In der angewandten Mikrobiologie, insbesondere in der Biotechnologie, ist es bekannt, Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen auf bestimmten Trägern zu fixieren, beispielsweise wenn sie als Biokatalysatoren verwendet werden. Dieser Vorgang wird im allgemeinen als Immobilisierung bezeichnet.

Da native Enzyme bei der Lagerung oder beim einmaligen Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität reduziert werden, besteht wegen der hohen Herstellungskosten von Enzymen ein Bedarf, diese Enzyme zu stabilisieren. Durch die Immobilisierung werden sie wiederverwendbar. Nach der Verwendung können die Enzyme leicht wieder abgetrennt werden. Auf diese Weise lassen sie sich in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität des Enzyms dürfen durch die Immobilisierung nicht verloren gehen.

Bei der Immobilisierung von Enzymen werden im allgemeinen drei grundsätzliche Methoden unterschieden, nämlich erstens die Immobilisierung durch Quervernetzung, zweitens die Immobilisierung durch Bindung an einen Träger und drittens die Immobilisierung durch Einschluß.

Bei der Immobilisierung durch Quervernetzung erhält man quervernetzte Enzyme, die miteinander fixiert sind, ohne daß ihre Aktivität beeinflußt wird. Die Enzyme sind jedoch nicht mehr löslich. Die Quervernetzung erfolgt beispielsweise mit Glutardialdehyd. Wenn die Immobilisierung durch Anbindung an einen Träger erfolgt, kann die Bindung durch Adsorption, lonenbindung oder kovalente Bindung erfolgen. Die Bindung an den Träger kann auch innerhalb der ursprünglichen mikrobiellen Zelle stattfinden. Das Enzym wird durch die Fixierung nicht in seiner Aktivität beeinflußt, es kann trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.

Bei der Immobilisierung durch Einschluß wird das Enzym meist zwischen semipermeablen Membranen und/oder Gelen, Mikrokapseln oder Fasern eingeschlossen. Die gekapselten Enzyme sind z. B. durch eine semipermeable Membran von der umgebenden Substrat-und Produkt-Lösung getrennt. Es können auch Zellen gekapselt werden. Das Enzym ist durch die Fixierung im Raum nicht in seiner Aktivität beeinflußt.

Immobilisierte Enzyme, enzymproduzierende Mikroorganismen oder Zellen werden insbesondere in biotechnologischen Verfahren eingesetzt. Die ersten technischen Verfahren mit immobilisierten Zellen wurden empirisch optimiert und werden noch heute eingesetzt, so z. B. die Abwasserreinigung im Tropfkörper.

Ein ebenfalls älteres Verfahren ist die Essigproduktion mit dem Generatorverfahren. Im Nahrungsmittelbereich ist der Einsatz von Zellen mit Glucose-Isomerase zur Produktion von fructosehaltigem Sirup das wichtigste Verfahren. Glucose-Amylase zur Glucose-Herstellung im Stärkeprozeß wird ebenfalls immobilisiert eingesetzt. Die Spaltung von Lactose mit Hilfe der immobilisierten ß-Galaktosidase aus Hefen zu Glucose und Galactose ist ebenfalls ein gängiges Verfahren. Weitere technische Verfahren mit immobilisierten Systemen gibt es bei der Aminosäureherstellung, bei der Spaltung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillinsäure und bei der Herstellung von Ethanol mit wachsenden, immobilisierten Zellen von Saccharomyces sp.

Immobilisierte Enzym-und Zellsysteme werden nicht nur in biotechnologisch ablaufenden Produktionsverfahren, sondern auch in der Analytik eingesetzt, so z. B. in sogenannten Biosensoren. Das Prinzip der Analytik mit Hilfe von immobilisierten Systemen beruht darauf, daß ein zu bestimmendes Substrat durch ein immobilisiertes System umgesetzt wird, wobei die Veränderung der Produkt-, Substrat-oder Cosubstrat-Konzentration verfolgt werden kann, beispielsweise mit mehreren gekoppelten Methoden (z. B. Enzym-Elektroden).

Oftmals erfolgt der Abbau oder die Umsetzung von Molekülen aber nicht durch ein einziges Enzym, sondern entlang einer sogenannten Enzymabbaukette aus mehreren Enzymen, d. h. die Reaktion wird mehrstufig enzymkatalysiert mit unterschiedlichen Enzymen. Bisweilen ist auch die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym (abbau-) ketten erforderlich. In herkömmlichen Biosensoren und Bioreaktoren des Standes der Technik kann eine solche mehrfach enzymatisch katalysierte Reaktionsfolge aber oftmals nur selten durchgeführt werden, weil die aus dem Stand der Technik bekannten Bioreaktoren und Biosensoren vorzugsweise einen Typ von Enzym umfassen.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein System bereitzustellen, mit dem sich auch solche Prozesse enzymatisch katalysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Moleküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in mehreren Stufen enzymatisch katalysiert abgebaut oder zu Endprodukten umgesetzt werden, wobei die Umsetzung innerhalb nur eines einzigen enzymatischen Systems, aber mit verschiedenen Enzymen erfolgen soll.

Des weiteren liegt der vorliegenden Erfindung das Problem zugrunde, ein System bereitzustellen, mit dem auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch mehrere unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym (abbau-) ketten möglich ist.

Insbesondere soll ein solches System zur Anwendung in Bioreaktoren, Biosensoren und chromatographischen Systemen geeignet sein.

Es wurde nun hier überraschenderweise herausgefunden, daß das zuvor genannte Problem gelöst werden kann durch Kombination von mindestens zwei verschiedenen Enzymen, d. h. mindestens zwei verschiedenen Typen von Enzymen, die vorzugsweise jeweils in immobilisierter Form vorliegen können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein enzymatisches System, welches eine Enzymabbaukette umfaßt, die ihrerseits mindestens zwei verschiedene bzw. unterschiedliche Enzyme, d.. h. Enzyme unterschiedlichen Typs, umfaßt.

Die mindestens zwei Enzyme der Enzym (abbau-) kette sind dabei derart aufeinander abgestimmt, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein bestimmtes Molekül-auch als"Target-Molekül" bezeichnet-abbauen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym (abbau-) kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Molekül, insbesondere ein technisches Molekül, abbauen. Dabei können die Enzyme der Enzym (abbau-) kette beispielsweise derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine nicht natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden. Alternativ können aber die Enzyme der Enzym (abbau-) kette auch derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie das nicht natürlich vorkommende Molekül, insbesondere technische Molekül, gemäß einem natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen, d. h. eine natürlich vorkommende Metabolismuskette bilden, welche aber natürlich vorkommend den Abbau anderer, nämlich natürlich vorkommender Moleküle reguliert.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Enzyme der Enzym (abbau-) kette derart aufeinander abgestimmt sein, daß sie, insbesondere selektiv oder im wesentlichen selektiv, mindestens ein natürlich vorkommendes Molekül gemäß einem nicht natürlich vorkommenden Metabolismus abbauen. Das natürlich vorkommende Molekül kann beispielsweise ein Naturstoff sein.

Das erfindungsgemäße enzymatische System eignet sich insbesondere zum konsekutiven und/oder mehrstufigen Abbau von Molekülen. Dabei verläuft der Abbau vorzugsweise selektiv oder im wesentlichen selektiv in bezug auf das oder die abzubauenden Moleküle.

Des weiteren kann das erfindungsgemäße enzymatische System insbesondere zur Katalyse mehrstufig enzymatisch katalysierter Reaktionen eingesetzt werden.

Gleichermaßen eignet sich das erfindungsgemäße enzymatische System zur parallelen Umsetzung von verschiedenen Molekülen mit jeweils unterschiedlichen Enzymen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in dem erfindungsgemäßen enzymatischen System mindestens eines der Enzyme der Enzym (abbau-) kette in immobilisierter Form vor. Vorzugsweise können bei dieser Ausführungsform alle Enzyme der Enzym (abbau-) kette in immobilisierter Form vorliegen.

Die Immobilisierung der Enzyme kann erfindungsgemäß nach den üblichen, zuvor beschriebenen Verfahren des Standes der Technik erfolgen, wobei die Reaktivität der auf diese Weise immobilisierten Enzyme zumindest im wesentlichen erhalten bleiben soll.

So kann die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems beispielsweise durch Quervernetzung erfolgen.

Des weiteren besteht die Möglichkeit, mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems durch Einschluß oder Verkapselung zu immobilisieren, insbesondere durch Einschluß oder Verkapselung in eine semipermeable Membran oder zwischen mehrere semipermeable Membranen, aber auch zwischen eine und/oder mehrere semipermeable Membranen und abschließend eine ionendurchlässige, aber gaspermeable Membran, z. B. aus PTFE oder Silikonkautschuk.

Die Immobilisierung mindestens eines der Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems kann auch durch Bindung an einen geeigneten Träger erfolgen. Hierbei kann die Bindung aufgrund von Adsorption, lonenbindung oder/und kovalenter Bindung zustandekommen. Beispielsweise kann die Immobilisierung durch Anbindung an einen geeigneten, vorzugsweise chemisch inerten Träger erfolgt sein, wobei der Träger zuvor durch plasmachemische Oberflächenmodifizierung aktiviert worden sein kann.

Schließlich besteht auch die Möglichkeit, das oder die Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems durch ein Verfahren zu immobilisieren, wie es beschrieben ist in der deutschen Patentanmeldung mit dem Amtsaktenzeichen DE 101 18 553.7, wobei deren gesamter Inhalt hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrensschritte : (a) Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche durch Modifizierung der Trägeroberfläche mit plasmachemischen Methoden, insbesondere wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche eine Funktionalisierung der Trägeroberfläche umfaßt und vorzugsweise dadurch erfolgt, daß unter plasmachemischen Bedingungen mindestens eine geeignete, gegenüber dem oder den anzubindenden Enzymen reaktive funktionelle Gruppe direkt an der chemisch inerten Trägeroberfläche angebracht wird, insbesondere wobei die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Carboxyl-, Amino-, Hydroxy- und/oder Thiogruppe, gegebenenfalls in aktivierter, insbesondere protonierter oder deprotonierter Form, umfaßt ; anschließend (b) Anbindung des oder der zu immobilisierenden Enzyms, gegebenenfalls nach ihrer Überführung in einen aktivierten, anbindungsfähigen Zustand, an die auf in Schritt (a) aktivierte Trägeroberfläche ; und schließlich (c) gegebenenfalls Quervernetzung des in Verfahrensschritt (b) angebundenen Enzyms, insbesondere wobei die Verfahrensschritte (b) und (c) gegebenenfalls zusammengefaßt, insbesondere gleichzeitig durchgeführt werden können und/oder die Immobilisierung gegebenenfalls schichtweise, insbesondere mit Glutardialdehyd, durchgeführt werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft also gemäß einer besonderen Ausführungsform ein enzymatisches System, bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym (abbau-) kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche nach dem zuvor beschriebenen Verfahren immobilisiert sind.

Die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche mittels plasmachemischer Methoden in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens ist vorzugsweise selektiv nur an der Oberfläche erfolgt, so daß die Bulk-Eigenschaften der chemisch inerten Trägeroberfläche im übrigen erhalten bleiben, wobei die Aktivierung der chemisch inerten Trägeroberfläche in Schritt (a) des zuvor beschriebenen Verfahrens im reaktiven Plasma, insbesondere Hochfrequenzplasma, erfolgt ist. Die chemisch inerte Trägeroberfläche kann insbesondere Edelmetalle wie insbesondere Platin sowie deren Legierungen, Edelstahl oder polyhalogenierte Polymere, insbesondere polyhalogenierte polymere Kohlenwasserstoffe wie insbesondere Polytetrafluorethylen oder Polyvinylchlorid, oder aber Celluloseacetat oder Kombinationen dieser Materialien umfassen. Besonders geeignet sind beispielsweise PTFE- (Teflon) und Celluloseacetatmembranen.

Die Anbindung oder Ankopplung des oder der zu immobilisierenden Enzyme an die plasmachemisch modifizierte Trägeroberfläche gemäß Schritt (b) des zuvor beschriebenen Verfahrens kann insbesondere durch Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über die in Schritt (a) angebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen erfolgt sein, wobei das oder die Enzyme unmittelbar an die auf die Trägeroberfläche aufgebrachten, reaktiven funktionellen Gruppen angebunden sein können oder aber mittelbar über einen geeigneten Linker.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisches System bei dem mindestens eines der Enzyme, vorzugsweise sämtliche Enzyme der Enzym (abbau-) kette durch Fixierung und/oder Bindung an eine chemisch inerte, plasmachemisch aktivierte und/oder funktionalisierte Trägeroberfläche immobilisiert sind. Dabei können das oder die Enzyme unmittelbar oder mittelbar an eine chemisch inerte Trägeroberfläche fixiert, insbesondere angebunden oder angekoppelt sein. Insbesondere kann die Anbindung oder Ankopplung des oder der Enzyme über an die chemisch inerte Trägeroberfläche angebrachte, geeignete, reaktive funktionelle Gruppen erfolgt sein.

Die Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems können insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe von Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen (z. B. Esterasen wie Lipasen), Lyasen, Isomerasen und Ligasen (Synthetasen) sowie deren Mischungen oder Kombinationen untereinander.

Bei dem erfindungsgemäßen enzymatischen System befinden sich die mindestens zwei Enzyme entweder innerhalb einer einzigen Reaktionszone oder aber in getrennten, hintereinander folgenden, sequentiell geschalteten Reaktionszonen, die dann gemeinsam das enzymatische System bilden. Mit anderen Worten können in dem erfindungsgemäßen enzymatischen System die Enzyme der Enzym (abbau-) kette innerhalb einer Einheit, vorzugsweise innerhalb einer Reaktionszone, eines Kompartimentes oder einer Zelle, insbesondere Meßzelle, angeordnet sein oder aber auch in getrennten, insbesondere hintereinanderfolgenden Einheiten, vorzugsweise in getrennten, hintereinanderfolgenden Reaktionszonen, Kompartimenten oder Zellen, insbesondere Meßzellen, die zusammen das enzymatische System bilden, angeordnet sein. Zwecks Differenzmessung kann jedoch auch eine Parallelschaltung von Meßzellen erfolgen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße enzymatische System Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder a- Glucosidase (Maltase). Ein solches System ist insbesondere zum Abbau von nichtionischen Tensiden, insbesondere von Alkylpolyglucosiden, geeignet.

Das erfindungsgemäße enzymatische System ist vielseitig verwendbar, insbesondere in Biosensoren, Bioreaktoren oder chromatographischen Systemen (z. B. chromatographischen Säulen). Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Biosensoren, Bioreaktoren und chromatographische Systeme, welche das erfindungsgemäße enzymatische System umfassen.

Wie zuvor beschrieben, können die erfindungsgemäßen enzymatischen Systeme in Biosensoren Verwendung finden. Es werden mindestens zwei verschiedene Arten von immobilisierten Enzymen miteinander kombiniert, die in einer Enzymkette oder Enzymabbaukette eingesetzt werden. Dabei können die verschiedenen Enzyme entweder in einem einzigen Reaktionssystem (z. B. in einer Meßzelle) vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sein (z. B. in aufeinanderfolgenden Meßzellen), die dann zusammen das erfindungsgemäße enzymatische System bilden. Auf diese Weise gelingt beispielsweise die parallele Bestimmung mehrerer Stoffe durch mehrere Enzyme (oder Enzymketten) in einer Meßzelle oder der sequentielle Abbau eines Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meßzellen bei gleichzeitiger Elektroanalyse in einer und/oder mehreren Meßzellen.

Unter"Biosensoren"versteht man erfindungsgemäß Meßfühler mit einer bioaktiven Komponente, basierend auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifisch Analyte erkennen, mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal (z. B.

Sauerstoffkonzentration, pH-Wert, Farbstoff etc.) in elektrische Meßsignale umformen.

Fig. 1 zeigt schematisch den typischen Aufbau eines Biosensors zur spezifischen Erkennung eines Analyten 1, wobei der Biosensor einen Rezeptor 2 und einen Transduktor 3 umfaßt, der das vom Rezeptor 2 erzeugte biologische Signal in ein elektronisches Signal 4 umwandelt, welches an eine Elektronik 5 weitergeleitet wird.

Zur spezifischen Erkennung können verschiedene Biomoleküle verwendet werden, insbesondere Enzyme. Als Transduktoren können eingesetzt werden potentiometrische Sensoren, amperometrische Elektroden, piezoelektrische Sensoren, Thermistoren oder optoelektronische Sensoren. Aufgrund der Reaktion oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptor unterscheidet man insbesondere zwei Grundtypen von Biosensoren, nämlich einerseits Bioaffinitätssensoren, die bei der Komplex-Bildung eintretende Veränderung der Elektronendichte ausnutzen, und andererseits Metabolismussensoren, die auf der spezifischen Erkennung und Umsetzung von Substraten beruhen.

Biosensoren finden-insbesondere in Form von Enzym-Elektroden-im Gesundheitswesen, zur Kontrolle biotechnologischer Prozesse, in der Lebensmittelindustrie oder im Umweltschutz Verwendung. Mit Biosensoren können unterschiedlichste Systeme analysiert werden z. B. Glucose, Galactose, Lactose, Ethanol, Milchsäure oder Harnsäure.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Biosensoren können beispielsweise die verschiedenen Enzymmoleküle zur Immobilisierung entweder in polymere Matrizes (wie z. B. PVC, Gele, Graphite oder Zeolithe) oder zwischen Folien (z. B. Celluloseacetat) eingebracht werden.

Des weiteren kann bei Sensoren, die beispielsweise auf der enzymatischen Erzeugung oder dem Verbrauch von Sauerstoff basieren und eine chemisch inerte Membran (z. B. eine Teflon@-Membran) besitzen, diese genutzt werden, um die verschiedenen Enzyme anzubinden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Biosensoren kann beispielsweise erfolgen, wie es beschrieben ist in der bereits zitierten deutschen Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Die erfindungsgemäßen Biosensoren ermöglichen beispielsweise die Herstellung von Mikroelektroden (arrays) für kleine Volumina und hohen Probendurchsatz (z. B. für die kombinatorische Anwendung).

Anwendungsbeispiele für die erfindungsgemäßen Biosensoren sind die analytische Bestimmung von Tensiden, insbesondere ionischen Tensiden wie nichtionischen Tensiden (z. B. Alkylpolyglucosiden), von Polyasparaginsäure und von Fettalkoholderivaten.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor, insbesondere zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung nichtionischer Tenside, vorzugsweise von Alkylpolyglucosiden, wobei der Biosensor als Enzym (abbau-) kette ein enzymatisches System umfaßt, welches als Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase, gegebenenfalls in Kombination mit Mutarotase und/oder a-Glucosidase (Maltase), enthält. Dabei liegen die zuvor genannten Enzyme insbesondere in immobilisierter Form vor, vorzugsweise durch Bindung an eine chemisch inerte Oberfläche und/oder Membran, bevorzugt an eine Polytetrafluorethylen-oder Celluloseacetatmembran.

Wie zuvor beschrieben kann das erfindungsgemäße enzymatische System auch in Bioreaktoren Verwendung finden.

Unter"Bioreaktoren"versteht man erfindungsgemäß das physikalische Behältnis, in dem biologische Stoffumwandlungen insbesondere mit Enzymen durchgeführt werden.

Dabei können die immobilisierten Enzyme des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems beispielsweise an die Wandungsoberflächen des Bioreaktors angebracht sein oder aber-insbesondere im Fall von Festbettreaktoren-an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut angebunden sein. Zu Einzelheiten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte deutsche Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Auf diese Weise kann eine effizientere Generation von Reaktoren verwirklicht werden, bei denen keine Abtrennung der Enzyme von der Reaktionslösung erforderlich ist. Erfindungsgemäß geeignete Reaktoroberflächen können aus Metall (z. B. Edelmetall wie Platin) bestehen oder mit allen gängigen Polymeren, die für die Reaktorherstellung eingesetzt werden, beschichtet sein (z. B. Teflon@).

Fig. 2 zeigt beispielhaft und schematisch verschiedene Arten von Bioreaktoren des Standes der Technik : Fig. 2A zeigt einen Rührkessel-Reaktor, bei dem der Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einheiten erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom und M die mechanische Antriebsvorrichtung (z. B. Motor). Wegen ihrer Vielseitigkeit werden Rührkessel-Reaktoren am häufigsten eingesetzt.

Fig. 2B zeigt einen Blasensäulen-Reaktor, bei dem die Durchmischung durch Zufuhr von Luft oder eines anderen Gases erfolgt. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 2C zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit innerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 2D zeigt einen sogenannten Airlift-Fermenter mit äußerem Durchlauf, wobei im allgemeinen durch Eintrag von Luft oder einem anderen Gas ein Flüssigkeitsumlauf und eine Durchmischung erzeugt wird. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

In den zuvor beschriebenen Bioreaktor-Typen des Standes der Technik kann das erfindungsgemäße enzymatische System zum Einsatz kommen, beispielsweise durch Modifizierung der Wandungsoberfläche (z. B. durch Ankopplung der Enzyme an die chemisch inerte Reaktorwandungen) oder im Fall von Festbett- Bioreaktoren durch Anbindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw.

Schüttgut.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen enzymatischen Systems in Bioreaktoren, insbesondere zur Modifizierung der Wandungsoberfläche oder bei der Bindung der Enzyme an das stationäre Trägermaterial bzw. Schüttgut, besteht die Möglichkeit, die mindestens zwei verschiedenen Arten von Enzymen derart miteinander zu kombinieren, d. h. die Enzymketten oder Enzymabbauketten derart einzusetzen, daß entweder die verschiedenen Enzyme in einer einzigen Reaktionszone vorliegen oder aber sequentiell hintereinander geschaltet sind (z. B. in aufeinanderfolgenden Reaktionszonen). Auf diese Weise werden insbesondere mehrstufige, enzymatisch katalysierte Synthesen und Prozesse ermöglicht oder auch die zeitgleiche, parallele Umsetzung verschiedener Ausgangsstoffe durch verschiedene Enzyme.

Die Fig. 3 zeigt exemplarisch und schematisch einige Ausführungsformen von Bioreaktoren nach der vorliegenden Erfindung : Fig. 3A zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisierten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche in unterschiedlichen, aufeinanderfolgenden Reaktionszonen angeordnet sind. Hierbei bezeichnet G den Gasstrom.

Fig. 3B zeigt einen Bioreaktor, dessen chemisch inerte Wandungen durch Ankopplung eines immobilisierten Enzyms vom Typ A und eines immobilisierten Enzyms vom Typ B modifiziert sind, welche innerhalb einer einzigen Reaktionszone angeordnet sind.

Fig. 3C zeigt einen Bioreaktor in Form eines Festbettreaktors, an dessen Trägermaterial oder Schüttgut immobilisierte Enzyme vom Typ A und vom Typ B angekoppelt sind, welche innerhalb einer Reaktionszone angeordnet sind.

Es sind noch zahlreiche andere Varianten möglich, die der Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung ohne weiteres in Betracht ziehen wird, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Des weiteren besteht die Möglichkeit, das erfindungsgemäße enzymatische System in chromatographischen Systemen, insbesondere in chromatographischen Säulen, einzusetzen. Dies kann zu synthetischen Zwecken geschehen (z. B. Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen auf einer chromatographischen Säule) oder aber auch zu analytischen Zwecken (z. B. bei der analytischen Säulenchromatographie). Hierbei können die immobilisierten Enzyme des enzymatischen Systems beispielsweise an das stationäre Trägermaterial oder Schüttgut, insbesondere das stationäre Säulenmaterial, des chromatographischen Systems gebunden sind. Für weitere Einzelheiten kann verwiesen werden auf die bereits zitierte deutsche Patentanmeldung DE 101 18 553.7, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems hat den Vorteil, daß sich mit dem erfindungsgemäßen System auch solche Prozesse enzymatisch katalysieren lassen, die mehrstufig enzymatisch ablaufen, d. h. bei denen die Moleküle, insbesondere Biomoleküle oder technische Moleküle, in mehreren Stufen und mit verschiedenen Enzymen enzymatisch katalysiert abgebaut oder zu Endprodukten umgesetzt werden.

Des weiteren ermöglicht der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch die parallele Umsetzung mehrerer Stoffe durch unterschiedliche Enzyme oder durch Enzym (abbau-) ketten und hierdurch beispielsweise die parallele analytische Bestimmung mehrerer Stoffe nebeneinander mit einer einzigen Meßzelle, welche eine Enzymabbaukette aus verschiedenen Enzymen enthält oder der sequentielle Abbau eines Ausgangsstoffes (Analyt) in mehreren hintereinander geschalteten Meßzellen bei gleichzeitiger Elektroanalyse in einer und/oder mehreren Meßzellen.

Schließlich hat der Einsatz des erfindungsgemäßen enzymatischen Systems auch den Vorteil, daß einerseits die Enzyme aufgrund der Immobilisierung wiederverwendet werden können und andererseits nach ihrer Verwendung eine leichte Abtrennung möglich ist (z. B. nach erfolgter Synthese im Bioreaktor, beispielsweise durch Ablassen der Reaktionsmischung). Auf diese Weise lassen sich die Enzyme effizient und kostengünstig in hoher lokaler Konzentration und in kontinuierlichem Durchfluß einsetzen. Die Substrat-Spezifität und die Spezifität der Reaktion sowie die Reaktivität der Enzyme gehen dabei jedoch nicht verloren.

Das Konzept der vorliegenden Erfindung besteht also darin, verschiedene Enzyme so miteinander zu kombinieren, daß auf diese Weise Moleküle (z. B. technische Moleküle oder Biomoleküle) abgebaut werden können. Dies kann beispielsweise zu analytischen Zwecken dazu genutzt werden, um die abgebauten Moleküle über bestimmte, wie zuvor beschriebene Parameter (z. B. pH-Wertveränderung, Sauerstoffzehrung/-erzeugung etc.) nachzuweisen. In bezug auf Bioreaktoren bedeutet dies, daß auch die Möglichkeit der gleichzeitigen oder sequentiellen Umsetzung eines oder mehrerer Stoffe besteht.

Nach dem erfindungsgemäßen Konzept sind die Herstellung eines Stoffes und die Reaktionsverfolgung mit Sensoren, die beispielsweise Sauerstoff oder H202 messen, identisch und ermöglichen somit auch eine effiziente Reaktionskontrolle.

Weitere Ausgestaltungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Patentschrift ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen.

Ausführungsbeispiele Enzymatische Abbauketten für Alkylpolyglucoside (APG) in erfindungsgemäßen Biosensoren Für APG (Alkylpolyglucoside, eine Gruppe von nichtionischen Tensiden, vertrieben von der Firma Henkel) wurde eine enzymatische Abbaukette entwickelt, bestehend aus Amyloglucosidase und Glucoseoxidase sowie gegebenenfalls auch Mutarotase und/oder a-Glucosidase (Maltase).

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Biosensors wurden die zuvor genannten Enzyme zunächst immobilisiert.

Die Immobilisierung erfolgte, indem die zuvor genannten Enzyme auf eine Celluloseacetat-Membran oder auf eine Teflon-Membran aufgebracht wurden, wie dies beschrieben ist in der deutschen Patentanmeldung DE 101 18 553.7.

Hierzu wurde die Membran nach an sich bekannten plasmachemischen Methoden modifiziert bzw. aktiviert, d. h. im reaktiven Hochfrequenzplasma unter an sich bekannten Bedingungen funktionalisiert, wobei hierdurch geeignete, enzymreaktive funktionelle Gruppen an die chemisch inerte Membranoberfläche gebunden werden, insbesondere Amino-und/oder Carboxylgruppen. Hieran wurden dann die Enzyme mit an sich bekannten Methoden gebunden.

Alternativ kann die Immobilisierung auch mit an sich aus dem Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt werden, z B. durch Einbringen zwischen Folien (z. B. aus Celluloseacetat) oder in polymere Matrizes (z. B. PVC, Gele, Graphite, Zeolithe etc.).

Mit dieser enzymatischen Abbaukette konnten dann APG# nachgewiesen oder elektroanalytisch bestimmt werden.

1. Alkylpolyglycoside Seit circa 10 Jahren konnte ein erheblicher Anstieg in der Produktion von Alkylpolyglycosiden beobachtet werden. Phosphatfrei werden sie als oberflächenaktive Neutraltenside Kosmetikpräparaten oder Waschmitteln zugesetzt. Ein bis sieben Glucoseeinheiten, in der Häufigkeit von Mono-zu Heptaglycosiden drastisch abnehmend, sind glycosidisch mit einem meist langkettigen Alkohol wie Dodecanol oder Tetradecanol verknüpft.

Da auf der Basis von Enzymen die gesamte biochemische Information zur Erkennung des Analyten in ein Membransystem inkorporiert werden kann, bieten sich bioelektrochemische Membranelektroden als ein besonders attraktives Me#prinzip für die Alkylpolyglycoside an.

Von den bisher konzipierten verschiedenen molekularselektiven APG#- Membranen mit immobilisierten Enzymen wird hier anhand von elf Membransystemen über die erfindungsgemäßen Prinzipien berichtet.

Zur Analytik stand das wasserlösliche Alkylpolyglycosid APG 220 (C8-1o- Alkylpolyglycosid) der Firma Henkel KGaA in Düsseldorf zur Verfügung. Alle Me#lösungen wurden phophatgepuffert auf einen pH-Wert von 5,0.

2. Konstruktion molekularselektiver APG#-Sensoren 2.1. APG#-Sensoren Die erfindungsgemä#en Sensoren sind in ein Durchflu#me#system integriert, wobei die Enzymmembranen für den APG#-Substratumsatz das Dach einer wannenförmig abgeflachten Durchflußkammer bilden, die über radiale Zu-und Abflußkanäle verfügt. Die tangentiale Anströmung der Enzymmembran erfolgt durch Ansaugung der APG-haltigen Lösungen mit einer der Meßzelle nachgeordneten Rollenpumpe, wobei Meß-und Kalibrierlösungen luftblasengetrennt eingespeist werden.

2. 1. 1. H202-sensitiv-enzymatische APG-Sensoren 2.1.1.1. Modular aufgebautes Meßsystem Es handelt sich um amperometrische APG-Biosensoren mit H202-Detektoren in Disk-Elektrodenbauweise ohne Innenelektrolyt aus Pt-Meßanode und Ag- Referenzkathode mit jeweils 2 mm Durchmesser in zwei getrennten, seriell angeordneten und über einen Schlauch verbundenen Durchflußkammern.

Meßanode und Referenzkathode sind in"zündkerzenförmiger"Bauweise ausgeführt und werden dichtend gegen die Berandung der Durchflußkammern geschraubt. Nur die Stirnflächen der Edelmetall-Elektroden liegen in frei zugänglicher Form vor und sind elektroanalytisch aktiv. Die Membransysteme mit einem Durchmesser von 5 mm stehen jeweils kavitätengeschützt in direktem Kontakt zur Pt-Meßanode.

Besondere Ausgestaltungsformen der Enzym-Membranen sehen zwecks Oberflächenvergrö#erung die zylidnrische Auskleidung der Kavität gegebenenfalls mit Überzug der Pt-Oberfläche vor (SBC-1412-APG#). Konvexe Elektrodenoberflächengestaltung in Verbindung mit dünnen Enzymmembranen fördert die Schnelligkeit des Einstellverhaltens.

Für eine spezielle Applikationsform erfolgte der Einbau der hier beschriebenen Meßanoden und Referenzkathoden in den Deckel und Boden von Kunststoffgefäßen (SBC-1420-APG) zur stationären Messung z. B. für einen Meßkoffer des Kundendienstes. In einer anderen Ausführungsform wurden diese Meßsystembauteile in die Seitenwände eines Acrylglasrohres integriert, das am oberen und unteren Ende mit Zu-und Abflußhähnen versehen war.

2.1.1.2. Meßsystem mit anodischem Fenster Die Pt-Meßanode mit ebenfalls kavitätengeschützter Enzymmembran von 5 mm verfügt durch ein anodisches Fenster über einen direkten Zugang zur Meßlösung, während sich die stabförmige Ag-Referenzkathode (Durchmesser 1 mm) in einem Seitenraum der Meßzelle befindet und über einen Innenelektrolyten mit der Pt-Meßanode in Verbindung steht.

0 2.1.2.02-sensitiv-enzymatische APG-Sensoren Diese APG#-Sensoren bestehen aus einer Pt-Kathode mit einem Membransystem (vgl. 2.1.2.1. und 2.1.2.2.) auf der Basis von PTFE und immobilisierten Enzymen. Die Ag/AgCI-Referenzanode befindet sich wiederum analog zu 2.1.1.2. in einem Seitenraum der Meßzelle und steht über einen gepufferten Innenelektrolyten mit der Pt-Meßelektrode im kathodischen Fenster in Verbindung, das durch die PTFE-Membran ionenundurchlässig, aber gaspermeabel verschlossen ist, so daß Os als Transducer zwischen den immobilisierten Enzymen und der Pt-Kathode fungieren kann.

2.1.2.1. Membransystem mit chemisch nicht modifizierter PTFE-Membran Elektrodenseitig verfügt das Membransystem über eine chemisch nicht modifizierte PTFE-Membran, der meßlösungswärts zwei Dialysemembranen aus Celluloseacetat aufliegen, zwischen denen-vor bakteriellem Abbau geschützt-die Enzyme an einem Streifen aus Cellulosefasern durch Adsorption und/oder ionischer Bindung immobilisiert und/oder kovalent vernetzt liegen.

2.1.2.2. Membransystem mit chemisch modifizierter PTFE-Membran An die im Hochfrequenzplasma aminisierten PTFE-Membranen koppelt kovalent das bifunktionelle Reagenz Glutardialdehyd unter gleichzeitiger Quervernetzung APG# umsetzende Enzyme.

3. APG#-selektive Enzymmembranen 3.1. Bienzym-Membranen Der enzymatische Angriff auf die a-1, 6-glucosidischen Bindungen von APG 220 durch die Amyloglucosidase liefert Glucose, Alkylpolyglycoside Amyloglucosidase n Glu deren ß-Form durch Glucoseoxidase (GOD) weiter umgesetzt wird : ß-D-Glucose + °2 + H20 GOD W H202 + Gluconsäure.

Reaktionsbedingt kann die amperometrische Messung am Ende der Enzymabbaukette über den Verbrauch von 02 durch Sauerstoff-Elektroden oder die Bildung von H202 mit Wasserperoxid-Detektoren erfolgen.

Abb. 1 zeigt ein U/I-Diagramm für Bienzym-Membranen für Alkylpolyglycosid- Biosensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren (t = 20,0 °C).

SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase 1417 6,7 U 6,7 U 1419 26,7 U 26,7 U 1408 40,0 U 40,0 U Für die APG#-Sensoren mit Wasserstoffperoxid-DEtektoren des Typs 2.1.1.1. mit den Membranen SBC-1408, SBC-1417 und SBC-1419 gibt Abb. 1 graphisch den Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentrationgesamt in U/Membran, der bei 7500 ppm APG 220 (Markierungspunkte) gemessenen Stromstärke und der Einstellzeit wieder.

Die Bienzym-Membranen enthalten die beiden Enzyme Amyloglucosidase und Glucoseoxidase in gleicher Konzentration bezogen auf Units, deren Gesamtkonzentration in der graphischen Darstellung in Abb. 1 angegeben ist.

Die Enzyme liegen in den Membransystemen durch Glutardialdehyd in vernetzter Form vor.

SBC-1419-APG verfügt unter den drei in Abb. 1 aufgeführten Meßsystemen mit Bienzym-Membranen über das höchste analytische Auflösungsvermögen.

Eine Erhöhung der Enzymkonzentration (SBC-1408-APG) verlängert die intramembranösen Diffusionswege. Durch die Membranverdickung kommt es zu einem Anstieg in der Einstellzeit. Parallel geht damit zugleich ein Absinken des Auflösungsvermögens einher. Es erscheint diskussionswürdig, daß hierfür ursächlich u. a. ein größerer Zerfall an H202 auf dem längeren Diffusionsweg zur Pt-Meßanode mit zusätzlichem Verlust durch Abdiffusion über die Membranoberfläche verantwortlich sein könnte.

Als Ausdruck niedrigerer Enzymkonzentration (SBC-1417-APG#) sinkt der Substratumsatz und entsprechend der Meßstrom. Die schnelleren Einstellzeiten sind eine Folge der kürzeren intramembranösen Diffusionswege (Membranverdünnung).

Die Bienzym-Membran SBC-1419-APG ist prinzipiell auch für einen Einsatz am H202-sensitiv-enzymatischen Meßsystem mit anodischem Fenster (2.1.1.2.) geeignet ebenso wie die im nachfolgenden beschriebene Trienzym- Membran.

3.2. Trienzym-Membranen Um die Empfindlichkeit des APG-Sensors nochmals zu steigern, wurde durch zusätzliche kovalente Bindung beziehungsweise Quervernetzung von Mutarotase mit Glutaraldehyd die Trienzym-Membran SBC-1425-APG konzipiert (Tab. 1).

Tab. 1 : Bi-und Trienzym-Membranen für Alkylpolyglycosid-Biosensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase Mutarotase 1419 26,7 U 26,7 U- 1425 22,9 U 22,9 U 142,9 U Bekanntlich reagiert GOD hochselektiv mit ß-D-Glucose, während die a-Form durch dieses Enzym nicht umgesetzt wird.

Von Rybinski, W. und Hill, K. beschreiben aber in ihrer Arbeit über "Alkylpolyglycoside-Eigenschaften und Anwendungen einer neuen Tensidklasse"in Angew. Chem. 110 (1998), Seiten 1395 bis 1412, daß im technischen Prozeß die a-Anomere und ß-Anomere in einem Verhältnis von ungefähr 2 : 1 stehen. Da aber nahezu umgekehrt nach Einstellung des Mutarotationsgleichgewichtes a-D-Glucose mit 36 % und ß-D-Glucose mit 64 % nach ca. 2 Stunden aus frisch angesetzter a-D-Glucose vorliegen, wurde erwartet, daß mit Hilfe der zusätzlich inkorporierten Mutarotase a-D-Glucose Mutarotase, ß-D-Glucose langsame spontane Reaktion in beschleunigter Reaktionsweise ein höheres intramembranöses Substratangebotfür die Glucoseoxidase erzwungen werden kann, wenn man davon ausgeht, da# im Produkt APG# 220 ein ähnliches Verhältnis der α- und ß-Anomere wie im technischen Prozeß gegeben ist.

Es konnte an modular aufgebauten Meßsystemen (vgl. 2.1.1.1.) mit H202- Detektoren der Nachweis erbracht werden, da# sich gegenüber der Bienzymmembran SBC-1419-APG# durch die zusätzliche Anwesenheit der Mutarotase inder Trienzym-Membran SBC-1425-APG# die Sensorempfindlichkeit um ca. 30 % steigern ließ, obwohl die beiden anderen Enzyme sogar in geringfügig niedrigeren enzymatischen Konzentrationen im Trienzym-Membransystem vorlagen (vgl. Tab. 1).

3.3. Tetraenzym-Membranen Die ersten molekularselektiven Membranelektroden zur Bestimmung von APG wurden auf der Basis von vier Enzymen realisiert und enthielten neben Amyloglucosidase, Glucoseoxidase, Mutarotase zusätzlich a-Glucosidase, letztere unter der Vorstellung, möglicherweise den Fettalkohol aus seiner glycosidischen Bindung freizusetzen (Tab. 2).

Tab. 2: Tetrenzym-Membranen für O2-sensitive APG#-Multienzymelektroden SBC-Nr. Amyloglucosidase Glucoseoxidase Mutarotase a-Glucosidase 1400 52,0 U 40,0 U 1056,0 U 20,8 U 1402 150,0 U 120,0 U 1000,0 U 20,8 U Ein Umsatz von a-1, 6-glucosidischen Bindungen durch das auch als Maltase bekannte Enzym erfolgt leider nur langsam. Kein Angriff findet auf ß- glucosidische Bindungen statt. Hingegen sind a-1, 4-glucosidische Bindungen der bevorzugte Angriffsort.

Die Immobilisierung der vier Enzyme erfolgte durch Adsorption und/oder ionischer Bindung an einem Streifen aus Cellulosefasern zwischen zwei Dialysemembranen aus Celluloseacetat. Die Enzymmembran wurde mit einer chemisch nicht modifizierten PTFE-Membran abgedeckt und auf einem Acrylglasring mittels eines O-Ringes gespannt und schließlich unter Vermittlung eines lnnenelektrolytfilmes vor der Pt-Kathode des 02-Sensors positioniert, die durch eine Ag/AgCl REferenzkathode mit dem gemeinsamen Innenelektrolyten zur Me#zelle komplettiert wurde: O2-sensitive APG#-Multienzym- Membranelektroden.

3.4. APG#-Biosensoren mit Enzymen an aminisierten PTFE- Membranen An chemisch modifizierte PTFE-Membranen in aminisierter Form (2.1.2.2.) für Sauerstoff-Elektroden (2.1.2.) wurden durch das bifunktionelle Reagenz Glutardialdehyd Amyloglucosidase und Glucoseoxidase kovalent gebunden. In weiteren Schichten wurden diese Enzyme quervernetzt und an die vorherige Schicht angekoppelt. Unter den in Tab. 3 aufgeführten Enzymmembranen zeichnet den APG-Sensor mit 10.) SBC-1322-APG-HDKS5-Nr. 1 neben einer hohen Meßwertstabilität Einstellzeiten von nur 3 bis 6 Minuten aus. Dies ist Folge einer besonders strömungsgünstigen Geometrie bei tangentialer Anströmung des gesamten Membransystems und dem Fehlen von Enzyme kapselnden Dialysemembranen.

Tab. 3 : Aminisierte PTFE-Membranen mit kovalent gebundenen Enzymen für @ 02-Detektoren molekularselektiverAPG-Sensoren Labor-Code Amyloglucosidase GOD 7.) SBC-1322-APG-HDKS3-Nr. 1 60,0 U 120,0 U 8.) SBC-1322-APG-HDKS4-Nr. 1 140,0 U 120,0 U 10.) SBC-1322-APG-HDKS5-Nr. 1 40,0 U 40,0 U 4. Ergebnisse 4.1. Einstellzeit Neben der Wechselzahl der einzelnen Enzyme und strömungsgünstigen Positionierung der Membransysteme üben die Konzentrationen immobilisierter Enzyme über die damit in Zusammenhang stehende Länge der Diffusionswege Einflu# auf die Einstellzeit der APG#-Sensor-Membranen aus. Das VErhältnis von Masse (mg) zum Substratumsatz (Unit) der in den APG#-Sensor- Membranen immobilisierten Enzyme läßt nach Abb. 2 erwarten, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im intramembranösen Diffusionsgeschehen von der Amyloglucosidase ausgeht. Ein Vergleich von Abb. 3 mit Abb. 4 bestätigt diesen Zusammenhang (vgl. hierzu auch Abb. 1).

Daraus erklärt sich aber auch das schleichende Einstellverhalten von SBC- 1402. Im Gegensatz hierzu zeigen andere APG#-selektive Membranelektroden mit 02-Detektoren und immobilisierten Enzymen an aminisierten PTFE- Membranen bei ebenfalls tangentialer Anströmung unter Verzicht auf Dialysemembranen kurze Einstellzeiten von wenigen Minuten : vgl. hierzu 10.) SBC-1322-APG-HDKS5-Nr. 1 unter 3.4 und Tab. 3, während APG-Sensoren mit Wasserstoffperoxid-Detektoren mit einer überlegenem Empfindlichkeit bzw. größerem Auflösungsvermögen aufwarten (vgl. hierzu Abb. 1).

Abb. 2 zeigt die Beziehung von Masse (mg) zum Substratumsatz (U) der in den APG-Sensor-Membranen eingesetzten Enzyme (1 Unit = 1 limol Substratumsatz/min) Abb. 3 zeigt die Enzymkonzentrationen in U/APG-selektiver Biosensor- Membran.

In den Abb. 3 und 4 sind die Säulen für Mutarotase und Maltase (a-Glucosidase) der mit"Bi." (Abkürzung für Bienzymmembran) gekennzeichneten Membranen auf Null gesetzt, für SBC-1425-Tri. (Tri. = Trienzymmembran) betrifft dies entsprechend nur die α-Glucosidase (Maltase).

Abb. 4 zeigt die Enzymkonzentrationen in mg/APG#-selektiver Biosensor- Membran.

Durch Anhebung der Temperatur des Me#mediums darf eine Verkürzung der Einstellzeiten von APG#-Sensoren erwartet werden. Um eine thermisch bedingte Denaturierung der Enzyme sicher auszuschließen, wurde ein Temperaturanstieg über 40 °C vermieden. Für die Trienzym-Membran SBC- 1425-APG wurde an H202-Detektoren des nach 2.1.1.1. aufgebauten modularen Durchflußmeßsystems bei einer Temperaturerhöhung um 10 °C der Faktor 1,3 bestimmt, der ebenfalls darauf hinweist, daß der physikalische Vorgang der Diffusion als geschwindigkeitsbestimmender Schritt für die Einstellzeiten dieses APG-Sensors maßgeblich ist ; denn bekanntlich steigt nach der RGT-Regel die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion um das Zwei-bis Vierfache an, wenn sich die Temperatur um 10 °C erhöht.

Offensichtlich wird also dieser chemische Vorgang durch die intramembranösen Diffusionsvorgänge überlagert, wobei dann ein Faktor von nur etwa 1,2 zu erwarten ist.

4.2. Funktionsdauer Da der bisherige Schwerpunkt in der Erarbeitung membranchemischer Prinzipien lag, wurden die kontinuierlichen Dauerperfusionen der APG- Sensoren mit Phosphatpuffer des pH-Wertes 5,0 bei zwischenzeitlichen Messungen in APG#HaltigenLösungennach einigen Wochen abgebrochen.

4.3. Molekularselektivität Neben der Substratselektivität der Enzyme sind prinzipiell detektorbezogene Querempfindlichkeiten bei APG#-Sensoren zu berücksichtigen. Diese verursachen bei 02-Detektoren grenzflächenaktive oder gasförmige, die PTFE- Membran permeierende und kathodisch umsetzbare Substanzen wie beispielsweise die Halogenkohlenwasserstoffe Chloroform (Trichlormethan) oder das Inhalationsnarkotikum Halothan (1,1,1-Trifluor-2-brom-2-chlorethan).

Wasserstoffperoxid-Detektoren setzen in ihrer Eigenschaft als Meßanoden auch andere anodisch oxidierbare Substanzen um. Der bei einer Polarisationsspannung von +950 mV Meß-gegen Referenzelektrode an frisch polierten Platin-Anoden zu beobachtende Glucose-lnterferenzstrom in 5,55 mol/1 glucosehaltigen Phosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 7,04 zeigte innerhalb von zwei Wochen einen e-funktionellen drastischen Abfall, der nach diesem Zeitraum nahezu vernachlässigbar klein wurde.

Bei einer Konzentration von7500 mg/l APG# 220 in auf einen pH-Wert von 5,0 phophatgepufferten Lösungen lieferten nicht frisch polierte Pt-Meßanoden in einem modular aufgebauten Meßsystem nach 2.1.1.1. lediglich 1,33 % des Me#stromes gegenüber einer mit der Bienzym-Membran SBC-1419 beschichteten. Diese geringfügige durch die APG#-Moleküle konzentrationsabhängig direkt am Detektor auslösbar zusätzliche Stromstärke kann nicht als Interferenzsignal gewertet werden, da sie synergistisch zu dem durch die Enzym-Membran ausgelösten Meßstrom wirkt und einkalibrierbar ist.

5. Elektronische Komponenten und rechnergestützte Meßdatenauswertung Der Nanoamperemeßwandler liefert dem amperometrischen Sensor plateauanpaßt eine Polarisationsspannung und verfügt über eine Wandler- konstante von 1mV/nA. Die Polarisationsspannung beträgt für Oz-sensitiv- enzymatische Meßsysteme-750 mV Meß-gegen Referenzelektrode und für H202-sensitiv-enzymatische Meßsysteme mit anodischer Oxidation +950 mV Meß-gegen Referenzelektrode.

Der 21-Bit-AD-Wandler setzt die von dem Nanoamperemeßwandler nach Stromstärke/Spannungswandlung gelieferten elektrischen Gleichspannungen in entsprechende digitale Signale um, die über eine serielle Schnittstelle (RS 232) an einen IBM-kompatiblen Rechner übermittelt werden, um rechnergestützt aus den gemessenen Stromstärken eine Meßdatenauswertung vorzunehmen. Der Meßkurvenverlauf mit einem Meßwert innerhalb von ca.

2 Sekunden läßt sich dadurch am Bildschirm in fortlaufender Darstellung verfolgen.

Weitere Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der Biosensoren sind neben Alkylpolyglucosiden und anderen Tensiden beispielsweise auch die Bestimmung von Polyasparaginsäure und Fettalkoholderivaten.

Stoffe im Bereich der Reaktoren können z. B. Stoffe sein, die vor Ort beim Kunden gebraucht werden, so z. B. Peroxide oder Tenside, Schmiermittel oder hochwertige Spezialchemikalien.