Procedimiento enzimático para la disociación de células de tejidos animales y su aplicación.

OBJETO DE 1--A INVENCIÓN:

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la Biotecnología. De forma más concreta, la invención consiste en un nuevo método para la disociación de las células de los tejidos del sistema nervioso central de los vertebrados usando proteasas de Streptomyces fradiae. La ventaja principal de este método respecto a los actualmente usados para la misma finalidad, consiste en que disocia las células preservando su forma y estructura nativas. Por su estado superior de conservación, las células así disociadas son más adecuadas que las obtenidas por otros métodos conocidos, para importantes aplicaciones en biomedicina, tales como el cultivo de células, transplante de células, nuevas técnicas de biología celular y molecular, y otras.

ANTECEDENTES

La disociación de los tejidos es el primer paso en la realización de cultivos de células. Las células se pueden disociar por métodos estrictamente mecánicos, químicos o enzimáticos. En los procedimientos enzimaticos se suele combinar la utilización de enzimas proteolíticas con procedimientos mecánicos

Prácticamente todas las proteasas usadas en la disgregación de los tejidos animales son productos comerciales crudos que contienen mezclas de proteasas con diferentes actividades, y pueden contener también lipasas, glicosidasas y nucleasas (Waymouth, C. To disaggregate or not to disaggregate. Injury and cell disaggregation, transient or permanent?. In vitro,1974, 10 97- 111), (Waymouth, C Methods for obtaining cells in suspensions from animal tissues, In. Pretlow, Th. G. and Pretlow, Th. P. (Eds.), Cell separation methods and selected applications. 1982,Vol 1 , Academic Press, Inc. New York, pp. 1-29) Por ello, las enzimas utilizadas hasta ahora no son específicas para la matriz extracelular, sino que también actúan sobre proteínas, lípidos e hidratos de carbono de la membrana plasmática, causando siempre daño a las células, en mayor o menor grado

(Waymouth, O In vitro, 1974,10 97- 111) A pesar de esta falta de especificidad sobre la matnz extracelular, algunas proteasas son mas apropiadas que otras para disociar ciertos tejidos, y se han desarrollado aplicaciones especiales para algunas de ellas. Así, determinadas colagenasas se usan selectivamente para disgregar el hígado (Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells Methods Cell Biol , 1976, 13. 29-83) o los islotes pancreáticos (Lacy, P E. and Kostianovsky, M Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat páncreas Diabetes, 1967, 16 35-39), la dispasa es la enzima de elección en la preparación "in vitro" de laminas de epidermis humanas, utilizadas para transplantes (Green, M., Kehmde, O and Thomas, J Growth of cultured human epidemial cells mto múltiple epithelia suitable for grafting Proc Nat l Acad Sci. USA, 1979, 76 5665- 5668) y la elastasa es la enzima apropiada para disociar las células del pulmón o para digeπr las fibras de elastina de las arterias (Waymouth, C 1982, obra cit ) La tripsina es, sin duda, la enzima que más se usa para la disgregación del sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados (Freshney, R I Culture of animal cells A Manual of Basic Technique, Alan R Liss, Inc, New York 1987), (Banker, G and Goslm, K Pπmary dissoαated cell cultures of neural tissue In Banker, G and Goslm, K (Eds ), Cultuπng nerve cells, MIT Press, Cambπdge, Mass, 1991 , pp 41-73), aunque también la papaína, la colagenasa, la pronasa, o la dispasa han sido usadas para disgregar hipocampo o retina, bien solas o mezcladas con otras enzimas La tπpsma cruda es la enzima de uso generalizado para la disociación del SNC embπonano. Esta proteasa es un complejo multienzimatico que, ademas de tripsina, puede contener quimotπpsina, colagenasa, elastasa πbonucleasa, fosfatasa, lipasa y amilasa (Waymouth, C 1982, obra cit) La misma tripsina rompe enlaces peptídicos de los que forman parte la lisina o arginma, aminoácidos presentes en cualquier proteína (Waymouth, C. 1982, obra cit.). Por esta razón, las células son dañadas siempre (Waymouth, O 1974, obra cit ), y el resultado de la disociación son células redondeadas, desprovistas de sus prolongaciones y morfológicamente no identificares, aunque muchas de ellas retienen la capacidad de dividirse, crecer y diferenciarse, al menos en cierto grado, en un medio de cultivo (Freshney, R I 1987, obra αt ) y (Banker G and Goslm, K. 1991, obra αt). Dado que las células del SNC embrionario y adulto de los vertebrados, tanto neuronas como células de glía, son complejas morfológica y estructuralmente, y poseen dominios subcelulares en los que se llevan a cabo funciones específicas, algunas ya bien caracteπzadas, el aislamiento de las células sin alteración de su morfología y preservando

su integridad funcional ha sido un reto permanente para los neurocientíficos. Algunas neuronas del SNC adulto han sido aisladas con cierto grado de integridad, suficiente para estudiar la electrofisiología de sus membranas, introduciendo variaciones menores en los métodos usados para disgregación del SNC embrionario (Bader, C. R., MacLeish, P. R. and Schwartz, E. A. J.Physiol. (Lond.),1979, 296 1-26), ( Sarthy, P. V. and Lam, D. M. K. Brain Res., 1979, 176: 208-212), (Tachibana, M , J Physιol.,1981 , 321: 141-161), (Newman, E. A , J. Neurosa., 1985, 5 2225-2239), (Kay, A. R. and Wong, R K. S, J. Neurosci. Methods,1986, 16: 227-238), (Kaneda, M., Nakamura, H. and Akaike, N. Neurosa. Res., 1988, 5: 299-315), (Reichenbach, A., Wolburg, H., Ríchter, W. and Eberhardt, W., J. Neurosci. Methods,1990, 32 227-233), ( Chad, J. E., Stanford, I., Wheal, H. V., Williamson, R and Woodhall, G , In Chad, J and Wheal, H (Eds.), Cellular Neurobiology A Practical Approach, IRL Press Oxford,1991, pp. 19-37), (Sayer, R. J., Brown, A. M., Schwmdt, P C and Cπll W E , J Neuroρhysιol.,1993, 69: 1596-1606), (Tumer, R. W., Borg, L. L. and Syed, N I , CNS J Neurosci. Methods, 1995, 56: 57-70) entre otros. Sin embargo, las células del SNC embnonaπo obtenidas por disociación con cualquier proteasa, usando los métodos corrientes, son siempre redondeadas (Banker, G. and Goslin, K. 1991, obra αt ), (Adler, R Nature and nurture in the differentíatjon of retinal photoreceptors and neurons. Cell Dιffer,1987 , 20 183-188), debido a que sólo sus somas se libran del daño causado por estas enzimas

No hay un método enzimatico estándar para la disociación de tejidos, aunque cualquiera de los métodos publicados incluye un numero de etapas comunes, tales como troceamiento y/o trituración del tejido, incubación con proteasas disueltas en tampón fosfato salino isotónico simple o en soluciones de sales equilibradas carentes de Ca ⁺² y Mg ⁺² , e inhibición de la acción enzimática Son muchas las vaπables descritas que pueden modificar el resultado de una disociación tisular, entre las que están el grado de troceamiento del tejido, la osmolalidad y pH de las soluciones empleadas, el tiempo y temperatura de incubación del tejido con la solución de proteasa(s), la presencia de nutrientes, tales como glucosa, en las soluciones, el modo en que se realiza la trituración de los fragmentos de tejido durante o después de la incubación (Waymouth, O 1974, obra cit.), (Bashor, M. M. .Dispersión and disruption of tissues. In ^* Jakoby, W. B. and Pastan, I. H. (Eds.), Methods in enzymology, Vol LVIII, Academic Press, Inc., New York, 1979, pp. 119-131), (Waymouth, 1982, obra cit), (Kay A R and Wong, R K.S , 1986, obra cit.),

(Kaneda, M., Nakamura, H. and Akaike, N , 1988, obra cit), (Banker, G and Goslin, K.

1991, obra cit.)

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de disociación celular, por el que se obtienen células vivas del SNC embrionario y adulto de los vertebrados con sus formas y estructuras nativas preservadas

El procedimiento se caracteriza principalmente por la utilización de un complejo de proteasas alcalinas producidas por Streptomyces fradiae, al que nos referiremos de aquí en adelante como "proteasa-SF", nunca antes usado para disociar células de tejidos animales, y de un medio de disociación de composición diferente a los utilizados en los métodos conocidos.

El procedimiento sirve para la disgregación de tejidos animales, tales como los tejidos del SNC del pollo, la rata y el conejo, y otros tejidos de éstas y otras especies. La proteasa-SF se diferencia de las proteasas hasta ahora utilizadas para la disgregación del SNC en que está libre de lipasas, nucleasas, amílasas y glicosidasas, lo cual la hace menos dañina para las células que las proteasas comerciales.

La proteasa-SF se obtiene por fermentación con una cepa de Streptomyces fradiae, preferentemente Streptomyces fradiae ATCC 10745 o Streptomyces fradiae ATCC 14544, en un medio acuoso que contiene, en g/l, 30,0 de almidón, 10,0 de harina de soja, 5,0 de "corn steep solids", 1.0 de fosfato dipotasico, 0,25 de sulfato magnésico, 0.01 de sulfato ferroso y 10,0 de carbonato calcico La fermentación es aerobia, en cultivo sumergido, a 28-35°C y con una duración de 24-72 h A continuación, las proteasas presentes en la fase líquida del caldo fermentado se concentran y purifican por filtración o centrifugación del mismo, precipitación con sulfato amónico, cromatografía y precipitación en soluciones acuosas de acetona, hasta llegar a un preparado sólido de proteasa-SF con las siguientes características: a) Una actividad proteolítica específica de 20.000-25,000 UAP/mg, definiéndose la unidad de actividad proteolítica (UAP) como la cantidad de proteasa-SF que, actuando sobre hemoglobina desnaturalizada, libera, en diez minutos, a pH 7,5, 25°C, productos de hidrólisis con una absorbancia total, a 280 μm, igual a la de 1 μg de tirosina. b) Actividad hidrolítica sobre proteínas animales y vegetales (hemoglobina, caseína, colágeno, gelatina, elastina, queratina, gluten, gliadma, etc.).

c) Actividad proteolítica a pH 5-12 d) Actividad proteolítica no activada por compuestos con grupos sulfidnlo ni inhibida por compuestos que bloquean dichos grupos, pero ligeramente inhibida por los inhibidores de la tnpsma procedentes de la soja y del páncreas, y fuertemente inhibida por muy bajas concentraαones de isopropilfluorofosfato, comportamiento típico de las proteasas serínicas e) Ausencia de contaminación por glicosidasas amilasas, lipasas y nucleasas f) Gran estabilidad en estado solido a temperatura ambiente La estabilidad en solución es mucho menor que en estado solido pero aumenta considerablemente en presencia de iones de calcio y, en estas condiciones, es máxima a pH 8,2 Durante el desarrollo de la invención se utilizaron diferentes muestras de proteasa-SF con actividades de 1 700-35000 UAP/mg Sin embargo, como distintas muestras de proteasa- SF pueden dar resultados diferentes el procedimiento objeto de esta invención ha sido establecido utilizando muestras de proteasa-SF de 20 000-25 000 UAP/mg

A diferencia de todas las proteasas comerαalmente disponibles para la disgregación de los tejidos, que se usan a concentraciones en tomo a 1 mg/ml, la concentración óptima de proteasa-SF para disgregar los tejidos del sistema nervioso central varía entre 4 y 156 μg/ml, dependiendo de la especie animal, tipo de tejido y estadio de desarrollo o edad del animal La concentración óptima se define aquí como aquella que permite obtener el mayor número de células viables y con sus formas nativas, de un tipo o de todos los tipos que componen el tejido objeto de disgregación, utilizando el procedimiento que descnbimos mas adelante

Para los procesos de disección y troceamiento del tejido, y para la preparación del medio de incubación se emplea un medio de disociación de osmolalidad vaπable entre 175 y 300 mOsm/kg, en funαon del tipo de tejido a diferencia de los medios de disociación empleados en los protocolos publicados que son todos isoosmoticos con el plasma, teniendo una osmolahdad en torno a los 300 mOsm/kg La osmolalidad adecuada para cada tipo de tejido se indica en la tabla 1 que se incluye mas adelante La composición de este medio es sacarosa 175-300 mM en tampon fosfato sódico 1mM o en tampon HEPES 5 mM, a pH 6,2-7,4, o simplemente en agua destilada, pH 6,4-6,5 Por lo tanto, este medio se diferencia, también, de los medios empleados en los procedimientos de disgregación publicados por tener baja fuerza iónica lo cual es condición necesana para el buen funcionamiento de la proteasa-SF En cuanto al pH del medio de dtso aαón, los resultados no varían apreαablemente en el intervalo 6,2-7,4

El medio de incubación consiste en una solución de proteasa en el medio de disociación definido en el párrafo anterior, a la concentración de proteasa adecuada para cada tipo de tejido, especie animal y estadio del desarrollo según se indica también en ia tabla 1 Dado que la actividad de la proteasa en la solución de disociación decae progresivamente con el tiempo en el intervalo de temperatura de 4 a 25°C, y se pierde al congelar la solución, es necesaπo preparar la solución de incubación inmediatamente antes de comenzar la disección del tejido

Tabla 1. Concentraciones óptimas de la proteasa-SF para disociar células viables y bien preservadas morfológica y estructuralmente de diferentes tejidos del SNC de pollo y rata.

Tejido Estadio N" dc Osmolalulad Rango Tipos de células experimentos medio IIK IIII.HKHI do concentración

Retina E8-E18 142 | 7^- ^* !ι ιu ^* t-l-76 Neuroblastos y neuronas de todos los tipos, células de Müller (glía) en diferenciación

E1 -adulto 92 76- 152 Todos los tipos de neuronas, con excepción de células gang onares, células de Müller

Cerebelo E12-E19 55 17S-1I K I 46-156 Células de Purkinje en diferentes estadios de diferenciación y morfológicamente diferenciadas, otros tipos celulares

RATA

Retina PO-aduJto 56 15-26 Neuronas en diferentes estadios de diferenciación y diferenciadas de todos los tipos, células de Müllcr en diferenciación v adultas

Cerebelo PO-Pl l 29 4-73 Células de Pur inje en diferentes estadios de diferenciación y morfológicamente diferenciadas, otros tipos celulares

Hipocampo PO-Pl l 91 4- 17 Células piramidales en diferentes estadios de diferenciación y morfológicamente diferenciadas, otros tipos de neuronas, células de gha

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Descripción del procedimiento objeto de la patente.

El procedimiento se concreta en cuatro etapas esenciales comunes a las múltiples variantes del mismo, que se han de emplear para disgregar los distintos tejidos del sistema nervioso central de las diferentes especies animales. 1": Troceamiento del tejido.

Se realiza en un volumen de medio de disociación aproximadamente el doble del volumen del tejido, suficiente para realizar un troceamiento manual lo más fino posible, a temperatura de 20-23°C. La osmolalidad de la solución de disociación, de 175 a 300 mOsm/kg, depende del tipo de tejido como se Indicó anteriormente (tabla 1) 2 ^a : Colocación del tejido en el medio de incubación

El tejido se pasa con el medio de disociación en el que se ha troceado a un tubo que contiene la solución de incubación a temperatura de 28-36°C, comenzando en este momento la digestión enzimática. La concentración de la proteasa-SF en el medio de incubación, de 4 a 156 μg/ml, depende de la especie animal, el tipo de tejido y estadio de desarrollo embrionario o edad del animal, como ya se indicó anteriormente en la tabla 1.

El volumen de medio de incubación está en relación a la masa de tejido a disociar. La relación masa de tejido/volumen del medio de incubación es una variable que influye claramente en el resultado de la disociación Las magnitudes de los dos términos de la relación se determinan experimentalmente en función de la cosecha de células a obtener, el tipo de tejido y el estadio de desarrollo o edad del animal. A título orientativo, las relaciones masa/volumen que proporcionan el máximo número de células morfológicamente bien preservadas son una retina de pollo de 3 días posteclosión (P3) en 600 μl de solución de incubación, una circunvolución de cerebelo de rata de 3 días postnatal (P3) en 800μl, o cuatro hipocampos de rata P3 en 800μl. Dado que la cosecha de células (número de células por porción de tejido, o por volumen del medio que contiene la suspensión celular al final de la disociación) no sólo depende de la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación, sino también del grado de troceamiento del tejido y de la ayuda mecánica durante el proceso de digestión enzimática, se ajusta la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación en función de estas dos variables, que a su vez se fijan y controlan para obtener resultados reproducibles. A modo de ejemplo, la relación una retina de pollo P3 en 600 μl, es adecuada para obtener 6,6-8,3 x 10 ⁵ células/ml (40-50 x 10 ⁶ células/retina), si se hace un troceamiento muy fino del tejido y se ayuda mecánicamente pasando cuidadosamente la

suspensión celular diez veces a través de una punta de micropipeta de 1 mi, al inicio de la incubación y cada 10 minutos en una incubación de 45 minutos a 35°C. 3 ^a : Incubación del tejido.

Se coloca el tubo que contiene el tejido troceado en el volumen de medio de incubación, a la relación adecuada, en un soporte para tubos que se coloca en un baño de agua a temperatura constante.

La temperatura de incubación puede variar entre 32 y 36°C, dependiendo del tipo de tejido, estadio del desarrollo embrionario o edad del animal. Los tejidos de estadios embrionarios jóvenes se disgregan a temperatura menor que los de estadios avanzados, y a menor temperatura es menor el daño celular y, por lo tanto, mayor la cosecha de células. El rango de temperatura indicado sirve para disociar completamente los tejidos de la tabla 1, utilizando la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación adecuada y las concentraciones de proteasa indicadas en la misma tabla para cada tejido. La temperatura no puede superar en ningún caso los 36°C, puesto que a 37°C la proteasa-SF hace una digestión fulminante del tejido. Por debajo de 32°C la disociación es más lenta siendo necesario alargar el tiempo de incubación por encima de 75 minutos, con lo cual es mayor el daño celular y se obtiene menor densidad de células viables.

El tiempo de incubación del tejido en la solución de proteasa varía entre 30 y 75 minutos, en relación inversa a la temperatura de incubación y a la intensidad de la ayuda mecánica, y en relación directa a la densidad de células deseada. 4 ^a : Inhibición de la digestión enzimática

La proteasa-SF se puede inhibir de dos formas, dependiendo del uso posteπor de las células; o bien bajando la temperatura de la suspensión celular por debajo de 28°C, o bien añadiendo a la suspensión celular inhibidores de proteasas. El inhibidor de la tripsina obtenido de la soja, a 7μg/ml, o bien el suero fetal, al 10%, son inhibidores adecuados. La primera forma de inhibición es útil y barata, cuando las células van a ser extendidas en portaobjetos y fijadas para ser sometidas a técnicas diversas de biología celular y molecular, como por ejemplo autorradiografía, tnmunocitoquímica, o hibridación in situ. La segunda forma es la indicada si las células se pretenden cultivar, o utilizar para transplantes.

Análisis de resultados

La suspensión celular resultante de la disociación de los tejidos del SNC con la proteasa-SF, por el procedimiento descrito anteriormente, contiene una mayoría de células vivas de diferentes formas y una minoría de células muertas, siendo éstas el resultado inevitable de los procesos de troceamiento del tejido y de la ayuda mecánica. El análisis de los resultados comprende una evaluación cualitativa y cuantitativa de las células obtenidas, y se realiza por observación ai microscopio óptico utilizando contraste de fases

El análisis cualitativo, consistente en la identificación de los tipos de células por sus formas, revela una gran vaπedad de tipos celulares tanto de células de glía como de neuronas En la tabla 1 se da el análisis cualitativo de la suspensión celular resultante de la disgregación de los tejidos indicados en la misma

El análisis del numero de células viables de diferentes formas, por el método clasico de exclusión del azul de tπpano indica un 85-96% de células de la suspensión celular que excluyen el colorante, es decir, vivas Este análisis se realiza durante la pπmera hora después de la inhibición de la digestión enzimatica y sin cambiar las células de medio, es decir, en el mismo medio en el que ha ocurrido la disociación Este rango de viabilidad corresponde a los mejores resultados obtenidos en la disociación de cualquiera de los tipos de tejido indicados en la tabla 1 El porcentaje de células vivas y morfológicamente identificables varía dependiendo del tipo de tejido y especie animal Por ejemplo, en los disgregados de retinas embnonaπas de pollo de 14-18 días de incubación se obtiene un 45-60%, mientras que en los disgregados de retinas de la rata de P5-P12 (estadios de diferenciación de la retina de la rata aproximadamente equivalentes a los indicados de la retina del pollo), se obtiene un porcentaje mucho menor, del 15-30%

Una sene de expeπmentos realizados con células disociadas de distintos tejidos con sus formas morfológicamente preservadas, tanto embπonaπas como adultas, demuestran que su citoesqueleto permanece organizado tras la disgregaαón, lo que explica la preservación de sus formas nativas Los expeπmentos que demuestran la preservación del citoesqueleto consisten en centπfugar las células sobre cubreobjetos a 3000 rpm y fijarlas con 4% de paraformaldehido (PFA) en tampón fosfato sódico 0.1M, pH 7,2, para inmunoreacαonarlas con el anticuerpo monoclonal 3CB2, marcador de una proteína asociada a filamentos intermedios del αtoesqueleto, o bien fijarlas con PFA al 3% más glutaraldehido al 0,2%, EGTA 20 M y 0 065% de Tritón X-100 en tampon fosfato sódico salino, para inmonurreaccionarlas con anti-α-tubulina, o anti-β-actma Por

¡nmunorreacción subsiguiente de las células con anticuerpos secundarios unidos a moléculas fluorescentes y observación en un microscopio óptico de fluorescencencia, se visualizan los tres tipos de moléculas principales (actma, tubuiina y filamentos intermedios) constituyendo organizadamente el αtoesqueleto celular. Puesto que las células que se disocian con sus formas nativas y excluyen el azul de tripano, tienen la membrana plasmática preservada y el citoesqueleto organizado, la disociación de las células con tal grado de mtegπdad sólo se explica si la proteasa-SF rompe selectivamente proteínas especificas de la matriz extracelular. Este mecanismo de acción de la proteasa sólo tiene lugar en un medio con muy baja fuerza iónica y a una temperatura inferior a 37°C como demuestran los experimentos en los que o bien se modificó la temperatura, o la fuerza iónica

Ventajas del procedimiento objeto de esta patente respecto a ios otros procedimientos utilizados para disociar tejidos del SNC.

La disociación de cualquiera de los tejidos del SNC embrionario del pollo o de la rata, con el procedimiento objeto de la patente, proporciona células vivas con el citoesqueleto preservado y la variedad de formas que las caracterizan, mientras que con cualquiera de ios procedimientos conocidos se obtienen células vivas todas ellas redondas y no ¡dentificables morfológicamente.

Con el procedimiento objeto de esta patente se obtienen células de glía íntegras y neuronas con sus dendritas y largos trayectos de sus axones, los cuales son cortados inevitablemente durante el troceado del tejido, las células en proceso de diferenciación presentan incluso sus prolongaciones transitorias y conos de crecimiento. Con los otros procedimientos conocidos las células de los tejidos embrionarios son dañadas de forma tal que sólo conservan sus somas, lo cual explica que todas ellas sean redondas. La variedad de tipos celulares y el elevado número de células íntegras que se obtienen de la retina adulta del pollo y la rata, por disociación con el procedimiento objeto de la patente, no se pueden obtener por ninguno de los otros procedimientos conocidos, estando fuera de discusión que la proteasa-SF disocia mejor que ninguna otra proteasa esa parte del SNC adulto. Es muy probable que realizando modificaciones en el procedimiento objeto de esta patente se puedan disociar con la proteasa-SF otros tejidos del SNC adulto de igual manera que la retina

El grado de integridad con el que se disocian las células embrionarias por el procedimiento objeto de esta patente abre múltiples vías de utilización de éstas. La

aplicación de técnicas de electrofisiologia, autorradiografía e inmunocitoquímica, entre otras, a células disociadas morfológicamente preservadas es de una utilidad inmediata que añade precisión al análisis de los resultados, y abre un abanico de posibilidades en el diseño de experimentación encaminada a obtener conocimientos básicos en neurobiología del desarrollo.

El elevado número de células íntegras de diferentes tipos, tanto embrionarias como adultas, que se obtienen por el procedimiento objeto de esta patente, abre la posibilidad de purificar cualquiera de los tipos celulares disociados para estudios bioquímicos, lo cual ha sido un desafío permanente en Neurobiología El uso de células embrionarias con semejante grado de integridad para transplantes de células del sistema nervioso central, es ventajoso respecto al uso actual de las células mutiladas que se obtienen por disgregación con las otras proteasas y procedimientos. Resulta evidente que células embrionarias morfológicamente preservadas son más adecuadas para su integración y desarrollo en un tejido receptor que células dañadas.

La utilización de células embrionarias íntegras para establecer cultivos de células que puedan simular con más precisión el funcionamiento de las mismas in situ, es obviamente más ventajoso, y abre nuevas posibilidades en el campo de la Biotecnología.

DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DE LOS DIBUJOS

Para facilitar la comprensión de la invención y formando parte integrante de esta memoπa descriptiva, se acompañan las siguientes figuras que con carácter ilustrativo representan lo siguiente:

Todos los dibujos de las figuras 1-4 han sido realizados mediante cámara lúcida acoplada a un microscopio óptico Zeiss (modelo "Universal").

Figura 1. Dibujos de células de la retina del embrión de pollo de los estadios E17-

E18, disociadas por el protocolo que se descnbe en el ejemplo 1. Las células fueron extendidas sobre portaobjetos gelatinados, fijadas con una mezcla de etanol, formol y ácido acético (18:1:1), observadas por contraste de fases y dibujadas, f, fotorreceptores en fases diferentes de diferenciación; h, células horizontales; bi, células bipolares; a, células

amacrinas de diferentes tipos; g, células ganglionares; M, células de Müller (glía) en proceso de diferenciación. Aumentos: 800x.

Figura. 2. Dibujos de células de la retina adulta de rata de 1,5 a 18 meses disociadas por el protocolo que se describe en el ejemplo 2. Los dibujos se tomaron de preparaciones en fresco, observadas por contraste de fases en las dos horas siguientes después de finalizar la digestión enzimática. c, conos (fotorreceptores); b, bastones (fotoireceptores); bi, células bipolares; a, células amacrinas; M, células de Müller (glía). Aumentos: 800x.

Figura. 3. Dibujos de células del hipocampo de rata del día postnatal 5 disociadas por el protocolo que se describe en el ejemplo 3. Los dibujos se tomaron de preparaciones en fresco, observadas por contraste de fases en las dos horas siguientes después de finalizar la digestión enzimática. p, células claramente identificadas como piramidales. El resto de células, no marcadas, pueden pertenecer a la capa de células piramidales o a otras capas del hipocampo. Aumentos: 500x Fig. 4. Dibujos de células del cerebelo de embrión de pollo del estadio E14, disociadas por el protocolo que se describe en el ejemplo 4. Los dibujos se tomaron de preparaciones en fresco, observadas por contraste de fases en las dos horas siguientes después de finalizar la digestión enzimática. P, células de Purkinje en diferenciación, en la fase en la que la célula posee prolongaciones peπsomáticas cortas. El resto de células, no marcadas, pueden pertenecer a la capa de células de Purkinje o a otras capas del cerebelo. Aumentos: 500x.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Con carácter aclaratorio se dan los siguientes ejemplos prácticos de realización del procedimiento objeto de la invención:

EJEMPLO 1

DISOCIACIÓN DE LAS CÉLULAS DE LA RETINA DE EMBRIÓN DE POLLO DE LOS ESTADIOS E17-E18

Medio de disociación:

Sacarosa 175mM en tampón fosfato sódico 1mM a pH 6-6,2.

Esta solución se puede mantener vanos días en frigorífico, a 4 ⁰ C.

Solución de proteasa-SF:

1 mg de proteasa-SF de 24.000 UAP/mg disuelta en 2,4 mi del medio de disociación. Esta solución se prepara diariamente y se pude mantener a temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizada, pero no más de 3-4 horas.

Procedimiento:

Se extrae una retina (sólo la retina visual) de embrión de pollo de 17 o 18 días de incubación y se coloca en un pocilio de vidrio, con capacidad para 1 mi, que contiene 200 μl de medio de disociación.

Con unas tijeras de pequeño tamaño, de punta fina y curva, se trocea la retina lo más finamente posible en el mismo pocilio Con una micropipeta de 1 mi se pasa el contenido del pocilio a un tubo de vidπo que contiene. 100μ I de la solución de proteasa y 300 μl del medio de disociación, a temperatura de 34-35°C. Por lo tanto, la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación es de una retina en 600 μl. La concentración de proteasa es de 68 μg/ml.

Por la punta de una micropipeta de 1 mi se pasa cuidadosamente el contenido del tubo 10 veces con objeto de facilitar mecánicamente la disociación enzimática. A continuación se coloca el tubo en un baño de agua a 35°C durante 45 minutos, ayudando mecánicamente cada 10 minutos

Pasado el tiempo de digestión enzimatica, se saca el tubo del baño y se deja a temperatura ambiente (20-22°C), con lo cual se inhibe la acción de la proteasa-SF y las células permanecen vivas en el mismo medio en el que se ha realizado la incubación por espacio de varias horas (hasta 4 horas).

Resultados:

El análisis cualitativo de los resultados se realiza por observación en contraste de fases en un microscopio óptico de iluminación por luz transmitida. Para ello se toman 20 μl de la suspensión celular, se colocan sobre un portaobjetos y se dispone encima un cubreobjetos de 24mm x 24mm. Se sellan los bordes del cubreobjetos con laca de uñas, o cera líquida, para evitar la pérdida de liquido por evaporación e impedir que las células salgan fuera del mismo.

La suspensión celular obtenida por el protocolo descrito contiene una mezcla de células de todos los tipos en grado variable de diferenciación, con sus formas nativas preservadas, es decir, fotorreceptores, horizontales, bipolares, amacrinas y ganglionares. Las células que aparecen intactas, brillantes y con un halo refringente alrededor de sus somas (45-60% de las disociadas) excluyen el azul de tripaπo, lo cual indica que están vivas. En la suspensión celular también hay, inevitablemente, células redondas y células que siendo reconocibles por sus formas han perdido alguna de sus prolongaciones, producto del troceamiento inicial del tejido y de la ayuda mecánica. El 85-96% de estas células también excluyen el azul de tπpano durante la primera hora después de finalizada la digestión enzimática. A modo de ilustración se acompañan dibujos (Fig. 1) de una muestra de células intactas, representativa de la multitud observada en las suspensiones celulares obtenidas por este protocolo

EJEMPLO 2

DISOCIACIÓN DE LAS CÉLULAS DE LA RETINA ADULTA DE RATA DE 1,5 A 18 MESES

Medio de disociación: Sacarosa 175 mM en agua bidestilada

Esta solución se puede mantener vanos días en frigorífico, a 4°C

Solución de proteasa-SF:

1 mg de proteasa-SF de 24 000 UAP/mg disuelta en 2,4 mi del medio de disociación. Esta solución se prepara diariamente y se pude mantener a temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizada pero no más de 3-4 horas.

Procedimiento:

Se extrae una retina (sólo la retina visual) de rata de 1,5 a 18 meses de vida y se coloca en un pocilio de vidrio, con capacidad para 1 mi, que contiene 200 μl de medio de disociación.

Con unas tijeras de pequeño tamaño, de punta fina y curva, se trocea la retina lo mas finamente posible en el mismo pocilio Con una micropipeta de 1 mi se pasa el

contenido del pocilio a un tubo de vidrio que contiene: 20 μl de la solución de proteasa y 180 μl del medio de disociación, a temperatura de 33°C. Por lo tanto, la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación es de una retina en 400 μl. La concentración de proteasa es de 21μg/ml. Por la punta de una micropipeta de 1 mi se pasa cuidadosamente el contenido del tubo 10 veces con objeto de facilitar mecánicamente la disociación enzimática. A continuación se coloca el tubo en un baño de agua a 33°C durante 60 minutos, ayudando mecánicamente cada 10 minutos.

Pasado el tiempo de digestión enzimática, se saca el tubo del baño y se deja a temperatura ambiente (20-22°C), con lo cual la proteasa se inhibe y las células permanecen vivas en el mismo medio en el que se ha realizado la incubación por espacio de varias horas (hasta 4 horas).

Resultados: La observación al microscopio óptico, por contraste de fase, de la suspensión celular, muestra abundantes células brillantes, refringentes, con sus formas nativas preservadas. La prueba del azul de tπpano indica que son células vivas. Entre las células morfológicamente preservadas se identifican numerosos fotorreceptores (conos y bastones), células bipolares, amacrinas y células de Müller. En la suspensión celular también se encuentran células redondas y células que, aun siendo identificables por su forma global han perdido prolongaciones, producto del troceamiento inicial del tejido y de la ayuda mecánica durante el proceso de digestión enzimática. En la Figura. 2 se presentan dibujos de una muestra representativa de las numerosas células morfológicamente preservadas que se observan en la suspensión celular obtenida por el protocolo de este ejemplo.

EJEMPLO 3

DISOCIACIÓN DE LAS CÉLULAS DEL HIPOCAMPO DE RATA DEL DÍA POSTNATAL 5

Medio de disociación:

Sacarosa 300mM en agua bidestilada

Esta solución se puede mantener vanos días en frigorífico, a 4°C.

Solución de proteasa-SF:

1 mg de proteasa-SF de 24.000 UAP/mg disuelta en 2,4 mi del medio de disociación. Esta solución se prepara diariamente y se puede mantener a temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizada, pero no más de 3-4 horas.

Procedimiento:

Se extraen los dos hipocampos de una rata de 5 días postnatal y se colocan en un pocilio de vidrio, con capacidad para 1 mi, que contiene 300μ I de medio de disociación.

En el mismo pocilio se hacen rodajas de los hipocampos, tan finas como sea posible, cortándolos transversalmente con un bisturí, tras lo cual, se trocean las rodajas también lo más finamente posible con unas tijeras de pequeño tamaño, de punta fina y curva.

Con una micropípeta de 1 mi se pasa el contenido del pocilio a un tubo de vidrio que contiene: 20 μl de la solución de proteasa-SF y 480 μl del medio de disociación, a temperatura de 33°C, comenzando en este momento la digestión enzimática. Por lo tanto, la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación es de dos hipocampos en 800 μl. La concentración de proteasa es de 10 μg/ml

Por la punta de una micropipeta de 1 mi se pasa cuidadosamente el contenido del tubo 10 veces, con objeto de ayudar mecánicamente la disociación enzimática. A continuación se coloca el tubo en un baño de agua a 33° durante 35 minutos, ayudando mecánicamente cada 5 minutos.

Transcurrido el tiempo de digestión enzimatica, se saca el tubo del baño y se deja a temperatura ambiente (20-22°C), con lo cual la proteasa se inhibe. Las células permanecen vivas en el mismo medio en el que se ha realizado la incubación por espacio de 2 horas.

Resultados:

La observación al microscopio óptico, por contraste de fase, de la suspensión celular muestra abundantes células brillantes, refringentes, con sus formas nativas preservadas. La prueba del azul de tripano indica que estas células son viables. Entre las células morfológicamente preservadas se identifican numerosas células de la capa de piramidales en grado variable de diferenciación, y células indiferenciadas supuestamente

de esta y de otras capas del hipocampo. En la suspensión celular también se encuentran células redondas y células, que aún siendo identificables por su forma global han perdido prolongaciones, producto del troceamiento inicial del tejido y la ayuda mecánica durante el proceso de incubación. En la Fig. 3 se presentan dibujos de una muestra representativa de las células morfológicamente preservadas que se observan en la suspensión celular obtenida por el protocolo de este ejemplo

EJEMPLO 4

DISOCIACIÓN DE LAS CÉLULAS DEL CEREBELO DEL EMBRIÓN DE POLLO DEL ESTADIO E14

Medio de disociación:

Sacarosa 175mM en agua bidestilada Esta solución se puede mantener vanos días en frigorífico, a 4°C.

Solución de proteasa-SF:

1 mg de proteasa-SF de 24 000 UAP/mg disuelta en 2,4 mi del medio de disociación. Esta solución se prepara diariamente y se puede mantener a temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizada pero no más de 3-4 horas.

Procedimiento:

Se extrae todo el cerebelo de un embrión de pollo de 14 días de incubación. Se coloca en un pocilio de vidrio, con capacidad para 1 mi, que contiene 300μ I de medio de disociación.

En el mismo pocilio se hacen rodajas del cerebelo en el plano sagital, tan finas como sea posible, con un bisturí. Se trocean las rodajas, también lo más finamente posible, con unas tijeras de pequeño tamaño, de punta fina y curva.

Con una micropipeta de 1 mi se pasa el contenido del pocilio a un tubo de vidrio que contiene: 400 μl de la solución de proteasa-SF y 500 μl del medio de disociación, a temperatura de 34-35°C, comenzando en este momento la digestión enzimátíca. Por lo tanto, la relación masa de tejido/volumen del medio de incubación es de un cerebelo en

1200 μl. La concentración de proteasa es de 136 μg/ml

Con una micropipeta de 1 mi se ayuda mecánicamente 10 veces, succionando y soltando el contenido del tubo. A continuación se coloca el tubo en un baño de agua, a temperatura de 34-35° C, durante 30-45 minutos, ayudando mecánicamente cada 10 minutos.

Transcurrido el tiempo de digestión enzimática, se saca el tubo del baño y se deja a temperatura ambiente (20-22°C),con lo cual la proteasa se inhibe. Las células permanecen vivas en el mismo medio en el que se ha realizado la incubación por espacio de varias horas (hasta 4 horas)

Resultados:

La observación al microscopio óptico, por contraste de fases, de la suspensión celular, muestra abundantes células brillantes, refπngentes, con sus formas nativas preservadas. La prueba del azul de tπpano indica que estas células son viables. Entre las células morfológicamente preservadas se identifican numerosas células de la capa de Purkinje en grado variable de diferenciación, y células indiferenciadas supuestamente de esta y de otras capas de la corteza cerebelosa. En la suspensión celular se encuentran también células redondas y células que siendo identíficables por su forma global han perdido prolongaciones, producto del troceamiento inicial del tejido y la ayuda mecánica durante el período de incubación. En La figura 4 se presentan dibujos de una muestra representativa de las células morfológicamente preservadas que se observan en la suspensión celular obtenida por el protocolo de este ejemplo.