consistencia de pasta en un rotavapor a presión reducida. A este concentrado se adicionaron 10 mi de acetato de etilo y se concentró nuevamente, agregando otros 10 mí» de acetato de etilo. La mezcla se enfrió a 5 ^¾ C, manteniéndose a esta temperatura durante 2 horas para posteriormente filtrarla al vacio. Los sólidos obtenidos so lavaron con 5 mL de acetato de etilo y se secaron a temperatura ambiente hasta peso constante. De esta reacción se obtuvieron 3.8 g del estearato de valniiiinamina

SJernol© 21 Síntesis ensimática de le esteariivamilinamJda, Variante 1

Con 0.1 M de esíearato de vainliíinamina obtenido en el ejemplo 20 se itevó a cabo una reacción enzimática en un tubo eppendorf de 1.5 mi, en un agitador térmico (Thermomixer compact, eppendorf®} con el fin de agitar el sistema ¥ mantener ia temperatura controlada. La reacción contenía 1 mt de tert-amítaleohoí (2WB) _f 10 mg de Novoxvm 43S y se llevó a ca o a S5 *C con agitación a 1400 rpm. Transcurridas las 48 horas de reacción ai tubo fue removido del termo-agitador y se analizó el tiempo inicial y final de la reacción por HPLC para cuantlcar Sa desaparición de yainiinamlrsa. En estas condicionas se obtuvo un 74% de conversión.

Ejemplo 22 Síntesis ensmátíoa de la esteariivalniliinamida. Variante 2

Se procedió da manera similar al ejemplo 21 salvo que se sustituyó al disolvente 2M2B por acetona, obteniéndose una conversión del 62%,

Ejemplo 23 Síntesis aromá ic de la esteanívaíniinamida. Variante 3

Se procedió da manera similar al ejemplo 21, salvo que se sustituyó al disolvente 2M28 por íetrahidrofurano (THF), obteniéndose una conversión del 53%

Ejemplo 24 Síntesis ensimática de la astea rUvainlllinami fa. Variante 4

Se procedió de manera similar al ejemplo 21 salvo que se sustituyó ai disolvente 21 2B por THF y la reacción se llevó a cabo con el biocataiizador Lipozyme R 4M, Se obtuvo una conversión del 79%.

EJesw fe 2S Síntesis enziroática de la esteariívalniirsamída. Variante S

Se procedió de manera similar al ejemplo 21 salvo que se sustituyó al biocatalkador No sym 435 por Liposyme Ύ14 , obteniéndose una conversión da! 31%.

Ejem l 28. Síntesis enzimática de la capnivalniliinamída a partir de caprilato de vainiliinarnina, sin la remoción de la sal Inorgánica (KCI).

Síntesis de caprilato de vainifcamsna. En un vial de 16 mi se disolvieron 0.2 ramo! de hidróxicto de potasio 10 mi de metano!, logrando una disolución ciara y transparente. La temperatura de la solución alcanzó tos §8 *C. A esta solución se te agregaron 0,2 mmoi de oforohidrato de vainillinamina y se agitó vigorosamente por 30 mia Posterior a ello, se agregaron 0,2 mmol de ácido octanóioo. En la reacción se mantuvo una agitación vigorosa por 1 hr, tiempo suficiente para que la reacción alcanzara una temperatura ambiente {~28*C). Posteriormente, se «vaporó el metano! a sequedad y se obtuvo un sólido blanco (~Ü.6 mg) que corresponde a una mezcla de KCI y capriíato de vainilnarnina.

Condensación emimáfica de la caprilvainilinarnida. El sólido blanco obtenido en el paso anterior fue resuspendido en 10 mi de 2 ^» meíil ^« 2 ^» butanoi _! e lo u se obtuvo 5 una mezcla heterogénea (la sai orgánica se disolvió dejando el KCI como sólidos no disueltes), Λ dicha solución se le agrega n 200 mg de bioeatalizador Novozym 43S y la mezcla se llevó a un híorldkador (Thermo Sctentífic® Shake 'n Síack) con el que se controló la agitación y se mantuvo la temperatura a 5Q . Transcurridas 48 horas de reacción el vial fue removido del nibTidizadof y se analizaren por HPLC 10 las muestras correspondientes al tiempo inicial y final. El análisis por HPLC reveló la conversión de 85% de caprilaío de vainillinamlna a caprüvainiilieamlda. Con este ejemplo se demuestra que la presencia de la sai inorgánica (KCI) no impide la actividad del blocatalteador,

Í S REFERENCIAS

DOCUMENTOS DE PA EN E {«n el onten ettwto)

US 4,388,280 Process for the preparatfon of p sydroxy~benxyi-nitriles and correspond ng amirses. Le n Fartser, Petar S. Gradeff (1983).

0 US 8,329,048 B2 e iod for the synthesls of substltuted fo niyíamines and subsiitu ed amines ikhali Sobylev (2012),

US SS8 _S 18 Process for prepariog vaftiylamlne hydrodiioríde. Ingo Reddesheimor, Otiver Meyer (2O0S).

U$ 4 _f $3¾,13t Compounds and compositions useful for prodoolng analgesia. John 5 . Janusi, Tilomas R. LaHann (1985}.

Ü$ §,094,782 Synthesis of capsalcin derivativos and iheíf use as an analgesíc drug and vessel dílation drug. Cnen, Jwo-Lal Yeh (1992),

US S _? 322 _S S02 esin moidlng composition for preveniing gna ing damage by animáis. Yasuhiro fcbika ltem Kurata, Yoshlnobo Gkuí, Iwao Takahasbi, Mika 30 Toya (19S4).

US S _» 4S8 ₍ 9ÍS Microoapsules contalning ca salcine ccmpound and fheir producfion. Yasuhiro ienikawa, Soichl Kalo, Mitsuo ursrta _» Takeshí ishítaní, Yos anobu Gkui, Iwao Taka ashi, ika Toya (1996).

US 2δ9? δ203?83 A1 Preparatíon and purifícate of synthe ic- capsaicin. Tirnothy 3S Anderson, Uamlú Suroh, Richard Cárter, Weí Chen, Snaron yciívain, Premchandran Ramiya, He rsg Zhang (2007).

US 7,446,226 B2 Capsaicin derívales and í e producto and use thereof. E nar Bakstad, Totsteo Helsing (2008).

US 2Ο03 δ1δ7δ7δ A1 Ca saícín ^» «fec mposíng syníhesi2áng « symes and method for producing Ibe same. Koreyosni Imamura, Kazuhiro Nakanishi, Takaharu Sakiyama {2003}-

US 2884/01861 2 Al Hydfoíyzing/dahydration condensing enzymes and rrsetnsd for synthesízíng amide by usir¾ fhe ertzyme. orayosh Imamura, Kazuriim Makanis f, Taka aru Sakiyama (2004),

UTERATURA CIINTÍF1CA (en al ontatt citado)

a. » Kenjí Kofeata, Momoyo Kawamura, akíko Toyoshíma, Yukiyosh» Tamura, Susumu Ogawa< Tatsuo Waianabe; Upase-cataiyzed syethes of capsaicin analogs by amidafíon of ^y anillyiamlne with fafty ackfó de va^ es. Sfot hnoksgy LBtt&rs 20 (1998) 451-464.

b. - Kenji Kobata, Malayo Toyosbima, Mom yo Kawamura, Tatsuo Wa ana e; Upase-catalyíed $yntheais of capsaicin anaSogs usíng natural oits as an aey^ donor, Bfotechnofogy L® rs 20 <199β) 7S1-783,

c. ~ $nj ^j Kofeaía, Mamíko Kobayas i, Yukiyoshi Taroura, Sbozo ¾¾yoshi, Susumu Ogawa, Tatsuo Watanabe; Upase-cafalyzod synthesis of capsaicin analogs by transacylatícn of capsaicin wítb natural oufs ar fatty acid denvatives in n-taan . Siotec notogy Lettets 21 (1999) 547-550

d. - Kenji Ksbata, amiko obayasbi, Sachiy inpara, Tatsuo Watanabe; Supercrifícal CQ2 as a reaction médium for synthasis of capsaicin analo ues by íipase-caíafyzed transacyiatsort of capsaicin. Biotechnalogy Letters 25 (2803) 1575- 1578,

Dolores Reyas-Duarte, Edmundo Castillo, Roberto Martínez, Agustín López- ungusa; Lípas -cataiyzed synthests of olvanil in organie solvente. Biotectmoiagy Leíiers 24 (2002) 2057-2061.

Edmundo Castillo, Alejandro Torres-Oavilán. Patricia Severiano, Arturo Navarro, Agustín Lopez-Munguía; tipase-catalyzed synthesis of ungent capsaidn «naiogues. Food Cbemisíry 100 (2007) 1202-1208.

Soi im, Yoon Kyung Choí, Jieun Hon§ ₅ Jaiwook Park, ahn-Jo© Kim; Candida ant rctica Upase A and Psmidomonas síruteori ¡pasa as a pair of stetBocompüemerííary enxymes for tbs resoiution of 1,2-diaryieí anois and 1,2- 21 dlaryíet anamines. T dfon L& m 54 {2m } 1185-1188,

Fionan Ls Joubioux _* Yesmine m Henda, Nicolás Bridiau, Oussama Áchour, Marianrte Graber, Th&rr Vfaugard Tte afffect of subsrate stmcture o« th« chemQsetectsvfty f Candida antwct 8pa$e B-caialyssd acyfation of amlno- alcohois. Journal ø/ Moíacuíar Caaí sis B: Enzymaiki 85 ^« 66 (2013} 1 3- 199

Xiang-Guo Li, María Láhitía, üisa T. Kanerva; BurkhoidBria capada U ase and acívated beta-íactams s eía-dpepikJe and beía-amsno aroide synthesis. Tetmhedmn: A&y etry 19 (2008) 1857-1861.

Xhterry augard, Magafi Rtmaud-Simeon, D míníque Pete, Fierre Monsan; U ase-cal iyxed c emoseteotiva N-acyíaiíor» of amiri0 ^» sugar derivativas m hydrophobc seiven acíd-arrene ion-p a ir rffecís, Tet &dron 53 (1887) ?58?~?504, Ab l Azim, Suri . Sharma, Car E. Olsen, VMnáters S. Pa mar; Upase Cataíysed Sy hesis of Gpticaliy Enriched aífs-Baicamides. Bioorgerib ¡ Me icinal Gh&mÍstry 9(2091} 1345-1348.

iohrs M. Janusz, Bñm L Buckwalíer, Patricia A. Young, Themas . laHann, Ral h W. Fa ser, Geraid B. Kasting, fterice E, Lo mans, Gary A. ercfcaert Che S. Madáin, Eíiza eth P, Sermam, Richard L Bohne, Tfto as L Cu s, Judlt R. Mslsteirv; Vaniiloíds. i, Anaíogs of Capsaícín with Antinocieeptive and AníBtofiammatory Aclivíty. Jmsm&í of Medici al C is y 38 (1SS3) 2595-2604.