La détection et t'identification de bacteries est très importante en médecine ou dans l'industrie alimentaire sachant que ces micro-organismes peuvent non seulement se révéler être des agents pathogenes, mais egaiement mettre en evidence certains types de contaminations.

Les méthodes récentes développées dans ce but font appel à l'utilisation de composes colorés ou fluorescents et les applications de ces composes ont été décrites par exemple dans les revues de Manafi M. evt Ll1., Microbiological Reviews, 55 (3), p 335- 348,1991 ou plus recemment Manafi Nl., De Ware (n) Chemicus, 28, p 12-17,1998.

De manière générale, quatre groupes de composes peuvent être distingues : -les marqueurs fluorescents comme 1'acridine orange qui produisent une augmentation de fluorescence quand le marqueur est adsorbe sur les acides nucléiques ou les protéines des cellules des micro-organismes, -les indicateurs pH dépendants comme I'acridine ou la 7-hydroxycoumarine qui varient en intensite ou en spectre de couleur ou fluorescence en fonction du pH et donc de l'activité biochimique des micro-organismes ; -les composes sensibles a la nature oxydo-reductrice du milieu comme le bleu de méthylène et qui produisent une couleur sous 1'effet d'un milieu réducteur, -les substrats d'enzymes colorés ou fluorescents qui produisent respectivement une couleur ou de la fluorescence sous 1'effet d'une hydrolyse en présence d'une enzyme spécifique d'un micro-organisme ou d'un groupe de micro- organismes.

Parmi cette dernière categorie, un certain nombre de substrats ont été décrits, qui permettent notamment la detection de la ß-D-glucosidase ou P-D-galactosidase qui sont des marqueurs taxinomiques importants pour) es micro- organismes et en particulier les Enterobacteriaceae. Parmi ces substrats, on peut citer les dérivés de l'ortho-nitrophenyle qui produisent de l'o-nitrophenol jaune après hydrolyse ou des substrats fluorescents comme les dérivés de la fluorescéine ou de la 4-methylumbelliferone qui produisent un marqueur fluorescent. Une limitation

importante de ces substrats est le phénomène de diffusion dans le milieu de culture ce qui rend plus difficile la distinction entre la colonie et le bruit de fond.

Pour résoudre ce problème, d'autres substrats ont été employés qui donnent un produit insoluble après hydrolyse. Ces substrats restent localises autour de la colonie bactérienne sans diffuser sur le support de culture ce qui facilite l'interprétation du test.

Parmi ces substrats, les derives de 1'indoxyl (voir par exemple Kodaka et al., J. Clin Microbiol., 33, p 199-201,1995 ou les brevets US 5 358 854 et US 5 364 767) ou de l'esculétine (voir par exemple WO 97/41138) ont été développés. Pour les premiers la difficulté de synthèse rend le cout très élevé limitant le développement d'applications industrielles à grande échelle et de plus, ces substrats sont sensibles aux conditions d'incubation du milieu. Pour les deuxièmes, l'obligation de rajouter dans le milieu un agent complexant à base de fer pour avoir une réaction colorée pose problème pour certains micro-organismes car il peut interférer avec leur métabolisme et notamment celui étudie.

La présente invention décrit une nouvelle famille de substrats enzymatiques qui ne présente pas les inconvénients précités puisque la synthèse de ces composes est simple à mettre en oeuvre, les substrats sont insolubles après hydrolyse, ne diffusent pas dans le milieu et ils ne nécessitent pas 1'addition d'agent complexant comme le fer ou de conditions d'oxydo-reduction particulières.

Un objet de la présente invention est de décrire une famille de composes de formule générale (I) : dans laquelle

X représente un atome d'azote ou un atome de carbone substitue par un groupement phényle, ledit groupement phényle étant éventuellement substitue en position méta ou para, Y et Z représentent un atome d'hydrogène lorsque X représente un atome de carbone ou Y et Z représentent ensemble une liaison ether, thioether ou amine éventuellement substituée par un groupement alkyle ou aryle, R, et R, représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non, R3 et R, représentent chacun indépendamment l'un de I'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents, R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme.

Les enzymes d'intérêt dans la présente invention sont les enzymes dont la présence donne une information permettant la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'un ou de plusieurs micro-organismes ou d'un analyte comme une protéine, un peptide, un acide nucléique. En particulier, 1'enzyme est de la famille des osidases comme la p-glucuronidase, la P-galactosidase, la 6-phosphogalactohydrolase, I'a-galactosidase, 1'a-amylase, 1'a-glucosidase, la p-glucosidase, les hexosaminidases comme la N-acetyl-B-glucosaminidase ou la N-acetyl-B-galactosaminidase, de la famille des estérases, des lipases, des phosphatases, des sulfatases, des DNases, des peptidases et des proteases. Préférentiellement 1'enzyme est de la famille des osidases comme la ß-D-glucosidase, p-glucuronidase ou la ß-D-galactosidase, de la famille des sulfatases, phosphatases, estérases.

Le groupement R est choisi en fonction de l'enzyme à détecter. R est, par exemple, un résidu de type sucre a-ou P-comme les derives du xylose, glucose, galactose, acide glucuronique, glucosamine ou un phosphate, un sulfate, un carboxylate (R6COO-) dans lequel R6 est un groupement alkyle ayant de un à 16 atomes de carbone, un nucléotide, un peptide. Préférentiellement le groupement R est le P-D-glucose ou le (3-D-galactose, ß-D-glucuronate, un phosphate, un sulfate, un acetate.

Quand R, et R2 représentent ensemble un noyau benzénique fusionne, on entend la structure (Ia) suivante qui indique la formule développée pour R, et R2 :

Quand Y et Z représentent ensemble une liaison ether, on entend une liaison telle que représentée dans le formule générale (Ib) :

Quand Y et Z représentent ensemble une liaison thioéther, on entend une liaison telle que représentée dans le formule générale (Ic) : Quand Y et Z représentent ensemble une liaison amine éventuellement substituée par un groupement aryle ou alkyle, on entend une liaison telle que représentée dans le formule générale (Id) :

dans laquelle A représente un groupe aryle ou alkyle, Des substrats particuliers de la formule generale (I) sont donnes dans les formules générales (II), (III), (IVa), (IVb) et (IVc) indiquées ci-dessous:

(II) formule générale (II) dans laquelle, R, et R représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non. Préférentiellement R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne non substitue.

R3 et R4 représentent chacun indépendamment l'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents. Préférentiellement R3 et R4 représentent H, Rs représente H, NO2, CF3, CN, OCH3, F, I, Cl, Br, SO, H, COH en position meta ou para. Préférentiellement R5 représente H, R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme. En particulier R représente un résidu de type sucre a-ou ß-, préférentiellement le ß-D-glucose ou le ß-D-gluctose ou un acetate, un sulfate.

formule générale (III) dans laquelle, R, et R, représentent chacun indépendamment 1'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non. Préférentiellement R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne non substitue.

R3 et R4 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou differents. Préférentiellement R3 et R4 représentent H.

R, represente H, NO,, CF3, CN, OCH3, F, I, Cl, Br, CO, H, S03H en position meta ou para. Préférentiellement R ; represente H.

R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme. En particulier, R représente un résidu de type sucre a-ou ß-, préférentiellement le ß-D-glucose ou le (3-D-galactose.

(IVa) formule générale (IVa) dans laquelle,

R, et R2 représentent chacun indépendamment 1'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non. Préférentiellement R, représente H et R, représente Cl.

R3 et R4 représentent chacun indépendamment l'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou differents. Préférentiellement R3 et R, représentent H.

R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme. En particulier, R représente un résidu de type sucre a-ou P-, préférentiellement le ß-D-glucose ou le ß-D-gluctose ou un acétate ou un sulfate.

(lob) formule générale (IVb) dans laquelle, R, et R, représentent chacun indépendamment l'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non. Préférentiellement R, représente H et R2 représente Cl.

R3 et R, représentent chacun indépendamment l'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents. Préférentiellement R3 et R4 représentent H.

R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme. En particulier, R représente un résidu de type sucre a-ou ß-, préférentiellement le ß-D-glucoce ou le ß-D-gluctoce ou un acétate ou un sulfate.

formule générale (IVc) dans laquelle, A représente un groupe aryle ou alkyle, R, et R, représentent chacun indépendamment 1'un de 1'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R, ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non. Préférentiellement R, représente H et R, représente Cl.

R3 et R4 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou differents. Préférentiellement R3 et R, représentent H.

R représente un groupement tel que la liaison O-R est hydrolysable par une enzyme. En particulier, R représente un résidu de type sucre a-ou (3-, préférentiellement le (3-D-glucose ou le (3-D-galactose ou un acétate ou un sulfate.

L'invention concerne également un procédé de synthèse du substrat enzymatique de formule générale (I) dans lequel on prépare un intermédiaire de formule générale (V) (v) dans laquelle X représente un atome d'azote ou un atome de carbone substitue par un groupement phényle, ledit groupement phényle étant éventuellement substitue en position méta ou para, Y et Z représentent un atome d'hydrogène lorsque X représente un atome de carbone ou Y et Z représentent ensemble une liaison éther, thioéther ou amine éventuellement substituée par un groupement alkyle ou aryle, R, et R, représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents ou R, et R2 ensemble représentent un noyau benzénique fusionne substitue ou non, R3 et R4 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre H, Cl, F, I, Br et peuvent être identiques ou différents.

et on greffe sur l'hydroxyle un groupement R convenablement protégé.

En particulier le greffage s'effectue par une réaction de glycosylation, estérification, phosphorylation.

Dans le cas de la glycosylation, il est nécessaire de protéger les groupements hydroxyles du sucre comme par exemple avec un groupement acétyle.

Les dérivés tétraacétylés du (3-D-glucoside ou ß-D-galactoside sont obtenus à partir du dérivé correspondant a-acetobromohexose.

La déprotection des groupements hydroxyles du sucre est réalisée après le greffage en présence d'un agent alcalin comme le méthoxyde de sodium dans le méthanol pour un dérivé acétylé. Les conditions de glycosylation sont choisies par l'homme du métier et en particulier par action de 1'hydroxyde de potassium dans l'acétone.

La formation d'esters organiques comme l'acétate est réalisée en faisant réagir sur le dérivé de formule générale (V), 1'anhydride acétique à froid dans la pyridine. La formation d'ester du type CH3 (CH2) COOR est réalisée en faisant réagir un dérivé chlorure d'acide dans un mélange de solvant type pyridine/dimethylformamide, éventuellement en présence d'un catalyseur comme la 4-dimethylaminopyridine.

La formation de phosphate est realisee en traitant le dérivé de formule générale (V) en présence de POCl3 en présence de pyridine.

La formation de sulfate est realisee en traitant le dérivé de formule générale (V) par action de 1'acide chlorosulfonique à froid dans la pyridine. Les substrats de la présente invention dans le cas des phosphates et sulfates sont sous forme de sel comme un sel de potassium ou de sodium.

Avantageusement, on prépare un intermédiaire répondant à l'une quelconque des formules (Va), (Vb) et (Vc) suivantes:

(Vb)

L'invention concerne également une composition pour la détection et/ou 1'identification et/ou la quantification d'au moins un micro-organisme comprenant au moins un substrat enzymatique de formule générale (I) et un milieu réactionnel dudit micro-organismes ou desdits micro-organismes.

Par milieu réactionnel selon 1'invention, on entend un milieu permettant le développement d'au moins une activité enzymatique d'au moins un micro-organisme, tel qu'un milieu de culture.

Le milieu réactionnel est solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide on entend par exemple un milieu gélose. L'agar est le milieu traditionnel solide en microbiologie pour la culture des micro-organismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de Fagarose. Un certain nombre de préparations sont disponibles comme

1'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud, celles décrites dans le"Livret technique MILIEUX DE CULTURE"de la demanderesse ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).

Avantageusement, le milieu réactionnel est un milieu gélifie contenant entre 2 et 40g/l préférentiellement entre 9 et 25 g/1 d'agar.

Les substrats de la présente invention sont utilisables dans une large gamme de pH, notamment entre pH 5,5 et 10,0 et avantageusement entre pH 6,0 et 8,5.

Le milieu réactionnel peut aussi comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison comme des acides amines, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des antibiotiques, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de metaux. Des exemples de milieux sont décrits dans les brevets suivants de la demanderesse EP 0656421 ou WO 99/09207.

Dans un autre aspect de la présente invention, le milieu réactionnel comprend au moins deux substrats enzymatiques: un premier substrat enzymatique de la famille de 1'invention et au moins un autre substrat enzymatique de la famille de l'invention et/ou un autre substrat enzymatique d'une autre famille de substrat.

L'hydrolyse enzymatique du ou des autres substrats génère un signal détectable, différent du signal généré par le premier substrat, comme par exemple des produits colores ou fluorescents différents, pour permettre la mise en évidence comme la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'un ou de plusieurs micro- organismes.

A titre d'exemple, on peut envisager les associations : -un substrat de B-glucuronidase selon 1'invention et X-B-D-glucoside (X est le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-) pour un milieu pour les prélèvements urinaires (type CPS ID2, bioMerieux, Marcy étoile, France); -un substrat de 13-galactosidase selon 1'invention et X-B-D-glucoside pour un milieu pour les prélèvements urinaires (type CHROMagar Orientation (marque deposee) vendu par la société CHROMagar, Paris France ou Oxoid UTI vendu par la société OXOID, Hampshire, Angleterre);

-un substrat de ß-glucuronidase selon 1'invention et X-B-D-galactoside pour un milieu pour les Escherichia coli et les coliformes (type Coli ID, bioMérieux, Marcy 1'Etoile, France); A titre d'exemple, on peut utiliser un substrat d'hexosaminidase selon 1'invention pour les levures et l'identification de Candida albicans.

Des substrats selon la présente invention peuvent notamment être introduits dans les milieux CPS ID2, SM ID, Albicans ID2, Coli ID, 0157: H7 ID commercialises par bioMerieux (Marcy étoile, France) et comprenant tout ou partie de leur substrats enzymatiques, ainsi que dans les milieux comprenant de 1'esculine tels que la gélose Bile Esculine avec ou sans agents sélectifs.

La concentration du substrat enzymatique dans le milieu réactionnel est comprise entre 0,02 et 1 g/l, avantageusement entre 0,03 et 0,30 g/1 et préférentiellement entre 0,04 et 0,10 g/l.

La présente invention s'étend aussi à un kit de diagnostic comprenant une composition telle que définie précédemment et un contenant pour le milieu réactionnel.

Par contenant, on entend tout support solide comme un flacon, un tube, une boite, une plaque de microtitration ou un consommable pour automate comme les galeries API ou les cartes VITEK (marques déposées, BioMerieux, Marcy étoile, France).

Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon ou l'on met en contact le micro-organisme provenant de l'échantillon avec un milieu réactionnel contenant un substrat enzymatique de formule générale (I) et l'on détecte le produit colore ou fluorescent forme par 1'hydrolyse dudit substrat enzymatique.

Les substrats de formule générale (I) présentent l'avantage d'être utilisables indépendamment des conditions d'atmosphère d'incubation. La détection peut donc être mise en oeuvre par incubation du milieu réactionnel contenant le substrat enzymatique et inocule par un micro-organisme au moins, dans une atmosphère contrôlée comme en condition aérobie, anaérobie, microaérophilie ou sous atmosphère CO, et de préférence aérobie, microaerophilie ou sous atmosphère CO2.

L'échantillon à analyser est un échantillon clinique comme un prélèvement de salive, de sang, d'urine, des selles ou tout autre échantillon dont

l'analyse peut aider un clinicien a poser un diagnostic. L'échantillon peut aussi être un échantillon de produit issu ou de base de l'industrie alimentaire et/ou pharmaceutique dans lequel il faut soit, garantir l'absence de micro-organisme pathogène, soit dénombrer une flore contaminante ou détecter des micro-organismes spécifiques.

L'échantillon peut être mis en culture soit directement sur un milieu contenant un substrat de formule générale (I) soit après une étape de préculture par exemple dans le cas d'un échantillon alimentaire.

Le ou les micro-organismes identifiables, détectables ou quantifiables dans la présente invention sont des bactéries, des levures, des champignons, appartenant notamment aux groupes ou taxa suivant: Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Nesseriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae, Campylobacte7 ; Micrococcaceae, Streptococcaceae, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Corynebacterium, Gardnerella, Nocardia, Candida, Cryptococcus, Aspergillus et plus particulièrement Escherichia coli, E. coli 0157 : H7, Shigella, Salmonella, Proteeae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Enterococcus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listera monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, des levures comme Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans et Aspergillus fumigatus. Ces micro- organismes peuvent être aérobies, aéroanaérobies, microaérophiles ou anaérobies.

Dans un autre aspect de la présente invention, les substrats enzymatiques sont utilises dans des réactions de détection d'un analyte ou une activité enzymatique (notamment la phosphatase alcaline ou la p-galactosidase) est mise en jeu comme: les réactions de détection d'anticorps ou d'antigène, ou d'acide nucléique, avec un format type ELISA (voir par exemple"les immunodosages de la théorie à la pratique" coordonne par Barbier Y., les éditions de 1'ACOMEN, Lyon, p 109-133,1988); dans des techniques de biologie moléculaire pour la mise en évidence d'un gène de type- galactosidase (voir par exemple"Molecular cloning a laboratory manual", 2"d ed., Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, section 16.56 et section 1.85,1989); pour la détection d'acides nucléiques (voir par exemple"DNA probes", 2nd edition, Keller G. H., Manak, M. M., Stockton press, section 5 à 9,1993) ou dans des techniques histochimiques, cytochimiques ou de cytometrie de flux.

Les exemples qui suivent permettent d'illustrer quelques avantages de 1'invention sans toutefois en limiter la portee.

Exemple 1 : synthèse du p-naphtolbenzein-p-D-galactoside, PNB-gal produit (1) O I I OH O \ \ O OU OH produit (1) Le p-naphtolbenzein est obtenu chez Acros Organics (Geel, Belgique).

Les autres réactifs sont obtenus chez Sigma Aldrich Chimie (St Quentin Fallavier, France). Le p-naphtolbenzein (1,87 g, 5 mmoles) est dissout dans 20 ml d'acétone sous une agitation vigoureuse. 5 ml d'hydroxyde de potassium à une concentration de 1,4 moles/litre sont ajoutes a cette solution suivie de 10 ml d'acetone. 5 ml d'eau sont alors additionnes goutte à goutte pour générer une solution bleu fonce. 10 mmoles d'a-acetobromogalactose (4,1g) dans 10ml d'acétone sont ajoutes à la solution. Pour maintenir le pH à une valeur supérieure à 11,2 ml d'une solution d'hydroxyde de potassium à 20 moles/litre sont additionnes une première fois après 30 min d'agitation et une deuxième fois après 90 min d'agitation. Une troisième addition de solution alcaline est effectuée après 3,5 heures suivie d'une addition de 5 ml d'oc-acétobromogalactose dans l'acétone à la même concentration que précédemment.

Après 4,5 heures une dernière addition de solution alcaline a lieu et la solution est laissée sous agitation pendant la nuit.

L'acétone est eliminee sous pression réduite et la solution résiduelle est versée dans 300ml d'une solution de carbonate de sodium à 0,06mole/l à une température de 0°C sous agitation. Le précipité marron est filtre sous vide, lave à 1'eau et seche à l'air. Le solide est dissout dans 100ml de dichlorométhane et lave

intensément avec une solution d'hydroxyde de potassium à 0°C pour enlever le p-naphtolbenzein en exces. Le p-naphtolbenzein résiduel est éliminé par agitation sur une résine Dowex Marathon dans 100ml d'eau à pH 11 pendant 2 à 3 heures. Cette purification est suivie par chromatographie couche mince en utilisant un solvant acétate d'ethyle/toluene (3: 1) avec une révélation par 1'ammoniaque. La solution jaune foncée est sechee la nuit sur sulfate de magnésium anhydre, évaporée sous pression réduite, reconstituée avec du méthanol puis évaporée à nouveau pour obtenir une mousse. Cette mousse est dissoute dans 50ml de méthanol et le produit est deprotege pendant 5 heures en utilisant 20ml de méthoxyde de sodium dans le méthanol à 0,4 mole/l. La solution est alors ajustée à pH 6,5 en utilisant une résine IR120 (H+), séparée par décantation et le solvant est éliminé sous pression reduite. Le glycoside forme, p-naphtolbenzein- P-D-galactoside, (1, 5g) se présente sous la forme d'une poudre jaune marron.

Exemple 2: Synthèse du dérivé acétate du p-naphtolbenzein.

Le p-naphtolbenzein est dissout dans la pyridine anhydre puis refroidi à 0°C et l'on additionne à cette solution de 1'anhydride acétique (exces molaire de 5 fois) dissout dans la pyridine à froid. Après 24 heures à température ambiante, la solution est traitée avec de 1'eau froide ajoutée goutte à goutte sous agitation pour décomposer l'excès d'agent acetylant. Un précipité de l'ester se forme qui est éliminé par filtration sous vide, lave avec de l'acide acétique et recristallise à chaud dans l'acide acétique.

Exemple 3: Synthèse du dérivé sulfate sous forme de sel de potassium du p-naphtolbenzein.

A une solution froide de p-naphtolbenzein dans la pyridine anhydre est ajoutée sous agitation 1,2 excès molaire d'acide chlorosulfonique a-15°C. Après 1 heure a-15°C et 30 minutes à température ambiante, l'excès de pyridine est évaporé sous pression réduite et le sel pyridinium est décomposé par dissolution dans l'méthanol et traitement avec une solution d'hydroxyde de potassium dans l'méthanol jusqu'a pH 10. Le sel de potassium est filtre sous vide, lave avec de l'méthanol puis de 1'éther diethylique.

Exemple 4: synthèse de la 8-chloro-1, 2-benzoresorufin-p-D-glucoside, (CBR-glu) produit (2). / CHOH) J)! t Cl N v0 I CH20H O O \ O \ O OH OH OH produit (2)

Le 6-nitroso-4-chlororesorcinol (2,94g, 20 mmoles) et le 1,3-dihydroxynaphthalene (3,20g, 20 mmoles) sont dissous séparément dans le butanol-1 (30ml) et mélangés. Le mélange réactionnel est chauffe entre 50 et 60°C à l'aide d'un bain marie et on additionne de I'acide sulfurique (l, Og) goutte à goutte sous agitation pendant 30 secondes. La solution devient rouge foncée et des cristaux se forment rapidement. Après 15 min à 50°C et 1 heure à température ambiante, le produit est filtre sous vide et recristallise à partir de butanol-1 chaud pour donner 2,8g de cristaux rouges foncés brillants de 8-chloro-1, 2-benzoresorufin.

Le dérivé glucoside (2) est préparé par une réaction de Koenigs-Knorr comme décrit précédemment pour le dérivé p-naphtolbenzein. Le glucoside sous une forme protégée tétraacétylée est isole par évaporation rotative à partir de dichlorométhane et déprotégé directement en utilisant une quantité catalytique de méthoxyde de sodium dans le méthanol anhydre. Le glycoside se présente sous la forme d'une poudre jaune orangée.

Exemple 5: synthèse de la 8-chloro-1, 2-benzoresorufin-ß-D-galactoside (CBR-gal) produit (3) Le mode de préparation du dérivé ß-D-galactoside (3) est identique à celui décrit dans 1'exemple 4 en utilisant le dérivé ß-D-galactoside sous forme protégée tétraacétylée à la place de l'équivalent glucoside.

Exemple 6: synthèse de la 3-hydroxy-9-phenyl-1, 2: 7,8-dibenzo- 6-fluorone-p-D-galactoside produit (4). 0 , I OH, ~O O O O OH OH produit (4)

La 3-hydroxy-9-phenyl-1, 2: 7,8-dibenzo-6-fluorone est préparé à partir du 1,3-dihydroxynaphtalene (Aldrich, 14529-7) par condensation à chaud avec le a, a, a- trifluorotoluene (Aldrich, T6370-3) en présence d'un acide de Lewis comme SnCl4 ou ZnCl2 dans un solvant à haut point d'ébullition comme le chlorobenzène ou le xylene. Après hydrolyse de 1'acide de Lewis, et purification du compose intermédiaire, le dérivé galactoside (4) est préparé comme décrit dans 1'exemple 1.

Exemple 6 bis : Synthèse du naphtosafranol (9-hydroxy-7phenol- 5benzo [a] phenazinone):

produit (5)

Un mélange de 50 g d'acide sulfurique et 130 ml d'eau sont additionnes lentement dans une solution, maintenue à 0°C et sous agitation, de phénol (20g), nitrite de sodium (18g) et d'hydroxyde de sodium (9g) dans 500 ml d'eau. Après 2 heures de réaction, le produit est collecte, lave à 1'eau glacée. Après recristallisation dans 1'eau, le produit p- nitrosophénol est isole pur (13, 4g).

Le p-nitrosophenol ainsi préparé (12,3 g, 0,1 mole) ainsi que de la N-phenyl-2- naphtylamine (14, 5g, 0,067 mole, Aldrich, 17,805-5) sont dissous dans l'méthanol (400ml) et le mélange est refroidi à 15°C. A cette solution, l'on ajoute de l'HCl concentre (15g). La température remonte spontanément et le produit isorosindone (sous forme de sel chlorhydrique) est separe par filtration et recristallise dans un mélange ethanol-eau (50%-50%) Le produit recristallise peut être converti dans sa forme base libre en le dissolvant dans un premier temps dans l'méthanol puis addition d'hydroxyde d'ammonium et enfin ajout de la solution dans 1'eau chaude.

La base libre (isorosindone) précipite sous forme de cristaux marron foncé en refroidissant la solution. Une filtration sous vide conduit à 15 g de produit pur.

Le produit cible (5) est obtenu en chauffant l'isorosindone à reflux dans une solution concentre de KOH dans le butanol-1. Le produit est purifie par chromatographie flash sur silice avec l'éthylacétate comme eluant.

Exemple 6 ter : Le derive galactoside du naphtosafranol est préparé selon le même protocole que celui décrit pour 1'exemple 1.

Exemple 7: utilisation du p-naphtolbenzein-ß-D-galactoside (PNB-gal) pour la détection de microorganismes possédant une activité p-galactosidase.

Un milieu solide agar comprenant le PNB-gal est préparé comme suit: 41g d'agar Columbia sont additionnes à 1 litre d'eau distillée avec 100mg de PNB-gal et 30 mg d'IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactoside) pour faciliter l'induction de l'activité p-galactosidase. L'agar est sterilise par autoclavage à 116°C pendant 10 min. Le milieu est refroidi lentement à 55°C avant d'être reparti dans des boites de 20ml.

367 souches différentes incluant 303 Enterobacteriaceae sont collectées à partir d'échantillons cliniques et environnementaux et identifies par la galerie API 20E (BioMerieux, France) comme méthode de référence. Les souches sont cultivées sur un milieu Columbia agar à 37°C pendant 24 heures puis un inoculum d'environ 108 organismes/ml (équivalent à un standard McFarland de 0,5) est réalisé pour chaque souche. En utilisant un inoculateur Denley, 1 microlitre de chaque suspension est inocule dans le milieu PNB-gal préparé ci-dessus à raison de 20 souches par boite.

Toutes les boites sont incubées à 37°C pendant 18 heures. Après incubation, les boites sont examinées en fonction de la présence d'une colonie violette en comparaison avec la croissance sur le milieu Columbia agar. Les résultats sont presentes dans le tableau I.

Tableau I Especes gram moins Nombre de souches Résultats positifs testees pour avec le { l'espèce PNB-gal(%) Acinetobacter 53 0 Aeromonas caviae 7 86 Aeromonas hydrophila 3 100 Citrobacter diversus 9 89 Citrobacter freundii 16 100 Enterobacter aerogenes 9 100 Enterobacter agglomerans 1 100 Enterobacter cloacae 21 100 Escherichia coli 41 95 Escherichia hermannii 1 100 Hafnia alvei 10 30 Klebsiella oxytoca 13 100 Klebsiella ozaenae 3 67 ............................................................ ............................................................ ............................................................ ............................ Morganella morganii 12 | 0 Proteus mirabilis 16 0 Proteus penneri 1 0 Proteus vulgaris 4 0 Providencia alcalifaciens 3 0 Providencia rettgeri 3 0 Providencia stuartii 10 0 Salmonella spp. 64 0 Serratia odorifera 1 100 Serratia spp. 14 79 Shigella boydii 1 0 Shigella dysenteriae 2 0 Shigella flexneri 2 0 Shigella sonnei 10 100 Vibrio cholerae 1 100 Yersinia enterocolitica 14 7 Yersinia pseudotuberculosis 3 0

Ce tableau montre une bonne efficacité du substrat comme indicateur de l'activité p-galactosidase. Aucune souche sans l'activité P-galactosidase n'est détectée ce qui signifie qu'il n'y a pas de faux positifs et la sensibilité sur les souches Enterobacteriaceae est de 95,1% par rapport à la méthode de référence API 20E.

Exemple 8 :Influence du pH sur la révélation de la B-D-galactosidase en présence de p-naphtolbenzein-B-D-galactoside PNB-gal.

Le milieu ci-apres, base Columbia à une concentration de 46,37g/l, isopropyl-thio-B-D-galactoside (IPTG) à 0,03g/l, p-naphtolbenzein-B-D-galactoside à 0, lg/l, a été ajuste à différents pH (5,5-6,0-6,5-7,0-7,5-8,0-8,5) à 24°C après autoclavage des milieux. Ces différents milieux repartis en boites de Pétri ont été inocule en isolement en trois cadrans à partir de suspension à 0,5 McFarland de micro- organismes bien caractérisés issus de collection type ATCC ou NCTC. Les boites ont été incubées à 37°C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation, la couleur a été notée. Les résultats sont presentes dans le tableau II ci-après : Tableau II Souches testées TI pH 5,7 pH 6,0 PH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 pH 8,5 E.coli 24 H - - - - - - - 032 48 H 1 0 g E.coli 24 H Orange Orange Orange Orange Orange Orange Marron 115 48 H Orange Orange Orange Orange Brun Brun Brun S.marcescens 24 H Marron Marron Marron Marron ; Marron Vert Vert 217 48 H Marron i Marron Marron Marron Vert Kaki Kaki E. cloacae 24 H Orange Orange Orange Orange Brun Brun Brun 061 48 H Marron Marron Marron Vert Vert Kaki Kaki S.typhiniuriuiii 24 H 010 48H E. faecalis 24 H - - - - - - - 117 48 H Orange Orange Orange Orange Orange Orange Orange S.agalactiae 24 H - - - - - - - 015 48 H - - - - - - - S.aureus 24 H 008 48 H - - - - - - -

-signifie une absence de coloration, TI représente le temps d'incubation sur les boites Suivant les souches et la durée d'incubation, la couleur des colonies varie en fonction du pH. En général, elle est plus orange à brune à pH acide et vert à kaki à

pH alcalin. Ceci peut permettre de différentier différents groupes de micro-organismes, d'adapter la couleur en fonction des besoins (association avec d'autres substrats enzymatiques, indicateurs de pH) ou de mettre en évidence plusieurs métabolismes (hydrolyse enzymatique et variation de pH) ce qui est un avantage du substrat PNB-gal.

Exemple 9: Influence du milieu réactionnel sur la révélation de la B-D-galactosidase en présence de p-naphtolbenzein-ß-D-galactoside, PNB-gal.

Dans les milieux Columbia, Trypcase Soja (GTS) et MacConkey Sorbitol (SMAC), il a été ajoute le mélange suivant: IsoPropyl-Thio-ß-D-galactoside 0,03g/l p-naphtolbenzein-B-D-galactoside......................... 0,1 g/1 Après autoclavage, le pH des milieux était à 23°C : 7,1-7,1 et 7,2 sur les milieux SAMC, GTS et Columbia respectivement. Ces différents milieux repartis en boites de Pétri ont été inocule en isolement en trois cadrans à partir de suspension à 0,5 McFarland de micro-organismes bien caractérisés issus de collection type ATCC ou NCTC. Les boites ont été incubées à 37°C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation, la couleur a été notée.

Les résultats sont presentes dans le tableau III ci-après : Tableau III Souches testees TI milieu SMAC'milieu GTS milieu Columbia E. coli 24 H - - - 032 48 H E. coli 24 H Orange Orange Brun-Orange 115 48 HOrange Orange Brun E. coli 24 H Orange Brun-Orange Brun 206 48 H Orange Brun-Orange Brun S. marcescens 24 H Fuchsia Brun-Orange Brun 217 48 H Fuchsia Brun Brun E. cloacae 24 H Orange Brun-Orange Brun 061 48 H Orange Brun Brun S. typhimurium 24 H 010 48 H E. faecalis 24 H 0 010 48 H - Orange Orange S. agalactiae 24 H 015 48 H S. aureus 24 H 008 48 H

-signifie une absence de coloration, TI représente le temps d'incubation sur boite.

Suivant les souches et la durée d'incubation, la couleur des colonies varie en fonction du milieu. En général, elle est orange sur le milieu SMAC et brune sur le milieu Columbia, sans que cette différence de couleur ne puisse être lie au pH du milieu. Sur le milieu SMAC, il est possible de différentier Serratia marcescens des autres bactéries, ce qui n'est pas le cas sur les deux autres milieux. De plus, il peut être intéressant de pouvoir adapter la couleur des colonies obtenue avec le p-naphtolbenzein-B-D-galactoside en fonction de l'utilisation d'autres substrats enzymatiques donnant d'autres couleurs (rose ou brune par exemple).

Exemple 10: Influence de l'atmosphère d'incubation sur la révélation de la B-D-galactosidase en présence de p-naphtolbenzein-B-D-galactoside, PNB-gal.

Dans le milieu ci-après : Extrait de levure.................................................. 6g/l Peptone de gelatine............................................. Sg/l NaCI........................................................ ............ 8g/l Carbonate de Na 0, 1 g/l IsoPropyl-Thio-B-D-galactoside........................ 0,03g/l Agar........................................................ ........... 13g/l est ajoute soit du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactoside (X-Gal), soit du p-naphtolbenzein-B-D-galactoside (PNB-Gal) a 0, 1 g/1. Nous avons inocule ces différents milieux repartis en boites de Petri avec des micro-organismes bien caractérisés issus de collection type ATCC ou NCTC. Les boites ont été incubées à 37°C pendant 48 heures sous différentes atmosphères : aérobiose (AE), microaerophilie (MAP), anaérobiose (ANA), CO2 par l'intermédiaire du système GENbox (BioMerieux, France) pour le contrôle de 1'atmosphere. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 et 48 heures d'incubation, l'intensité de coloration a été notée. Les résultats sont presentes dans le tableau IV ci-après : Tableau IV X-Gal PNB-Gal AE MAP ANA t CO2 AE MAP ANA CO2 Souches TI Essai 1 Essai 2 Essai 3 Essai 4 Essai 5 Essai 6 Essai 7 Essai 8 E. coli 24 H 3* 2 - 2 3 3 1 3 115 48 H 3 2 1 2 3 3 3 3 E. coli 24 H 3 1 1 3 3 3. 206 48 H 3 1 1 3 3 3 3 3 S. marcescen 24 H - - - - - - - - 042 48 H 1 1-2 3 1-3 E. cloacae 24 H 2 2 2 2 2 061 48 H 2 1 2 2 2 3 2 P. vulgaris 24 H---- 140 48 H - - - - - - - - E. Faecalis 24 H - - - - - - - - 117 28 H - - - - - - - - E. faecium 24 H 1 I--i t 255 48 H 3 1 3 S. aureus 24 H 008 48 H-|

* : intensite de coloration (échelle arbitraire à partir d'une observation visuelle) ;-signifie une absence de coloration; TI signifie temps d'incubation.

Si le X-Gal permet de détecter une activité sur la souche d'E. faecium contrairement au PNB-Gal, pour les souches qui hydrolysent fortement le X-Gal en aérobiose (E. coli, E. cloacae), le PNB-Gal permet de détecter cette activité B-D-galactosidase indépendamment de l'atmosphère et plus intensément. En effet, si les intensités sont faibles voire très faibles dans les conditions de 1'essai 3, elles sont fortes dans les conditions de 1'essai 7.

Exemple 11 : utilisation du 8-chloro-1, 2-benzoresorufin-p-D-galactoside (CBR-gal) pour la détection de micro-organismes possédant une activité ß- galactosidase dans un milieu solide.

Le substrat CBR-gal est incorpore dans un agar Columbia aux concentration suivantes 2,6,10 et 20 mg/100ml et le milieu ainsi préparé est reparti dans des boites. Chaque boite est inoculée avec les organismes suivants E. coli (NCTC,

10418), K. pneumonie (NCTC, 10896), P. rettgeri (NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC, 10211) et S. typhimurium (NCTC, 74). De l'IPTG est incorpore dans tous ces milieux à une concentration de 3 mg pour 100 ml d'agar Columbia. Toutes les boites sont incubées à 37°C pendant la nuit.

Les souches positives pour l'activité P-galactosidase (E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae et S. marcescens) hydrolysent rapidement le substrat après une incubation d'une nuit en donnant une coloration rose qui est limitée à la colonie bactérienne. Toutes les concentrations testées permettent de différencier les espèces mais la concentration optimale pour avoir une coloration rose clairement visible sans bruit de fond se situe vers 10mg/lOOml. Aucune inhibition de croissance n'est visible pour toutes les concentrations testées.

Exemple 12: utilisation du 8 chloro-1,2 benzoresorufin-P D galactoside (CBR-gal) pour la détection de micro-organismes possédant une activité ß galactosidase dans un milieu liquide.

Le substrat CBR-gal est teste dans un milieu liquide à différentes concentrations de 0, 5mg/ml à 0,0078mg/ml. Le milieu réactionnel liquide dans lequel est incorpore le substrat est compose d'un tampon phosphate pH 7,4 contenant 0,5% de bouillon nutritif et 0,5% de NaCI. 30 microlitres/ml d'IPTG sont ajoutes dans le milieu pour toutes les concentrations de substrat. Les souches testées sont E. coli (NCTC, 10418), K. pneumonie (NCTC, 10896), P rettgeri (NCTC, 7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC, 10211) et S. typhimurium (NCTC, 74) avec un inoculum de 0,5 McFarland.

Toutes les souches possédant une activité p-galactosidase génèrent une coloration rose au cours du temps comme résumé dans le tableau V ci-après.

Tableau V

Concentration en substrat CBR-gal 0. 5 0.25 0.125 0.0625 0.0313 0.0156 0.0078 Organismes mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml E. coli 2* 2 4 4 24 K. pneumoniae 2 2 4 4 24 - - P. rettgeri - - - - - - - E.cloacae 2 4 4 24 S. mancescens 24 24 24 24 24-- S. typhimurium - *: les résultats sont donnes en heures.-signifie une absence de coloration même après 24 heures.